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E. Coli métabolisation du paracétamol

E. Coli métabolisation du paracétamol


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Pour mon projet d'expo-sciences, j'ai fait une expérience sur la façon dont le paracétamol et l'ibuprofène affectaient la croissance des bactéries. Au jour 5, cependant, des parties du paracétamol ont noirci (image ci-dessous). je me demande si E. Coli peut métaboliser le paracétamol et si oui, quel opéron dans le génome K-12 est responsable de cela.

ÉDITER: J'ai réalisé qu'il pourrait métaboliser d'autres ingrédients du médicament que j'ai utilisé. J'inclus une liste des ingrédients du médicament que j'ai utilisé.

Acétaminophène 160 mg dans chaque 5 ml (duh)

Autres ingrédients (33.015873 ml):

  • Acide citrique anhydre
  • FD&C rouge no. 40
  • glycérine
  • sirop de maïs riche en fructose
  • cellulose microcristalline et carboxyméthylcellulose sodique
  • eau purifiée
  • benzoate de sodium
  • solution de sorbitol
  • sucralose
  • gomme xanthane

Je pensais que c'était peut-être le fructose, mais le sous-produit est-il vraiment noir ? Encore confus…


Désolé que ma réponse ne soit pas une vraie réponse, mais ce serait un bon point de départ pour un peu plus de science.

Plusieurs des questions que vous pourriez poser et auxquelles vous pourriez répondre (avec quelques expériences supplémentaires) :

  • Est-ce que cela se produit dans des plaques sans E. coli?
  • Vous avez une contamination sur le côté droit, peut-être aussi sur la partie noire. Cela pourrait-il être le coupable? Seule la moitié de la plaque est noire, le reste est (encore ?) rouge.
  • Vous avez utilisé un comprimé de paracétamol avec du colorant rouge et beaucoup d'édulcorants, est-ce que la même chose se produit si vous en utilisez un sans colorant rouge ? Un colorant serait une source probable, car il contient déjà une partie absorbante. Il suffit de le modifier légèrement pour absorber différentes longueurs d'onde.
  • Quel type de gélose utilisez-vous exactement ? Il en existe de nombreux types, souvent sélectionnés pour certains types de micro-organismes, avec des indicateurs de pH ou d'autres marqueurs colorés pour détecter et identifier les souches.

Pour votre question métabolique, vous pouvez consulter https://ecocyc.org/ où vous pouvez trouver une base de données avec toutes les voies métaboliques connues pour E. coli K12. Malheureusement, je n'ai rien trouvé pour le paracétamol (ou des synonymes) mais vous pouvez essayer de voir s'il produit un produit coloré pour l'un des additifs.


Colorimétrie : principe et instruments

La colorimétrie est une technique largement utilisée appliquée dans le système biologique. Il s'agit de la mesure d'un composé ou d'un groupe de composés présents dans un mélange complexe. La propriété des analyses colorimétriques est de déterminer l'intensité ou la concentration des composés en solution colorée.

Cela se fait en faisant passer une lumière d'une longueur d'onde spécifique du spectre visible à travers la solution dans un instrument colorimétrique photoélectrique et en observant la lecture galvanométrique de la réflexion en sensibilisant la quantité de lumière absorbée.

En fonction de la nature des composés colorés, des filtres de lumière spécifiques sont utilisés. Trois types de filtres sont disponibles - bleu, vert et rouge - avec des rayons de transmission de longueur d'onde lumineuse correspondants de 470-490 nm, 500-530 nm et 620-680 nm, respectivement.

Il existe deux lois fondamentales de l'absorption qui sont très importantes dans l'estimation colorimétrique. Il s'agit de la loi Lambert et de la loi Beer. La loi de Lambert stipule que lorsque la lumière monochromatique traverse une solution de concentration constante, l'absorption par la solution est directement proportionnelle à la longueur de la solution.

Au contraire, la loi de Beer stipule que lorsque la lumière monochromatique traverse une solution de longueur constante, l'absorption par la solution est directement proportionnelle à la concentration de la solution.

Ainsi, les deux lois peuvent être exprimées comme suit :

[Où je0 = Intensité de la lumière incidente (lumière entrant dans une solution)

I = Intensité de la lumière transmise (lumière laissant une solution)

l = Longueur de solution absorbante

c = Concentration de substance colorée en solution

Les deux lois de Beer-Lambert sont combinées pour obtenir l'expression transmittance (T).

(Où je0 est l'intensité du rayonnement incident et I est l'intensité du rayonnement transmis).

Une valeur de 100 % de ‘T’ représente une substance totalement transparente, sans qu'aucun rayonnement ne soit interrompu, tandis qu'une valeur nulle de ‘T’ représente une substance totalement opaque qui, en fait, représente une absorption complète. Pour valeur intermédiaire on peut définir l'absorbance (A) ou l'extinction (E) qui est donnée par le logarithme (en base 10) de l'inverse de la transmittance :

L'absorbance était autrefois appelée densité optique (DO), mais l'utilisation continue de ce terme devrait être déconseillée. De plus, comme l'absorbance est un logarithme, elle est, par définition, sans unité et a une plage de valeurs de 0 (= 100 % T) à cc (= 0 % T).

Ainsi, la variation de couleur du mélange réactionnel (ou système) avec le changement de concentration du substrat constitue la base de l'analyse colorimétrique.

La formation de couleur est due à la réaction entre les substances et les réactifs en proportion appropriée. L'intensité de la couleur observée est ensuite comparée à celle du mélange réactionnel qui contient une quantité connue de substrat. La spectrophotométrie optique est basée sur des principes identiques de colorimétrie.

Instruments de colorimétrie:

L'instrument colorimétrique est très simple, composé simplement d'une source lumineuse (lampe), d'un filtre, d'une curette et d'un détecteur photosensible pour collecter la lumière transmise. Un autre détecteur est nécessaire pour mesurer la lumière incidente ou un seul détecteur peut être utilisé pour mesurer alternativement la lumière incidente et la lumière transmise.

Cette dernière conception est à la fois moins chère et analytiquement meilleure, car elle élimine les variations entre les détecteurs. Le filtre permet ici d'obtenir une gamme appropriée de longueurs d'onde dans les bandes qu'il est capable de sélectionner.

(B) Spectrophotomètre:

C'est un instrument plus sophistiqué. Un photomètre est un appareil de mesure de la "lumière" et la "spectrométrie" implique toute la gamme de longueurs d'onde continues que la source lumineuse est capable de produire. Le détecteur du photomètre est généralement une cellule photoélectrique dans laquelle une surface sensible reçoit des photons et génère un courant proportionnel à l'intensité du faisceau lumineux atteignant la surface.

Dans les instruments de mesure de la lumière ultraviolette/visible, deux lampes sont généralement nécessaires : l'une, une lampe à filament de tungstène qui produit des longueurs d'onde dans la région visible, la seconde, une lampe à hydrogène ou au deutérium, est adaptée à l'ultraviolet.

Il existe deux types d'arrangements optiques : un type à faisceau unique ou un type à double faisceau. Ici, d'abord le blanc puis l'échantillon doivent être déplacés dans le faisceau, les ajustements effectués et les lectures prises.

Les détails de l'arrangement optique dans le spectrophotomètre sont donnés :

L'avantage majeur du spectrophotomètre, cependant, est la possibilité de balayer la gamme de longueurs d'onde sur la lumière ultraviolette et visible et d'obtenir des spectres d'absorption.

Un grand nombre de composés inorganiques et organiques ont été estimés quantitativement par l'utilisation de techniques colorimétriques ou spectrophotométriques optiques :


L'évolution du métabolisme du 2,4-dinitrotoluène déclenche une diversification indépendante du SOS des cellules hôtes

Les mécanismes moléculaires à l'origine de l'effet mutagène des espèces réactives de l'oxygène (ROS) libérées par une métabolisation défectueuse du xénobiotique 2,4-dinitrotoluène (DNT) par une voie de dégradation toujours en évolution ont été étudiés. À cette fin, les gènes nécessaires à la biodégradation du DNT de Burkholderia cepacia R34 ont été implantés dans Escherichia coli et l'effet de catabolisation du composé nitroaromatique surveillé avec des marqueurs et des rapporteurs liés au stress. Un tel proxy du scénario naturel a fidèlement recréé l'accumulation connue de ROS causée par un métabolisme défectueux du DNT et l'apparition d'un régime de mutagenèse intense. Alors que les ROS ont déclenché une réponse au stress oxydatif, ni la recombinaison homologue n'a été stimulée ni l'activité du promoteur recA n'a augmenté pendant le catabolisme du DNT. L'analyse des modifications d'un seul nucléotide se produisant dans rpoB pendant la dégradation du DNT a suggéré un relâchement de la fidélité de réplication de l'ADN plutôt que des dommages directs à l'ADN. Les fréquences des mutants ont été déterminées dans des souches défectueuses soit dans la conversion des dommages à l'ADN en mutagenèse, soit dans la médiation de l'inhibition de la réparation des mésappariements par une réponse générale au stress. Les résultats ont révélé que l'effet mutagène des ROS était largement indépendant du SOS et provenait plutôt de modifications de la fonctionnalité rpoS induites par le stress. L'évolution de nouvelles propriétés métaboliques ressemble donc à la façon dont les concentrations sublétales d'antibiotiques stimulent l'apparition de nouveaux gènes de résistance.


2 composés photoactivables et protéines optogénétiques

L'activation de la lumière dans les systèmes biologiques peut être obtenue soit par modification chimique avec des groupes photosensibles et des effecteurs chimiques (chélateurs, isomères), soit par des domaines photosensibles génétiquement codés. Cette dernière approche est appelée optogénétique. Cette section traite des deux approches en général et des propriétés des composants individuels en particulier, car celles-ci constituent la base et définissent les limites des approches d'ingénierie pour les systèmes contrôlables par la lumière. Des approches chimiques telles que les molécules photocagées ont été utilisées des décennies avant le développement des premières méthodes optogénétiques. Cependant, en raison de leur flexibilité et de leurs propriétés dynamiques uniques, les régulateurs optogénétiques ont rapidement rattrapé leur retard car ils sont très polyvalents pour une mise en œuvre dans diverses fonctions cellulaires et offrent des opportunités de contrôle spatio-temporel uniques. Les classes les plus importantes de modules de protéines sensibles à la lumière pour la biologie synthétique constituent la base de la discussion des stratégies d'ingénierie potentielles pour les régulateurs optogénétiques, et seront l'objectif principal de cette section.

2.1 Composés photoactivables

Bien avant que le terme optogénétique ne soit défini en 2006, des approches optochimiques pour mesurer et influencer les réponses biologiques avaient été développées dès les années 1960. Cette section donne un aperçu des groupes de photocage, des chélateurs photosensibles et de l'isomérisation cis-trans des azobenzènes. Ceux-ci servent d'exemples de certaines des approches biologiquement pertinentes, et cette sous-section n'est en aucun cas destinée à être exhaustive.

2.1.1 Groupes de protection photolabiles (PPG)

La plus polyvalente des trois approches est probablement l'utilisation de PPG (ou de groupes de photocaging) (Chiffre 2A). Bien qu'ils aient été utilisés de différentes manières, le principe général est que les composés photocagés contiennent un groupe photolabile, qui rend une biomolécule inactive. La lumière induit le clivage du groupe photolabile qui libère la biomolécule vers sa fonction native. [ 14 ] En 1962, Barltrop et Schofield [ 15 ] ont décrit le principe des PPG. En 1977, Engels et Schlaeger ont décrit la synthèse et la photolyse d'un AMPc en cage o-nitrobenzyle et ont testé leur activité en utilisant la protéine kinase dépendante de l'AMPc. [ 16 ] Un an plus tard, Kaplan et al. [ 17 ] a montré une libération photolytique d'« ATP en cage ». Depuis lors, le photocaging a été appliqué à de nombreuses molécules allant des protéines aux acides nucléiques en utilisant une variété de groupes photoclivables. Par exemple, la lumière peut être utilisée pour éliminer les groupes protecteurs dans la synthèse d'ADN, ou les nucléotides photoclivables marqués par fluorescence dans les approches de séquençage de nouvelle génération, telles que le séquençage par synthèse, ou le séquençage par ligature et synthèse de puces à ADN en utilisant la photolithographie et la synthèse en phase solide. [ 14, 18-20 ]

La molécule en cage varie en fonction de la fonction cellulaire qui doit être contrôlée par la lumière. Cette molécule est rendue inactive par le groupe de mise en cage qui contient un système conjugué qui peut être clivé lors d'une stimulation photonique. Deux groupes de photocage largement utilisés sont à base d'o-nitrobenzyl et de coumarine, qui, selon les substituants, peuvent présenter des maxima d'absorption du spectre UV au spectre de la lumière verte. [ 21 ] Bien que de nombreux autres groupes de mise en cage existent, plus de 80% des approches de photocage publiées incorporent un groupe nitrobenzyle, qui peut être libéré dans un mécanisme de photolyse bien caractérisé. [ 14 ] Les groupes nitrobenzyle peuvent être photoclivés en utilisant un excès de lumière UVA, même si le maximum d'absorption de la plupart des composés se situe dans la gamme UVB-UVC, car les UVA sont considérés comme beaucoup moins dommageables pour les cellules que les UVB-UVC. [ 14 ]

Alors que de nombreux produits chimiques biofonctionnels ont été mis en cage (par exemple, DOX, IPTG, arabinose, théophylline) avec des groupes photosensibles (figure 2A), la mise en cage des protéines pourrait présenter des caractéristiques avantageuses : 1) l'activité des fonctions cellulaires est précisément ciblée par les acteurs clés des protéines 2 ) seules de faibles concentrations par rapport aux produits chimiques photocagés pourraient éviter des problèmes avec les sous-produits de la photolyse. Cependant, il faut considérer que l'absorption des tryptophanes pourrait aider au transfert d'énergie et à la libération des cages, et pourrait également éteindre la photolyse. De plus, le pH et la constante diélectrique locale jouent un rôle important dans les propriétés d'absorption à l'état fondamental d'un groupe photolabile, et il faut tenir compte du fait que, par exemple, le « pKa apparent » d'un groupe peut être différent dans le site actif de une enzyme par rapport à d'autres environnements. Une autre difficulté peut être la taille, la structure et la complexité des protéines, car les groupes photoréactifs doivent également être libérés après déverrouillage d'un site actif. [ 14 ] Dans l'ensemble, les avantages des protéines photocagées s'accompagnent d'une complexité accrue dans leur synthèse.

Des groupes photosensibles peuvent être introduits dans les protéines in vitro, par exemple par modification aléatoire avec le chlorure d'oxycarbonyle de 1-(2-nitrophényl)éthanol. Le PPG réagit principalement avec les résidus de lysine, qui ont été utilisés pour créer des anticorps activables par la lumière. [ 22 ] Une autre stratégie cible les résidus de cystéine car leurs groupes nucléophiles permettent une modification sélective par un réactif de mise en cage électrophile. [ 14 ]

Ces stratégies et d'autres pour la synthèse in vitro de protéines photoactivables peuvent être utilisées dans des systèmes extracellulaires ou doivent être introduites dans la cellule à l'aide de techniques telles que la microinjection, qui peuvent être prohibitives pour de nombreuses études et applications. Par conséquent, la synthèse in vivo de protéines photoactivables peut être habilitante. Une approche intéressante consiste à étendre le code génétique grâce à l'utilisation de paires ARNt/aminoacyl-ARNt synthétase, permettant d'inclure des acides aminés avec des groupes photosensibles tels que la tyrosine en cage o-nitrobenzyl sur les sites ambre. Ces acides aminés en cage peuvent être situés sur des sites fonctionnels de protéines tels que le site actif d'une enzyme ou le site de liaison d'une protéine. [ 23-25 ​​]

2.1.2 Chélateurs photosensibles

Une approche différente exploite les chélateurs pour le contrôle de la lumière des cellules en influençant la concentration intracellulaire des ions métalliques libres, qui remplissent de nombreuses fonctions et sont des cofacteurs importants pour les enzymes. Cette approche a été très efficace pour les tampons et les indicateurs optiques pour le Ca 2+ , qui ont été synthétisés à base de BAPTA (acide 1,2-bis(o-aminophénoxy)éthane-A,M-A/A'-tétraacétique). [ 26 ] Cela a permis aux expérimentateurs de mesurer de manière non destructive les niveaux de Ca 2+ intracellulaires grâce à des changements dans le spectre d'absorption du chélateur lié au Ca 2+ non lié (figure 2B). [ 26 ] Les ions Ca 2+ ont été d'un grand intérêt pour les études biologiques et biomédicales, car c'est un composant important de la signalisation cellulaire, et les changements de concentration sont impliqués dans divers effets tels que l'activité neuronale, la motilité cellulaire, la contraction musculaire, l'apoptose ou la transcription . [ 27 ] Bien qu'être capable de mesurer les concentrations intracellulaires de Ca 2+ ait été utilisé efficacement pour obtenir des informations biologiques, le contrôle des concentrations intracellulaires était hautement souhaitable pour les études de perturbation. On s'est rendu compte plus tard que non seulement les concentrations pouvaient être mesurées, mais que l'affinité des chélateurs Ca 2+ change également avec la lumière. [ 28, 29 ] Molécules chélatrices, telles que BAPTA, EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) ou EGTA (éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N′,Nacide ′-tétraacétique) forment une « cavité » par la disposition stérique des groupes carboxylates. [ 30 ] La lumière UV est absorbée (maximum à 350 nm) par le composé en cage et peut conduire à la photolyse du chélateur en produits qui présentent une affinité inférieure pour le Ca 2+. Des chélateurs pour d'autres ions métalliques divalents ont également été développés. [ 31 ]

