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Pourquoi l'inhibition de RTK n'aidera pas dans un cas d'EGF mutant ?

Pourquoi l'inhibition de RTK n'aidera pas dans un cas d'EGF mutant ?


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On m'a donné ce qui suit comme exemple pour une question de quiz mais je ne comprends pas la réponse. Toute aide sera la bienvenue :

Question: Iressa est un inhibiteur de la tyrosine kinase. En tant que jeune oncologue, à qui des patients recommanderez-vous ne pas pour prendre ce traitement :

une. La biopsie a montré que le récepteur EGF est mutant

b. La biopsie a montré que la protéine RAS est mutante

c. La biopsie a montré que la MAP Kinase reste en permanence dans le noyau

ré. Le traitement peut aider chacun des cas a, b, c.

La bonne réponse devrait être a. Quelqu'un peut-il voir pourquoi et aider ici?

Je sais que le récepteur tyrosine kinase est la partie interne du récepteur EGF (où les deux monomères deviennent un dimère et se phosphorent mutuellement). Donc, si le récepteur EGF est mutant, ne devrait-il pas aider à inhiber sa continuation à l'intérieur de la cellule et ainsi empêcher de nombreuses cascades EGF ?

Merci!


Sauvetage basé sur le facteur de croissance aux inhibiteurs du récepteur tyrosine kinase (RTK) par phosphorylation d'Akt et d'Erk dans l'astrocytome et l'épendymome pédiatriques de bas grade

Jusqu'à présent, plusieurs études cliniques ont été lancées pour étudier la pertinence des inhibiteurs des récepteurs tyrosine kinase (RTK) sur la survie sans progression dans diverses tumeurs cérébrales pédiatriques. Cependant, l'inhibition de la kinase ciblée unique a échoué, probablement en raison de mécanismes de résistance tumorale. La présente étude étendra nos observations précédentes selon lesquelles le récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFR)-2, le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR)β, Src, la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique (ErbB) et le récepteur du facteur de croissance des hépatocytes (HGFR/ cMet) sont des cibles potentiellement médicamenteuses dans l'astrocytome et l'épendymome pédiatriques de bas grade avec des investigations concernant le sauvetage par facteur de croissance. Ceci a été étudié dans des lignées cellulaires pédiatriques d'astrocytome et d'épendymome de bas grade traitées avec des inhibiteurs du récepteur tyrosine kinase (RTK) e.g. le sorafénib, le dasatinib, le canertinib et le crizotinib. Les analyses par cytométrie en flux ont montré un pourcentage élevé de cellules exprimant VEGFR-1, le récepteur du facteur de croissance des fibroblastes (FGFR)-1, ErbB1/EGFR, HGFR et le récepteur d'origine nantais (RON) (respectivement 52-77%, 34-51%, 63 -90%, 83-98%, 65-95%). Leurs inhibiteurs respectifs ont induit une diminution de la viabilité cellulaire, mesurée avec des tests de viabilité cellulaire WST-1. Au moins, cela était partiellement dû à l'augmentation des niveaux d'apoptose mesurés par les tests d'apoptose à l'annexine V/iodure de propidium. L'EGF, le HGF et le FGF, qui sont normalement exprimés dans le tissu cérébral (tumeur), se sont révélés être des facteurs de croissance induisant un sauvetage efficace entraînant une survie cellulaire accrue, en particulier pendant le traitement par dasatinib (sauvetage complet) ou sorafenib (sauvetage partiel). Le sauvetage par facteur de croissance était moins important lorsque le canertinib ou le crizotinib étaient utilisés. Le sauvetage a été souligné par l'activation significative de la phosphorylation d'Akt et/ou d'Erk en aval et une augmentation de la migration des cellules tumorales. Le traitement combiné s'est avéré capable de surmonter le sauvetage induit par le facteur de croissance. En conclusion, notre étude met en évidence l'importance considérable des facteurs de croissance présents dans l'environnement dans le développement de la fuite tumorale vers les inhibiteurs de RTK dans l'astrocytome et l'épendymome pédiatriques de bas grade. Il est très intéressant d'anticiper ces résultats pour la conception de nouveaux essais thérapeutiques avec des inhibiteurs de RTK dans ces tumeurs cérébrales pédiatriques.

Citation: Sie M, den Dunnen WFA, Lourens HJ, Meeuwsen-de Boer TGJ, Scherpen FJG, Zomerman WW, et al. (2015) Sauvetage axé sur le facteur de croissance aux inhibiteurs du récepteur tyrosine kinase (RTK) par phosphorylation Akt et Erk dans l'astrocytome et l'épendymome pédiatriques de bas grade. PLoS ONE 10(3) : e0122555. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0122555

Éditeur académique : Ilya Ulasov, Institut suédois de neurosciences, ÉTATS-UNIS

A reçu: 29 décembre 2013 Accepté: 23 février 2015 Publié : 23 mars 2015

Droits d'auteur: © 2015 Sie et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous les termes de la Creative Commons Attribution License, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'auteur original et la source soient crédités

Le financement: Ce travail a été soutenu par une subvention de Jan Kornelis de Cock Stichting (code de projet 2013-75 à M. Sie). Le bailleur de fonds n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Intérêts concurrents : Les auteurs ont déclaré qu'ils n'existaient pas de conflit d'intérêts.


Introduction

Environ 50 % des mélanomes et 10 % des cancers colorectaux (CCR) hébergent des mutations ponctuelles V600E/K dans la kinase cytosolique BRAF. Alors que l'activation médiée par le récepteur de RAS-GTP régule normalement l'activité de l'enzyme en catalysant la formation de dimères BRAF, les mutations V600 entraînent une signalisation constitutive par le BRAF monomère, et la phosphorylation subséquente de MEK et ERK. 1 L'effecteur kinase ERK phosphoryle plus de 100 substrats cytosoliques et nucléaires, qui régulent l'activité enzymatique et l'expression des gènes, favorisant la prolifération et la survie cellulaire. 2

Le vémurafénib (Zelboraf®) et le dabrafénib (Tafinlar®) sont des inhibiteurs de BRAF compétitifs pour l'ATP (BRAFi) hautement sélectifs pour le mutant V600E, tous deux approuvés pour le traitement du mélanome métastatique. 3,4,5 Alors qu'environ la moitié des patients atteints de mélanome porteurs de cette mutation répondent au traitement par agent unique, la durée de la réponse est généralement inférieure à un an. Les réponses initiales sont en corrélation avec le degré de suppression des phospho-ERK (pERK) 6 et la résistance est souvent associée à la réactivation de la signalisation MAPK/ERK via une multitude de mécanismes génétiques et épigénétiques. 7,8,9,10 L'association avec les inhibiteurs de MEK (MEKi) cobimetinib (Cotellic®) ou trametinib (Mekinst®) permet d'obtenir une suppression pERK plus robuste, augmentant les taux de réponse globale (ORR) à plus de 70 % et prolongeant les deux sans progression survie et survie globale. 11,12,13

Suite à des réponses impressionnantes dans le mélanome, les thérapies BRAFi et MEKi ont été testées dans BRAF Cancers mutants V600E d'autres origines tels que colorectal. 14 L'activité clinique observée dans les petits essais initiaux a cependant été assez modeste par rapport aux patients atteints de mélanome, avec des taux de réponse de 5 % pour le vemurafenib en monothérapie, 15 et 12 % pour les associations BRAFi + MEKi (dabrafenib et trametenib). 16 Compte tenu de l'expression et de l'activité élevées du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) dans le CCR, la signalisation « de dérivation » via EGFR/RAS/CRAF a été postulée pour médier la résistance à BRAFi dans les modèles précliniques. 17, 18 L'ajout d'anticorps bloquant l'EGFR (EGFRi) tels que le cétuximab ou le panitumumab aux schémas BRAFi et MEKi a produit un bénéfice clinique supplémentaire modeste (ORR = 26% pour la triple combinaison), 19 mais toujours bien inférieur à ce qu'il est possible d'obtenir dans le mélanome. En tant que tel, il reste un besoin médical non satisfait de trouver des thérapies plus efficaces pour le traitement des BRAF V600E-CRC.

Si de tels cancers dépendent de la signalisation MAPK, nous avons estimé que les inhibiteurs d'ERK (ERKi) seuls ou dans le cadre de schémas thérapeutiques multi-médicaments pourraient être bénéfiques BRAF V600E -CRC, compte tenu de l'activité préclinique observée dans les modèles de mélanome et de CRC résistants aux inhibiteurs de BRAF et de MEK. 20,21,22,23 Un certain nombre d'inhibiteurs d'ERK, y compris BVD-523, SCH772984 et GDC-0994 (réf. 24) sont actuellement en développement préclinique et clinique précoce, mais il n'est pas clair si ces agents montreront plus activité clinique favorable par rapport aux inhibiteurs de MEK.

Pour l'évaluation prédictive de ces nouveaux agents anticancéreux, les xénogreffes dérivées de patients (PDX) apparaissent comme un outil précieux. 25 Cependant, le test systématique de schémas posologiques alternatifs et de combinaisons dans des panels de modèles de tumeurs génétiquement divers et cliniquement représentatifs via des « essais cliniques PDX » 26 est fastidieux et peu pratique en tant que plate-forme de développement de médicaments. Comme alternative, nous avons développé un modèle informatique prédictif de la voie MAPK et sa régulation de la croissance tumorale dans BRAF V600E -CRC, utilisant une approche quantitative basée sur la pharmacologie des systèmes, 27 qui :

Reproduit quantitativement les réponses de signalisation in vitro (lignée cellulaire) et les mécanismes génétiques de résistance aux inhibiteurs ciblés (voie MAPK)

Prédit les réponses de croissance tumorale in vivo (lignée cellulaire et xénogreffe dérivée du patient) aux traitements médicamenteux sur la base de ces mécanismes biochimiques et cellulaires sous-jacents

Reproduit les données cliniques disponibles sur les changements de taille des tumeurs en réponse aux traitements EGFRi, BRAFi et MEKi

Prédit les réponses cliniques à un nouvel ERKi (GDC-0994) 28 régimes de monothérapie et d'association


Matériaux et méthodes

Culture de cellules

Les cellules iKRAS ont été dérivées de souris porteuses de tumeurs P48 CRE_TetO-LSL-KRAS G12D_Rosa-rtTA_p53 fl/+ (15). Les tumeurs ont été hachées et digérées dans de la collagénase IV et éliminées (4 mg/mL) pendant 1 heure à 37°C sur un agitateur orbital et ensuite filtrées à travers un tamis à cellules en nylon de 40 mol/L. Pour la culture tissulaire conventionnelle, les cellules ont été maintenues dans du RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de FBS, 2 mmol/L de glutamine et 1 % de pénicilline-streptomycine. Pour la culture tissulaire 3D, les cellules ont été maintenues dans des plaques à faible attachement dans un milieu de cellules souches (MEBM Lonza) supplémenté avec 2 mmol/L de glutamine (Invitrogen), B27 (Invitrogen), 20 ng/mL hEGF (PeproTech), 20 ng/mL hFGF (PeproTech), 5 g/mL h-Insuline (Roche), 0,5 μmol/L d'hydrocortisone (Sigma-Aldrich), 100 μmol/L de β-mercaptoéthanol (Sigma-Aldrich), 4 g/mL d'héparine (Sigma-Aldrich) . Methocult M3134 (STEMCELL Technologies) a été ajouté au milieu de cellules souches (concentration finale de 0,8 %) pour maintenir les cellules tumorales en croissance sous forme de sphères clonales (16). Les cellules MIA PaCa-2 et Panc1 ont été obtenues auprès de l'ATCC.

Viabilité cellulaire

Pour déterminer la viabilité des cellules cultivées dans des conditions 3D, les cellules incluses dans des milieux semi-solides à base de méthylcellulose ont été exposées à 1 mol/L de calcéine (Life Technologies), incubées pendant 30 minutes et quantifiées à l'aide d'un appareil ImageXpress velos (Molecular Devices). Alternativement, les cellules ont été collectées par centrifugation, trypsinisées, colorées dans un tampon 1X Annexine V avec Annexine V-phycoérythrine et 7AAD (BD Biosciences) pendant 5 minutes à température ambiante et analysées par cytométrie en flux.

Études animales

Les études chez l'animal ont été menées conformément aux directives de l'IACUC. Pour l'établissement d'allogreffes et de xénogreffes, 5 × 10 4 cellules iKRAS ou 2 × 10 6 cellules PATC ont été mises en suspension dans 200 L de 50 % de HBSS, de Matrigel réduit à 50 % de facteur de croissance et injectées par voie sous-cutanée. dans le flanc droit des souris nude. Le volume tumoral a été évalué à l'aide de mesures au pied à coulisse et calculé selon la formule standard : longueur/2 × largeur 2 . L'AZD6244, le BEZ235, le lapatinib et l'imatinib ont été administrés par gavage oral, tandis qu'AXLi a été administré par voie i.p. injection. Les médicaments ont été dissous dans les véhicules suivants : (i) AZD6244 et lapatinib, 10 % de méthylcellulose, 2 % de tween 20 (ii) BEZ235, 50 % de 2 méthylpyrrolidone, 50 % de PEG300 (iii) imatinib, PBS stérile et (iv) AXLi, 10% DMSO, 90% PEG300.

Puce à protéines en phase inverse

Les profils d'expression des protéines du réseau de protéines en phase inverse (RPPA) ont été générés par l'installation centrale MD Anderson RPPA selon des protocoles standard (17). De plus amples informations sont disponibles sur http://www.mdanderson.org/education-and-research/resources-for-professionals/scientific-resources/core-facilities-and-services/functional-proteomics-rppa-core/index. html. Les courbes de dilution RPPA ont été ajustées avec un modèle logistique du paquet SuperCurve R (18,19), et les données RPPA ont été normalisées par chargement de protéines. Journal normalisé2-les données transformées ont été utilisées pour d'autres analyses statistiques. L'expression différentielle entre deux conditions a été calculée en utilisant le Student t test et conditions multiples avec ANOVA à sens unique avec des scripts R personnalisés. Brut P les valeurs ont été corrigées pour les tests d'hypothèses multiples à l'aide de la correction de Benjamini-Hochberg (FDR), et les changements protéiques ont été considérés comme significatifs lorsque le FDR était inférieur à 10 %.