2.1.3 Cis–Trans Isomérisation de l'Azobenzène

Cis–trans l'isomérisation de l'azobenzène en réponse à la lumière a été décrite par Hartley en 1937. [ 32 ] Ce changement induit par la lumière dans la structure du produit chimique a ensuite été exploité pour mettre en œuvre le contrôle de la lumière. Il a été montré que les réactions avant et arrière sont activées par la lumière et que la réaction thermique est lente. Alors que la configuration trans, qui est produite par une lumière de 410 à 450 nm, est plane, les anneaux de benzène dans le cis configuration sont asymétriques à 53°, ce qui peut être déclenché avec une lumière de 300 à 350 nm. [ 29 ] Bien que la découverte de ce phénomène remonte à plus de 80 ans, le mécanisme sous-jacent de photochimie et d'isomérisation est toujours à l'étude, avec quatre mécanismes proposés : rotation, inversion, inversion concertée et rotation assistée par inversion. [ 33 ] L'isomérisation peut être répétée de nombreuses fois, car l'azobenzène présente une photostabilité élevée, ce qui le rend intéressant pour la photocommutation répétée en contrôle dynamique. Le changement de géométrie peut être utilisé pour moduler l'accessibilité ou l'activité des biomolécules. Par exemple, il a été démontré qu'un peptide de 16 acides aminés attaché à un azobenzène peut basculer entre une structure plus hélicoïdale dans le trans, et un contenu hélicoïdal réduit dans le cis configuration (figure 2C). [ 34 ] L'azobenzène captif a également été utilisé pour bloquer et libérer de manière contrôlée le pore d'un canal K +. Lumière avec une longueur d'onde de 380 nm, qui crée le cis isomère, raccourcit l'azobenzène et débloque le pore, ce qui permet aux ions K + de passer le canal, tandis que la lumière à 500 nm crée l'isomère trans qui bloque le pore. [ 35 ]

2.2 Protéines photoactivables

Comme les composés photocagés présentent une réversibilité et un contrôle spatial limités une fois leur groupe protecteur libéré, et comme les chélateurs photosensibles et les azobenzènes ne peuvent être appliqués que dans des cas spécifiques, de nouvelles façons de contrôler la lumière et les implémentations génétiques nécessaires pour y parvenir ont été explorées. Les protéines ou domaines photoactivables sont des composants essentiels pour l'ingénierie des protéines optogénétiques. Tous les domaines photoactivables utilisés à ce jour en biologie synthétique sont dérivés de photorécepteurs naturels.Tout comme dans d'autres protéines de signalisation sensorielle, la modularité [ 36 ] est également courante dans les photocapteurs. En général, les domaines ou motifs de détection d'entrée sont physiquement et fonctionnellement séparables de l'activité catalytique ou des domaines de sortie. [ 36 ] Cette caractéristique de modularité des domaines photosensoriels, qui permet l'évolution par recombinaison, suppression ou insertion dans le contexte naturel, est également une caractéristique habilitante pour la bio-ingénierie de nouveaux régulateurs inductibles par la lumière. En effet, de telles parties ou modules biologiques avec des fonctionnalités définies sont la base fondamentale des approches de biologie synthétique. Grâce à la reconception, à la combinaison avec d'autres modules et à l'ingénierie des pièces elles-mêmes, de nouvelles fonctions peuvent être créées dans les organismes. [ 37 ] Une condition préalable à l'utilisation des modules est leur caractérisation fonctionnelle, idéalement avec une compréhension du mécanisme, de la base structurelle sous-jacente et des exigences minimales pour que les modules individuels fonctionnent (par exemple, la disponibilité d'un cofacteur ou d'un chromophore spécifique). Comme la compréhension des propriétés des photodomaines est essentielle pour le développement de protéines optogénétiques fonctionnelles, ces propriétés sont discutées dans la section suivante.

La famille de protéines photoactivables la plus largement utilisée en biologie et en médecine est celle des protéines transmembranaires photosensibles. Ces protéines contiennent le chromophore rétinien, ou un variant, qui en réponse à la lumière s'isomérise entre un 11- ou 13-cis et tout-trans rétinienne. L'isomérisation du chromophore se traduit par un changement structurel de l'apoprotéine. Selon leur origine, ces opsines sont divisées en opsines microbiennes (Type I) et animales (Type II). La fonction naturelle de ces protéines va de la vision chez les animaux, la régulation osmotique chez les halobactéries, au photopériodisme chez les plantes et les animaux. Bien que les opsines aient été largement utilisées en neurobiologie et en médecine régénérative pour le contrôle de la lumière des flux ioniques et la signalisation cellulaire, d'autres protéines photoactivables non opsines jettent les bases de la plupart des stratégies d'ingénierie des protéines en optogénétique. [ 38 ] Par conséquent, nous présentons un aperçu des protéines photoactivables non opsine de la nature, qui ont été adoptées pour des approches biologiques synthétiques.

2.3 Chromophore et photocycle

Les protéines photoactivables absorbent la lumière de longueurs d'onde spécifiques à travers un chromophore ou un cofacteur organique qui contient un système d'électrons π conjugué. [ 39 ] Les chromophores sont des molécules ou des fragments chimiques qui absorbent la lumière dans le spectre UV-vis. [ 40 ] La lumière absorbée conduit à des sauts d'électrons d'une orbitale moléculaire d'énergie inférieure à une énergie plus élevée, ce qui, dans les molécules à double liaison, provoque des transitions π–π *. Les systèmes π conjugués avec des électrons conjugués présentent un écart énergétique π–π * inférieur à celui des doubles liaisons simples et absorbent donc des longueurs d'onde plus longues et favorisent l'absorption de la lumière. [ 40 ] Cette excitation du chromophore conduit à son tour à un changement structurel du chromophore (par exemple, cis–trans isomérisation) et/ou ses interactions avec l'apoprotéine, ce qui entraîne des changements dans la structure de la protéine d'un état activé sombre à un état activé par la lumière dans un processus appelé « photocycle ». Ce photocycle est fermé une fois que la protéine photoactivable activée revient à l'état sombre. Cette réversion à l'état sombre est thermiquement entraînée, et son échelle de temps peut aller de quelques millisecondes à quelques heures, selon le photorécepteur.

2.4 Classification des photocapteurs

Aux fins de la biologie synthétique, nous adoptons une classification intuitive des protéines photoactivables qui est basée sur le chromophore incorporé de la protéine ou la structure du domaine photosensible, qui détermine également en partie la gamme des pics de longueur d'onde d'activation/inactivation. En conséquence, quatre classes de protéines photoactivables sont décrites dans cette sous-section : 1) l'activation par la lumière via un trypropane intrinsèque 2) les chromophores à base de flavine, 3) la cobalamine ou 4) les tétrapyrroles (Chiffre 3). Les protéines fluorescentes telles que PhoCl, PYP ou Dronpa, qui ont également été utilisées pour mettre en œuvre le contrôle de la lumière, ne sont pas discutées plus avant. Nous nous concentrerons sur les changements structurels induits par l'activation de la lumière dans le photorécepteur, car c'est la base de leur utilisation dans les approches d'ingénierie des protéines.

2.4.1 UVR8 régulé par tryptophane intrinsèque : récepteur UV

Cette classe de photorécepteurs utilise des tryptophanes intrinsèques pour l'absorption de la lumière, avec UVR8 comme exemple marquant. Le photorégulateur UVR8 a été découvert en Arabidopsis thaliana comme mécanisme pour optimiser la croissance et la survie en présence d'UV-B. [ 41 ] UVR8 se présente sous forme d'homodimère à l'état sombre. [ 41 ] La lumière UV-B est absorbée par les résidus d'acides aminés du tryptophane (W233, W285 et W337), ce qui conduit à la monomérisation d'UVR8, et à son tour permet l'hétérodimérisation avec le partenaire de liaison UVR8 COP1. [ 41 ] W233 et W285, qui agissent comme chromophore UV-B, montrent des interactions cation-π avec R286 et R338 et stabilisent la structure de la protéine. L'excitation des anneaux indoliques du tryptophane par la lumière UV-B perturbe ces interactions, ce qui conduit à la libération de liaisons hydrogène intermoléculaires médiées par l'arginine entre les homodimères et la monomérisation UVR8. [ 42 ] Le photocycle est fermé car les anneaux d'indole dissipent de l'énergie et retournent à leur état fondamental au fil du temps, conduisant à l'homodimérisation de l'UVR8. [ 42 ]

2.4.2 Cryptochromes à base de Flavine, domaines BLUF et LOV : récepteurs de lumière bleue

Les domaines cryptochromes, LOV et BLUF contiennent un chromophore de la flavine, soit le mononucléotide de la flavine (FMN) soit la flavine adénine dinucléotide (FAD), qui peut être lié de manière covalente ou non covalente à l'apoprotéine. [ 43 ] FMN et FAD sont présents dans la plupart des organismes. Flavin présente une absorption maximale dans la plage de la lumière bleue, ce qui provoque une réduction photochimique de la forme oxydée en une semiquinone ou une forme entièrement réduite. [ 44, 45 ] Le système de cycle isoalloxazine permet un ou deux processus de transfert d'électrons. [ 43 ] Une excitation multiphotonique avec une lumière proche infrarouge a également été montrée, permettant une activation 3D de systèmes à base de flavine et une pénétration profonde des tissus. [ 46-48 ]

Les cryptochromes CRY1 et CRY2 hautement conservés sur le plan de l'évolution appartiennent à la famille des flavoprotéines qui existent dans tous les règnes de la vie, où elles sont impliquées dans les réponses développementales et circadiennes. [ 49 ] Les cryptochromes ont évolué à partir de photolyases et contiennent un N-domaine d'homologie de photolyase terminale (PHR), qui se lie à FAD en tant que chromophore. [ 49 ] Dans un mécanisme d'activation de la lumière proposé dans le cryptochrome végétal, le FAD oxydé à l'état sombre est réduit en une semiquinone neutre par la lumière, ce qui induit une charge négative au voisinage de la flavine. Cela pourrait conduire à la libération d'ATP de sa poche de liaison et au dépliement ultérieur de l'extrémité C de la protéine. Grâce au changement de conformation et à la libération de l'extrémité C-terminale, les résidus d'acides aminés sont accessibles pour la phosphorylation, ce qui permet ensuite la liaison d'autres protéines. [ 50 ] Un cryptochrome largement utilisé est CRY2 de Arabidopsis thaliana (ÀCRY2). CRY2 est monomère à l'état sombre et oligomérise lors de l'activation de la lumière bleue. [ 51 ] À l'état photoexcité, il peut également former un hétérodimère avec la protéine basique-hélice-boucle-hélice (CIB1) interagissant avec le cryptochrome. [ 52 ] La demi-vie de cette interaction est de l'ordre de la minute, et elle peut être réglée par des mutations modulantes dans le domaine PHR. [ 53 ]

La deuxième classe de capteurs qui absorbent la lumière bleue à l'aide de FAD (domaine BLUF) a été découverte en Rhodobacter sphaeroides [ 54, 55 ] et Euglena gracilis, [ 56 ] où ils aident à l'adaptation de la synthèse du photosystème en fonction des conditions d'oxygène et de lumière. [ 57 ] Bien que les structures protéiques des protéines contenant le domaine BLUF aient été résolues, le mécanisme de la photo-activation est toujours en débat. [ 57, 58 ] Grâce à la lumière bleue, un électron puis un proton sont transférés d'une tyrosine conservée à la flavine, ce qui conduit à la formation de radicaux flavine et tyrosine. [ 48, 59 ] Le bi-radical pourrait alors induire un réarrangement de la liaison hydrogène dans la poche de liaison de la flavine. [ 57 ] PixD est un exemple de domaine BLUF pentamérique qui, avec PixE, forme des agrégats de grande masse moléculaire de deux sous-unités pentamériques PixD et 5 PixE. [ 60 ] Grâce à l'illumination, ce complexe peut être déstabilisé, ce qui donne des PixE monomériques et deux PixD pentamériques. [ 60 ]

Une autre classe largement utilisée de protéines sensibles à la lumière bleue est constituée par les domaines de tension et d'oxygène de la lumière (LOV) liant le mononucléotide de la flavine (FMN). Contrairement aux cryptochromes, où la lumière provoque des changements électrostatiques dans l'apoprotéine et des changements de conformation ultérieurs, le FMN C(4a) dans les domaines LOV forme généralement un adduit covalent avec une cystéine conservée adjacente, qui à son tour provoque également des changements de conformation dans le Per-ARNT -Sim (protéine d'horloge de période, translocateur nucléaire de récepteur d'hydrocarbure aromatique et PAS court à un seul esprit). [ 61-63 ] Outre FMN, FAD fonctionne également comme un chromophore dans les domaines LOV, comme par exemple dans le photorégulateur Vivid. [ 64 ] Les domaines PAS se trouvent dans tous les règnes de la vie et agissent généralement comme des capteurs et des transducteurs moléculaires. [ 65, 66 ] Les changements structurels générés par la formation de cystéinyl-(C4a) se propagent aux domaines effecteurs N- ou C-terminalement attachés via des lieurs amphipathiques -hélicoïdaux et enroulés. Ce changement de conformation peut initier divers mécanismes tels que la dimérisation des domaines LOV dans Vivid, [ 62, 64, 67 ] le déploiement et le déplacement d'une hélice Jα dans le cas de CommeLOV2, [ 66 ] ou le réarrangement et la libération d'un domaine hélice-tour-hélice (HTH) pour EL222 [ 68 ] à partir de leur noyau LOV respectif. Sur la base de ces caractéristiques, les domaines LOV1 impliquent généralement un noyau PAS dans certains cas avec une coiffe N-terminale supplémentaire (NCap) à travers laquelle les protéines s'associent. [ 69-71 ] Les domaines LOV2, d'autre part, contiennent une hélice Jα C-terminale qui se déplace après stimulation lumineuse. [72, 73]

2.4.3 Domaines de liaison à base de cobalamine : récepteurs de lumière verte

Les domaines de liaison à la cobalamine (CBD) sont des photorécepteurs de lumière verte qui utilisent la cobalamine comme chromophore pour la photodétection. Les CBD se sont avérés jouer un rôle photoprotecteur dans diverses bactéries [74-76] et ont été identifiés grâce à leur rôle dans la synthèse de caroténoïdes dépendante de la lumière qui éteint les espèces réactives de l'oxygène (ROS). [ 77-79 ] L'un des CBD utilisés jusqu'à présent en biologie synthétique est CarH. Le dimère du photorécepteur CarH se lie à la 5′désoxyadénosylcobalamine (AdoCbl) en tant que chromophore pour former un tétramère. L'AdoCbl et la méthylcobalamine (MeCbl) sont les deux principales formes biologiques de la vitamine B12 qui sont produits par des micro-organismes. [ 80 ] Les cellules de mammifères sont capables d'importer de l'AdoCbl et de sa conversion à partir de la vitamine B12. [ 81, 82 ] AdoCbl et MeCbl diffèrent par le groupe 5′désoxyadénosyle et méthyle qui est lié de manière covalente au cobalt, qui dans les deux cas a de faibles énergies de dissociation de liaison. Les faibles énergies de dissociation permettent le clivage des groupes 5'désoxyadénosyle ou méthyle respectifs avec des longueurs d'onde allant de la lumière proche UV jusqu'à des longueurs d'onde de 530 nm dans le spectre de la lumière verte. [ 80 ] Dans le cas de CarH, les protéines forment des tétramères tête-bêche en tant que dimère de dimères en présence d'AdoCbl qui implique de nombreuses liaisons hydrogène de l'apoprotéine avec des liaisons cobalamine et hydrogène et des interactions ioniques avec le 5' groupe désoxyadénosyle. [ 83 ] L'exposition à la lumière déclenche la dissociation du groupe 5'désoxyadénosyle, ce qui conduit à une réorientation du faisceau à quatre hélices de la protéine perturbant l'interface tête-à-queue, entraînant la monomérisation de CarH. [ 83 ] Puisque la cobalamine forme un adduit covalent avec CarH par ligature bis-His, cette réaction est irréversible, et la cobalamine photolysée ne peut pas être échangée avec l'AdoCbl photosensible. [ 83 ] Cela limite l'applicabilité de CarH pour un contrôle optogénétique dynamique rapide.