Analyse Western blot

Des extraits de cellules entières ont été soumis à une électrophorèse par SDS-PAGE et transférés sur une membrane de nitrocellulose en utilisant un appareil de transfert semi-sec selon les instructions du fabricant (Bio-Rad). Après incubation avec du lait écrémé à 5 % dans du TBST (10 mmol/L de Tris, pH 8,0, 150 mmol/L de NaCl, 0,5 % de Tween 20) pendant 60 minutes, les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires (voir Matériel supplémentaire pour la liste détaillée des anticorps) à 4°C pendant la nuit. Les membranes ont été lavées trois fois pendant 10 minutes et incubées avec une dilution de 1:5 000 d'anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP). Les transferts ont été lavés avec du TBST trois fois et développés après une réaction de chimiluminescence à base d'ECL par exposition à un film.

Immunohistochimie

Les tumeurs fixées au formol ont été déshydratées et incluses en paraffine selon les procédures standard. Des tranches (5 µm) ont été découpées à l'aide d'un microtome, réhydratées et soumises à un démasquage d'antigène par chauffage à 95°C pendant 30 minutes avec une solution de démasquage d'antigène disponible dans le commerce (Citra Plus - Biogenex). Les tranches ont ensuite été incubées avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % pendant 15 minutes, incubées avec des anticorps primaires, lavées, incubées avec des anticorps secondaires conjugués à HRP, lavées et développées par incubation DAB. Les tranches ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline, déshydratées et montées.

Pcr en temps réel

Les ADNc ont été synthétisés à partir d'ARN par transcription inverse avec un kit disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (Invitrogen). La PCR en temps réel a été réalisée par une réaction basée sur TAQMAN en utilisant les ensembles d'amorces et de sondes Invitrogen suivants : croissance arrestation-spécifique 6 (GAS6 mmol/L 00490378_m1), PDGFA (mmol/L 01205760_m1), PDGFB (mmol/L 00440677_m1 ) et PDGFC (mmol/L 00480205_m1). Les quantités relatives d'ARNm ont été calculées en utilisant le comparatif ΔΔCt méthode.

Production de lentivirus

Une plaque semi-confluente de 15 cm de HEK293T a été transfectée avec 30 g de plasmide pHAGE et un mélange des vecteurs codant pour l'encapsidation PMD2.G (9 g) et pCMVΔR-8,74 (19,5 g). Les milieux contenant le virus ont été collectés 72 heures après la transfection et filtrés, le virus a été concentré par ultracentrifugation.


Résultats

La délétion de SOS1 inhibe la transformation dans les cellules NSCLC mutées par l'EGFR

Des études antérieures ont montré que les lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR présentent une réactivité beaucoup plus robuste aux EGFR-TKI de première génération en culture 3D (sphéroïdes de lignées cellulaires cancéreuses en monoculture ou organoïdes en monoculture ou en culture mixte dans ECM/Matrigel) par rapport à la culture adhérente 2D, et en outre que les conditions 3D reflètent plus facilement les réponses EGFR-TKI observées in vivo (Jacobi et al., 2017). Pour confirmer ces résultats et les étendre aux EGFR-TKI de troisième génération, nous avons évalué la survie dose-dépendante des deux EGFR-TKI de première génération sensibles (HCC827, délétion de l'exon 19 [Δex19]) ou résistantes (NCI-H1975, L858R/T790M) lignées cellulaires NSCLC au géfitinib ou à l'osimertinib dans des conditions de culture adhérentes (2D) ou sphéroïdes (3D) (Figure 1A). Les cellules HCC827 et H1975 ont été ensemencées dans des cultures adhérentes ou sphéroïdes, laissées au repos pendant 48 heures, puis traitées avec des doses croissantes du gefitinib EGFR-TKI de première génération ou de l'osimertinib EGFR-TKI de troisième génération pendant 4 jours. Les cellules HCC827 ont montré une réactivité aux deux EGFR-TKI dans des conditions de culture 2D et 3D, mais dans les deux cas, les cultures de sphéroïdes 3D ont montré une amélioration de > 1 log de l'efficacité de l'EGFR-TKI et une inhibition globale de la croissance accrue. Alors que les cellules NCI-H1975 n'étaient pas sensibles au géfitinib, le traitement à l'osimertinib des cellules H1975 a montré une efficacité accrue et une inhibition de la croissance globale accrue dans les sphéroïdes 3D par rapport aux cultures adhérentes 2D.

SOS1 la délétion inhibe la transformation dépendante de l'ancrage (3D) dans les lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR.

(UNE) Courbes dose-réponse de cellules HCC827 mutées par l'EGFR (Δex19) (à gauche) ou NCI-H1975 (L858R/T790M) (à droite) traitées avec du géfitinib ou de l'osimertinib sous ancrage 2D dépendant (losanges gris) ou sphéroïde 3D (carrés noirs) conditions de culture. (AVANT JC) Prolifération 2D (à gauche) ou croissance sphéroïde 3D (à droite) dans des populations regroupées de (B) HCC827 ou (C) Cellules NCI-H1975 où SOS1 ou SOS2 a été supprimé à l'aide des contrôles CRISPR/Cas9 vs NT. Des images 10x de sphéroïdes représentatifs aux jours 0 et 21 sont affichées, barre d'échelle = 250 mm. () transformation 3D dans les populations regroupées des lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR indiquées où SOS1 ou SOS2 a été supprimé à l'aide des contrôles CRISPR/Cas9 vs NT. (E) Cellules de courbe dose-réponse de cellules NCI-H1975 traitées avec l'inhibiteur SOS1 BAY-293 dans des conditions de culture dépendantes de l'ancrage 2D (losanges gris) ou sphéroïde 3D (carrés noirs). Les données sont représentées par le nombre de cellules par rapport à celles non traitées pour chaque lignée cellulaire individuelle. (F) Courbes dose-réponse des cellules NCI-H1975 où SOS1 (cercles rouges) ou SOS2 (triangles bleus) a été supprimé à l'aide de contrôles CRISPR/Cas9 vs NT (carrés noirs) traités avec BAY-293 dans des conditions de culture de sphéroïdes 3D. Pour chaque condition, l'échantillon non traité a été fixé à 100 %, et les échantillons traités par le médicament ont été comparés aux échantillons non traités pour chaque lignée cellulaire. Les courbes dose-réponse et la prolifération 2D sont présentées en moyenne +/- s.d. d'au moins trois expériences indépendantes. Pour les études de transformation, les données proviennent de quatre expériences indépendantes. Chaque expérience individuelle a été réalisée en utilisant des populations (pas des clones) de cellules CRISPR indépendantes. Pour chaque expérience, trois répétitions techniques ont été évaluées. La signification statistique a été déterminée par ANOVA en utilisant la méthode de Tukey pour des comparaisons multiples. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 par rapport aux cellules NT. # p<0.05, ##p<0.01 vs. SOS1 cellules KO.

Figure 1—données sources 1

L'inhibiteur de SOS1 BAY-293 est spécifique de SOS1 et est renforcé parSOS2délétion dans des lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR (T790M).

SOS1 et SOS2 sont des RasGEF exprimés de manière ubiquitaire responsables de la transmission de la signalisation EGFR aux voies effectrices en aval. Pour déterminer si SOS1 ou SOS2 étaient nécessaires pour la prolifération dépendante de l'ancrage 2D ou la croissance sphéroïde 3D dans les cellules NSCLC mutées par EGFR, SOS1 (Figure 1—supplément de la figure 1 et Munoz et al., 2016) ou SOS2 (31) ont été supprimés dans des populations regroupées de cellules HCC827 et H1975 pour éviter les effets clonaux, et la prolifération et la croissance sphéroïde ont été évaluées par rapport aux témoins NT (figure 1B et C). Dans la culture adhérente, ni SOS1 ni SOS2 la suppression a modifié la prolifération (figure 1B). En revanche, SOS1 la délétion a complètement inhibé la croissance sphéroïde dans les cellules HCC827 et H1975, indiquant que SOS1 était nécessaire pour maintenir le phénotype transformé dans les deux lignées cellulaires. Pour déterminer si SOS1 était généralement requis pour la transformation mutée par EGFR, nous avons en outre supprimé SOS1 ou SOS2 dans les deux NCI-H3255 (L858R) sensibles de première génération et PC9 (Δex19) et en sous-cultures de ces lignées cellulaires ayant acquis des mutations T790M après traitement continu par EGFR-TKI (PC9-TM [de Bruin et al., 2014] et H3255-TM [Engelman et al., 2006]). Dans tous les cas, SOS1 la délétion diminuait significativement la transformation oncogène, alors que SOS2 la délétion a eu des effets variables sur la transformation en fonction de la lignée cellulaire mutée EGFR examinée (figure 1D). Ces données indiquent que SOS1 est le principal RasGEF responsable de l'oncogenèse en aval de l'EGFR muté.

BAY-293 a récemment été décrit comme un inhibiteur spécifique de SOS1 (Hillig et al., 2019). Pour déterminer si l'inhibition de SOS1 était également plus efficace dans les sphéroïdes 3D par rapport à la culture adhérente 2D, nous avons évalué la survie dose-dépendante des cellules H1975 après le traitement BAY-293 dans des conditions de culture 2D et 3D (figure 1E). Similaire à ce que nous avons observé après un traitement par EGFR-TKI (Figure 1A) ou SOS1 suppression (figure 1C et D), BAY-293 a montré une efficacité améliorée et une inhibition de la croissance globale accrue dans les sphéroïdes 3D par rapport aux cultures adhérentes 2D. Pour confirmer la spécificité de BAY-293 pour SOS1, nous avons en outre traité des cellules H1975, PC9-TM et H3255-TM cultivées en sphéroïdes 3D où soit SOS1 ou SOS2 avaient été supprimés par rapport aux témoins NT avec des doses croissantes de BAY-293 pendant quatre jours, et évalué la viabilité cellulaire dans les sphéroïdes à l'aide de Cell Titre Glo (Figure 1F et Figure 1—supplément de la figure 2). Le traitement au BAY-293 n'a pas inhibé la survie des sphéroïdes où SOS1 avait été supprimé, indiquant la spécificité de BAY-293 pour SOS1. De plus, les cellules où SOS2 avait été supprimé a montré une amélioration d'environ 1 log de l'efficacité de BAY-293 et ​​une inhibition globale de la croissance accrue par rapport aux témoins NT, indiquant que SOS1 et SOS2 ont des fonctions qui se chevauchent pour soutenir la survie des cellules NSCLC mutées par EGFR en culture sphéroïde. Pour ces expériences, le nombre de cellules de l'échantillon non traité au quatrième jour du traitement pour chaque lignée cellulaire (NT, SOS1 KO, SOS2 KO) a été fixé à 100 %, de sorte que les différences de transformation (voir la figure 1B-D) ne seront pas appréciées. De plus, pour les cellules NCI-H1975 et NCI-H3255-TM, SOS1 la suppression ne montre pas de différences de transformation après quatre jours. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que les cellules NSCLC mutées par EGFR sont plus sensibles à l'inhibition de l'EGFR mutant ou de SOS1 dans la culture de sphéroïdes 3D par rapport aux conditions d'adhésion 2D traditionnelles.

L'inhibition de SOS1 est en synergie avec les EGFR-TKI pour inhiber la survie cellulaire dans des conditions de culture indépendantes de l'ancrage (3D)

Des études antérieures ont rapporté que la combinaison de l'osimertinib avec un autre inhibiteur de RTK peut inhiber ou traiter le développement d'une résistance induite par ce RTK spécifique (Mancini et al., 2018 Romaniello et al., 2018 La Monica et al., 2017), tandis que l'inhibition simultanée de plusieurs RTK parallèles avec l'osimertinib peuvent être nécessaires pour potentialiser efficacement l'action de l'osimertinib (Romaniello et al., 2018). En outre, bien que de nombreuses études montrent une activité médicamenteuse accrue dans les thérapies combinées par rapport au traitement à l'osimertinib seul, elles n'évaluent pas si les effets des combinaisons de deux médicaments sont vraiment synergiques. Les interactions synergiques entre les thérapies permettent de maximiser l'effet thérapeutique tout en minimisant les événements indésirables et peuvent être nécessaires pour des combinaisons thérapeutiques efficaces avec des agents ciblés (Roell et al., 2017).

SOS1 est un médiateur en aval commun de la signalisation RTK. Nous avons émis l'hypothèse que SOS1 pourrait être une cible médicamenteuse efficace pour créer une synergie avec l'inhibition de l'EGFR-TKI pour traiter l'adénocarcinome pulmonaire muté par l'EGFR. Pour évaluer directement la synergie entre l'osimertinib et l'inhibition de SOS1, nous utilisons deux méthodes distinctes basées sur les modèles de référence les plus largement établis d'additivité médicamenteuse. La première méthode, l'analyse d'isobologrammes, évalue les changements dans les courbes dose-réponse pour les mélanges de deux médicaments par rapport aux mélanges fictifs de chaque médicament individuel avec lui-même. La deuxième méthode, l'analyse d'indépendance de Bliss, évalue si un mélange de deux doses individuelles de médicament a un effet plus important que celui attendu si les deux médicaments agissaient indépendamment. Nous décrirons d'abord puis utiliserons chaque méthode à tour de rôle pour déterminer si l'inhibition de SOS1 à l'aide de BAY-293 pourrait être en synergie avec l'osimertinib EGFR-TKI dans EGFR-cellules d'adénocarcinome pulmonaire mutées.