2.4.4 Phytochromes à base de tétrapyrrole : des récepteurs UV aux récepteurs du rouge lointain

Outre les photorécepteurs à base de flavine, les phytochromes sont la deuxième classe largement utilisée de domaines inductibles par la lumière qui ont été utilisés dans les premiers régulateurs optogénétiques dans les cellules eucaryotes [ 2 ] et bactériennes [ 84 ]. Les phytochromes (Phy) ont été découverts grâce à leur rôle dans la promotion du développement des plantes telles que la germination et la floraison en réponse à la lumière rouge. [ 85-87 ] Cependant, les phytochromes ne sont pas seulement présents dans les plantes, mais aussi dans les bactéries [ 88, 89 ] (BphP) et les champignons [ 90 ] (Fph). Les phytochromes sont classés en fonction de leur longueur d'onde de lumière d'activation au type I, qui est activé par la lumière rouge lointaine (pic d'absorption à 730 nm), et au type II, qui est activé par la lumière rouge (pic d'absorption à 660 nm). Les deux types diffèrent donc par leurs états fondamentaux thermiques et peuvent basculer de manière réversible entre un état absorbant le rouge (Pr) et un état absorbant le rouge lointain (Pfr). Cependant, les phytochromes d'algues [ 91 ] et les cyanobactériochromes [ 92 ] ont été décrits et montrés pour couvrir tout le spectre visible et même atteindre la gamme UV. Par exemple, des phytochromes avec des longueurs d'onde d'activation bleu(Pb)–vert(Pg) [ 93 ] et vert(Pg)–rouge(Pr) [ 94 ] ont été découverts. Même s'ils absorbent une large gamme de longueurs d'onde, tous les phytochromes utilisent un chromophore tétrapyrrole, soit sous forme réduite comme la phycocyanobiline (c. [ 95 ] La biliverdine (BV), le chromophore de la BphP et de la Fph, est synthétisée à partir de l'hème en une seule étape via l'hème oxygénase HO1. Dans les cyanobactéries et les algues vertes, la VB est encore réduite en phycocyanobiline (PCB) par une réductase de biline PcyA dépendante de la ferredoxine. Chez les plantes cependant, une enzyme de la même famille appelée HY2 réduit la BV en phytochromobiline (PΦB). [ 95-97 ] Les différentes bilins sont liées dans un domaine GAF, qui est hautement conservé. Les phytochromes typiques présentent une structure de module photosensoriel de domaine PAS-GAF-PHY, bien que des variations dans cette structure existent. [ 95 ] Dans un mécanisme de photoactivation suggéré, la lumière induit une isomérisation Z-E dans la double liaison C15-C16 du tétrapyrrole, [ 98 ] induisant une rotation sur l'anneau D de la molécule, qui à son tour génère un réarrangement de la liaisons hydrogène du domaine GAF qui se propagent vers le domaine PHY. [ 95, 99 ] Ces changements structurels peuvent avoir des effets divers dans différents phytochromes et, par exemple, permettre l'hétérodimérisation de PhyB induite par la lumière avec le facteur d'interaction phytochrome (PIF3), ou l'homodimérisation dans le cas du phytochrome cyanobactérien Cph1. [ 88 ] En outre, les phytochromes ne reposent pas uniquement sur la réversion de l'état sombre au fil du temps par dissipation d'énergie, mais ils peuvent être induits spécifiquement en désactivant la lumière à une longueur d'onde différente de la longueur d'onde d'induction (par exemple, la lumière rouge lointaine pour PhyB [ 100 ] ou Cph1 [ 88 ] ). Cela donne aux phytochromes une résolution temporelle supérieure.


Résumé

NLa -ε-Carboxyméthyllysine (CML) se forme lors des réactions de glycation (synonyme, réaction de Maillard). La LMC est dégradée par le microbiote colique humain, mais on ne sait rien sur la formation de métabolites particuliers. Dans la présente étude, six probiotiques E. coli les souches ont été incubées avec CML en présence ou en l'absence d'oxygène dans un milieu minimal ou riche en nutriments. La LMC n'a été dégradée par toutes les souches qu'en présence d'oxygène. La HPLC-MS/MS a été appliquée pour l'identification des métabolites de la LMC. Pour la première fois, trois métabolites bactériens de la LMC ont été identifiés, à savoir N-carboxyméthylcadavérine (CM-CAD), N-acide carboxyméthylaminopentanoïque (CM-APA), et le Nl'ion -carboxyméthyl-Δ 1 -pipéridéinium. Pendant 48 h d'incubation de la LMC avec cinq E. coli souches en milieu minimal en présence d'oxygène, 37 à 66 % de la LMC ont été dégradés, tandis que CM-CAD (1,5 à 8,4 % de la dose initiale de LMC) et CM-APA (0,04 à 0,11 % de la dose initiale de LMC) ont été formé linéairement. La formation des métabolites est renforcée lorsque la CML liée au dipeptide est appliquée, ce qui indique que les phénomènes de transport peuvent jouer un rôle important dans la « manipulation » du composé par les micro-organismes.


Laboratoire 12 : Isolement et identification des entérobactéries et des Pseudomonas, partie 1

Les laboratoires 12 et 13 traitent des cas opportunistes et pathogènes bacilles à Gram négatif fermentescibles appartenant à la famille bactérienne Entérobactéries, ainsi que les bacilles à Gram négatif non fermentaires tels que Pseudomonas et Acinetobacter.

UNE. ENTEROBACTERIACEAE: LE BACILLI FERMENTATIF, GRAM-NÉGATIF, ENTÉRIQUE

Bactéries appartenant à la famille Entérobactéries sont les organismes les plus couramment rencontrés isolés à partir d'échantillons cliniques. Les Entérobactéries est une grande famille diversifiée de bactéries appartenant à l'ordre Entérobactéries dans la classe Gammaprotéobactérie du phylum Protéobactérie. Les membres médicalement importants de cette famille sont communément appelés bacilles entériques fermentatifs, Gram-négatifs, parce qu'ils sont Bâtonnets à Gram négatif qui peut fermenter les sucres. Beaucoup sont la flore normale du tractus intestinal des humains et des animaux tandis que d'autres infectent le tractus intestinal. Les membres de cette famille ont en commun les caractéristiques suivantes :

1. Ils sont Bâtonnets à Gram négatif (voir fig. 1)
2. S'ils sont mobiles, ils possèdent un arrangement péritriche de flagelles (voir fig. 2)
3. Ils sont anaérobies facultatives
4. À quelques exceptions près, ils sont oxydase négative
5. Toutes les espèces fermenter le sucre glucose mais par ailleurs varient considérablement dans leurs caractéristiques biochimiques
6. La plupart réduire les nitrates en nitrites.

Pour plus d'informations sur la paroi cellulaire à Gram négatif, consultez l'objet d'apprentissage suivant dans votre guide de cours :

Au moins quarante-quatre genres et plus de 130 espèces de Entérobactéries ont été reconnus. Certains des genres de la famille les plus importants sur le plan clinique Entérobactéries comprendre:

Salmonelle Citrobacter Morganelle
Shigella Enterobacter Yersinia
Protée Serratia Edwardsiella
Escherichia Klebsiella Providence

Plusieurs genres de Entérobactéries sont associés avec gastro-entérite et les maladies d'origine alimentaire. Ceux-ci inclus:

  • Salmonelle,
  • Shigella,
  • certaines souches de Escherichia coli, et
  • certaines espèces de Yersinia.

Toutes les infections intestinales sont transmis par voie fécale-orale.

Il existe deux espèces de Salmonelle, Salmonella enterica et Salmonelle bongori. Toute infection causée par Salmonelle s'appelle un salmonellose. Non typhoïde Salmonelle représente environ 520 cas pour 100 000 habitants (environ 1 600 000 cas) par an aux États-Unis et au moins 500 meurent. Étant donné que de nombreux animaux différents portent Salmonelle dans leur tractus intestinal, les personnes sont généralement infectées en ingérant de la volaille, des œufs, de la viande, des produits laitiers, des légumes ou des fruits mal réfrigérés, non cuits ou insuffisamment cuits contaminé par des excréments d'animaux.

L'entérite est la forme la plus courante de salmonellose. Les symptômes apparaissent généralement 6 à 48 heures après l'ingestion de la bactérie et comprennent vomissements, nausées, diarrhée non sanglante, fièvre, crampes abdominales, myalgies et maux de tête. Les symptômes durent généralement de 2 jours à 1 semaine suivis d'une récupération spontanée. Toutes les espèces de Salmonelle peut causer bactériémie mais S. enterica Le sérotype Typhi, isolé uniquement chez l'homme, se dissémine fréquemment dans le sang provoquant une forme sévère de salmonellose appelée fièvre typhoïde. Environ 400 cas de fièvre typhoïde surviennent chaque année aux États-Unis, mais environ 75 % d'entre eux sont contractés lors de voyages à l'étranger.

Salmonelle le sérotypage est une méthode d'identification de sous-typage basée sur l'identification d'antigènes distincts de la paroi cellulaire, flagellaires et capsulaires avec un antisérum connu, comme cela sera discuté dans le laboratoire 17. Salmonelle les sérotypes Enteritidis et Typhimurium sont les deux sérotypes les plus courants aux États-Unis, représentant environ 35 à 40 % de toutes les infections confirmées par culture de laboratoire. Comme mentionné ci-dessus, S. enterica Le sérotype Typhi est responsable de la fièvre typhoïde.

Tout Shigella l'infection est appelée une shigellose. contrairement à Salmonelle, qui peut infecter de nombreux animaux différents, Shigella n'infecte que les humains et autres primates supérieurs. Il y a environ 14 000 cas de laboratoire de shigellose par an signalés aux États-Unis avec un total estimé de 450 000 cas et 70 décès.

Shigellose fréquemment commence par une diarrhée aqueuse, de la fièvre et des crampes abdominales mais peut évoluer vers la dysenterie avec des selles peu abondantes contenant du sang, du pus et du mucus. La période d'incubation est de 1 à 3 jours. La diarrhée aqueuse abondante initiale apparaît généralement d'abord à la suite d'une entérotoxine. En 1 à 2 jours, cela évolue vers des crampes abdominales, avec ou sans selles sanglantes. La shigellose classique se présente sous la forme de crampes abdominales basses et de selles abondantes de sang et de pus se Shigella envahir la muqueuse du côlon.

Escherichia coli est l'une des flores normales dominantes du tractus intestinal des humains et des animaux. Certaines souches, cependant, peut causer des infections des intestins tandis que d'autres sont capables de provoquer des infections en dehors des intestins. Pathogène extra-intestinal E. coli provoquent des infections opportunistes telles que les infections des voies urinaires, les infections des plaies et la septicémie et seront discutées plus en détail ci-dessous. Intestinal ou diarrhéique E. coli provoquer des infections du tractus intestinal. Diarrhéique E. coli comprendre:

  • Entérotoxinogène E. coli (ETEC) produisent des entérotoxines qui provoquent la perte d'ions sodium et d'eau de l'intestin grêle, ce qui entraîne une diarrhée aqueuse. C'est une cause importante de diarrhée dans les pays pauvres. Plus de la moitié de toutes les diarrhées des voyageurs sont dues à ETEC, près de 80 000 cas par an aux États-Unis.
  • Entéropathogène E. coli (EPEC) provoque une diarrhée endémique dans les pays pauvres, en particulier chez les nourrissons de moins de 6 mois. La bactérie perturbe les microvillosités normales sur les cellules épithéliales de l'intestin grêle, entraînant une maladsorption et une diarrhée. Ils ne produisent pas d'entérotoxine ou de toxine shiga et ne sont pas invasifs. C'est rare dans les pays industrialisés.
  • Entéroagrégatif E. coli (EAEC) est une cause de diarrhée endémique chez les enfants des pays pauvres et des pays industrialisés. Il est également responsable d'une diarrhée persistante chez les personnes infectées par le VIH. Il provoque probablement la diarrhée en adhérant aux cellules épithéliales muqueuses de l'intestin grêle et en interférant avec leur fonction.
  • Enteroinvasive E. coli (EIEC) envahissent et tuent les cellules épithéliales du côlon provoquant généralement une diarrhée aqueuse mais évoluant parfois vers un syndrome de type dysenterie avec du sang dans les selles. Elle survient principalement dans les pays pauvres et est rare dans les pays industrialisés.
  • Entérohémorragique E. coli (EHEC), tel que E. coli 0157:H7, produisent une toxine shiga qui tue les cellules épithéliales du côlon provoquant une colite hémorragique, une diarrhée sanglante. Dans de rares cas, la toxine shiga pénètre dans le sang et est transportée vers les reins où, généralement chez les enfants, elle endommage les cellules vasculaires et provoque un syndrome hémolytique et urémique. E. coli 0157:H7 causerait plus de 20 000 infections et jusqu'à 250 décès par an aux États-Unis.

Plusieurs espèces de Yersinia, tel que Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis sont aussi des causes de maladie diarrhéique.

De nombreux autres genres de la famille Entérobactéries sommes microbiote normal du tractus intestinal et sont considérés pathogènes opportunistes. Les genres les plus courants de Entérobactéries provoquant des infections opportunistes chez l'homme sont:

  • Escherichia coli,
  • Protée,
  • Enterobacter,
  • Klebsiella,
  • Citrobacter, et
  • Serratia.

Ils agissent comme pathogènes opportunistes quand ils sont introduits dans des endroits du corps où ils ne se trouvent normalement pas, en particulier si l'hôte est affaibli ou immunodéprimé. Ils provoquent tous les mêmes types de infections opportunistes, à savoir :

  • infections des voies urinaires,
  • infections des plaies,
  • pneumonie, et
  • septicémie.

Ces bacilles à flore normale à Gram négatif, ainsi que des bactéries à Gram positif telles que Entérocoque espèces (voir Lab 14) et Staphylocoque espèces (voir Lab 15), sont parmi les causes les plus fréquentes de infections nosocomiales (anciennement appelé infections nosocomiales).

Selon le site Web des Centres de contrôle et de prévention des maladies (CDC) sur les infections associées aux soins de santé, "Dans les hôpitaux américains seuls, les infections nosocomiales représentent environ 1,7 million d'infections et 99 000 décès associés chaque année. Parmi ces infections :

  • 32 pour cent de toutes les infections nosocomiales sont des infections des voies urinaires (IVU)
  • 22% sont des infections du site opératoire
  • 15 pour cent sont des pneumonies (infections pulmonaires)
  • 14% sont des infections sanguines"

La plupart des patients qui ont des infections nosocomiales sont prédisposés à l'infection en raison des mesures de soutien invasives telles que les cathéters urinaires, les cathéters intravasculaires et l'intubation endotrachéale.

De loin, la bactérie à Gram négatif la plus fréquente à l'origine d'infections nosocomiales est Escherichia coli. E. coli provoque entre 70 et 90 % des infections des voies urinaires supérieures et inférieures (IVU). C'est aussi une cause fréquente de infections des plaies abdominales et septicémie. Selon l'établissement, E. coli est responsable de 12 à 50 % de toutes les infections nosocomiales.

Cependant, selon une étude de 2008, Entérobactéries autre que E. coli étaient responsables de 7 des 10 organismes Gram-négatifs les plus courants isolés des infections des voies urinaires, des voies respiratoires et de la circulation sanguine chez les patients des unités de soins intensifs entre 2002 et 2008 aux États-Unis. Ceux-ci inclus Klebsiella pneumoniae (15%), Enterobacter cloacae (9%), Serratia marcescens (6%), Enterobacter aerogenes (4%), Proteus mirabilis (4%), Klebsiella oxytoca (3 %), et Citrobacter freundii (2%). En outre, le Réseau national de sécurité des soins de santé a signalé K. pneumoniae (6%) , Enterobacter spp. (5%) et K. oxytoca (2 %) parmi les 10 infections nosocomiales les plus fréquemment isolées entre 2006 et 2007.

1. Infections des voies urinaires

L'infection la plus courante causée par les opportunistes Entérobactéries est un infection des voies urinaires (IVU). Les infections urinaires représentent plus de 8 000 000 visites de cabinets médicaux par an aux États-Unis et jusqu'à 100 000 hospitalisations. Parmi la population non hospitalisée et non affaiblie, les infections urinaires sont plus fréquentes chez les femmes en raison de leur urètre plus court et de la proximité plus étroite entre leur anus et l'ouverture urétrale. (Plus de 20 pour cent des femmes ont des infections urinaires récurrentes.) Cependant, n'importe qui peut devenir sensible aux infections urinaires en présence de facteurs prédisposants qui provoquent des anomalies fonctionnelles et structurelles des voies urinaires. Ces anomalies augmentent le volume d'urine résiduelle et interfèrent avec l'élimination normale des bactéries par la miction. Ces facteurs comprennent l'élargissement de la prostate, l'affaissement de l'utérus, l'expansion de l'utérus pendant la grossesse, la paraplégie, le spina bifida, la formation de tissu cicatriciel et le cathétérisme. Entre 35 et 40 pour cent de toutes les infections nosocomiales, environ 900 000 par an aux États-Unis, sont des infections urinaires et sont généralement associées à un cathétérisme.

E. coli et Staphylococcus saprophyticus (un staphylocoque à Gram positif qui sera discuté dans le laboratoire 15) causent environ 90 % de toutes les infections urinaires non compliquées. La plupart des infections urinaires non compliquées restantes sont causées par d'autres entériques à Gram négatif tels que Proteus mirabilis et Klebsiella pneumoniae ou par Entérocoque fécales (un streptocoque à Gram positif qui sera discuté dans le laboratoire 14). E. coli est responsable de plus de 50 % des infections urinaires associées aux soins de santé. Les autres causes d'infections urinaires nosocomiales comprennent d'autres espèces de Entérobactéries (tel que Protée, Enterobacter, et Klebsiella), Pseudomonas aeruginosa (discuté ci-dessous), Entérocoque espèces (discutées au labo 14) , Staphylococcus saprophyticus (discuté dans Lab 15), et la levure Candidose (discuté dans le laboratoire 9).

La norme de culture de laboratoire traditionnelle pour une infection urinaire a été la présence de plus de 100 000 UFC (unités formant des colonies, voir Lab 4) par millilitre (ml) d'urine médiane, ou de toute UFC à partir d'un échantillon d'urine obtenu par cathéter. Plus récemment, cela a été modifié et des dénombrements d'aussi peu que 1000 colonies d'un seul type par ml ou aussi peu que 100 coliformes par ml sont maintenant considérés comme indiquant une infection urinaire.

2. Infections des plaies

Infections des plaies sont dues à la contamination fécale de plaies externes ou à la suite de plaies qui causent traumatisme du tractus intestinal, telles que les blessures chirurgicales, les blessures par balle et les blessures au couteau. Dans ce dernier cas, les bactéries fécales sortent du tractus intestinal et pénètrent dans la cavité péritonéale provoquant une péritonite et la formation d'abcès sur les organes trouvés dans la cavité péritonéale.

3. Pneumonie

Bien qu'ils provoquent parfois pneumonie, les Entérobactéries représentent moins de 5 % des pneumonies bactériennes nécessitant une hospitalisation.

4. Infections sanguines

Septicémie à Gram négatif est le résultat de la pénétration de ces bactéries à Gram négatif opportunistes dans le sang. Elles sont généralement introduit dans le sang à partir d'un autre site d'infection, tel qu'un rein, une plaie ou un poumon infecté. En regardant les patients qui développent un choc septique :

  • Les infections des voies respiratoires inférieures sont à l'origine d'environ 25 % des patients.
  • Les infections urinaires en sont la source chez environ 25 % des patients.
  • Les infections des tissus mous en sont la source chez environ 15 % des patients.
  • Les infections gastro-intestinales en sont la source chez environ 15 % des patients.
  • Les infections de l'appareil reproducteur en sont la source chez environ 10 % des patients.
  • Les corps étrangers (canaux intravasculaires, dispositifs chirurgicaux implantés, etc.) en sont à l'origine chez environ 5% des patients.

Il y a environ 750 000 cas de septicémie par an aux États-Unis et 200 000 cas de choc septique. Le choc septique entraîne environ 100 000 décès par an aux États-Unis. Environ 45 % des cas de septicémie sont dus à des bactéries Gram-négatives. Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Serratia, et E. coli, sont tous communs Entérobactéries provoquant une septicémie. (45 % supplémentaires sont dus à des bactéries Gram-positives (voir Labs 14 et 15) et 10 % sont dus à des champignons, principalement la levure Candidose (voir Lab 9).

Dans la membrane externe de la paroi cellulaire à Gram négatif, la fraction lipidique A du lipopolysaccharide (LPS) fonctionne comme un endotoxine (voir figure 4). L'endotoxine nuit indirectement au corps lorsque des quantités massives sont libérées lors d'infections à Gram négatif graves. Ceci, à son tour, provoque une réponse excessive des cytokines.

1. Le LPS libéré de la membrane externe de la paroi cellulaire à Gram négatif se lie d'abord à une protéine de liaison au LPS circulant dans le sang et ce complexe, à son tour, se lie à une molécule réceptrice (CD 14 ) trouvée à la surface de la défense corporelle. cellules appelées macrophages (voir Fig. 5) situées dans la plupart des tissus et organes du corps.

2. On pense que cela favorise la capacité du récepteur de type péage TLR-4 à répondre au LPS, incitant les macrophages à libérer divers produits chimiques de régulation de la défense appelés cytokines, y compris le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-alpha), l'interleukine- 1 (IL-1), l'interleukine-6 ​​(IL-6) et l'interleukine-8 (IL-8) et le facteur d'activation des plaquettes (PAF). Les cytokines se lient ensuite aux récepteurs des cytokines sur les cellules cibles et initient l'inflammation et activent à la fois les voies du complément et la voie de la coagulation (voir Fig. 5).

3. Le complexe de LPS et de protéine de liaison au LPS peut également se lier à des molécules appelées CD14 à la surface des globules blancs phagocytaires appelés neutrophiles, les obligeant à libérer des protéases et des radicaux oxygénés toxiques pour la destruction extracellulaire. Les chimiokines telles que l'interleukine-8 (IL-8) stimulent également la destruction extracellulaire. De plus, le LPS et les cytokines stimulent la synthèse d'un vasodilatateur appelé monoxyde d'azote.

Lors d'infections locales mineures avec peu de bactéries présentes, de faibles niveaux de LPS sont libérés, ce qui entraîne une production modérée de cytokines par les monocytes et les macrophages et, en général, favorise la défense de l'organisme en stimulant l'inflammation et la fièvre modérée, en brisant les réserves d'énergie pour fournir de l'énergie pour la défense, l'activation de la voie du complément et de la voie de la coagulation, et généralement la stimulation des réponses immunitaires (voir Fig. 5). De plus, en raison de ces cytokines, les globules blancs phagocytaires circulants tels que les neutrophiles et les monocytes se collent aux parois des capillaires, se pressent et pénètrent dans les tissus, un processus appelé diapédèse. Les globules blancs phagocytaires tels que les neutrophiles tuent alors les microbes envahisseurs avec leurs protéases et leurs radicaux oxygénés toxiques.

Cependant, lors d'infections systémiques sévères avec un grand nombre de bactéries présentes, des niveaux élevés de LPS sont libérés, ce qui entraîne une production excessive de cytokines par les monocytes et les macrophages et cela peut endommager le corps (voir Fig. 6). De plus, les neutrophiles commencent à libérer leurs protéases et leurs radicaux oxygénés toxiques qui tuent non seulement les bactéries, mais également les tissus environnants. Les effets nocifs comprennent une forte fièvre, une hypotension, une destruction des tissus, une fonte, un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) et des lésions de l'endothélium vasculaire entraînant un choc, une défaillance multiviscérale (MOSF) et souvent la mort.

Cette réponse inflammatoire excessive est appelée Syndrome de réponse inflammatoire systémique ou SIRS. La mort est le résultat de ce qu'on appelle la cascade de choc. La séquence des événements est la suivante:

  • Les dommages aux capillaires induits par les neutrophiles, ainsi qu'une vasodilatation prolongée, font que le sang et le plasma quittent la circulation sanguine et pénètrent dans les tissus environnants. Cela peut entraîner une diminution du volume de sang circulant (hypovolémie).
  • Une vasodilatation prolongée entraîne également une diminution de la résistance vasculaire dans les vaisseaux sanguins, tandis que des taux élevés de TNF inhibent le tonus musculaire lisse vasculaire et la contractilité myocardique. Il en résulte une hypotension marquée.
  • L'activation de la voie de coagulation sanguine peut provoquer la formation de caillots appelés microthrombus dans les vaisseaux sanguins dans tout le corps, provoquant une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD).
  • Une perméabilité capillaire accrue en raison de la vasodilatation dans les poumons, ainsi que des lésions induites par les neutrophiles aux capillaires des alvéoles, entraînent une inflammation aiguë, un œdème pulmonaire et une perte des échanges gazeux dans les poumons (syndrome de détresse respiratoire aiguë ou SDRA). En conséquence, le sang ne s'oxygéne pas.
  • L'hypotension, l'hypovolémie, le SDRA et la CIVD entraînent une hypoperfusion marquée.
  • L'hypoperfusion dans le foie peut entraîner une baisse de la glycémie due à un dysfonctionnement hépatique.
  • L'hypoperfusion entraîne une acidose et un mauvais pH pour les enzymes impliquées dans le métabolisme cellulaire, entraînant la mort cellulaire.
  • L'hypoperfusion peut également entraîner une insuffisance cardiaque.

Collectivement, cela peut entraîner :

  • ischémie des organes cibles: une restriction de l'apport sanguin qui entraîne des dommages ou un dysfonctionnement des tissus ou des organes,
  • défaillance multi-organes (MSOF),
  • décès.

Les pili et les protéines de surface de la paroi cellulaire à Gram négatif fonctionnent comme adhésines, permettant à la bactérie de adhèrent intimement aux cellules hôtes et d'autres surfaces afin de coloniser et de résister au rinçage. Certaines bactéries Gram-négatives produisent également envahissant, permettant à certaines bactéries de envahir les cellules hôtes. Motilité, capsules, formation de biofilm et exotoxines jouent également un rôle dans la virulence de certains Entérobactéries.

Pour plus d'informations sur les facteurs de virulence associés à divers Entérobactéries, consultez les objets d'apprentissage suivants dans votre guide de cours :

Beaucoup de Entérobactéries possèdent également Plasmides R (résistance). Ces plasmides sont de petits morceaux d'ADN circulaire non chromosomique qui peuvent coder pour résistance multiple aux antibiotiques De plus, le plasmide peut coder pour un sexe pilus, permettant à la bactérie de transmettre des plasmides R à d'autres bactéries en conjugaison. Entre 50 et 60 pour cent des bactéries causant des infections nosocomiales sont résistantes aux antibiotiques.

Pour plus d'informations sur la résistance bactérienne aux antibiotiques, consultez l'objet d'apprentissage suivant dans le texte électronique de votre cours :

L'identification des bâtonnets à Gram négatif fermentant le lactose appartenant à la famille bactérienne Entérobactéries (bactérie communément appelée coliformes) dans l'eau est souvent utilisé pour déterminer si l'eau a été contaminée par des matières fécales et, par conséquent, peut contenir des agents pathogènes pathogènes transmis par voie fécale-orale. La procédure à suivre est donnée à l'annexe E.

B. PSEUDOMONAS ET AUTRES BACILLI GRAM-NÉGATIFS NON FERMENTATIFS

Les bacilles à Gram négatif non fermentaires désignent les bâtonnets à Gram négatif ou les coccobacilles qui ne peut pas fermenter les sucres. Les bacilles à Gram négatif non fermentescibles sont souvent des habitants normaux du sol et de l'eau. Ils peuvent provoquer des infections humaines lorsqu'ils colonisent des individus immunodéprimés ou accèdent à l'organisme à la suite d'un traumatisme. Cependant, moins d'un cinquième des bacilles à Gram négatif isolés à partir d'échantillons cliniques sont des bacilles non fermentaires. De loin, le Le plus commun Le bâtonnet à Gram négatif non fermentaire qui provoque des infections humaines est Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas appartient à la famille Pseudomonacées dans l'ordre Pseudomonadales dans la classe Gammaprotéobactérie du phylum Protéobactérie.

Pseudomonas aeruginosa est aussi un pathogène opportuniste. C'est une cause fréquente d'infections nosocomiales et on peut la trouver en croissance dans une grande variété d'emplacements environnementaux. En milieu hospitalier, par exemple, il a été isolé des canalisations, des éviers, des robinets, de l'eau des fleurs coupées, des solutions de nettoyage, des médicaments et même des solutions de savon désinfectant. Il est particulièrement dangereux pour le patient affaibli ou immunodéprimé.

Comme l'opportuniste Entérobactéries, Pseudomonas est un bâtonnet à Gram négatif, on le trouve fréquemment en petites quantités dans les selles, et il provoque des infections opportunistes: infections des voies urinaires, infections des plaies, pneumonie et septicémie. Paeruginosa est le quatrième pathogène nosocomial le plus souvent isolé, représentant 10 % de toutes les infections nosocomiales. P. aeruginosa est responsable de 12 pour cent des infections urinaires nosocomiales, de 16 pour cent des cas de pneumonie nosocomiale et de 10 pour cent des cas de septicémie. En outre, P. aeruginosa est une cause importante de brûlures avec un taux de mortalité de 60 pour cent. Il colonise également et infecte chroniquement les poumons des personnes atteintes de mucoviscidose. Comme les autres bacilles à Gram négatif opportunistes, Pseudomonas aeruginosa libère également des endotoxines et possède fréquemment des plasmides R. Un certain nombre d'autres espèces de Pseudomonas ont également été trouvés pour provoquer des infections humaines.

Pour plus d'informations sur les facteurs de virulence associés à Pseudomonas, consultez les objets d'apprentissage suivants dans votre guide de cours :

D'autres bacilles Gram-négatifs non fermentaires qui sont parfois des agents pathogènes opportunistes chez l'homme comprennent Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Eikenella, Flavobacterium, et Moraxelle.

Acinetobacter est devenue une cause fréquente d'infections nosocomiales des plaies, de pneumonie, et septicémie. La bactérie est devenue bien connue comme une cause d'infections chez les vétérans des guerres en Irak et en Afghanistan et devient une cause croissante d'infections nosocomiales aux États-Unis. Acinetobacter On pense qu'il a été contracté dans des hôpitaux de campagne en Irak et en Afghanistan, puis transporté dans des hôpitaux pour vétérans aux États-Unis. Parce que la plupart des espèces sont multirésistantes aux antibiotiques, il est souvent difficile à traiter. Acinetobacter se trouve couramment dans le sol et l'eau, ainsi que sur la peau des personnes en bonne santé, en particulier le personnel de santé. Bien qu'il existe de nombreuses espèces de Acinetobacter qui peut provoquer des maladies humaines, Acinetobacter baumannii représente environ 80 % des infections signalées.

Articles Medscape sur les infections associées aux organismes mentionnés dans cet exercice de laboratoire. L'inscription pour accéder à ce site est gratuite.

  • Salmonellose
  • La fièvre typhoïde
  • Shigellose
  • Escherichia coli
  • Protéeespèce
  • Klebsiellaespèce
  • Enterobacterespèce
  • Serratiaespèce
  • Yersinia enterocolitica
  • Yersinia pseudotuberculosis
  • Acinetobacter baumannii
  • Pseudomonas aeruginosa
  • Infections des voies urinaires
  • Infections des plaies
  • Pneumonie communautaire
  • État septique

SCÉNARIOS POUR LE LABO D'AUJOURD'HUI

Les étudiants seront affectés soit Étude de cas 1A ou 1B à faire aujourd'hui. Tous les étudiants feront l'étude de cas 2 dans le cadre des résultats la prochaine fois.

Étude de cas #1A

Une femme de 66 ans ayant des antécédents d'infections urinaires récurrentes et de multiples traitements antibiotiques présente une fréquence et une urgence d'uriner, une dysurie, une gêne sus-pubienne, des douleurs lombaires et une température de 99,2°F. Une formule sanguine complète (CBC) montre une leucocytose avec un décalage vers la gauche. Une bandelette urinaire montre un test d'estérase leucocytaire positif, un test de nitrite positif, 30 mg de protéines par décilitre et des globules rouges dans l'urine.

Supposons que votre inconnu est une culture d'urine de cette personne.

Étude de cas #1B

Une femme de 72 ans, diabétique et fumeuse, a été admise à l'hôpital avec une blessure à la jambe qui ne guérit pas. Elle semble confuse et anxieuse, a une température de 102 °F , une fréquence cardiaque de 101 battements par minute, une fréquence respiratoire de 29 respirations par minute, une tension artérielle de 94/32 mm Hg, un débit urinaire de seulement 110 cc pour le dernières 8 heures, et un nombre total de globules blancs de 2300/µL. Une hémoculture est prélevée.

Supposons que votre inconnu est une hémoculture de cette personne.

ATTENTION : TRAITER CHAQUE INCONNU COMME UN PATHOGENE !. Informez votre instructeur de tout déversement ou accident. LAVEZ ET ASSAINISSEZ-VOUS BIEN LES MAINS avant de quitter le laboratoire.

Disque Taxo N®, alcool, flacon compte-gouttes d'eau distillée, écouvillon et Soit une plaque de gélose MacConkey ou une plaque de gélose Cetrimide, et un EnteroPluri-Test

PROCÉDURE (à faire en groupe de 3 )

[Gardez à l'esprit que les organismes autres que les Entérobactéries et Pseudomonas peut provoquer ces infections, donc dans une situation clinique réelle, d'autres tests de laboratoire et cultures de bactéries autres que ceux sur lesquels ce laboratoire est basé seraient également effectués.]

1 . Effectuer un Coloration de Gram sur ton inconnu. N'oubliez pas que la concentration de bactéries sur les lames préparées en prélevant des bactéries d'une boîte de Pétri a tendance à être beaucoup plus élevée que celles préparées en prélevant des bactéries d'un bouillon de culture, donc attention à ne pas sous-décolorer. Continuez à décolorer jusqu'à ce que le violet cesse de s'écouler du frottis bactérien, puis lavez à l'eau.

Enregistrez les résultats de votre coloration de Gram dans la section coloration de Gram du laboratoire 13.