L'analyse par isobologramme est une analyse dose-effet basée sur le principe de l'additivité de Loewe, qui stipule qu'un médicament mélangé avec lui-même, et par extension un mélange de deux ou plusieurs médicaments similaires, présentera des effets additifs. Pour deux médicaments (Drogue A et Médicament B) qui ont des courbes dose-réponse parallèles de sorte qu'un rapport d'activité constant soit maintenu à toutes les doses de A et B (Figure 2A), le traitement utilisant n'importe quel mélange d'équivalent dose (DEQ) de Médicaments A et B montrera un effet similaire au traitement avec le médicament A ou le médicament B seul si les effets des deux médicaments sont additifs. En revanche, si les deux médicaments présentent une synergie, alors l'effet observé par le traitement avec des mélanges DEQ de A et B sera supérieur à l'effet de l'un ou l'autre médicament seul. En générant des courbes dose-réponse pour différents mélanges DEQ de médicaments A et B (figure 2B), on peut comparer la CE50 de chaque mélange DEQ à la CE50 du médicament A ou du médicament B seul sur un tracé d'isobologramme (figure 2C). Le CE50 de chaque médicament individuel est tracé comme l'ordonnée à l'origine x ou y, et la contribution calculée de chaque médicament à la CE globale50 pour chaque mélange DEQ est tracé comme un seul point (EC50,A, CE50,B) sur le graphique. Si la CE50 les valeurs pour chaque mélange DEQ tombent le long de la ligne droite (isobole) qui relie le médicament individuel EC50 valeurs, alors l'interaction médicamenteuse est additive. En revanche, les points situés au-dessus ou au-dessous de l'isobole indiquent un antagonisme ou une synergie. La mesure dans laquelle deux médicaments interagissent peut être davantage quantifiée à partir de la CE50 données sous forme d'indice de combinaison (IC) (figure 2D). Un IC entre 0,8 et 1,2 indique que les deux médicaments ont des effets additifs lorsqu'ils sont combinés, un IC <0.8 indique une synergie et un IC >1.2 indique un antagonisme.

L'inhibition de SOS1 est en synergie avec l'inhibiteur d'EGFR-TKI osimertinib pour inhiber la survie cellulaire dans des conditions de culture indépendantes de l'ancrage (3D).

(UN D) L'analyse d'isobologramme examine la synergie médicament-médicament en comparant les mélanges d'équivalents de dose (DEQ) de deux médicaments en fonction de leur CE50 valeurs au traitement avec l'un ou l'autre médicament seul (A et B). A partir des courbes dose-réponse des mélanges DEQ, tracer l'EC fractionnaire50 pour chaque médicament de la combinaison (violet) par rapport au médicament individuel EC50 valeurs (bleu, rouge) sur un tracé d'isobologramme (C) et calcul de l'indice combiné (CI, D et E) permet d'évaluer la synergie médicament-médicament. Les effets additifs se produisent sur les lignes en pointillés du tracé de l'isobologramme et ont un IC de 0,8 à 1,2 (boîte grise), tandis que les interactions synergiques se situent en dessous des lignes en pointillés et ont un IC <0,8. (E) Graphiques d'isobologramme et IC à partir de traitements à dose équivalente de cellules NSCLC H1975 mutées par EGFR traitées avec des combinaisons DEQ d'osimertinib et de BAY-293. Les données d'isobologramme et d'IC ​​sont présentées sous forme de moyenne +/- s.d. à partir de trois expériences indépendantes. (F) L'additivité de Bliss évalue si l'effet global d'une combinaison de médicaments individuelle (EMélange A+B) est supérieur à celui attendu pour deux médicaments ayant des effets indépendants sur la population globale (EUNE + EB – EUNE * EB). (g) L'indice de bonheur compare le rapport de l'effet attendu à l'effet réel. Les interactions synergiques ont un indice de bonheur < 0,85. (H) Excess over Bliss évalue l'ampleur de la différence entre les effets réels et attendus. Des interactions de plus en plus synergiques montrent un excès par rapport à l'indice de bonheur > 0. (je) Carte thermique des cellules H1975 traitées avec les doses indiquées d'osimertinib et/ou de BAY-293 cultivées dans des conditions de culture 2D (adhérentes) ou sous forme de sphéroïdes 3D. Le vert indique plus de cellules, le rouge indique moins de cellules. CE50 les valeurs pour chaque médicament individuel sont indiquées par un *. (J) Carte thermique de l'indice de Bliss évaluant la synergie médicament-médicament entre l'osimertinib et le BAY-293 à chaque combinaison de doses de D. (K) La carte thermique de l'excès par rapport au Bliss évaluant la synergie médicament-médicament entre l'osimertinib et le BAY-293 à chaque combinaison de doses de l'indice D. Bliss et l'excès par rapport au Bliss sont présentées comme la moyenne de trois expériences indépendantes. Pour chaque expérience, trois répétitions techniques ont été évaluées.

Figure 2—données sources 1

L'inhibition de SOS1 est en synergie avec l'inhibiteur d'EGFR-TKI osimertinib pour inhiber la survie cellulaire dans des conditions de culture indépendantes de l'ancrage (3D).

Pour évaluer la synergie médicament-médicament entre l'osimertinib et le BAY-293 via une analyse d'isobologramme, les cellules NCI-H1975 ont été cultivées dans des conditions d'adhérence 2D ou de sphéroïde 3D pendant 48 heures, et ont été traitées avec diverses combinaisons DEQ d'osimertinib:BAY-293 (voir Figure 2B ) pour quatre jours. Les données de viabilité cellulaire ont été évaluées à l'aide de CellTiter-Glo et EC50 les valeurs de chaque mélange DEQ ont été utilisées pour générer des parcelles d'isobologramme et calculer les indices de combinaison (figure 2E). Lorsque les cellules ont été cultivées dans des conditions 2D, l'osimertinib et le BAY-293 ont montré des effets additifs, comme DEQ EC50 les valeurs sont tombées sur l'isobole et les valeurs d'IC ​​étaient comprises entre 0,8 et 1,2. En revanche, lorsque les cellules ont été cultivées sous forme de sphéroïdes 3D, l'osimertinib et le BAY-293 ont montré une synergie significative, car DEQ EC50 les valeurs étaient bien inférieures à l'isobole et à l'IC <0.8.

L'analyse d'indépendance de Bliss est une analyse basée sur les effets basée sur le principe de l'additivité de Bliss, qui suppose que deux médicaments agiront indépendamment l'un de l'autre afin que leur effet combiné puisse être évalué en évaluant l'effet de chaque médicament de manière séquentielle (Figure 2F). Contrairement à l'analyse par isobologramme, cette méthode n'exige pas que deux médicaments évalués aient des courbes dose-réponse parallèles et peut être calculée sur la base de seulement trois traitements médicamenteux, l'effet que chaque médicament a sur la population cellulaire et l'effet de la combinaison les deux traitements médicamenteux ensemble. En représentant l'effet de chaque traitement médicamenteux comme un résultat probabiliste entre 0 (aucun effet) et 1 (effet à 100 %), nous pouvons comparer l'effet observé de l'association médicament-médicament à l'effet attendu si chaque médicament agissait indépendamment (Figure 2E ). Le rapport entre l'effet attendu et l'effet observé est l'indice de félicité (BI), où un BI <1 indique une synergie (figure 2G). Alternativement, l'ampleur de la différence entre le résultat observé et attendu peut être signalée comme l'excès par rapport à Bliss (figure 2H). Alors que l'excès par rapport à Bliss est la mesure de synergie la plus largement rapportée, l'indice de Bliss peut être directement comparé à l'indice de combinaison dans les expériences d'isobologramme et doit être utilisé lorsque les deux méthodes de synergie sont utilisées pour évaluer une interaction médicamenteuse donnée.

Pour évaluer la synergie médicament-médicament entre l'osimertinib et le BAY-293 via l'analyse d'indépendance Bliss, les cellules NCI-H1975 ont été cultivées dans des conditions d'adhérence 2D ou de sphéroïde 3D pendant 48 heures et ont été traitées avec des doses croissantes de BAY-293, d'osimertinib ou de combinaisons de deux médicaments sur une échelle de 3 log pendant quatre jours. La viabilité cellulaire a été déterminée à l'aide de CellTiter-Glo et la viabilité globale (Figure 2I), l'indice de Bliss (Figure 2J) et l'excès par rapport à Bliss (Figure 2K) ont été représentés sous forme de cartes thermiques. Semblable à ce que nous avons observé pour l'analyse d'isobologramme, l'osimertinib et le BAY-293 n'ont pas montré de synergie significative dans les cellules cultivées dans des conditions d'adhérence 2D. En revanche, nous avons observé une synergie significative entre l'osimertinib et le BAY-293, principalement à des combinaisons de doses d'osimertinib et de BAY-293 tombant juste en dessous de la CE du médicament individuel.50 valeurs. Dans l'ensemble, les données présentées à la figure 2 indiquent que l'osimertinib et le BAY-293 présentent une synergie médicament-médicament significative dans les cellules H1975 mutées par EGFR, mais uniquement dans des conditions de culture de sphéroïdes 3D.

Pour déterminer si l'inhibiteur de SOS1 BAY-293 pouvait généralement interagir avec les EGFR-TKI dans les cellules d'adénocarcinome pulmonaire mutées par l'EGFR, nous avons étendu notre évaluation de la synergie médicament-médicament à l'analyse d'isobologramme (Figure 3) et à l'analyse d'indépendance de Bliss (Figure 4) dans six différentes lignées cellulaires d'adénocarcinome pulmonaire mutées par l'EGFR. Dans les cellules qui étaient sensibles aux EGFR-TKI de première génération (HCC827, PC9, H3255 T790 de type sauvage), nous évaluons la synergie médicament-médicament entre BAY-293 et ​​une première génération (gefitinib) ou une troisième génération (osimertinib) EGFR-TKI. Dans les cellules résistantes aux EGFR-TKI de première génération (H1975 PC9-TM, H3255-TM T790M), nous avons limité notre évaluation à la synergie entre le BAY-293 et ​​l'osimertinib. Pour déterminer d'abord la CE individuelle50 valeurs pour le géfitinib, l'osimertinib et le BAY-293 dans chaque lignée cellulaire, les cellules ont été cultivées sous forme de sphéroïdes 3D pendant 48 à 72 heures, puis traitées avec des doses croissantes de médicament pendant quatre jours, suivies d'une évaluation de la viabilité cellulaire par CellTiter-Glo (Figure 3—supplément de chiffres 1). Dans cinq des six lignées cellulaires, les courbes dose-réponse individuelles pour le BAY-293, l'osimertinib et le géfitinib (le cas échéant) ont montré des effets maximaux et des coefficients de Hill similaires, et étaient donc appropriées pour l'analyse d'isobologramme linéaire pour chaque combinaison de deux médicaments de BAY -293, l'osimertinib et le géfitinib (Tallarida, 2011). En revanche, les cellules H3255-TM n'étaient que modérément sensibles à l'osimertinib, montrant au plus une réduction de 50 % de la viabilité à des doses élevées. Par conséquent, nous avons limité notre évaluation de la synergie médicament-médicament dans les cellules H3255-TM à l'analyse d'indépendance de Bliss. De plus, pour simplifier notre évaluation de l'indépendance de Bliss entre plusieurs médicaments et lignées cellulaires, nous avons limité nos traitements médicamenteux à des mélanges 1:2, 1:1 et 2:1 de chaque combinaison de médicaments en fonction de l'équivalence de dose (voir Figure 4A).

Analyse d'isobologramme montrant que l'inhibition de SOS1 est en synergie avec le traitement EGFR-TKI pour inhiber la survie dans plusieurs lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR.

Analyse d'isobologramme et indice de combinaison (IC) à partir de traitements équivalents à la dose des lignées cellulaires NSCLC indiquées avec mutation de l'EGFR sensibles au géfitinib (L858R ou Δex19, en haut) ou résistantes au géfitinib (T790M, en bas) avec des combinaisons de géfitinib, d'osimertinib et de BAY -293. Les effets additifs se produisent sur les lignes en pointillés du tracé de l'isobologramme et ont un IC de 0,8 à 1,2 (boîte grise), tandis que les interactions synergiques se situent en dessous des lignes en pointillés et ont un IC <0.8. Les données sont présentées en moyenne +/- s.d. à partir de trois expériences indépendantes. Pour chaque expérience, trois répétitions techniques ont été évaluées.

Figure 3—données sources 1

Les lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR sont sensibles à l'osimertinib, au BAY-293 et ​​au géfitinib dans les cultures de sphéroïdes 3D.

Analyse Bliss Independence montrant que l'inhibition de SOS1 est en synergie avec le traitement EGFR-TKI pour inhiber la survie dans plusieurs lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR.

(UNE) Carte thermique de l'indice de Bliss à partir de cellules NCI-H1975 cultivées en sphéroïdes 3D Figure 2A (à gauche) et projections horizontales des indices de Bliss des traitements médicamenteux à des ratios 2:1, 1:1 et 1:2 d'osimertinib:BAY-293 sur la base des équivalences de dose (droit). Des interactions de plus en plus synergiques (indice de Bliss <0.85) sont indiquées par la carte thermique correspondante. Les concentrations de BAY-293 (maintenue constante, en bas) et d'osimertinib (au-dessus de chaque projection horizontale) sont données. Le CI50 pour chaque médicament individuel sont indiqués (*). (B) Cartes thermiques de l'indice de Bliss basées sur A pour les lignées cellulaires indiquées sensibles au géfitinib et résistantes au géfitinib à des ratios 2:1, 1:1 et 1:2 d'osimertinib, de géfitinib et de BAY-293 sur la base des équivalences de dose. Les données pour les cellules NCI-H1975 sont les mêmes que dans A. Les données sont présentées comme la moyenne de trois expériences indépendantes. Pour chaque expérience, trois répétitions techniques ont été évaluées.

Figure 4—données sources 1

Analyse Bliss Independence montrant que l'inhibition de SOS1 est en synergie avec le traitement EGFR-TKI pour inhiber la survie dans plusieurs lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR.

Pour chaque lignée cellulaire sensible à l'EGFR-TKI de première génération (HCC827, PC9, H3255), le géfitinib et l'osimertinib n'ont montré aucune synergie l'un avec l'autre par l'analyse d'isobologramme (Figure 3) ou l'analyse d'indépendance de Bliss (Figure 4), effets (CI et BI

1) comme on pouvait s'y attendre pour deux médicaments ayant la même cible moléculaire. En revanche, BAY-293 a montré une synergie significative avec le géfitinib et l'osimertinib à la fois par l'analyse des isobologrammes (Figure 3) et l'analyse de l'indépendance de Bliss (Figure 4), suggérant que l'inhibition de SOS1 peut agir comme traitement secondaire pour tous les EGFR-TKI. En outre, dans les trois lignées cellulaires mutées T790M (H1975, PC9-TM, H3255-TM), BAY-293 a de nouveau montré une synergie avec l'osimertinib. Ces données suggèrent que l'inhibition combinée de SOS1 et d'EGFR est une combinaison thérapeutique robuste qui agit en synergie pour inhiber la croissance des cellules d'adénocarcinome pulmonaire muté par EGFR.

La synergie entre BAY-293 et ​​osimertinib est indépendante de SOS2

Nous avons montré que SOS2 la suppression a sensibilisé les cellules NCI-H1975 à l'inhibiteur de SOS1 BAY-293 (figure 1F). Nous voulions déterminer si la synergie que nous avons observée entre l'inhibition de l'EGFR et de SOS1 (figures 3 et 4) était renforcée par SOS2 délétion dans les lignées cellulaires NSCLC mutées par EGFR. Pour examiner si la suppression de SOS2 modifie la synergie entre l'osimertinib et le BAY-293 dans les cellules mutées EGFR (T790M), SOS2 a été supprimé dans les cellules H1975, PC9-TM et H3255-TM. Pour les cellules H1975 et PC9-TM, SOS2 Les cellules KO vs les contrôles NT ont été cultivées dans des conditions de sphéroïde 3D pendant 48 à 72 heures, puis ont été traitées avec diverses combinaisons DEQ d'osimertinib:BAY-293 pendant 4 jours. Les données de viabilité cellulaire ont été évaluées à l'aide de CellTiter-Glo et EC50 les valeurs de chaque mélange DEQ ont été utilisées pour générer des tracés d'isobologrammes et calculer les intervalles de confiance (figure 5A et B). Pour les deux lignées cellulaires, SOS2 cellules sensibilisées à la délétion à BAY-293, diminuant la CE50 de 5 à 10 fois par rapport aux témoins NT sans altérer la CE50 au traitement par osimertinib seul. Cependant, contrairement à ce que nous avons observé dans les cellules témoins NT, l'osimertinib et le BAY-293 n'ont montré qu'une légère synergie dans les cellules mutées par EGFR où SOS2 a été supprimé tel qu'évalué par la distance des points d'interaction à l'isobole et l'indice de combinaison accru par rapport aux témoins NT. De plus, lorsque nous avons superposé le NT et SOS2 Graphiques d'isobologramme KO à deux échelles différentes de BAY-293, les points de données de combinaison de médicaments se chevauchaient entre NT et SOS2 cellules KO, suggérant que SOS2 la suppression n'a pas amélioré la synergie entre l'osimertinib et le BAY-293.

SOS2 la suppression n'améliore pas l'interaction synergique entre l'inhibition de SOS1 et le traitement par EGFR-TKI.

(UN B) Analyse d'isobologramme (à gauche) et indice de combinaison (à droite) des traitements à dose équivalente d'osimertinib et de BAY-293 en H1975 (UNE) ou PC9-TM (B) les cellules où SOS2 a été supprimé (bleu) par rapport aux contrôles NT (noir). Des tracés superposés sur deux échelles de dosage BAY-293 différentes sont présentés sous les tracés d'isobologrammes individuels. Les effets additifs se produisent sur les lignes en pointillés du tracé de l'isobologramme et ont un IC de 0,8 à 1,2 (boîte grise), tandis que les interactions synergiques se situent en dessous des lignes en pointillés et ont un IC <0.8. (C) Cartes thermiques Bliss Index pour les cellules H3255-TM où SOS2 a été supprimé par rapport aux témoins NT traités à des ratios de 1:2, 1:1 et 2:1 d'osimertinib et de BAY-293 sur la base des équivalences de dose. Les données sont présentées en moyenne +/- s.d.à partir de trois expériences indépendantes. Pour chaque expérience, trois répétitions techniques ont été évaluées.

Figure 5—données sources 1

SOS2 la suppression n'améliore pas l'interaction synergique entre l'inhibition de SOS1 et le traitement par EGFR-TKI.

Étant donné que les cellules H3255-TM ne sont pas appropriées pour l'analyse d'isobologramme linéaire entre le BAY-293 et ​​l'osimertinib, nous avons plutôt effectué une analyse d'indépendance de Bliss pour évaluer la synergie potentielle entre l'osimertinib et le BAY-293 en présence ou en l'absence de SOS2. Cellules H3255-TM où SOS2 avaient été supprimés par rapport aux témoins NT ont été cultivés dans des conditions de sphéroïde 3D pendant 48 à 72 heures, puis ont été traités avec des doses croissantes d'osimertinib seul, de BAY-293 seul ou de mélanges de chaque dose de médicament à 1:2, 1:1, et Mélanges 2:1 d'osimertinib et de BAY-293 sur la base d'une équivalence de dose pendant quatre jours. Les données de viabilité cellulaire ont été évaluées à l'aide de CellTiter-Glo, et l'indice de Bliss a été calculé pour chaque mélange de médicaments, comme indiqué sur la figure 2C et la figure 4. Comme ce fut le cas dans les cellules H1975 et PC9-TM, tandis que la SOS2 la suppression des cellules H3255-TM sensibilisées à BAY-293, nous avons observé une synergie globale moindre entre l'osimertinib et les cellules BAY-293 H3255-TM où nous avions supprimé SOS2 vs contrôles NT. Ces données suggèrent que bien que l'osimertinib et le BAY-293 agissent en synergie pour limiter la viabilité des cellules d'adénocarcinome pulmonaire mutées par l'EGFR, la synergie entre l'osimertinib et le BAY-293 est indépendante de SOS2.

BAY-293 et ​​osimertinib agissent en synergie pour inhiber la signalisation des effecteurs RAS

Signaux EGFR mutés via les voies effectrices RAF/MEK/ERK et PI3K/AKT en aval pour favoriser la prolifération, la transformation et la survie. Depuis SOS2 la suppression n'a pas amélioré davantage la synergie entre le BAY-293 et ​​l'osimertinib, nous avons émis l'hypothèse que l'inhibition de SOS1 a spécifiquement amélioré l'inhibition dépendante de l'EGFR-TKI de la signalisation en aval dans la culture 3D. Pour effectuer des expériences de signalisation sur des sphéroïdes cultivés en 3D, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture à faible attachement micropatterned 24 puits (Aggrewell, StemCell) contenant

1200 sphéroïdes individuels par condition. Déterminer dans quelle mesure l'inhibition et/ou SOS2 suppression altérée inhibition dépendante de l'osimertinib de la signalisation effectrice en aval dans la culture 3D, les cellules H1975 ou PC9-TM où SOS2 a été supprimé par rapport aux contrôles NT ont été cultivés sous forme de sphéroïdes pendant 48 à 72 heures, puis traités avec des doses croissantes d'osimertinib +/- BAY-293 avant la collecte des sphéroïdes, la lyse et le western blot pour ERK et AKT phosphorylés (Figure 6). Dans NT et SOS2 cellules knock-out, BAY-293 a réduit la dose d'osimertinib nécessaire pour inhiber à la fois la phosphorylation d'ERK et d'AKT (Figure 6). Pour la signalisation Raf/MEK/ERK, l'analyse Bliss Independence de la quantification pERK a révélé que l'inhibition de SOS1 ou SOS2 la délétion a été indépendamment mise en synergie avec l'osimertinib pour inhiber la signalisation Raf/MEK/ERK, et la combinaison de l'inhibition de la signalisation SOS1/2 a encore amélioré cette synergie. En revanche, pour la signalisation PI3K/AKT SOS2 la suppression n'a pas amélioré la synergie entre l'osimertinib et le BAY-293. Pendant que le traitement à l'osimertinib ou SOS2 délétion indépendamment synergisée avec BAY-293 pour inhiber la phosphorylation d'AKT, SOS2 la suppression n'a pas amélioré davantage la capacité de l'osimertinib à inhiber la signalisation PI3K/AKT en présence ou en l'absence de BAY-293. Ces données suggèrent fortement que l'inhibition verticale de l'EGFR et du SOS1 limite la viabilité de l'appel en inhibant l'activation des voies effectrices RAF/MEK/ERK et PI3K/AKT.

L'inhibition de SOS1 est en synergie avec l'inhibition de l'EGFR mutant pour inhiber la signalisation des effecteurs en aval.

Western blots (UN D), quantification pERK et pAKT (ÊTRE) et les indices de bonheur (C, F) des WCL des cellules NCI-H1975 (A-C, haut) ou des cellules PC9-TM (D-F, en bas) cultivées dans des conditions de sphéroïde 3D pendant 48 heures, puis traitées avec les concentrations indiquées de l'osimertinib EGFR-TKI et/ou de l'inhibiteur SOS1 BAY-293 pendant 6 heures. Les transferts Western sont pour pEGFR, EGFR, pAKT, AKT, pERK1/2, ERK1/2, HSP90 et -actine. Les quantifications pERK et pAKT ont été calculées à l'aide d'une moyenne pondérée des western blots de protéines totales. Les indices de combinaison sont basés sur les quantifications pERK/protéine totale et pAKT/protéine totale. Les combinaisons de plus en plus synergiques sont indiquées en jaune, orange, rouge ou violet. Les quantifications de phosphoprotéines sont présentées en moyenne +/- s.d. à partir de trois expériences indépendantes. Les indices de bonheur sont présentés comme la moyenne de trois expériences indépendantes. Pour chaque expérience, trois répétitions techniques ont été évaluées.

Figure 6—données sources 1

L'inhibition de SOS1 est en synergie avec l'inhibition de l'EGFR mutant pour inhiber la signalisation des effecteurs en aval.

L'évaluation du paysage des inhibiteurs dans les lignées cellulaires mutées par EGFR montre une synergie lors de l'inhibition des effecteurs de la voie en amont

Étant donné que les mécanismes de résistance indépendants de l'EGFR les plus courants impliquent la réactivation des voies RTK/RAS/effecteur (Mancini et al., 2018 Romaniello et al., 2018 La Monica et al., 2017 Eberlein et al., 2015), nous avons voulu évaluer si l'inhibition de différentes protéines au sein de la voie de signalisation EGFR/RAS pourrait agir en synergie pour inhiber la survie 3D des cellules cancéreuses mutées par l'EGFR (T790M). Pour déterminer les synergies médicament-médicament après inhibition de la voie de signalisation EGFR-RAS à différents niveaux, nous avons évalué la synergie entre l'osimertinib, les inhibiteurs des intermédiaires de signalisation EGFR en amont de RAS (BAY-293 pour SOS1 et RMC-4450 pour SHP2), et les inhibiteurs de la Voies Raf/MEK/ERK (tramétinib) et PI3K/AKT (buparlisib) (Figure 7A). Les cellules H1975 et PC9-TM ont été traitées avec chaque inhibiteur individuel ou des mélanges DEQ 1:1 de chaque combinaison médicament-médicament, et l'indice de combinaison a été calculé pour évaluer la synergie médicament-médicament. Étant donné que les cellules H3255-TM ne conviennent pas à l'analyse d'isobologramme, ces cellules ont été traitées avec des mélanges à dose complète basés sur l'équivalence de dose et l'indice de Bliss a été calculé pour chaque combinaison médicament-médicament (figure 7B). Curieusement, les trois lignées cellulaires ont montré une synergie médicament-médicament avec n'importe quelle combinaison d'inhibition d'EGFR, SOS1 et SHP2. En revanche, l'inhibition des voies Raf/MEK/ERK ou PI3K/AKT en aval n'a pas réussi à établir une synergie constante avec l'osimertinib ou tout autre inhibiteur (figure 7B, en haut). Ces données soutiennent l'hypothèse selon laquelle l'inhibition verticale combinée de la signalisation proximale de l'EGFR peut constituer une stratégie efficace pour traiter les adénocarcinomes pulmonaires mutés par l'EGFR.

L'évaluation du « paysage des inhibiteurs » de la voie EGFR/RAS suggère que les thérapies combinées inhibant l'EGFR muté, le SOS1 et le SHP2 ont un potentiel thérapeutique dans le CPNPC muté par l'EGFR.

(UNE) Diagramme de signalisation montrant les inhibiteurs de la voie EGFR/RAS qui ont été évalués pour la synergie par paires par analyse d'isobologramme en utilisant des mélanges d'équivalent de dose 50:50 de chaque paire de médicaments. (B) Carte thermique des indices de combinaison à partir d'analyses d'isobologrammes des combinaisons médicament-médicament indiquées dans NT et SOS2 Lignées cellulaires KO NSCLC. Les combinaisons synergiques sont indiquées en jaune, orange ou rouge. Les données sont présentées comme la moyenne de trois expériences indépendantes. (CD) Analyse d'isobologramme et indice de combinaison (IC) à partir de traitements à dose équivalente de cellules NCI-H1975 en culture sphéroïde 3D traitées avec les deux médicaments (C) ou trois médicaments indiqués () combinaisons d'osimertinib (noir), RMC-4550 (violet) et BAY-293 (rouge). Pour une combinaison de trois médicaments, les deux médicaments indiqués sur l'axe des y ont été maintenus à un rapport de 1:1, puis mélangés à un rapport d'équivalent de dosew avec le troisième médicament. Les valeurs d'IC ​​indiquent une synergie améliorée au-delà de la combinaison de deux médicaments sur l'axe des y du tracé de l'isobologramme et sont calculées sur la base de la combinaison de médicaments de l'axe des y calculée pour un traitement médicamenteux unique. Les effets additifs se produisent sur les lignes en pointillés du tracé de l'isobologramme et ont un IC de 0,8 à 1,2 (boîte grise), tandis que les interactions synergiques se situent en dessous des lignes en pointillés et ont un IC <0.8. (E) Indices de combinaison des combinaisons de deux médicaments d'osimertinib (noir), RMC-4550 (violet) et BAY-293 (rouge) mélangés à des ratios 2:1, 1:1 ou 1:2 ou la combinaison de trois médicaments à un Rapport 1:1:1 (gris). Les IC sont calculés sur la base de trois traitements médicamenteux individuels. (F) Modèle de signalisation basé sur les données des figures 1 à 7 montrant que le ciblage combiné de l'EGFR muté et du SOS1 fournit une inhibition verticale suffisante de la signalisation en amont pour inhiber la signalisation des effecteurs RAS et bloquer la transformation oncogène. Cette inhibition synergique peut être encore renforcée par l'inhibition de SHP2, fournissant de multiples combinaisons médicamenteuses potentielles pour une intervention thérapeutique dans le NSCLC muté par EGFR. Les données d'isobologramme et d'IC ​​sont présentées sous forme de moyenne +/- s.d. à partir de trois expériences indépendantes. Pour chaque expérience, trois répétitions techniques ont été évaluées.