2. Si vous avez un bacille à Gram négatif, déterminez s'il s'agit d'un fermentaire Bacille à Gram négatif comme la plupart Entérobactéries ou un non fermenté Bacille à Gram négatif tel que Pseudomonas en effectuant un test d'oxydase comme suit:

une. À l'aide d'une pince flambée à l'alcool, retirer un disque Taxo-N® et l'humidifier avec une goutte d'eau distillée stérile.

b. Placez le disque humidifié sur les colonies de la culture de votre inconnu.

c. A l'aide d'un écouvillon stérile, grattez une partie des colonies et étalez-les sur le disque Taxo-N®.

Dans le essai immédiat, les réactions positives à l'oxydase vont couleur rose en 30 secondes (voir fig. 10). Oxydase-négatif ne deviendra pas rose (voir Fig. 9). Cette réaction ne dure que quelques minutes. Dans le essai différé, les colonies oxydase-positives à moins de 10 mm du disque Taxo-N® devient noir dans les 20 minutes et restera noir (voir figure 11). Si la bactérie est oxydase-négative, la croissance autour du disque ne deviendra pas noire (voir Fig. 12).

Enregistrez les résultats de votre test d'oxydase dans la section Test d'oxydase du laboratoire 13.

3. Si votre inconnu est oxydase-négatif, indiquant un bacille à Gram négatif fermentaire, faire les inoculations suivantes :

une. Rayez votre inconnu pour l'isolement sur une assiette de Gélose MacConkey, une milieu sélectif utilisé pour l'isolement de bâtonnets Gram-négatifs non exigeants et en particulier les membres de la famille Entérobactéries, en utilisant l'un des deux modèles de stries illustrés dans les Fig. 4 et Fig. 5. Incuber à l'envers et empilé dans le support de plaque de pétri sur l'étagère de l'incubateur 37°C correspondant à votre section de laboratoire.

b. Inoculer un EnteroPluri-Test comme suit:

1. Retirez les deux capuchons de l'EnteroPluri-Test et avec le extrémité droite du fil d'inoculation, prélevez l'équivalent d'une colonie dans votre assiette inconnue. Un inoculum visible doit être vu sur la pointe et le côté du fil.

2. Inoculer l'EnteroPluri-Test en saisissant le extrémité coudée du fil d'inoculation, en le tordant et en retirant le fil à travers les 12 compartiments à l'aide d'un mouvement de rotation.

3. Réinsérez le fil dans le tube (utiliser un mouvement de rotation) à travers les 12 compartiments jusqu'à ce que l'encoche sur le fil soit alignée avec l'ouverture du tube. (La pointe du fil doit être visible dans le compartiment du citrate.) Casser le fil à l'encoche en se pliant. Ne jetez pas encore le fil.

4. En utilisant la partie cassée du fil, percer des trous dans la cellophane qui recouvre les entrées d'air situées sur le côté arrondi des 8 derniers compartiments. Votre instructeur vous montrera leur emplacement correct. Jetez le fil cassé dans le contenant de désinfectant.

5. Remettez les deux capuchons et incuber l'EnteroPluri-Test sur sa surface plane à 36°- 37°C pendant 18-24 heures.

4. Si votre inconnu est oxydase positive, indiquant un bacille Gram négatif non fermentaire, procéder à l'inoculation suivante :

une. Rayez votre inconnu pour l'isolement sur une assiette de Gélose cétrimide, un support sélectif et différentiel pour Pseudomonas, en utilisant l'un des deux modèles de stries illustrés dans les Fig. 4 et Fig. 5. Incuber à l'envers et empilé dans le support de plaque de pétri sur l'étagère de l'incubateur 37°C correspondant à votre section de laboratoire.

Noter que Gélose MacConkey peut également être utilisé pour isoler Pseudomonas mais nous utilisons aujourd'hui la gélose Cetrimide car elle nous permet de détecter la production du pigment hydrosoluble bleu à vert en Pseudomonas aeruginosa, ainsi que la production de fluorescéine.

Vous allez également inoculer un EnteroPluri-Test pour la pratique uniquement, mais gardez à l'esprit que l'EnteroPluri-Test est utilisé pour identifier Entérobactéries, ne pas Pseudomonas.

Étude de cas #2

Après avoir reçu un poussin pour Pâques, un garçon de 7 ans est emmené aux urgences avec des symptômes de vomissements, nausées, diarrhée non sanglante, crampes abdominales et une température de 100°F. Une formule sanguine complète (CBC) montre que le nombre de globules blancs se situe dans la plage de référence.

Cette gélose XLD et cette EnteroPluri-Test proviennent d'une coproculture de ce patient.

ATTENTION : TRAITER L'INCONNU COMME UN PATHOGENE !. Informez votre instructeur de tout déversement ou accident. LAVEZ ET ASSAINISSEZ-VOUS BIEN LES MAINS avant de quitter le laboratoire.

Plaque de gélose XLD de démonstration et EnteroPluri-Test

PROCÉDURE (à faire en groupe de 3 )

1. Observez les démonstrations suivantes indiqué dans les liens directement ci-dessous et identifier la bactérie en cause :

une. Une plaque de gélose XLD,un milieu sélectif utilisé pour isoler et différencier les bactéries entériques à Gram négatif, en particulier les agents pathogènes intestinaux tels que Salmonelle et Shigella.

2. Enregistrez vos résultats dans la section Résultats du laboratoire 13.

C. Tests de laboratoire utilisés dans le cadre du laboratoire d'aujourd'hui

Isoler Entérobactéries et Pseudomonas, les spécimens du site infecté sont étalés sur l'un des nombreux médias sélectifs et différentiels tels que la gélose EMB, la gélose Endo, la gélose Deoxycholate, la gélose MacConkey, la gélose Hektoen Enteric et la gélose XLD. Nous en examinerons trois.

1. Gélose MacConkey

Gélose MacConkey est un milieu sélectif utilisé pour l'isolement de bâtonnets Gram-négatifs non exigeants, en particulier les membres de la famille Entérobactéries et le genre Pseudomonas, et la différenciation du lactose fermentant des bacilles à Gram négatif non fermentants. Gélose MacConkey contient le colorant violet cristal ainsi que des sels biliaires qui inhibent la croissance de la plupart des bactéries Gram-positives mais n'affectent pas la croissance de la plupart des Gram-négatifs (voir Fig. 6).

Si la bactérie à Gram négatif fermente le sucre lactose du milieu, les produits finaux acides abaissent le pH du milieu. Le rouge neutre dans la gélose devient rouge une fois que le pH descend en dessous de 6,8. Lorsque le pH baisse, le rouge neutre est absorbé par les bactéries, provoquant la les colonies apparaissent rose vif à rouge.

  • Forte fermentation du lactose avec des niveaux élevés de production d'acide par la bactérie provoque la les colonies et la croissance confluente apparaissent rose vif à rouge. L'acide résultant, à des concentrations suffisamment élevées, peut également provoquer la précipitation des sels biliaires du milieu hors de la solution. provoquant l'apparition d'un précipité rose (nébulosité) dans la gélose entourant la croissance(voir fig. 13).
  • Fermentation faible du lactose par la bactérie provoque la les colonies et la croissance confluente apparaissent roses à rouges, mais sans précipitation de sels biliaires, il y a pas de halo rose autour de la pousse(voir fig. 15).
  • Si les bactéries ne pas fermenter le lactose, les les colonies et la croissance confluente semblent incolores et le la gélose entourant les bactéries reste relativement transparente(voir fig. 17).

Morphologie typique des colonies de nos souches de Entérobactéries et Pseudomonas aeruginosa sur la gélose MacConkey est la suivante :

1. Escherichia coli: les colonies et la croissance confluente apparaissent rose vif à rouge et entourées d'un précipité rose (nébulosité) dans la gélose entourant la croissance (voir Fig. 13). Forte fermentation du lactose.

2. Klebsiella pneumoniae: les colonies et la croissance confluente apparaissent rose vif à rouge mais ne sont pas entourées d'un précipité rose (nébulosité) dans la gélose entourant la croissance (voir Fig. 14). Fermentation faible du lactose.

3. Enterobacter aerogenes: les colonies et la croissance confluente apparaissent rose vif à rouge mais ne sont pas entourées d'un précipité rose (nébulosité) dans la gélose entourant la croissance (voir Fig. 15). Fermentation faible du lactose.

4. Enterobacter cloacae : les colonies et la croissance confluente apparaissent rose vif à rouge mais ne sont pas entourées d'un précipité rose (nébulosité) dans la gélose entourant la croissance (voir Fig. 16). Fermentation faible du lactose.

5. Proteus mirabilis: gélose colonies incolores relativement transparentes (voir Fig. 17). Pas de fermentation du lactose.

6 . Proteus vulgaris: gélose colonies incolores relativement transparentes (voir Fig. 18). Pas de fermentation du lactose.

7 . Serratia marcescens : gélose colonies incolores relativement transparentes (voir Fig. 19). Pas de fermentation du lactose.

8 . Pseudomonas aeruginosa: gélose colonies incolores relativement transparentes (voir Fig. 20).

9. Salmonella enterica: gélose colonies incolores relativement transparentes (voir Fig. 21). Pas de fermentation du lactose.

2 . Gélose XLD

Gélose Xylose Lysine Désoxycholate (XLD) est utilisé pour isoler et différencier les bactéries entériques à Gram négatif, en particulier les agents pathogènes intestinaux tels que Salmonelle et Shigella. La gélose XLD contient du désoxycholate de sodium, qui inhibe la croissance des bactéries Gram-positives mais permet la croissance des Gram-négatifs. Il contient également les sucres lactose et saccharose, l'acide aminé L-lysine, le thiosulfate de sodium et l'indicateur de pH rouge de phénol. Les résultats peuvent être interprétés comme suit :

  • Si la bactérie à Gram négatif fermente le lactose et/ou le saccharose, des produits finis acides seront produits et faire en sorte que les colonies et le rouge de phénol dans la gélose autour des colonies devenir jaune(voir fig. 16).
  • Si le lactose et le saccharose ne sont pas fermentés par la bactérie mais l'acide aminé lysine est décarboxylé, l'ammoniac, un produit final alcalin provoquera le rouge de phénol dans la gélose autour des colonies à virer au rouge plus foncé(voir fig. 17).
  • Parfois la bactérie fermente les sucres produire des produits finis acides et décompose la lysine produire des produits finis alcalins. Dans ce cas certaines colonies et une partie de la gélose virent au jaune et certaines colonies et une partie de la gélose virent au rouge plus foncé(voir fig. 18).
  • Si sulfure d'hydrogène est produit par la bactérie à la suite de la réduction du thiosulfate, tout ou partie de la la colonie apparaîtra noire(voir fig. 19). Des colonies bien isolées sont généralement nécessaires pour de bons résultats.

La morphologie typique des colonies sur gélose XLD est la suivante :

1. Escherichia coli: colonies jaunes plates certaines souches peuvent être inhibées.

2. Enterobacter et Klebsiella: colonies jaunes mucoïdes.

3. Protée: les colonies rouges à jaunes peuvent avoir des centres noirs.

4. Salmonelle: colonies généralement rouges avec des centres noirs.

5. Shigella, Serratia, et Pseudomonas: colonies rouges sans centre noir

Gardez à l'esprit, cependant, que certaines espèces et sous-espèces ne présentent pas de réactions typiques.

3. Gélose au cétrimide (Pseudomonas gélose)

Gélose cétrimide contient le cétrimide chimique (bromure de cétyl timéthylammonium) pour le inhibition sélective de la plupart des bactéries autres que Pseudomonas. Le médium stimule également Pseudomonas aeruginosa pour produire un certain nombre de chélateurs du fer solubles dans l'eau, y compris la pyoverdine et la pyocyanine. La couleur verte soluble dans l'eau caractéristique de Pseudomonas aeruginosa est créé lorsque le la pyoverdine fluorescente jaune-vert ou jaune-brun se combine avec la pyocyanine bleue hydrosoluble (voir fig. 20). Les pyoverdine fluorescente sera généralement fluorescent lorsque la plaque est placée sous une lumière ultraviolette de courte longueur d'onde (voir fig. 21). Après quelques minutes à température ambiante, la plaque perd sa fluorescence. La fluorescence peut cependant être restaurée en replaçant la plaque à 37°C pendant plusieurs minutes.

4. Test d'oxydase

Dans ce laboratoire, un disque Taxo N® est utilisé pour effectuer le test d'oxydase. Le test d'oxydase est basé sur la production bactérienne d'une enzyme oxydase. Cytochrome oxydase, en présence d'oxygène, oxyde le réactif test para-amino diméthylanaline oxydase dans un disque Taxo-N®.

  • Dans le essai immédiat, les réactions positives à l'oxydase vont couleur rose en 30 secondes(voir fig. 5). Oxydase-négatif ne deviendra pas rose (voir Fig. 6). Cette réaction ne dure que quelques minutes.
  • Dans le essai différé, les colonies oxydase-positives à moins de 10 mm du disque Taxo-N® devient noir dans les 20 minutes et restera noir(voir fig. 7). Si la bactérie est oxydase-négative, la croissance autour du disque ne deviendra pas noire (voir Fig. 8).

Pseudomonas aeruginosa et la plupart des autres bacilles non fermentaires à Gram négatif sont oxydase-positifs à l'exception du genre Plesiomonas, les Entérobactéries sont oxydase-négatives.

5. Production de pigments en Pseudomonas aeruginosa

La couleur verte soluble dans l'eau caractéristique de Pseudomonas aeruginosa est créé lorsque le la pyoverdine fluorescente jaune-vert ou jaune-brun se combine avec la pyocyanine bleue hydrosoluble (voir fig. 20). Les pyoverdine fluorescente sera généralement fluorescent lorsque la plaque est placée sous une lumière ultraviolette de courte longueur d'onde (voir Fig. 21). Après quelques minutes à température ambiante, la plaque perd sa fluorescence. La fluorescence peut cependant être restaurée en replaçant la plaque à 37°C pendant plusieurs minutes. Aucun des Entérobactéries produit un pigment à 37°C.

6. Odeur

La plupart Entérobactéries avoir une odeur assez nauséabonde Pseudomonas aeruginosa produit un arôme caractéristique de fruit ou de jus de raisin en raison de la production d'un composé aromatique appelé aminoacétophénone.

7. Les EnteroPluri-Test

Un certain nombre de techniques peuvent être utilisées pour l'identification d'espèces et de sous-espèces spécifiques de Entérobactéries. La spéciation est importante car elle fournit des données sur les profils de sensibilité aux agents antimicrobiens et les changements qui se produisent sur une période de temps. Elle est également indispensable pour les études épidémiologiques telles que la détermination des infections nosocomiales et leur propagation.

Dans un effort pour simplifier la spéciation des Entérobactéries et réduire la quantité de milieux préparés et d'espace d'incubation nécessaires au laboratoire clinique, un certain nombre de systèmes multi-tests ont été commercialisés. Certains de ces systèmes multi-tests ont été combinés à un manuel préparé par ordinateur pour fournir une identification basée sur l'ensemble probabilité d'occurrence pour chacune des réactions biochimiques. De cette façon, un grand nombre de tests biochimiques peuvent être effectués de manière économique dans un court laps de temps, et les résultats peuvent être interprétés avec précision avec une relative facilité et assurance.

Les EnteroPluri-Test (voir illustration 22) est un tube en plastique autonome et compartimenté contenant 12 géloses différentes (permettant la réalisation d'un total de 15 tests biochimiques standard) et un fil d'ensemencement fermé. Après l'inoculation et l'incubation, la combinaison résultante de réactions, ainsi qu'un système de codage et d'identification informatique (CCIS), permet une identification facile. Les différentes réactions biochimiques de l'EnteroPluri-Test et leur interprétation correcte sont discutés ci-dessous. Bien qu'il soit conçu pour identifier les membres de la famille bactérienne Entérobactéries, il identifiera parfois aussi des biotypes communs de Pseudomonas et d'autres bacilles à Gram négatif non fermentescibles. il n'identifie pas Pseudomonas aeruginosa.

IDENTIFICATION DES MEMBRES DU ENTEROBACTERIACEAE AVEC LE ENTEROPLURI-TEST

L'EnteroPluri-Test contient 12 géloses différentes qui peuvent être utilisées pour effectuer 15 tests biochimiques standards (voir Fig. 22). Interprétez les résultats de votre EnteroPluri-Test en suivant les instructions ci-dessous et enregistrez-les sur l'EnteroPluri-Test tableau sur votre page de résultats. Pour plus de détails sur les 15 tests biochimiques de l'EnteroPluri-Test, voir le tableau 13A.

1. Interpréter les résultats de glucose fermentation en compartiment 1.

  • Tout jaune = + rouge = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 4 sous glucose sur votre page de résultats.

2. Interpréter les résultats de gaz fabrication également en compartiment 1.

  • Cire blanche extraite de la gélose jaune = + cire non extraite de la gélose = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 2 sous gaz sur votre page de résultats.

3. Interpréter les résultats de lysine décarboxylase dans compartiment 2.

  • Tout violet = + jaune = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 1 sous la lysine sur votre page de résultats.

4. Interpréter les résultats de ornithine décarboxylase dans compartiment 3.

  • Tout violet = + jaune = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 4 sous l'ornithine sur votre page de résultats.

5. Interpréter les résultats de H2S fabrication en compartiment 4.

  • Noir/marron = + beige = - (Le noir peut s'estomper ou redevenir négatif si l'EnteroPluri-Test est lu après 24 heures d'incubation.)
  • Si positif, encerclez le chiffre 2 sous H2S sur votre page de résultats.