Figure 7—données sources 1

L'évaluation du « paysage des inhibiteurs » de la voie EGFR/RAS suggère que les thérapies combinées inhibant l'EGFR muté, le SOS1 et le SHP2 ont un potentiel thérapeutique dans le CPNPC muté par l'EGFR.

SHP2 est important pour la stabilisation des complexes GRB2:SOS1/2 sur EGFR (Dance et al., 2008), et le mécanisme des inhibiteurs allostériques de SHP2 dépend de SOS1 (Nichols et al., 2018), bien que la contribution de SOS2 à Les inhibiteurs de SHP2 n'ont pas été évalués. Pour déterminer si SOS2 la délétion a modifié le spectre des synergies médicament-médicament dans les cellules mutées par EGFR, des études parallèles ont été réalisées dans des cellules mutées par EGFR où SOS2 a été supprimé (Figure 7B, en bas). Contrairement à ce que nous avons observé pour la synergie entre l'inhibition de l'EGFR et de SOS1, la synergie entre l'inhibition de SOS1 et SHP2 a été renforcée par SOS2 effacement. Ces données suggèrent que SOS2 joue un rôle dans la signalisation dépendante de SHP2. L'inhibition de SOS1 est également synergisée avec l'inhibition de MEK dans SOS2 cellules KO. Compte tenu de la forte synergie entre l'inhibition de SOS1 et SOS2 suppression dans l'inhibition de la signalisation Raf/MEK/ERK (figure 6), ces données suggèrent qu'une inhibition profonde de la signalisation MEK est suffisante pour inhiber la survie dans les cellules mutées par EGFR.

Pour évaluer davantage la synergie entre les inhibiteurs de la signalisation EGFR proximale, nous avons examiné des combinaisons d'inhibition d'EGFR-SOS1- et SHP2 à la fois par une évaluation élargie de chaque combinaison de deux médicaments et en évaluant si l'inhibition combinée d'EGFR, SOS1 et SHP2 serait plus efficace que deux combinaisons médicamenteuses de ces inhibiteurs. Pour évaluer chaque combinaison de deux médicaments, des cellules H1975 cultivées dans des conditions de sphéroïde 3D ont été traitées avec des combinaisons à dose équivalente d'osimertinib, BAY-293 et ​​RMC-4550, évaluées pour la viabilité cellulaire et soumises à une analyse d'isobologramme pour évaluer la synergie médicament-médicament. . Chaque combinaison de deux médicaments a montré une synergie à trois rapports DEQ différents (figure 7C), suggérant que l'inhibition de deux protéines de signalisation proximales peut être un régime thérapeutique efficace pour traiter le cancer muté par l'EGFR. Pour évaluer si l'ajout d'un troisième inhibiteur proximal à chaque combinaison de deux médicaments améliorerait davantage l'inhibition synergique de la survie des sphéroïdes, chaque combinaison de deux médicaments a été mélangée dans un rapport de 1:1, puis un troisième inhibiteur de la voie proximale a été ajouté pour donner les trois -mélanges de médicaments (figure 7D). L'analyse par isobologramme de ces trois mélanges de médicaments a révélé que l'ajout d'un troisième inhibiteur de la voie proximale à toute combinaison de deux médicaments d'osimertinib, BAY-293 et ​​RMC-4550 a encore amélioré la synergie au-dessus de ce qui a été observé pour chaque combinaison de deux médicaments (Figure 7D) . Enfin, la comparaison de l'indice de combinaison pour la combinaison de trois médicaments à un rapport de 1:1:1 lorsque chaque médicament est traité indépendamment par rapport aux combinaisons de deux médicaments a montré une synergie marquée pour la combinaison de trois médicaments, mais que cette synergie n'était pas significativement améliorée par rapport à l'association d'osimertinib et de BAY-293 (Figure 7E). Ces données indiquent que l'inhibition verticale de la signalisation proximale de l'EGFR avec la combinaison d'osimertinib et d'un inhibiteur de SOS1 peut être la combinaison thérapeutique la plus efficace pour traiter EGFR- NSCLC muté.


Discussion

Cbl-c est un membre de la famille Cbl Ring Finger E3 [14, 17]. Comme d'autres membres de la famille Cbl, Cbl-c peut réguler négativement la signalisation RTK en ubiquitinant et en régulant à la baisse les RTK activés tels que l'EGFR et le RET [18, 21, 24, 36, 37]. Cbl-c est exprimé principalement dans les cellules épithéliales tandis que Cbl et Cbl-b sont exprimés de manière plus ubiquitaire [13, 14, 38]. Des mutations dans Cbl qui abrogent l'activité E3 et créent une protéine Cbl négative dominante qui peut bloquer l'interaction entre d'autres protéines Cbl et les RTK cibles ont été décrites dans

5 % des néoplasmes myéloïdes [12]. Dans ce travail, nous avons identifié des mutations dans E3 Cbl-c dans un cancer du sein murin et dans des tumeurs solides humaines qui inactiveraient l'activité E3 de Cbl-c et, dans certains cas, créeraient des protéines dominantes négatives qui pourraient interférer avec l'activité des endogènes sauvages. protéines de type Cbl.

La mutation murine (Cbl-c Δex7) s'est produite dans une tumeur mammaire apparue dans un modèle murin génétiquement modifié – le modèle murin transgénique de cancer du sein C3(1) SV40 Large T antigen [28, 29]. L'ADNc de Cbl-c qui a été cloné à partir de cette tumeur exprime une forme de Cbl-c dépourvue d'exon 7, entraînant une délétion dans le cadre de la partie distale de la région de liaison et de la partie proximale du domaine RF (Fig. 1). Des délétions in-frame similaires de tout ou partie du RF dans Cbl sont observées dans les lymphomes murins et les néoplasmes myéloïdes humains (examinés dans [12]). Plusieurs mécanismes ont été décrits pour la génération de ces délétions dans le cadre de l'ARNm, notamment des mutations ponctuelles, des insertions ou des délétions dans les sites donneurs et accepteurs d'épissage entourant les exons de liaison et RF et des délétions plus importantes englobant un ou plusieurs exons [12]. L'ADNc mutant Cbl-c a été séquencé dans le cadre d'un projet de séquençage d'ADNc à grande échelle et soumis à GenBank en 2005 [39]. Étant donné que la tumeur, l'ARNm, la banque d'ADNc ou l'ADNg dérivé de la tumeur ne sont plus disponibles, nous ne pouvons pas identifier définitivement le mécanisme par lequel cette délétion dans le cadre de l'exon 7 s'est produite.

La mutation dans Cbl-c est probablement survenue comme un deuxième coup dans une tumeur du sein qui a été entraînée par Tag [28, 29]. Conformément à cela, il n'y a aucune preuve de délétion par analyse Southern (figure 1C) ou de petits INDEL ou mutations par analyse de séquence dans l'ADNg des souches de souris parentales ou transgéniques. En outre, le mutant Cbl-c Δex7 n'a pas transformé par lui-même les cellules NIH 3T3 dans un essai de foyers, mais a augmenté la fréquence des cellules transformées lorsqu'il a été cotransfecté avec Tag (figure 2). Nous n'avons identifié aucune autre mutation dans Cbl-c dans 21 tumeurs supplémentaires, ce qui indique que de telles mutations Cbl-c sont rares dans ce contexte. De rares mutations secondaires de Cbl ont été observées dans un modèle animal de syndrome myélodysplasique [40].

La délétion dans l'ADNc de Cbl-c Δex7 code pour une protéine dépourvue du linker critique tyrosine qui est phosphorylée pour activer l'activité E3 des protéines Cbl [35, 41, 42] et des 4 premiers acides aminés de coordination du zinc du RF (Fig. 1). Comme prévu, la protéine Cbl-c ex7 manque d'activité E3, comme démontré par l'absence d'augmentation de l'ubiquitination de l'EGFR activé lorsqu'il est cotransfecté avec Cbl-c Δex7 par rapport à la protéine Cbl-c de type sauvage (figure 3A). Les protéines Cbl interagissent avec l'EGFR activé via leur domaine TKB N-terminal [1] qui est intact dans la protéine Cbl-c Δex7. Le mutant peut interagir avec l'EGFR via le domaine TKB mais est incapable d'ubiquitiner l'EGFR. Le mutant Cbl-c Δex7 empêche l'ubiquitination de l'EGFR activé par WT Cbl-c (Fig 3B). Ainsi, la Cbl-c Δex7 agit comme une protéine négative dominante et inhibe l'ubiquitination de l'EGFR par la Cbl-c de type sauvage (figure 3B).

Il a été démontré que les protéines Cbl interagissent avec et régulent négativement de nombreuses voies de signalisation RTK et non-RTK [1, 17], de sorte que la fonction négative dominante de Cbl-c Δex7 pourrait avoir de larges effets en inhibant la fonction d'autres protéines Cbl. Pour tester si Cbl-c ex7 pouvait inhiber de manière similaire d'autres protéines Cbl, nous avons surexprimé WT Cbl en présence et en l'absence de Cbl-c Δex7 et mesuré l'ubiquitination et la régulation négative de l'association EGFR et Cbl stimulée par l'EGF avec l'EGFR activé. Nos données montrent que Cbl-c Δex7 était capable d'inhiber le recrutement de WT Cbl à l'EGFR et, par conséquent, d'inhiber l'ubiquitination de l'EGFR (Fig 4B-4D). Nous démontrons également que Cbl-c Δex7 empêche la régulation négative de l'EGFR activé, ce qui pourrait stimuler la prolifération dans les cellules cancéreuses épithéliales dépendantes de l'EGFR. Nos résultats sont également cohérents avec d'autres mutations Cbl négatives dominantes et leurs effets inhibiteurs sur la fonction des protéines endogènes.

Nous avons exploré le spectre des mutations de Cbl-c dans les tumeurs humaines dans la base de données cBioPortal for Cancer Genomics (tableau 1, figure 5) [25, 26, 31]. La majorité des mutations se produisent dans les tumeurs solides mais le nombre de malignités hématologiques dans cette base de données est relativement faible (tableau 1). Dans l'ensemble, les mutations de Cbl-c sont peu fréquentes (112 ou <0,5 %) et étaient plus fréquentes dans le mélanome, le cancer colorectal et le cancer de l'endomètre (2,9, 0,96 et 0,95 %, respectivement) (tableau 1). Tous ces types de tumeurs ont des charges mutationnelles relativement élevées, le mélanome étant la plus élevée de toutes les tumeurs, de sorte que cette fréquence élevée peut refléter un taux de mutation global élevé et ne pas indiquer un rôle spécifique pour Cbl-c [43]. A titre de comparaison, les mutations de Cbl et Cbl-b dans la même base de données étaient plus fréquentes (199 et 210 pour Cbl et Cbl-b, respectivement) (S1 Fig, S1 Table et S2 Table). Cela peut refléter la plus grande taille des exons et des loci génomiques pour Cbl et Cbl-b par rapport à Cbl-c. Les régions codantes de Cbl et Cbl-b sont

2 fois plus grand que celui de Cbl-c (3081, 3971, contre 1574 pb, respectivement) et les loci génomiques pour Cbl et Cbl-b sont considérablement plus grands que ceux de Cbl-c (

20 ko, respectivement) [30]. Semblable à Cbl-c, les tumeurs présentant les mutations les plus fréquentes dans Cbl et Cbl-b étaient à nouveau le mélanome, le cancer de l'endomètre, le cancer colorectal et le cancer du poumon non à petites cellules (tableau S1 et tableau S2). Des mutations de Cbl ont déjà été décrites dans le cancer du poumon non à petites cellules [44]. Distinctes de Cbl-c (ou Cbl-b), des mutations de Cbl ont été trouvées dans

5 % des néoplasmes myéloïdes, y compris le syndrome myélodysplasique, la myélofibrose, l'anémie réfractaire avec excès de blastes, la leucémie myéloïde aiguë de novo et secondaire, la leucémie myéloïde chronique atypique, la LMC en crise blastique, la leucémie myélomonocytaire chronique et la leucémie myélomonocytaire juvénile (revue dans [1, 12 ]). La base de données cBioPortal for Cancer Genomics contient peu de ces néoplasmes, de sorte que cela n'a pas été observé dans notre évaluation. Cependant, l'évaluation des néoplasmes myéloïdes >2000 a trouvé des mutations Cbl dans environ 5% de ces néoplasmes [1, 12]. Les mutations de Cbl-c et Cbl-b dans les néoplasmes myéloïdes sont beaucoup moins fréquentes (

5 mutations dans chacune rapportées) et leur signification dans les néoplasmes myéloïdes n'est pas claire [1, 12].

La plupart des mutations faux-sens de Cbl-c observées dans les tumeurs solides sont probablement des mutations passagères. Cependant, 11 des 97 mutations faux-sens se produisent dans la région de liaison ou dans le RF et pourraient potentiellement perturber la fonction E3 (Fig 5).Plusieurs de ces mutations se produisent dans des acides aminés connus pour être importants pour la fonction E3, y compris une mutation sur la tyrosine de liaison conservée (Y341C), deux mutations ponctuelles sur un tryptophane dans le RF (W378C) et une mutation dans l'arginine qui est immédiatement après la dernière cystéine de coordination du zinc (R390H). Des mutations de chacun des résidus d'acides aminés correspondants dans Cbl abrogent l'activité E3 [32, 34, 35, 41, 42]. Il y a 7 mutations de troncature qui perturberaient la protéine Cbl-c avant ou dans le RF et seraient ainsi prédites abroger la fonction E3 (Fig 5). Enfin, il existe deux mutations du site d'épissage qui pourraient potentiellement conduire à des délétions ou à des décalages de cadre qui pourraient perturber l'activité E3 (figure 5). Au total, 20 des 112 mutations peuvent conduire à une perturbation fonctionnelle de la protéine. L'analyse des mutations Cbl et Cbl-b trouvées dans la base de données cBioPortal for Cancer Genomics a révélé qu'il y avait une fraction similaire des mutations globales qui pourraient perturber la fonction E3 (33 et 15 pour Cbl et Cbl-b, respectivement).

Nous avons testé la capacité d'une mutation tronquée Cbl-c (A232Gfs*14) et d'une mutation ponctuelle Cbl-c (Y341C) à ubiquitiner l'EGFR activé dans les cellules et, comme prévu, les deux mutations abrogent l'activité E3 (Fig 5). Cependant, les mutations se sont comportées différemment dans leur capacité à agir de manière négative dominante. Seul Cbl-c Y341C a agi comme une protéine négative dominante, tandis que Cbl-c A232Gfs*14 n'a pas perturbé l'ubiquitination par les protéines WT Cbl (figures 5B, 6 et 7). La mutation Cbl-c Y341C laisse le domaine TKB intact, et donc cette protéine peut interagir avec l'EGFR activé (Fig 5C). Alors que Cbl-c Y341C ne parvient pas à ubiquitiner l'EGFR, il empêche également l'ubiquitination en bloquant le recrutement de la protéine WT Cbl sur son substrat cible (Fig 6D). Cette inhibition de la fonction E3 par la mutation ponctuelle bloque ensuite la régulation négative de l'EGFR stimulé (figure 6C). En revanche, la mutation tronquée perturbe la protéine Cbl-c au sein de la TKB et donc le mutant Cbl-c A232Gfs*14 ne peut pas interagir avec l'EGFR (figure 5C). En conséquence, l'expression de Cbl-c A232Gfs*14 ne perturbe pas le recrutement de WT Cbl vers l'EGFR activé, ne bloque pas l'ubiquitination par WT Cbl et n'inhibe pas la régulation négative de l'EGFR activé par WT Cbl. (Illustration 7). Ces données suggèrent que les mutations ou les troncatures qui perturbent le RF mais laissent le domaine TKB intact sont plus susceptibles d'avoir des effets significatifs en raison de leur capacité à interférer avec les protéines Cbl de type sauvage dans la cellule.

Dans l'ensemble, ces données identifient des mutations de Cbl-c qui se produisent dans les tumeurs solides humaines et perturbent l'activité E3. À notre connaissance, il s'agit de la première description de mutations Cbl-c pouvant contribuer au développement de tumeurs solides humaines. De plus, des mutations similaires sont trouvées dans Cbl et Cbl-b provenant de tumeurs solides, suggérant que Cbl-c et les protéines Cbl en général peuvent contribuer à la pathogenèse des tumeurs solides humaines.


Fond

Le cancer du sein est une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les femmes dans le monde. L'incidence du cancer du sein varie considérablement dans le monde. Elle devrait toucher 0,2 million et entraînerait environ 41 070 décès en 2017 aux États-Unis [1]. Le cancer du sein apparaît à la suite d'une dérégulation de différentes voies de signalisation dans les cellules épithéliales mammaires. Les facteurs de croissance et les chimiokines activent diverses cascades de signalisation qui se croisent dans le microenvironnement tumoral et conduisent à la progression du cancer. Ils se lient à différentes familles de récepteurs. Rrécepteur Tyrosine Kles inases (RTK) constituent une de ces familles. Les RTK sont des protéines transmembranaires à passage unique, exprimées sur divers types de cellules, y compris celles du microenvironnement tumoral. Surexpression de divers types de RTK tels que les récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR), les récepteurs du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFR), les récepteurs du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR), les récepteurs du facteur de croissance analogue à l'insuline (IGFR) et les récepteurs du facteur de croissance des fibroblastes (FGFR) se retrouve dans différents types de cancer dont le sein [2,3,4]. Des niveaux élevés de RTK sont associés à une agressivité accrue du cancer du sein et à une diminution de la survie globale et sans maladie [5]. La liaison au ligand entraîne des changements de conformation dans les RTK qui entraînent l'activation de molécules de signalisation en aval. Les voies importantes qui sont connues pour être activées par les RTK comprennent la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK), la Janus kinase (JAK)/le transducteur de signal et l'activateur de transcription (STAT) et la phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt [6,7 ,8,9,10]. Les voies régulées par RTK jouent un rôle clé dans diverses facettes de la progression du cancer. La signalisation activée par RTK induit également le phénotype des cellules souches cancéreuses (CSC) qui présentent une résistance aux schémas thérapeutiques [6, 9]. La progression du cancer n'est pas seulement régulée par des réseaux de signalisation autonomes, mais également par des signaux moléculaires dépendants du contexte reçus du stroma tumoral. Le stroma tumoral est constitué de divers types de cellules non cancéreuses telles que des fibroblastes, des cellules endothéliales, des macrophages et d'autres cellules immunitaires [11]. L'interaction régulée par la signalisation RTK entre la tumeur et les cellules stromales contribue au remodelage tissulaire, au recrutement et à l'activation des cellules stromales. La survie des cellules cancéreuses disséminées dans les sites métastatiques nécessite la formation de la niche pré-métastatique par les cellules stromales. Les cellules stromales exprimant les RTK sont connues pour être recrutées sur les sites métastatiques et se sont avérées former une niche pré-métastatique grâce à la signalisation régulée par RTK [8]. Les RTK régulent également la trans-différenciation des cellules cancéreuses en cellules endothéliales pour former de nouveaux vaisseaux sanguins dans un processus connu sous le nom de mimétisme vasculogène [12, 13]. Étant donné que les RTK jouent un rôle important dans différents aspects de la progression du cancer du sein, le ciblage des RTK pourrait être utile dans le traitement du cancer. Au fil des ans, plusieurs inhibiteurs de RTK ont été criblés et testés dans des essais cliniques. Certains d'entre eux, comme le lapatinib, le trastuzumab et le bevacizumab, ont été approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) aux États-Unis pour la prise en charge clinique du cancer du sein. Fait intéressant, les inhibiteurs de RTK annulent la multirésistance aux médicaments conventionnelle induite par la thérapie et améliorent la survie sans maladie chez les patientes atteintes d'un cancer du sein métastatique [14]. Même si la thérapie anti-RTK montre des avantages cliniques chez les patientes atteintes d'un cancer du sein, malheureusement, les cellules cancéreuses se développent de novo ou une résistance acquise qui limite le succès de la thérapie ciblée RTK [15]. Dans cette revue, nous traitons de la signalisation EGFR, VEGFR, PDGFR et FGFR dans la progression du cancer du sein, le maintien du phénotype des cellules souches cancéreuses, l'interaction tumeur-stroma et la résistance aux médicaments. De plus, cette revue aborde également les principaux défis liés au ciblage des RTK pour le traitement réussi du cancer du sein.

Structure et classification des RTK

Cinquante-huit RTK différents ont été caractérisés chez l'homme et ils ont été classés en 20 sous-familles différentes sur la base de caractéristiques structurelles. Chaque sous-famille RTK présente une organisation structurelle prototype ainsi que des caractéristiques spécifiques à la classe. Un prototype de RTK a un domaine de liaison de ligand extracellulaire et un domaine de tyrosine kinase intracellulaire séparés par un domaine transmembranaire. Les sous-familles de RTK sont (1) EGFR, (2) InsR, (3) PDGFR, (4) VEGFR, (5) FGFR, (6) PTK7/CCK4, (7) Trk, (8) Ror, (9) MuSK, (10) Met, (11) Axl, (12) Tie, (13) EphA/B, (14) Ret, (15) Ryk, (16) DDR1/2, (17) Ros, (18) LMR , (19) ALK et (20) SuRTK106/STYK1. Le domaine intracellulaire des RTK a une activité tyrosine kinase (domaine tyrosine kinase TKD). Ce domaine tyrosine kinase peut phosphoryler les résidus tyrosine dans cis (au sein de la même molécule) ou dans trans (résidant sur une molécule différente) (Fig. 1). Cette conception consensuelle des RTK s'est avérée être conservée au cours de l'évolution. Des mutations dans les RTK qui entraînent des anomalies structurelles se sont avérées être à l'origine de divers troubles.

Structure du prototype du récepteur tyrosine kinase et mécanisme d'activation. Les récepteurs tyrosine kinases (RTK) ont les segments structurels suivants de N- à C-terminal : replis d'immunoglobuline, région transmembranaire, région juxtamembranaire, lobe N, boucle d'activation, lobe C et queue cytoplasmique. Les RTK résident au niveau de la membrane plasmique en tant que monomère. La liaison au ligand réticule les molécules réceptrices et induit des changements de conformation qui conduisent à l'autophosphorylation et à l'activation des récepteurs. La RTK phosphorylée sert soit de site d'amarrage pour les protéines adaptatrices (B), soit peut directement phosphoryler les molécules de signalisation (A). Les protéines adaptatrices ou les molécules de signalisation se lient au récepteur phosphorylé via l'homologie Src 2 (SH2) ou le domaine de liaison à la phosphotyrosine (PTB). Les protéines adaptatrices ancrées transduisent davantage le signal en phosphorylant d'autres molécules en aval (C, D)

Les RTK sont activés par la liaison de ligands solubles. Certains des RTK (DDR1, DDR2) sont activés non par des ligands solubles mais par des fibres de collagène de la matrice extracellulaire [16]. Deux événements obligatoires dans l'activation de RTK sont la liaison au ligand et la dimérisation du récepteur. Bien que l'idée antérieure était que la liaison de ligands apparentés aboutit finalement à la dimérisation du récepteur, il a été constaté que peu de RTK sont oligomères même en l'absence de ligands [17]. L'EGFR est principalement présent sous forme de monomère alors que le récepteur de l'insuline est présent sous forme de dimère sur la membrane cellulaire [18]. Néanmoins, l'activation du récepteur nécessite la liaison du ligand et la dimérisation ou l'oligomérisation consécutive du premier dans un état actif. Différents mécanismes de dimérisation des récepteurs induite par la liaison de ligands ont été expliqués pour différentes classes de RTK par différents groupes de recherche. Les mécanismes comprennent deux extrêmes où l'interface dimère est entièrement formée soit par le ligand soit par les molécules réceptrices. Les deux autres mécanismes incluent la participation à la fois du ligand et du récepteur pour la formation de l'interface dimère et dans un autre cas la participation d'une molécule accessoire. Un exemple du premier mécanisme est l'activation du récepteur du facteur de croissance nerveuse (NGF), TrkA, où seules deux molécules de NGF forment l'interface dimère et aucun des domaines extracellulaires du récepteur n'entre en contact physique avec la molécule voisine [19, 20]. Les ligands qui activent les membres de la famille EGFR ne forment pas eux-mêmes de dimères, ils se lient plutôt à deux domaines différents de la même molécule et induisent des changements de conformation favorables qui conduisent à la formation d'une interface dimère par les molécules réceptrices [21]. Le facteur de cellules souches (SCF) se lie à son récepteur, KIT et induit une dimérisation du récepteur où l'interface dimère est formée à la fois par les molécules du ligand et du récepteur [22]. Dans le cas du FGFR, la molécule d'héparine stabilise la configuration du dimère du FGFR après la liaison du ligand (facteur de croissance des fibroblastes (FGF)) [23].

En l'absence de ligands apparentés, les RTK sont maintenus dans un état inactif par des mécanismes d'auto-inhibition. Deux mécanismes d'auto-inhibition différents ont été décrits pour différentes familles de RTK. Le TKD des RTK contient trois éléments essentiels, le lobe N, le lobe C et la boucle d'activation [24]. Dans le mécanisme d'auto-inhibition médiée par la boucle d'activation, la boucle d'activation établit un contact physique avec le site actif de TKD. Un résidu tyrosine critique dans la boucle d'activation est phosphorylé et l'activité tyrosine kinase est auto-inhibée dans cis [25]. Dans l'autre mécanisme, les séquences juxtamembranaires entrent en contact étendu avec le site actif du TKD et ce dernier est arrêté dans une conformation inactive auto-inhibée [26,27,28]. La liaison au ligand induit des changements conformationnels favorables qui éliminent les autoinhibitions après la dimérisation des récepteurs. Les RTK activés peuvent recruter de nombreuses molécules effectrices en aval. Ces molécules contiennent des domaines SH2 ou PTB qui fixent les résidus phosphotyrosine sur les RTK [29]. Ces protéines peuvent soit interagir directement avec les RTK activés, soit interagir avec d'autres protéines d'amarrage qui sont phosphorylées sur la tyrosine par les RTK. Certaines des protéines d'amarrage bien connues qui orchestrent la formation de grands complexes protéiques en aval de l'activation de RTK sont le substrat du récepteur FGF 2 (FRS2), le substrat du récepteur de l'insuline 1 (IRS1) et le liant associé à Grb2 1 (Gab1). Certaines des protéines d'amarrage ont une spécificité en termes de classes de RTK auxquelles elles se lient, tandis que d'autres protéines d'amarrage se lient aux membres de RTK dans différentes familles. Un seul RTK peut lier différents ligands. L'EGFR se lie à sept ligands différents [30]. La force de l'interaction avec RTK varie pour ces différentes molécules de ligand. Les attributs de la conformation active du récepteur dimérisé diffèrent grandement pour différents ligands. Différentes conformations dimères actifs de RTK activent différentes cascades de signalisation en aval [31]. Les réarrangements et mutations de gènes confèrent certaines caractéristiques structurelles aux RTK qui entraînent une dimérisation et une activation de récepteurs indépendantes du ligand. L'activation aberrante des RTK par de tels moyens peut conduire à une physiopathologie différente. Les réarrangements géniques peuvent conduire à des conformations anormales de spirale enroulée et de fermeture à glissière leucine du domaine extracellulaire qui induisent une association indépendante du ligand des RTK. Des mutations résultant en des résidus de cystéine dans le domaine extracellulaire peuvent également induire une association permanente de deux monomères RTK [32]. Les mutations du domaine transmembranaire peuvent également entraîner une dimérisation constitutive des RTK conduisant à certaines physiopathologies [33]. Outre la classification décrite ci-dessus, les RTK ont également été classés en fonction de la similitude de la signalisation en aval et du modèle d'expression à travers les tissus. Trois de ces classes sont (1) EGFR/FGFR1/c-Met, (2) IGF-1R/NTRK2 et (3) PDGFRβ [34].