6. Indole fabrication également en compartiment 4. Ne pas interpréter le test d'indole pour le moment. N'ajoutez le réactif de Kovac qu'après avoir lu tous les autres tests (voir étape 16 au dessous de).

7. Interpréter les résultats de adonitol fermentation en compartiment 5.

  • Tout jaune = + rouge = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 4 sous adonitol sur votre page de résultats.

8 . Interpréter les résultats de lactose fermentation en compartiment 6.

  • Tout jaune = + rouge = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 2 sous lactose sur votre page de résultats.

9. Interpréter les résultats de arabineux fermentation en compartiment 7.

  • Tout jaune = + rouge = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 1 sous l'arabinose sur votre page de résultats.

10. Interpréter les résultats de sorbitol fermentation en compartiment 8.

  • Tout jaune = + rouge = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 4 sous le sorbitol sur votre page de résultats.

11. Voges-Praskauer (VP) tester dans compartiment 9. N'interprétez pas le test VP pour le moment. N'ajouter les réactifs alpha-naphtol et hydroxyde de potassium (KOH) qu'après avoir lu tous les autres tests (voir étape 17 au dessous de).

12. Interpréter les résultats de dulcitol fermentation en compartiment 10.

  • Jaune = + vert ou marron foncé = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 1 sous dulcitol sur votre page de résultats.

13. Interpréter les résultats de Pennsylvanie désaminase également dans compartiment 10.

  • Marron foncé= + vert ou jaune= -
  • Si positif, encerclez le chiffre 4 sous PA sur votre page de résultats.

14. Interpréter les résultats de urée hydrolyse dans compartiment 11.

  • Rose, rouge ou violet = + beige = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 2 sous l'urée sur votre page de résultats.

15. Interpréter les résultats de citrate utilisation dans compartiment 12.

  • Tout bleu = + vert = -
  • Si positif, encerclez le chiffre 1 sous citrate sur votre page de résultats.

16. Votre instructeur ajoutera 2-3 gouttes de Le réactif de Kovac vers le compartiment d'essai d'indole.

17. Ouinotre instructeur ajoutera 3 gouttes de réactif alpha-naphtol et 2 gouttes d'hydroxyde de potassium (KOH) dans le compartiment de test VP.

18. Ajouter toutes les valeurs de nombre de tests positifs dans chaque section entre parenthèses et entrez chaque somme dans sa case de code sur l'EnteroPluri-Test graphique sur votre page de résultats.

19. Le numéro à 5 chiffres est le numéro CODICE. Cherchez ce numéro dans le Livre de codes et identifiez votre inconnu. (Si plus d'un organisme était répertorié, les tests de confirmation indiqués dans le CCIS devraient normalement être effectués. De plus, une identification de Salmonelle ou Shigella serait généralement confirmé par des tests sérologiques directs, comme cela sera décrit dans le laboratoire 17.)


Régulation du métabolisme de l'acétate dans Escherichia coli BL21 par acétylation de la protéine N -lysine

La production d'acétate est l'une des différences les plus frappantes entre Escherichia coli souches K12 et BL21. La transcription des gènes du métabolisme de l'acétate est régulée. De plus, l'acétyl-CoA synthétase, qui active l'acétate en acétyl-CoA, est régulée par l'acétylation post-traductionnelle. Le but de cette étude était de comprendre la contribution de l'acétylation réversible de la protéine lysine à la régulation du métabolisme de l'acétate dans E. coli BL21. Les différences phénotypiques entre les deux souches étaient particulièrement importantes en présence d'acétate. La forte expression de l'acétyl-CoA synthétase (acs) en phase exponentielle du glucose dans BL21 permet la consommation simultanée d'acétate et de glucose. L'absence de répression catabolique a également affecté son régulateur post-traductionnel, la protéine acétyltransférase (patZ). L'effet de la suppression de cobB (codant pour une protéine désacétylase de type sirtuine) et patZ les gènes dépendaient du bagage génétique. La suppression de cobB dans les deux souches, une augmentation de la production d'acétate et une diminution du taux de croissance dans les cultures d'acétate. La suppression de patZ dans BL21 supprimait le débordement d'acétate dans le milieu glucose et augmentait le taux de croissance dans les cultures d'acétate. Les différences de débordement d'acétate entre les souches BL21 et K12 sont causées par de nombreux facteurs qui se chevauchent. Deux effets contributifs majeurs ont été identifiés : (1) l'expression de acs pendant la croissance exponentielle n'est pas réprimée dans la souche BL21 en raison de la production concomitante d'AMPc et (2) l'activité de l'acétyl-CoA synthétase est plus étroitement régulée par l'acétylation des protéines dans BL21 que dans K12. Dans l'ensemble, ces différences contribuent à réduire le débordement d'acétate et à améliorer la capacité de E. coli BL21 de consommer ce métabolite en présence de glucose.

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Devenir des acides gras issus de la biomasse bactérienne dans le sol et leur contribution à la matière organique du sol

La matière organique du sol (MOS) est un pool majeur du cycle global du C et détermine la fertilité du sol. La stabilité de la SOM dépend fortement des précurseurs moléculaires et des structures. Les résidus végétaux ont été considérés comme les précurseurs dominants, mais des résultats récents ont montré une contribution majeure de la biomasse microbienne. Le devenir des constituants de la biomasse microbienne n'a pas encore été exploré, par conséquent, nous avons étudié le devenir des acides gras (AG) de bactéries Gram-négatives marquées au 13 C (Escherichia coli) dans une étude de sol modèle [Kindler, R., Miltner, A., Richnow, H.H., Kästner, M., 2006. Fate of gram negativebacterial biomass in soil—mineralization and contribution to SOM. Biologie des sols et biochimie 38, 2860-2870]. Après 224 jours d'incubation, le marqueur dans les acides gras totaux (t-FA) dans le sol a diminué à 24% et dans les acides gras phospholipidiques (PLFA) des microbes vivants à 11% de la quantité initialement ajoutée. Étant donné que le C en vrac n'a diminué qu'à 44 % au cours de cette période, le chiffre d'affaires de FA est clairement plus élevé, ce qui indique que d'autres composés doivent avoir un chiffre d'affaires inférieur. Le marqueur 13 C dans le t-FA a atteint un niveau stable après 50 jours mais le marqueur du PLFA de la biomasse microbienne vivante a diminué jusqu'à la fin de l'expérience. L'enrichissement isotopique des PLFA individuels montre que le C dérivé de la biomasse s'est propagé à travers le réseau trophique microbien. La modélisation des flux de C dans cette expérience a indiqué que la biomasse microbienne est continuellement minéralisée après la mort cellulaire et recyclée par d'autres organismes jusqu'au niveau de 10 %, alors que la majorité du C en vrac résiduel dérivé de la biomasse (∼ 33 %) a été stabilisée dans le non- piscine SOM vivant.

Adresse actuelle : Département de la gestion des déchets et de la recherche environnementale, Université de technologie de Berlin, Franklinstr. 29, 10587 Berlin, Allemagne.


Métabolisme

2. la somme des processus physiques et chimiques par lesquels la substance organisée vivante est construite et maintenue (anabolisme), et par lesquels les grosses molécules sont décomposées en molécules plus petites pour rendre l'énergie disponible à l'organisme (catabolisme). Essentiellement, ces processus concernent la disposition des nutriments absorbés dans le sang après la digestion.

Il existe deux phases de métabolisme : la phase anabolique et la phase catabolique. La phase anabolique, ou constructive, concerne la conversion de composés plus simples dérivés des nutriments en substances vivantes et organisées que les cellules du corps peuvent utiliser. Dans la phase catabolique, ou destructrice, ces substances organisées sont reconverties en composés plus simples, avec la libération d'énergie nécessaire au bon fonctionnement des cellules du corps.

Le taux de métabolisme peut être augmenté par l'exercice par une température corporelle élevée, comme dans une fièvre élevée, qui peut plus que doubler le taux métabolique par l'activité hormonale, comme celle de la thyroxine, de l'insuline et de l'épinéphrine et par une action dynamique spécifique qui se produit après l'ingestion d'un repas.

Le taux métabolique de base fait référence au taux le plus bas obtenu lorsqu'un individu est au repos physique et mental complet. Le taux métabolique est généralement exprimé en termes de quantité de chaleur libérée au cours des réactions chimiques du métabolisme. Environ 25 pour cent de toute l'énergie provenant des nutriments est utilisée par le corps pour poursuivre sa fonction normale, le reste devient de la chaleur.


Effets du paracétamol sur l'activité NOS, COX et CYP et sur le stress oxydatif chez des sujets masculins sains, des hépatocytes de rat et des NOS recombinants

Le paracétamol (acétaminophène) est un médicament analgésique largement utilisé. Il interagit avec diverses familles d'enzymes, notamment le cytochrome P450 (CYP), la cyclooxygénase (COX) et l'oxyde nitrique synthase (NOS), et cette interaction peut produire des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Nous avons étudié les effets du paracétamol sur la prostacycline, le thromboxane, l'oxyde nitrique (NO) et le stress oxydatif chez quatre sujets masculins ayant reçu une dose orale unique de 3 g de paracétamol. La synthèse du thromboxane et de la prostacycline a été évaluée en mesurant leurs principaux métabolites urinaires 2,3-dinor-thromboxane B2 et 2,3-dinor-6-cétoprostaglandine F1??, respectivement. La synthèse du NO endothélial a été évaluée en mesurant le nitrite dans le plasma. Urinaire 15(S)-8-iso-prostaglanding F2?? a été mesurée pour évaluer le stress oxydatif. Oxyde d'acide oléique plasmatique (cis-EpOA) a été mesurée comme marqueur de l'activité du cytochrome P450. Lors de l'administration de paracétamol, la synthèse de prostacycline était fortement inhibée, tandis que la synthèse de NO augmentait et que la synthèse de thromboxane restait presque inchangée. Le paracétamol peut modifier l'équilibre vasodilatation/vasoconstriction dépendant de la COX au détriment de la vasodilatation. Cet effet peut être contrarié par l'augmentation de la synthèse de NO endothéliale. Le paracétamol à haute dose n'a pas augmenté le stress oxydatif. À des concentrations pharmacologiquement pertinentes, le paracétamol n'a pas affecté la synthèse/la biodisponibilité de NO par la NOS endothéliale humaine recombinante ou la NOS inductible dans les hépatocytes de rat. Nous concluons que le paracétamol n'augmente pas le stress oxydatif chez l'homme.

1. Introduction

Oxyde nitrique (NO), prostaglandine (PG) I2, c'est-à-dire la prostacycline (PGI2), et le thromboxane A2 (TxA2) sont d'importantes molécules de signalisation à courte durée de vie impliquées dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Ainsi, l'IGP2 et NO sont de puissants vasodilatateurs et inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire. Au contraire, TxA2 est un puissant vasoconstricteur et inducteur de l'agrégation plaquettaire. Le NO est synthétisé à partir de la L-arginine (Arg) par des isoformes constitutives et inductibles de la NO synthase (NOS). Les isoformes de la prostaglandine H synthase (PGHS), généralement appelées cyclooxygénase (COX), convertissent l'acide arachidonique (AA) en prostanoïdes collectivement nommés. La voie L-arginine/NO est généralement acceptée pour interagir avec la voie COX et moduler son activité [1–4]. Par exemple, il a été démontré que l'isoforme inductible NOS (iNOS) se lie à l'isoforme inductible COX (COX-2) et à

-nitrosylate et active la COX-2 [2]. Le rôle du NO dans la biologie des prostaglandines a été récemment mis à jour par Kim [4]. Les mécanismes potentiels de la diaphonie directe NOS-COX peuvent inclure (1) la liaison de NO à l'atome de fer du groupe hème de COX, (2) la réaction du cation nitrosyle (NO + ) avec les groupes sulfhydryle (SH) de la cystéine ( Cys) de COX pour former -nitroso-COX, et (3) la réaction du peroxynitrite (ONOO − ), c'est-à-dire le produit de réaction du radical NO ( NO) et l'anion radical superoxyde (

) produit soit par la NOS elle-même, soit par d'autres enzymes dont COX et CYP [3], avec des groupes SH des résidus Cys ou avec des résidus tyrosine (Tyr) de COX impliqués dans le processus catalytique [2]. -Nitrosylation des fragments COX-Cys par des oxydes supérieurs de NO, notamment le trioxyde de diazote (N2O3), et par ONOO - et -transnitrosylation des fragments COX-Cys par des -nitrosothiols de faible masse moléculaire, se sont avérés à la fois augmenter et inhiber l'activité de la COX. La nitration des résidus Tyr situés dans le domaine catalytique de la COX est supposée inhiber l'activité de la COX [2, 4-6]. D'autre part, il a été rapporté que ONOO - améliore l'activité de la COX, probablement en augmentant la concentration de peroxyde requise pour l'activité de la peroxydase de la COX [7].

Le paracétamol (acétaminophène, APAP) est l'un des médicaments les plus fréquemment appliqués dans le monde et est généralement considéré comme un médicament analgésique et antipyrétique sûr à dose thérapeutique, qui manque cependant d'une activité anti-inflammatoire et antiplaquettaire appréciable [10]. Le mécanisme des effets analgésiques et antipyrétiques du paracétamol n'est pas complètement établi, mais l'inhibition de l'activité de la PGHS par le paracétamol dans différents types de cellules et de tissus est généralement considérée comme le principal mode d'action analgésique et antipyrétique du paracétamol. La PGHS possède à la fois une activité peroxydase et cyclooxygénase. On pense que le paracétamol inhibe le site catalytique de la peroxydase de la PGHS, contrairement à la majorité des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et aux inhibiteurs de la PGHS2. In vitro, le paracétamol est un inhibiteur beaucoup plus puissant de la synthèse des prostanoïdes dans les cellules endothéliales que dans les plaquettes. En particulier, le paracétamol est un faible inhibiteur de la TxA2 synthèse dans les plaquettes. Il est également remarquable que le pouvoir inhibiteur du paracétamol soit inversement corrélé à la concentration de PGHS (pour une revue, voir [10]). Ces caractéristiques particulières distinguent le paracétamol des AINS dont l'acide acétylsalicylique (AAS).

In vitro, l'activité PGHS peut être évaluée en mesurant le taux de production de divers prostanoïdes primaires, tels que les PGE2, IGP2, et TxA2. En raison de la remarquable instabilité chimique du PGI2 et TxA2, leurs produits d'hydrolyse stables, c'est-à-dire le 6-céto-PGF1?? et TxB2, respectivement, sont mesurés au lieu de PGI2 et TxA2 [11]. In vivo, mesure de PGE2, 6-céto-PGF1??, et TxB2 dans le plasma est associée à une synthèse artéfactuelle de prostanoïdes lors des prélèvements sanguins et peut conduire à des conclusions erronées en ce qui concerne l'activité de la PGHS [12]. Cela s'applique particulièrement à TxA2 qui est produit en grande quantité dans les plaquettes activées [13]. Mesure du PGE2 dans l'urine reflète la PGE rénale2 synthèse. La mesure des principaux métabolites urinaires des prostanoïdes, tels que le 2,3-dinor-TxB, est bien plus fiable.2 pour TxA2, 2,3-dinor-6-céto-PGF1?? pour IGP2, et le principal métabolite urinaire de la PGE2 (PGE-MUM) pour les PGE systémiques2 fabrication [11]. Cela peut être mieux accompli au moyen de technologies analytiques qui ont une sensibilité et une sélectivité inhérentes élevées telles que la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) et plus encore la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse en tandem (GC-MS/MS) (pour un examen, voir [11]).

Récemment, Sudano et ses collègues [9] ont rapporté que le paracétamol (1 g TID pendant 2 semaines en plus du traitement cardiovasculaire standard) augmentait la pression artérielle systolique et diastolique moyenne en ambulatoire d'environ 3 et 2 mmHg, respectivement, sans modifier la fonction de l'endothélium et des plaquettes chez les patients. avec une maladie coronarienne (CAD). Soudano et al. [9] ont conclu que, en particulier chez les patients à risque cardiovasculaire accru, l'utilisation du paracétamol doit être évaluée aussi rigoureusement que les AINS traditionnels et les inhibiteurs sélectifs de la COX2. Dans cette étude, les PGE plasmatiques et urinaires2 ainsi que le plasma TxB2 n'a pas changé lors de l'administration de paracétamol [9]. Cependant, comme mentionné ci-dessus, la mesure de la PGE2 et TxB2 dans le plasma est sujette à une synthèse de prostanoïdes artéfactuelle [12, 13], alors que la mesure de PGE2 dans l'urine ne fournit pas d'informations sur la synthèse catalysée par la PGHS des deux antagonistes TxA2 et IGP2 [11].

Chez l'homme, l'administration orale de paracétamol (500 mg) n'a pas entraîné de diminution du taux d'excrétion du 2,3-dinor-TxB.2, contrairement à l'aspirine (500 mg) ou à l'indométacine (50 mg), mesurées par GC-MS [14]. De plus, contrairement à l'aspirine (3 g pendant 2 jours), il a été rapporté que l'administration orale de paracétamol (3 g pendant 2 jours) ne réduisait pas l'excrétion urinaire de PGE.2 mais pour réduire faiblement l'excrétion de PGE-MUM indiquant une inhibition de la PGE systémique2 synthèse [15]. D'autre part, il a été démontré qu'une dose orale unique de 500 mg de paracétamol réduisait le taux d'excrétion urinaire de 2,3-dinor-6-keto-PGF1?? pendant 6 à 8 h de 60 % au maximum (c.-à-d. inhibition de la PGI2 synthèse), sans réduire le taux d'excrétion urinaire du 2,3-dinor-TxB2 (c'est-à-dire pas d'inhibition de TxA2 synthèse) [16]. Les résultats de ces études in vivo chez l'homme suggèrent que le paracétamol administré par voie orale, à une dose unique de 500 mg ou à une dose cumulée de 3000 mg par jour, n'inhibe pas de manière remarquable la TxA.2 synthèse, mais il peut temporairement inhiber la PGI2 synthèse.

Les ramifications entre les voies NOS et COX ont été fréquemment étudiées dans le passé (examinées dans [4]), mais les résultats sont incohérents. Par exemple, dans les macrophages murins, le paracétamol, à des concentrations plasmatiques pharmacologiquement pertinentes (60-120 ??M), a été signalé comme n'affectant pas l'activité de l'iNOS [17]. À des concentrations suprapharmacologiques (2, 5 et 10 mM), il a été rapporté que le paracétamol inhibe l'expression du gène iNOS et l'activité iNOS dans les macrophages de la lignée cellulaire RAW 264.7 [18]. En revanche, il a été rapporté que le paracétamol (jusqu'à 10 mM) n'affectait pas l'activité neuronale de la NOS (nNOS) et de l'iNOS dans le cervelet du rat et les HUVEC [19]. D'autres ont rapporté que le paracétamol (100 ??M) n'a pas affecté l'activité de la nNOS dans le cervelet mais a inhibé l'activité de la NOS dans les tranches de moelle épinière murine telle que mesurée par le dosage de la L-citrulline radiomarquée [20]. L'effet du paracétamol sur in vivo chez l'homme est insaisissable.

Parce que le paracétamol, lorsqu'il est appliqué à des doses pharmacologiques, inhibe la synthèse de l'IGP vasodilatatrice et antiagrégante.2 beaucoup plus fort et durablement que la synthèse du TxA vasoconstricteur et thrombogène2 chez l'homme, nous nous sommes demandé si le changement d'équilibre induit par le paracétamol entre l'homéostasie vasodilatatrice/anti-agrégante et vasoconstrictrice/thrombogène liée à la COX pouvait induire des processus conduisant à une synthèse améliorée du NO vasodilatateur/anti-agrégant, contrecarrant ainsi la chute de la pression artérielle et l'activation plaquettaire. Les investigations préliminaires de notre groupe ont montré que le paracétamol, administré à des doses thérapeutiques à des humains en bonne santé (jusqu'à 10 mg/kg), ne modifiait pas la synthèse de NO du corps entier (données non présentées), suggérant qu'un effet potentiel du paracétamol sur l'activité de NOS est probable. d'exiger des doses suprapharmacologiques beaucoup plus élevées de ce médicament. Compte tenu de la puissance toxicologique de doses élevées de paracétamol, nous avons étudié les effets d'une dose orale unique de 3 g chez quatre volontaires sains. À notre connaissance, les effets d'une dose orale unique de paracétamol aussi élevée sur l'IGP2, TxA2, et la synthèse de NO chez l'homme n'a pas été étudiée jusqu'à présent. En raison de la dose élevée utilisée dans l'étude humaine, le paracétamol peut induire un stress oxydatif et diminuer la biodisponibilité du NO [21]. Nous avons donc mesuré le biomarqueur du stress oxydatif 15(S)-8-iso-PGF2?? [22] dans le plasma et l'urine. Le nitrite dans le plasma a été mesuré en tant que biomarqueur de la synthèse et de la biodisponibilité du NO (examiné dans [23]). De plus, nous avons réalisé des études in vitro sur la NOS endothéliale recombinante (eNOS) et la NOS inductible (iNOS) dans les hépatocytes de rat pour tester les effets potentiels du paracétamol sur la synthèse et la biodisponibilité du NO.

2. Matériels et méthodes

2.1. Sujets et performances de l'étude

Quatre adultes de sexe masculin non-fumeurs en bonne santé (âgés de 39, 40, 44 et 64 ans) ont participé à l'étude et ont donné leur consentement éclairé à l'étude. Les volontaires ont reçu par voie orale six comprimés de paracétamol à 500 mg (Ratiopharm) à la fois. La posologie était de 29 mg/kg pour le volontaire A et le volontaire B, de 37 mg/kg pour le volontaire C et de 52 mg/kg pour le volontaire D. Les volontaires n'étaient pas à jeun mais n'ont pas mangé dans les trois premières heures suivant l'administration de paracétamol. Avant et après l'administration de paracétamol, le sang veineux et l'urine ont été collectés à des intervalles de 30 et 60 min sur une période d'observation de 6 h pour l'analyse des paramètres biochimiques comme décrit ci-dessous. Du sang veineux (8 ml) a été prélevé en utilisant des vacutainers EDTA de 9 ml (Sarstedt, Allemagne) et centrifugé immédiatement (800 xg, 4°C, 5 min). Le plasma a été décanté, portionné en aliquotes de 0,1 et 1,0 ml selon les besoins pour chaque paramètre biochimique, et conservé congelé à -80°C jusqu'à l'analyse. L'urine provenant de la miction spontanée a été recueillie dans des tubes en polypropylène de 45 ml, aliquotée en portions de 0,1 et 1,0 ml selon les exigences des paramètres biochimiques individuels, et conservée à -20°C jusqu'à l'analyse.

2.2. Analyse des paramètres biochimiques dans l'étude humaine

Tous les échantillons de cette étude ont été analysés dans les 10 jours suivant le prélèvement. Dans les méthodes GC-MS et GC-MS/MS, des analogues marqués par des isotopes stables ont été utilisés comme étalons internes comme indiqué dans les références respectives citées ci-dessous. Nous avons constaté que le paracétamol ajouté à un pool de plasma humain à des concentrations de 10, 25, 50, 75 et 100 mg/L n'interférait pas avec l'analyse des paramètres biochimiques mesurés dans les échantillons de plasma de l'étude (données non présentées). Les données de cette étude sont rapportées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM).

2.2.1. Mesure du paracétamol

La concentration plasmatique de paracétamol a été déterminée par HPLC en phase inverse (250 × 4 mm i.d., 5 ??m) avec élution isocratique (phase mobile : 45 mM sulfate d'ammonium-acétonitrile, 10 : 1, débit v/v : 1 mL/min) avec détection d'absorbance UV à 236 nm.

2.2.2. Mesure des prostanoïdes et de la créatinine

IGP2 et TxA2 la synthèse a été évaluée par GC-MS/MS en mesurant dans des aliquotes d'urine de 1 mL les principaux métabolites urinaires respectifs [11], à savoir le 2,3-dinor-6-keto-PGF1?? et 2,3-dinor-TxB2, exactement comme décrit ailleurs [24]. PGE2 et libre non conjugué 15( )-8-iso-PGF2?? dans l'urine (1 mL) et libre 15(S)-8-iso-PGF2?? dans le plasma (1 mL) ont été mesurés par GC-MS/MS après extraction par chromatographie sur colonne d'immunoaffinité comme décrit précédemment [25]. Le taux d'excrétion urinaire des eicosanoïdes a été corrigé de l'excrétion de créatinine [11] et est exprimé en nmol de prostanoïde/mol de créatinine. La créatinine urinaire a été mesurée dans 10 ??L aliquotes d'urine par GC-MS comme rapporté ailleurs [26].

2.2.3. Analyse de la voie L-Arginine/NO

Le nitrite et le nitrate ont été mesurés simultanément dans 100 ??L aliquotes de plasma ou d'urine par GC-MS comme décrit ailleurs [27]. Le taux d'excrétion urinaire de nitrite et de nitrate a également été corrigé pour l'excrétion de créatinine. L'arginine et l'inhibiteur endogène de l'activité NOS diméthylarginine asymétrique (ADMA) ont été mesurés par GC-MS et GC-MS/MS, respectivement, dans 100 ??L aliquotes d'ultrafiltrat obtenu à partir de plasma par centrifugation selon les procédures précédemment rapportées [8].

2.2.4. Analyses supplémentaires

L'homocystéine totale (hCys) dans le plasma (0,1 ml) a été mesurée par un dosage immunologique par polarimétrie de fluorescence (FPIA) disponible dans le commerce. L'activité CYP in vivo [28] a été évaluée en mesurant l'oxyde d'acide oléique (cis-EpOA) dans des aliquotes de 1 mL de plasma comme décrit ailleurs [29].

2.2.5. Contrôle de qualité

Les échantillons de contrôle qualité (CQ) ont été analysés avec les échantillons d'étude pour tous les paramètres biochimiques. L'exactitude et la précision des échantillons de CQ se situaient dans les plages généralement acceptées, c'est-à-dire que les niveaux de biais et d'imprécision étaient inférieurs à 20 %.

2.3. Effet du paracétamol sur l'activité eNOS humaine recombinante

L'effet du paracétamol sur l'activité de la NOS in vitro a été étudié en utilisant une NOS endothéliale humaine recombinante disponible dans le commerce (ALEXIS, Grünberg, Allemagne) (heNOS) et en mesurant simultanément la formation de [ 15 N]nitrite et de [ 15 N]nitrate à partir de L- [guanidine- 15 N2]arginine par dosage GC-MS [30]. Les incubations ont été réalisées à 37°C dans du tampon phosphate de potassium 50 mM (1000 ??L, pH 7) contenant de l'héNOS (50 ??g/mL), L-[guanidine- 15N2]-arginine (20 ??M, Cambridge Isotope Labs, Andover, MA, USA), et tous les cofacteurs NOS (tous achetés auprès de Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne) et groupes prothétiques (10 ??M tétrahydrobioptérine, 800 ??M NADPH, 5 ans ??M FAD, 5 ??M pour FMN, 500 nM de calmoduline et 500 ??M CaCl2 (Merck, Darmstadt, Allemagne)). Les réactions ont été interrompues par l'ajout de 400 ??L des aliquotes d'acétone glacé et des échantillons ont été traités pour l'analyse GC-MS du [ 15 N]nitrite et du [ 15 N]nitrate. Du nitrite et du nitrate non marqués ont été utilisés comme étalons internes pour le [ 15 N]nitrite et le [ 15 N]nitrate, respectivement. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (SD) à partir de deux expériences indépendantes.

2.4. Effet du paracétamol sur l'activité iNOS dans les hépatocytes de rat en culture proliférant in vitro

L'effet du paracétamol sur l'activité iNOS a été étudié dans des hépatocytes primaires de rat proliférant in vitro comme décrit récemment en mesurant la formation de [ 15 N]nitrite et [ 15 N]nitrate par GC-MS [31]. Dans certaines expériences, LiCl (10 mM) a été utilisé pour améliorer l'expression de l'ARNm iNOS et la croissance cellulaire [31]. Les incubations ont été réalisées à 37°C en présence de 5 mM de L-[guanidine- 15N2]-arginine ajoutée au temps -22 h. Les réactions ont été arrêtées par l'ajout de 400 ??L des aliquotes d'acétone glacée et des échantillons ont été traités pour l'analyse GC-MS du [ 15 N]nitrite et du [ 15 N]nitrate. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD à partir de trois expériences indépendantes.

2.5. Analyses statistiques

En raison des différences considérables dans les concentrations de base de certains des paramètres biochimiques mesurés chez les quatre sujets, les changements et la signification statistique ont été calculés en fixant les niveaux de base respectifs à 100 %. Signification statistique (

) a été évalué en utilisant

-tester et comparer les données obtenues à différents moments aux valeurs de base ou aux valeurs de 0,5 h lorsque les changements en pourcentage ont été comparés.

3. Résultats

3.1. Effet du paracétamol à haute dose sur l'activité COX, NOS et CYP et sur le stress oxydatif chez l'homme

Concentration plasmatique maximale moyenne de paracétamol (

) était de 30,2 mg/L (200 ??mol/L) (Figure 1). Cette valeur est cohérente avec une valeur d'environ 20 mg/L qui a été atteinte après administration orale de 2000 mg de paracétamol [32]. Dans les échantillons d'urine, nous avons mesuré par HPLC en phase inverse avec détection de l'absorbance UV des taux d'excrétion corrigés par la créatinine comparables des métabolites du paracétamol glucuronide et du sulfate (données non présentées).


Concentration plasmatique de paracétamol avant et après administration (le temps zéro est indiqué par la flèche en pointillés) d'une dose orale unique de 3 g de paracétamol à quatre sujets masculins. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM.

Après prise de 3 g de paracétamol, diminution considérable et soutenue du 2,3-dinor-6-keto-PGF corrigé par la créatinine1?? un taux d'excrétion a été observé, suggérant une forte PGI2 inhibition par le paracétamol (Figure 2(a)). IGP maximale et statistiquement significative2 une inhibition d'environ 60 à 70 % a été atteinte 1 h, 1,5 h et 2,5 h après l'administration de paracétamol. L'étendue de la diminution observée dans le 2,3-dinor-6-keto-PGF1?? le taux d'excrétion dans la présente étude est comparable à celui observé lors de l'administration d'une dose orale de 500 mg de paracétamol [14]. Le paracétamol n'a causé qu'une diminution modérée et statistiquement insignifiante du 2,3-dinor-TxB2 excrétion chez les quatre volontaires (Figure 2(b)). Chez trois volontaires sur quatre, TxA maximum2 une inhibition d'environ 70 % a été atteinte 1,5 h après l'administration, mais la durée de TxA2 l'inhibition était relativement courte (non montrée). La figure 2(c) montre que l'IGP2/TxA2 le rapport molaire a diminué d'un facteur de 2 à 3 lors de l'administration de paracétamol, bien que la signification statistique ait échoué d'un cheveu 1,5 h (

) et 2,5 h ( ) après l'ingestion de paracétamol. Le paracétamol semble diminuer très faiblement l'excrétion de PGE2 dans l'urine (Figure 2(d)), suggérant que même 3 g de paracétamol pris en une seule fois ne sont pas capables d'inhiber la synthèse rénale de PGE2 chez les quatre volontaires inclus dans l'étude.


(une)
(b)
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(ré)
(une)
(b)
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(ré) Effet d'une dose orale unique de 3 g de paracétamol sur la synthèse systémique de prostacycline et de thromboxane et sur la synthèse rénale de PGE2 chez quatre volontaires sains (le temps zéro et les valeurs de base sont indiqués par des flèches en pointillés). (a) Excrétion urinaire corrigée par la créatinine de la 2,3-dinor-6-céto-prostaglandine F1?? (2,3-dn-6k-PGF1??) comme mesure de l'IGP systémique2 synthèse. (b) Excrétion urinaire corrigée par la créatinine du 2,3-dinor-thromboxane B2 (2,3-dn-TxB2) comme mesure du TxA systémique2 synthèse. (c) IGP2/TxA2 rapport molaire calculé à partir du 2,3-dn-6k-PGF1?? et 2,3-dn-TxB2 taux d'excrétion indiqués en (a) et (b), respectivement. (d) Excrétion urinaire de PGE corrigée par la créatinine2 comme mesure de la PGE rénale2 synthèse. Un astérisque en (a) indique une signification statistique (

Les modifications induites par le paracétamol dans la synthèse systémique de la prostacycline n'étaient pas accompagnées de modifications notables de la concentration plasmatique de hCys totale (Figure 3 (a)) ou du taux d'excrétion urinaire de 15 libre(S)-8-iso-PGF2?? (Figure 3 (b)), suggérant aucune élévation ou réduction du stress oxydatif lors de l'administration de paracétamol à forte dose.


(une)
(b)
(une)
(b) Effet d'une dose orale unique de 3 g de paracétamol sur le stress oxydatif chez quatre volontaires sains (le temps zéro et la valeur de base sont indiqués par des flèches en pointillés). (a) concentration plasmatique totale d'homocystéine (hCys) et (b) taux d'excrétion urinaire corrigé par la créatinine de 15 (S)-8-iso-prostaglandine F2?? (15(

En raison de la différence considérable dans les concentrations plasmatiques de base de nitrite et de nitrate mesurées chez les quatre sujets, les changements dans les nitrites et nitrates plasmatiques ont été calculés et présentés en pourcentage des niveaux de base respectifs. La figure 4(a) montre des augmentations modérées de la concentration plasmatique de nitrite qui étaient statistiquement significativement plus élevées lorsque les valeurs de 2,5 et 3,5 h étaient comparées aux valeurs de 0,5 h. Les changements dans les concentrations plasmatiques de nitrate (Figure 4(b)) et l'excrétion urinaire de nitrite (Figure 4(c)) et de nitrate urinaire (Figure 4(d)) n'étaient pas statistiquement significativement différents. Enfin, les concentrations plasmatiques d'Arg et d'ADMA n'ont pas changé lors de l'ingestion de paracétamol (Figure 4 (e)).


(une)
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(c)
(ré)
(e) Effet d'une dose orale unique de 3 g de paracétamol sur les nitrites plasmatiques (a) et urinaires (c), les nitrates plasmatiques (b) et urinaires (d) et l'arginine plasmatique (Arg) et la diméthylarginine asymétrique (ADMA) (e) chez quatre volontaires sains (le temps zéro et les valeurs de base sont indiqués par des lignes pointillées). Les données dans le plasma sont présentées sous forme de variations en pourcentage des concentrations plasmatiques de base de nitrite (1,26, 3,04, 3,76 et 4,05 ??M) et les concentrations plasmatiques de base de nitrate (37,3, 42,5, 26,8 et 52,9 ??M), respectivement. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Un astérisque indique une signification statistique (

Auparavant, nous avons montré que l'activité corporelle totale des isoformes du CYP peut être évaluée en mesurant la concentration de l'oxyde d'acide oléique libre, c'est-à-dire non estérifié. cis-EpOA dans le plasma [28]. La figure 5 montre une augmentation brutale du plasma moyen cis-Concentration d'EpOA 2,5 h après l'administration de paracétamol suivie d'une chute brutale au niveau de base 1 h plus tard. Ce résultat peut suggérer une élévation à très court terme de l'activité du CYP induite par le paracétamol. Cependant, nous avons également trouvé un changement très similaire dans la concentration plasmatique de 15( )-8- libreiso-PGF2?? (Illustration 5). Auparavant, nous avons observé que l'ajout de phospholipase A2 (APL2) au sérum humain a augmenté en parallèle la concentration des deux cis-EpOA et gratuit 15( )-8-iso-PGF2?? [25]. Par conséquent, les augmentations temporaires du chômage partiel cis-EpOA et 15(S)-8-iso-PGF2?? vu 2,5 h après l'administration de paracétamol peut avoir résulté de la libération de PLA probablement hépatique2 dans le sang.


Effet d'une dose orale unique de 3 g de paracétamol sur le sérum cis-acide époxyoctadécanoïque (cis-EpOA) et 15(

)-8-iso-PGF2?? chez quatre volontaires sains (le temps zéro et la valeur de base sont indiqués par des lignes pointillées). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Notez l'échelle logarithmique sur le

-axe. Seule la concentration de 2,5 h de cis-EpOA était statistiquement significativement différent (

3.2. Effets du paracétamol sur l'activité heNOS recombinante et iNOS dans les hépatocytes de rat

À la concentration thérapeutiquement pertinente de 100 ??M (c'est-à-dire 15 mg/L), le paracétamol n'a eu qu'un faible effet sur la formation de [ 15 N]nitrite et de [ 15 N]nitrate dans les mélanges d'incubation d'un heNOS recombinant (figure 6). La régression linéaire de l'analyse entre les concentrations de [ 15 N]nitrite et [ 15 N]nitrate en présence de paracétamol versus les concentrations de [ 15 N]nitrite et [ 15 N]nitrate en l'absence de paracétamol a révélé une valeur de pente de 0,834 (Figure 6(b)). Cette découverte suggère que le paracétamol a inhibé la formation de 15 NO catalysée par heNOS (c.guanidine- 15N2]-arginine en moyenne de 16,6 %, notamment pour des temps d'incubation supérieurs à 10 min. De petits effets similaires du paracétamol sur l'iNOS ont également été observés dans des expériences avec des hépatocytes de rats adultes proliférant in vitro indépendamment de la présence de LiCl (figure 7). Il est bien établi que le peroxynitrite peut transformer le paracétamol en 3-nitroparacétamol [33].Dans les échantillons contenant du paracétamol provenant à la fois de la heNOS recombinante et des hépatocytes de rat iNOS, aucun 3-[ 15 N]nitroparacétamol n'a été détecté par GC-MS/MS au-dessus de la limite de quantification (environ 1 nM), suggérant aucune formation de peroxynitrite ( données non présentées).


(une)
(b)
(une)
(b) Effet du paracétamol (APAP) à 100 ??M (15 mg/L) sur la formation de [ 15 N]nitrite et de [ 15 N]nitrate dans un mélange d'incubation de heNOS recombinant sur le temps d'incubation (a) et analyse de régression linéaire entre [ 15 N]nitrite et [ 15 N] concentrations en nitrates mesurées en présence et en absence de paracétamol (b). Les données en (a) sont présentées sous forme de moyenne ± SD à partir de deux expériences indépendantes, aucune analyse statistique n'a été effectuée.

(une)
(b)
(une)
(b) Effet du paracétamol (APAP) à 100 ??M (15 mg/L) sur le rapport d'aire de pic de m/z 47 pour le [ 15 N]nitrite à m/z 46 pour le [ 14 N]nitrite (a) et sur le rapport d'aire de pic de m/z 63 pour [ 15 N]nitrate à m/z 62 pour [ 14 N]nitrate (b) lors de l'incubation d'hépatocytes de rat adulte avec L-[guanidine- 15N2]-arginine (5 mM) en l'absence et en présence de LiCl (1 mM) pendant les temps indiqués à 37°C comme décrit par ailleurs [8]. Les réactions ont été arrêtées par l'ajout de 400 ??L des aliquotes d'acétone glacé et des échantillons ont ensuite été traités pour une analyse GC-MS. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD à partir de trois expériences indépendantes, aucune analyse statistique n'a été effectuée.

4. Discussion

4.1. Remarques générales et objectif de l'étude

Le paracétamol est généralement supposé augmenter le stress oxydatif et est donc couramment utilisé dans les modèles animaux de stress oxydatif, dans lesquels le paracétamol est administré à des doses élevées exorbitantes [21]. On ne sait pas si le paracétamol, lorsqu'il est administré à des doses thérapeutiques, agit également comme prooxydant. Le paracétamol est connu pour interagir avec de nombreuses enzymes telles que CYP, COX et NOS, qui elles-mêmes sont connues pour contribuer au stress oxydatif, par exemple en produisant des anions radicaux superoxydes. Alors que l'effet inhibiteur du paracétamol sur la synthèse de la prostacycline in vivo chez l'homme est bien établi [16], ses effets sur la synthèse du thromboxane et du NO ainsi que sur l'activité du CYP sont incomplètement compris. Ceci peut être dû à des concentrations intracellulaires de paracétamol insuffisamment élevées lorsque ce médicament est administré à des doses thérapeutiques, par exemple, par administration orale d'un comprimé de paracétamol à 500 mg. Le but de ce travail était d'étudier chez l'homme sain les effets du paracétamol à forte dose (c'est-à-dire 3 g) sur l'activité de la COX, NOS et CYP, ainsi que sur le stress oxydatif. Compte tenu de l'hépatotoxicité bien connue du paracétamol, seuls quatre sujets sains ont été inclus dans l'étude chez l'homme. En utilisant des concentrations de paracétamol qui devraient persister pendant une période de temps considérable après l'administration d'une dose orale unique de 3 g à l'homme, nous avons étudié les effets du paracétamol à des concentrations suprapharmacologiques sur l'activité de deux isoformes de NOS in vitro, c'est-à-dire sur eNOS et iNOS humaines recombinantes dans des hépatocytes de rat.

4.2. Effets du paracétamol sur la voie de la cyclooxygénase

En considérant une fraction moyenne (biodisponibilité orale,

) valeur de 88 % pour le paracétamol [32], son volume de distribution moyen (

) chez les volontaires de l'étude humaine décrite dans cet article est estimée à 88 L. Cette valeur est presque 25 fois plus élevée que le volume plasmatique estimé des volontaires et suggère que le paracétamol peut atteindre des concentrations allant jusqu'à environ 5000 ??M dans d'autres compartiments du corps, à l'exception des globules rouges. Des concentrations aussi élevées seraient suffisamment élevées pour inhiber la prostacycline (PGI2) et le thromboxane (TxA2) synthèse respectivement dans les cellules endothéliales et les plaquettes [10].

En effet, le paracétamol, à la dose orale unique élevée de 3 g, a fortement inhibé la synthèse catalysée par la PGHS de la PGI.2, un puissant vasodilatateur et inhibiteur de l'agrégation plaquettaire. En revanche, la synthèse de TxA2, un puissant vasoconstricteur et activateur plaquettaire, s'est avéré ne pas être significativement inhibé par le paracétamol chez quatre sujets. Effets relatifs des médicaments sur l'IGP2 et TxA2 synthèse sont communément estimées en utilisant le rapport molaire des prostanoïdes [34]. Dans notre étude, l'administration orale d'une dose unique de 3 g de paracétamol par voie orale a diminué le PGI moyen2/TxA2 rapport molaire d'environ 0,6 avant l'administration à des valeurs comprises entre 0,4 et 0,2 après l'administration, décalant ainsi le vasodilatateur (PGI2)/vasoconstricteur (TxA2) équilibre au prix d'une vasodilatation. Une conséquence d'un tel changement peut être une augmentation de la pression artérielle. En effet, Sudano et ses collègues ont découvert que l'administration chronique de paracétamol à des patients coronariens à une dose plus faible (1 g TID pendant 2 semaines) que dans la présente étude entraînait une faible augmentation de la pression artérielle [9]. Il convient de mentionner que dans l'étude de Sudano et al. [9] des concentrations plasmatiques de paracétamol considérablement plus faibles avaient été atteintes par rapport à celles que nous avons mesurées dans notre étude. En confirmation des études précédentes [9, 15], nous avons constaté que l'excrétion de PGE2 n'a pas changé lors de l'administration de paracétamol, ce qui suggère que même une dose élevée de 3 g de paracétamol n'a pas modifié de manière significative la PGE rénale2 production chez les volontaires.

4.3. Effets du paracétamol sur la voie L-Arginine/NO

Les effets du paracétamol sur l'expression et l'activité de la NOS ont été étudiés par plusieurs groupes. Pourtant, les observations sont contradictoires [17–20]. Dans notre étude humaine, le paracétamol a augmenté temporairement la concentration de nitrite dans le plasma. Comme la majeure partie du nitrite circulant peut provenir du NO produit dans l'endothélium [23], nos résultats in vivo peuvent indiquer que le paracétamol a augmenté l'activité de l'eNOS et/ou l'expression de l'eNOS 2,5 à 3,5 h après l'administration. Pourtant, d'autres moyens tels que la réduction des nitrates en nitrites induite par le paracétamol peuvent également avoir augmenté les concentrations plasmatiques de nitrite chez les volontaires. Le paracétamol n'a pas modifié la concentration plasmatique de deux autres paramètres principaux de la voie L-arginine/NO, à savoir la L-arginine et l'ADMA. In vitro, le paracétamol n'a eu qu'un très faible effet inhibiteur sur la heNOS recombinante isolée et sur l'iNOS dans les hépatocytes de rat adulte proliférant in vitro. LiCl qui est connu pour induire l'expression et l'activité de l'iNOS dans les hépatocytes de rat [31] a augmenté l'activité de l'iNOS mais n'a pas modifié la biodisponibilité du NO. Ainsi, ni le paracétamol ni le LiCl n'ont influencé le stress oxydatif lié à l'iNOS dans les hépatocytes de rat.

4.4. Effets du paracétamol sur la voie du cytochrome P450

Le paracétamol est oxydé par la famille CYP en NAPQI (

-benzoquinone imine), l'intermédiaire toxique du paracétamol. Les acides gras insaturés, y compris l'acide arachidonique et l'acide oléique, sont des substrats des enzymes CYP [28, 35], et certains des époxydes d'acide arachidonique sont des composés vasoactifs [35]. À des concentrations élevées (par exemple, 1000 ??M), le paracétamol peut inhiber l'activité des isoformes du CYP. Dans notre étude humaine, le paracétamol a augmenté temporairement la concentration plasmatique de l'oxyde d'acide oléique cis-EpOA. Comme cis-EpOA est un marqueur de l'activité du CYP chez l'homme [28], ce résultat peut suggérer que le paracétamol augmente l'activité du CYP pendant une très courte période de temps. Une autre explication de l'augmentation très brève du plasma cis-La concentration d'EpOA pourrait être l'activation de la phospholipase A extracellulaire2 (APL2) activité ou libération de PLA hépatique2 dans la circulation sanguine par le paracétamol, car une fraction considérable de cis-EpOA se trouve estérifiée en lipides sériques humains [28]. Cette dernière explication est étayée par la découverte que la concentration plasmatique de 15( )-8- libreiso-PGF2?? affiché un parcours similaire y compris le maximum pointu comme cis-EpOA dans la présente étude humaine. Il convient de mentionner que les deux 15(S)-8-iso-PGF2?? et cis-Les EpOA sont libérées en parallèle des lipides sériques lors de l'incubation avec le PLA2 [28]. À l'heure actuelle, on sait très peu de choses sur les effets du paracétamol sur le PLA2 activité et/ou expression. Contrairement à l'indométacine, le paracétamol (à 1000 ??M) s'est avéré ne pas inhiber le PLA extracellulaire2 activité mesurée à l'aide d'acide oléique radiomarqué estérifié en E. coli membranes [36]. Chez la souris, l'hépatotoxicité induite par le paracétamol à la dose de 400 mg/kg, soit environ 10 fois plus élevée que dans notre étude humaine, s'est avérée associée à un mode dépendant du temps avec une sécrétion accrue de PLA hépatique.2 qui était exacerbée en l'absence de COX-2 hépatique [37]. Ainsi, l'augmentation temporaire de cis-EpOA et 15(S)-8-iso-PGF2?? observée dans notre étude peut être due à une hépatotoxicité à court terme induite par le paracétamol chez les sujets sains.

4.5. Effets du paracétamol sur le stress oxydatif

Dans l'étude humaine, le paracétamol (3 g) n'a pas augmenté le stress oxydatif tel qu'évalué en mesurant l'excrétion urinaire du biomarqueur du stress oxydatif 15( )-8-iso-PGF2?? [21, 22]. Comme indiqué ci-dessus, l'augmentation brutale et de courte durée de la concentration plasmatique de 15( )-8- libreiso-PGF2?? est probablement dû à la libération temporaire de PLA2 du foie et/ou due à l'activation du PLA extracellulaire2. À cette dose élevée, le paracétamol n'a pas augmenté la hCys plasmatique totale, ce qui est généralement supposé être associé au stress oxydatif. Compte tenu de la fraction phénolique piégeant les ROS du paracétamol ( -acétyl- -aminophénol), l'échec du paracétamol à augmenter le stress oxydatif semble raisonnable. Le F2-isoprostane 15( )-8-iso-PGF2?? est connu pour être produit à partir de l'AA par l'action catalytique de la COX [38]. Contrairement à l'acide acétylsalicylique, l'indométacine et le célécoxib [25, 39], notre étude indique que le paracétamol (3 g) n'inhibe pas la formation COX-dépendante de 15( )-8-iso-PGF2?? chez les humains.

5. Conclusion

Nous avons étudié les effets in vitro et in vivo du paracétamol, un médicament phénolique analgésique et antipyrétique, sur les voies biochimiques L-Arg/NO, AA/COX et CYP et sur le stress oxydatif. À la dose orale unique élevée de 3 g, le paracétamol n'a pas modifié le stress oxydatif in vivo. À des concentrations suprapharmacologiques, le paracétamol n'a pas non plus modifié le stress oxydatif in vitro, comme l'ont révélé les rapports molaires nitrite/nitrate inchangés mesurés dans des mélanges d'incubation de heNOS recombinant et dans des cultures d'hépatocytes de rat adulte qui expriment l'iNOS. La puissante IGP2 L'inhibition par le paracétamol à forte dose chez les sujets sains de la présente étude suggère que l'augmentation relativement faible de la pression artérielle observée chez les patients coronariens par d'autres [9] est probablement due à des mécanismes compensatoires impliquant une formation accrue de vasodilatateurs. Les candidats potentiels sont le NO et les acides époxyeicosatriénoïques (EET). Dans la circulation, le NO peut être produit à partir de la L-arginine par l'action catalytique d'eNOS et/ou de nitrite/nitrate. Les EET sont produites à partir de l'acide arachidonique par l'action catalytique de la famille CYP [34]. Nos résultats suggèrent que chez les sujets sains, le NO peut compenser la perte de la prostacycline vasodilatatrice et antiagrégante causée par le paracétamol à haute dose (Figure 8). De plus, le paracétamol n'augmente pas le stress oxydatif même lorsqu'il est administré à des doses suprapharmacologiques. Nous supposons que chez les humains en bonne santé, le changement de l'IGP induit par le paracétamol2/TxA2 l'équilibre est contrecarré par une augmentation concomitante de la production de NO circulant. Les mécanismes sous-jacents restent insaisissables. Les mécanismes contributifs possibles peuvent inclure l'élévation du NO dans l'endothélium et la conversion du nitrate en nitrite et sa réduction consécutive en NO. Chez les patients souffrant de maladies cardiovasculaires, c'est-à-dire avec un endothélium dysfonctionnel, le paracétamol ne contrecarre que partiellement son effet vasodilatateur/vasoconstricteur défavorable via le NO.


(une)
(b)
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Voir la vidéo: Lecture 4. Metabolism in Escherichia coli (Septembre 2022).


Commentaires:

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