Cellules souches du cancer du sein et résistance aux médicaments

Malgré l'avènement de nouvelles avenues thérapeutiques, la rechute tumorale reste un défi majeur dans la prise en charge du cancer du sein. Il existe diverses raisons à la récurrence tumorale, notamment les cellules souches cancéreuses du sein (BCSC) résidant au niveau de la tumeur primaire ainsi que sur les sites métastatiques. Les CSC sont une sous-population de cellules tumorales qui ont le potentiel de s'auto-renouveler et de stimuler la tumorigenèse. Les BCSC sont caractérisées par l'expression de marqueurs de surface cellulaire spécifiques dont EpCAM + /CD24 - /CD44 + [35]. De plus, il a été rapporté que les CSC expriment également un niveau élevé d'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) et que cela est associé à de mauvais résultats cliniques [36]. Cependant, une étude récente suggère que les CSC EpCAM + /CD24 - /CD44 + sont anatomiquement distinctes des CSC ALDH+ve. Le profilage moléculaire des CSC EpCAM + /CD24 - / CD44 + et ALDH+ve a révélé que les anciennes sous-populations présentent un phénotype de transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) au repos, tandis que les CSC ALDH+ve présentent un phénotype épithélial avec une capacité d'auto-renouvellement [37] . Le microenvironnement tumoral est constitué de fibroblastes associés au cancer (CAF), de macrophages associés aux tumeurs (TAM), de cellules souches mésenchymateuses (CSM) et d'autres cellules immunitaires et vasculaires et impliqués dans le maintien des CSC dans le cancer du sein [11, 38]. La signalisation RTK dans les cellules tumorales et stromales joue un rôle essentiel dans la régulation des phénotypes CD24 - et CD44 + et ALDH + ve CSC. Les CSC ont un impact majeur sur le traitement du cancer car elles montrent une résistance aux chimiothérapies conventionnelles en exprimant des gènes de résistance multi-drogues (MDR). La fraction de cellules tumorales CD44 + /CD24 - est augmentée chez les patientes atteintes d'un cancer du sein lors de l'administration d'une chimiothérapie néoadjuvante [39]. De plus, la chimiothérapie à base de paclitaxel et d'épirubicine est associée à un enrichissement en cellules ALDH+ve dans les tumeurs du sein [40]. L'expression/la dérégulation altérée des RTK est associée au phénotype BCSC et à la résistance aux médicaments. Plusieurs rapports suggèrent que le traitement du cancer du sein avec des thérapies à base de RTK inverse la multirésistance [41,42,43]. Le rôle de la signalisation RTK dans la régulation du phénotype CSC et de la résistance aux médicaments a été discuté plus en détail.

Rôle de la signalisation du récepteur tyrosine kinase (RTK) dans la progression du cancer du sein

EGFR : un régulateur clé du phénotype et des métastases des cellules souches cancéreuses dans le cancer du sein inflammatoire

L'EGFR est surexprimé dans les tissus du cancer du sein et est associé à une agressivité plus élevée et à de mauvais résultats cliniques [44, 45]. L'EGFR est un RTK classique et il subit une homo ou hétérodimérisation et une trans-autophosphorylation lors de la liaison du ligand. Les EGFR possèdent sept ligands apparentés différents, dont l'EGF, le TGFα, la bêtacelluline (BTC), l'EGF se liant à l'héparine, l'amphiréguline (AREG), l'épiréguline et l'épigène. La famille EGFR comprend EGFR1 (EGFR, HER1, c-erbB1), HER2 (EGFR2, c-erbB2), EGFR3 (c-erbB3, HER3) et EGFR4 (c-erbB4, HER4) [46, 47]. Witton et al. ont examiné l'expression de EGFR1, HER2, EGFR3 et EGFR4 en utilisant l'immunohistochimie chez 220 patientes atteintes d'un cancer du sein et ont trouvé une surexpression de EGFR1 dans 16,4%, HER2 dans 22,8%, EGFR3 dans 17,5% et EGFR4 dans 11,9% des tissus cancéreux du sein. Des expressions accrues d'EGFR1, HER2 ou EGFR3 étaient associées à une survie réduite alors qu'un niveau élevé d'EGFR4 était lié à une meilleure survie des patientes atteintes d'un cancer du sein. Il a également été rapporté que des expressions accrues d'EGFR1, HER2 et EGFR3 étaient associées à une expression réduite du récepteur des œstrogènes (ER) [48]. Lors de la liaison au ligand, l'EGFR active diverses molécules de signalisation en aval, notamment Ras, PI3K, la phospholipase C-γ (PLC-γ) et JAK, entraînant la survie cellulaire, la croissance cellulaire et la progression tumorale (Fig. 2) [6, 49, 50]. Diverses études ont montré que l'expression de l'ER est inversement corrélée avec l'EGFR ou le phénotype des cellules souches cancéreuses et cela est bien étayé par les données qui indiquent une expression plus élevée de l'EGFR et la présence d'une population de cellules souches dans les TNBC qui manquent d'expression de l'ER [51]. Pour déterminer si l'EGFR régule la tige dans le cancer du sein, Wise et al. ont étudié l'enrichissement des cellules souches cancéreuses sous activation EGFR. Ils ont découvert que l'activation de l'EGFR dépendante des métalloprotéinases enrichit les cellules souches CD44 + /CD24 - dans le TNBC via la voie MAPK/ERK (Fig. 2) [6]. Le cancer du sein inflammatoire (IBC) (en particulier le TNBC inflammatoire) est une forme plus mortelle et agressive de cancer du sein caractérisée par un enrichissement en CSC chimio- et radio-résistantes [52, 53]. Divers rapports suggèrent que la signalisation EGFR est importante pour la pathogenèse et la progression du CIB [54, 55]. L'activation de NF-κB dans l'IBC entraîne une régulation négative du RE et une surexpression d'EGFR et/ou d'ErbB2 et une hyperactivation de MAPK. La signature MAPK distingue mieux l'IBC des tumeurs non IBC que la stratification basée sur le RE (54). Wang et al. ont identifié que la signalisation nodale régulée par l'axe EGFR/cyclooxygénase-2 (COX-2) favorise le phénotype CSC et augmente le caractère invasif des cellules IBC par induction de l'EMT (Fig. 2) [55]. Le programme EMT déclenché par le TGF-β augmente l'expression des RTK tels que l'EGFR et l'IGF-1R qui forment des complexes cytoplasmiques avec ER-α et Src conduisant à une résistance aux anti-œstrogènes dans le cancer du sein [56]. Le Syndecan-1 (CD138) est surexprimé et associé à la prolifération et à l'invasion cellulaires, et est devenu une cible médicamenteuse importante dans l'IBC. Ibrahim et al. ont établi la relation entre Syndecan-1 et EGFR dans la régulation du phénotype des cellules souches cancéreuses dans le TNBC inflammatoire.Leurs études ont révélé que Syndecan-1 régule l'expression de l'EGFR par l'activation de la signalisation Notch. La diaphonie Syndecan-1/Notch/EGFR module l'interleukine-6 ​​(IL-6), la gp130 et d'autres expressions de cytokines inflammatoires, favorisant ainsi la formation de colonies et l'expression de marqueurs de cellules souches via l'activation de NFκB médiée par Akt (Fig. 2) [9].

Signalisation régulée par RTK dans la progression du cancer du sein. Le VEGFR active la voie de signalisation JAK/STAT pour induire le phénotype des cellules souches cancéreuses par l'expression de Myc et Sox2. Le mutant p53 induit l'expression de VEGFR via l'interaction avec le complexe SWI/SNF. La signalisation régulée par l'EGFR joue également un rôle central dans l'angiogenèse et les métastases. L'EGFR régule l'activation des voies de signalisation JAK/STAT et MAPK pour induire l'expression de Sox2 et d'autres marqueurs de cellules souches conduisant à l'enrichissement des cellules souches cancéreuses. L'EGFR induit la phosphorylation d'Akt pour favoriser l'inflammation. Le PDGFR est exprimé sur les cellules stromales telles que les fibroblastes et est un marqueur de l'activation des fibroblastes. L'activation de STAT régulée par PDGFR est impliquée dans la régulation de la différenciation médiée par miR-9 des cellules cancéreuses en cellules endothéliales conduisant à l'angiogenèse. La voie MAPK activée par le FGFR induit le phénotype EMT et CSC. La coopération entre le FGFR et HER2 régule la translocation nucléaire de la cycline D1 conduisant à une prolifération accrue des cellules cancéreuses

L'autophagie présente un rôle à double tranchant dans la progression tumorale selon le contexte d'une tumeur. Une étude récente a révélé que l'autophagie régule l'enrichissement des cellules souches cancéreuses ALDH+ve via la signalisation EGFR/Stat3 dans le cancer mammaire murin PyMT (Fig. 2) [57]. Le stroma tumoral induit également le phénotype des cellules souches cancéreuses en interagissant avec l'EGFR présent sur les cellules cancéreuses via différents acteurs moléculaires en aval [58]. Dans le même ordre d'idées, Yang et al. ont rapporté que l'activation des EGFR dans les cellules cancéreuses par les TAM conduit à l'expression de Sox2 médiée par Stat3 qui a entraîné une augmentation de la population de cellules souches cancéreuses et des métastases dans des modèles murins de cancer du sein (Fig. 2) [59].

VEGFR : nœuds maîtres dans les métastases régulées par le VEGF, l'angiogenèse tumorale et la lymphangiogenèse

Diverses études ont établi que l'angiogenèse est indispensable à la progression des tumeurs du sein. Les VEGF sont de puissants facteurs proangiogéniques qui se lient à trois types différents de VEGFR, VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR ou homologue murin, Flk1). Les VEGFR sont exprimés sur les cellules cancéreuses, endothéliales et autres cellules stromales. Les VEGFR sont des RTK typiques qui contiennent un domaine extracellulaire pour la liaison du ligand, un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique qui comprend un domaine tyrosine kinase (TKD) [38]. Le VEGF-A se lie à la fois au VEGFR1 et au VEGFR2 pour induire l'angiogenèse tumorale, tandis que les VEGF-C et D interagissent avec le VEGFR3 pour favoriser la lymphangiogenèse dans différents types de cancer [38, 60]. Cependant, Laakkonen et al. ont rapporté que la signalisation VEGFR3 régulée par VEGF-C et VEGF-D induit l'angiogenèse tumorale [61]. Chakraborty et al. ont montré que l'ostéopontine (OPN) augmente l'expression du VEGF-A dans les cellules cancéreuses du sein et induit la croissance tumorale et l'angiogenèse en régulant la signalisation VEGF/VEGFR autocrine, paracrine et juxtacrine dans les cellules cancéreuses et endothéliales [62]. Srabovic et al. ont rapporté que l'expression de VEGFR1 est significativement augmentée dans les tissus tumoraux du sein par rapport aux tumeurs bénignes ou aux tissus sains environnants, quel que soit le statut des métastases ganglionnaires [63]. Kosaka et al. ont identifié des niveaux élevés d'ARNm de VEGFR1 dans le sang périphérique de patientes atteintes d'un cancer du sein et qui sont associés à des métastases et à des récidives cancéreuses et pourraient être utilisés pour le pronostic du cancer du sein avec des maladies de type basal et luminal [64]. Dans une étude récente, Kapahi et al. ont révélé que le polymorphisme VEGFR1−710C/T est associé à un risque plus élevé de cancer du sein dans la population nord-indienne [65]. Ning et al. ont révélé que l'activation de VEGFR1 induit l'EMT des cellules cancéreuses, favorisant ainsi l'invasion et la métastase dans les modèles de cancer du sein [66]. Les preuves accumulées suggèrent que les macrophages infiltrés dans le microenvironnement tumoral favorisent la progression maligne et améliorent les métastases [11, 67]. Un rapport récent a suggéré que la signalisation VEGFR1 régule la tumorigenèse induite par l'obésité. L'ablation de VEGF1 chez les animaux obèses a réduit la croissance du cancer du sein et les métastases pulmonaires en diminuant la polarisation des macrophages M2 et en affectant le métabolisme du glucose (Fig. 2) [67]. Une preuve récente suggère que les macrophages associés aux métastases (MAM) Flt1 + ve, un sous-ensemble de TAM, sont enrichis dans le cancer du sein métastatique par rapport aux tumeurs primitives. La signalisation Flt1 dans les MAM régule un ensemble de gènes inflammatoires indispensables à la survie des cellules cancéreuses après l'ensemencement métastatique. De plus, les cellules myéloïdes VEGFR1+ve circulantes sont impliquées dans la formation de niches pré-métastatiques [8, 68]. Les TAM polarisés CYP4A stimulent la formation de niches pré-métastatiques et les métastases dans les poumons en mobilisant et en recrutant des cellules myéloïdes VEGFR1+ve (Fig. 2) [68]. VEGR-2 est un régulateur clé de l'angiogenèse et surexprimé dans les tissus cancéreux du sein [69]. Pfister et al. ont étudié l'activation de l'expression du gène VEGFR2 par le mutant p53 dans le cancer du sein triple négatif. Dans cette étude, ils ont montré que le mutant p53 interagit avec SWI/SNF et recrute vers le promoteur de VEGFR2 où ce complexe remodèle le promoteur VEGFR2 et induit la transcription conduisant à la progression de la tumeur du sein médiée par VEGFR. Ces résultats indiquent que le gain de fonction de p53 mutant est médié par l'activation de l'expression de VEGFR2 (Fig. 2) [70]. Des preuves collectives suggèrent que le VEGFR2 joue un rôle de premier plan dans les métastases du cancer du sein. Cependant, le rôle de VEGFR2 dans l'invasion et la migration des cellules cancéreuses dépend du contexte. Dans le microenvironnement des tumeurs du sein, l'hypoxie induit la formation d'un complexe d'intégrine c-Met/β1 qui entraîne un potentiel d'invasion et de migration plus élevé des cellules cancéreuses. Cependant, le VEGFR2 activé par le VEGF se lie directement à la c-Met et à l'intégrine 1 pour empêcher la formation de complexes conduisant ainsi à la séquestration de la c-Met et de l'intégrine 1 [71]. Zhao et al. ont découvert que le VEGF entraîne l'expression de VEGFR2 et active par la suite l'expression de Myc et Sox2 médiée par la signalisation JAK2/STAT3. Boucle autocrine établie sur l'axe VEGF/VEGFR2 constituée de STAT3, Myc et Sox2 qui est impliquée dans l'amélioration du phénotype des cellules souches cancéreuses dans le TNBC (Fig. 2) [10]. néanmoins, Les CSC sont responsables de la métastase des cellules cancéreuses, de la résistance aux médicaments et de la rechute tumorale, perturber l'axe VEGFR2/STAT3/Myc/Sox2 pourrait être utile pour surmonter la chimio-résistance dans le cancer du sein triple négatif.

La lymphangiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques joue un rôle majeur dans la dissémination des cellules cancéreuses et les métastases à distance. Ainsi, la lymphangiogenèse s'avère être une cible prometteuse pour le traitement du cancer du sein. Cependant, l'indisponibilité de marqueurs spécifiques pour l'étude des vaisseaux lymphatiques et des métastases lymphogéniques retarde le développement d'un traitement anti-lymphangiogénique pour la prise en charge de différents types de cancer [72]. Le VEGFR3 est un RTK exprimé sur les cellules endothéliales lymphatiques (LEC) et il joue un rôle clé dans la lymphangiogenèse [20]. Une étude récente a suggéré que l'axe des chimiokines CCL21/CCR7 exprimé sur les cellules cancéreuses du sein interagit avec le VEGFR3 présent sur les LEC pour induire un recrutement vasculaire lymphatique dépendant de la tumeur et ainsi une lymphangiogenèse dans le cancer du sein [73]. La lymphangiogenèse est également impérative pour les métastases dans le cancer du sein post-partum. Des rapports récents suggèrent que la COX-2 induit l'expression de VEGFR3 et la lymphangiogenèse via l'axe VEGF-C/VEGFR3 pour favoriser la métastase ganglionnaire du cancer du sein post-partum [74, 75]. Le VEGFR3 est indispensable pour la diaphonie médiée par la galectine-8 impliquant les voies VEGF-C, podoplanine et intégrine conduisant à la lymphangiogenèse dans le cancer du sein [76]. Sur la base des résultats ci-dessus, le ciblage de la lymphangiogenèse à l'aide d'une thérapie anti-VEGFR3 pourrait être utile pour prévenir les métastases des cellules tumorales et augmenter la survie des patientes atteintes d'un cancer du sein.

PDGFR : rôle prometteur dans l'interaction tumeur-stroma dans le carcinome du sein

Les PDGFR sont des RTK de type III qui sont fortement exprimés dans les cellules tumorales du sein et stromales. La famille PDGFR se compose de PDGFR-α et et les deux présentent des fonctions similaires. PDGFR-α et β sont structurellement similaires et contiennent un domaine extracellulaire qui se compose de cinq replis de type immunoglobuline (Ig) et des domaines intracellulaires qui présentent une activité kinase et se compose de 100 résidus d'acides aminés différents des autres RTK. Les PDGF se lient principalement aux domaines 2 et 3 de type Ig et induisent une homo ou une hétérodimérisation des récepteurs. De plus, ces récepteurs sont encore stabilisés par des interactions directes récepteur-récepteur via le domaine 4 de type Ig après dimérisation [77]. L'activité aberrante des PDGFR dans différents types de cancer, y compris le sein, entraîne la tumorigenèse. Diverses études ont rapporté que l'expression du PDGFR est associée à un mauvais pronostic des patientes atteintes d'un cancer du sein et qu'elle a des potentiels pronostiques et prédictifs [78,79,80]. PDGFR est connu pour réguler divers réseaux de signalisation en aval, y compris Stat3 pour soutenir l'initiation et la progression des tumeurs du sein [72]. Parc et al. ont rapporté que l'activation de STAT3 induite par AF1q améliore la prolifération des cellules cancéreuses du sein, l'angiogenèse et les métastases via la cascade de signalisation PDGFR/Src [7]. En plus de réguler directement les cellules cancéreuses, les PDGFR sont également exprimés dans le stroma desmoplastique réactif, ce qui montre son rôle possible dans l'interaction tumeur-stroma. Bhardwaj et al. ont trouvé que PDGFR est exprimé par les myofibroblastes α-SMA-positifs (fibroblastes associés au cancer, CAF) et les cellules endothéliales dans le stroma périépithélial des tissus cancéreux du sein (Fig. 2) [79]. Paulsson et al. ont examiné le rôle pronostique de l'expression stromale de PDGFR-β en utilisant des puces à ADN tissulaires (TMA) du cancer du sein. Leurs résultats suggèrent que le PDGFR-β stromal présente la signification pronostique la plus importante dans le sous-ensemble des tumeurs du sein. Ils ont également constaté qu'une expression accrue de PDGFR est associée à une réduction des ER et PR et à une expression plus élevée de HER2, ainsi qu'à une augmentation du taux de prolifération et de la taille de la tumeur [80]. Dans une ligne de preuves similaire, Pinto et al. ont montré que le stroma malin induit la prolifération des cellules cancéreuses du sein luminal et l'angiogenèse dans des conditions sans œstrogènes via la cascade de signalisation PDGFR [81]. Ces résultats indiquent le rôle majeur du PDGFR dans la progression du cancer du sein en l'absence de signalisation ER. Cette notion est encore étayée par le fait que le PDGFR induit la différenciation endothéliale des cellules TNBC en utilisant in vitro formation de tubes et in vivo modèles de xénogreffe. De plus, D'Ippolito et al. ont défini le mécanisme moléculaire par lequel PDGFR régule la différenciation endothéliale des cellules tumorales dans le TNBC. L'expression de miR-9 induite par PDGFR favorise les propriétés vasculogènes en ciblant STARD13 et en régulant à la baisse miR-200 dans le TNBC (Fig. 2) [13]. Ces résultats indiquent que le ciblage du PDGF/PDGFR dans le microenvironnement tumoral pourrait être les approches thérapeutiques prometteuses pour le traitement du TNBC.

FGFR : expression aberrante dans le cancer du sein et implications en thérapie ciblée

Les membres de la famille FGFR (FGFR1, FGFR2, FGFR3 et FGFR4) sont constitués d'un domaine extracellulaire de liaison au ligand, d'un domaine transmembranaire et d'un domaine tyrosine kinase (TK) intracellulaire. Le domaine extracellulaire a trois domaines de type Ig (IgI-III). La liaison des FGF au FGFR conduit à la dimérisation et à l'activation subséquente du domaine kinase intracellulaire entraînant une phosphorylation croisée des résidus tyrosine présents sur la queue cytoplasmique du récepteur [82]. Les voies Ras/MAPK et PI3K/Akt sont activées en aval de ces récepteurs lors de la stimulation du ligand. Ces voies sont connues pour être activées de manière aberrante dans le cancer du sein et sont impliquées dans la survie, la prolifération, l'apoptose et la migration cellulaires [83, 84]. Les FGFR abritent des aberrations génétiques telles que des amplifications de FGFR1, FGFR2 et FGFR4 et des mutations des gènes FGFR2 et FGFR4 dans le cancer du sein [84,85,86,87]. Le carcinome lobulaire du sein métastatique qui montre une faible réponse à la chimiothérapie démontre une amplification du gène FGFR1 avec des implications dans la thérapie ciblée [86]. Formisano et al. ont démontré que le cancer du sein ER+ montre une amplification de FGFR1. Ils ont découvert que le FGFR s'associe à ERα dans les noyaux des cellules cancéreuses du sein et régule les gènes ER-dépendants en présence de privation d'œstrogènes. En plus du cancer du sein ER+, l'amplification du gène FGFR1 était corrélée à un mauvais pronostic dans le cancer du sein HER2- [88]. De plus, l'élévation du FGFR régule le remodelage du stroma tumoral et la récidive tumorale dans le cancer du sein induit par le FGFR1 [2]. Par conséquent, les études avec des thérapies combinées, ciblant le FGFR1 et d'autres RTK ont montré de meilleurs résultats dans le traitement du cancer par rapport au ciblage d'un seul RTK. Les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) dans FGFR2 ont été associés à un risque accru de cancer du sein ER+ et PR+ [89]. Cerliani et al. ont observé que l'interaction de FGFR2 avec la progestérone et STAT5 dans la tumeur du sein a entraîné une transcription accrue des gènes régulés par PR/STAT5 [90]. Une association de l'expression de FGFR2 et FGFR3 avec la progression du cancer du sein ER+ a été observée [91]. Même si le rôle du FGFR3 dans la progression du cancer du sein n'a pas été bien étudié, les variantes d'épissage du FGFR3 sont connues pour se localiser dans le noyau des cellules épithéliales du cancer du sein [92]. Koziczak et al. ont montré que FGFR4 et ErbB2 régulent conjointement l'expression de la cycline D1 pour favoriser la prolifération cellulaire dans le cancer du sein [93]. La boucle de rétroaction positive Twist1 régulée par ERK1/2, régulée par la signalisation FGFR, stabilise un phénotype CD44 hautement résistant aux médicaments après inhibition d'ErbB (Fig. 2) [94]. Sur la base des résultats ci-dessus, il est clair que les FGFR sont liés mécaniquement aux fonctions d'autres RTK et à la résistance aux médicaments et peuvent être des cibles potentielles pour le traitement du cancer du sein.

Rôle des miARN et des lncRNA dans la régulation de la signalisation RTK

Ces dernières années, plusieurs études ont rapporté le rôle des microARN (miARN) et des ARN longs non codants (lncRNA) dans la régulation de l'expression des composants de différentes voies de signalisation RTK. Tan et al. ont montré que le niveau d'ErbB2 dans le cancer du sein ER + résistant au tamoxifène est étroitement régulé par l'interaction entre miR-26a/b et l'antigène humain R (HuR) (Fig. 2) [95]. miR-34a et miR-155 régulent également l'expression d'ErbB2 au niveau post-transcriptionnel (Fig. 2) [96, 97]. miR-24 cible deux régulateurs (tyrosine-protéine phosphatase non-récepteur de type 9 (PTPN9) et récepteur de type tyrosine protéine phosphatase F (PTPRF)) de l'activation de l'EGFR, favorisant ainsi la métastase du cancer du sein [98]. L'EGFR est une cible directe de miR-206 dans le cancer du sein et ce dernier est induit dans le cancer du sein déficient en facteur nucléaire (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) [99]. Dans le cancer du sein humain, le miR675 dérivé de l'ARNnc H19 cible c-Cbl et Cbl-b, les ubiquitine ligases E3 qui sont connues pour dégrader l'EGFR et le c-MET, augmentant ainsi la stabilité de ces derniers [100]. lncRNA CYTOR régule la progression du cancer du sein par voie dépendante de l'EGFR [101]. Un autre lncRNA, BCAR4, améliore l'activité des récepteurs ErbB2/3 [102]. Le rôle des différents miARN et lnRNA dans la régulation des composants de signalisation RTK est répertorié dans le tableau 1.

Rôle de la signalisation RTK dans la résistance aux médicaments

La thérapie endocrinienne est le traitement qui bloque spécifiquement la fonction de signalisation du RE à l'aide d'antagonistes (tamoxifène, fulvestrant) ou d'une privation d'œstrogènes [103]. Près de 20 % des patients acquièrent une résistance à la thérapie ciblée sur l'ER via l'activation de voies de signalisation d'échappement pour surmonter la dépendance aux œstrogènes [104]. La surexpression ou l'activation de RTK tels que EGFR, HER2 et IGF1R entraîne une régulation négative du RE et une résistance au tamoxifène via l'activation des voies PI3K/Akt et MAPK (Fig. 3) [105, 106]. L'axe EGFR/MAPK favorise la phosphorylation du domaine AF-1 du RE pour améliorer l'activation indépendante du ligand de la signalisation du RE [106, 107]. L'activation de la signalisation EGFR/ErbB2 dans les cellules cancéreuses du sein ER+ résistantes au tamoxifène induit un phénotype de cellules souches très agressif dans ces cellules [108,109,110]. L'inhibition de la signalisation EGFR par l'erlotinib réduit considérablement la souche cancéreuse et inverse la résistance endocrinienne en induisant l'expression du RE [111]. De plus, l'amplification de HER2 dans le cancer du sein résistant au RE est en corrélation avec la population de cellules souches ALDH+ [108]. La population CSC exprime un niveau très élevé d'ARNm et de protéines HER2 par rapport à la population non-CSC chez les patients endocriniens résistants. Une activation plus élevée de l'EGFR/HER2 pourrait être la force motrice de l'enrichissement de la population de SCC dans le cancer du sein résistant au tamoxifène [36, 108]. L'association de l'expression de HER2 avec la résistance au RE a été expliquée dans plusieurs rapports. Des études de séquençage de l'exome entier ont révélé 13 mutations dans différents domaines de HER2 chez des patientes atteintes d'un cancer du sein métastatique ER+ résistant au système endocrinien [112]. Ces mutations produisent différents niveaux de résistance au tamoxifène et au fulvestrant dans les lignées cellulaires de cancer du sein ER+. De plus, les cofacteurs ER, HOXB3 et HOXB7 sont surexprimés dans les cellules cancéreuses du sein résistantes au tamoxifène et améliorent le phénotype du CSC. La répression transcriptionnelle médiée par Myc de miR-375 et miR-196a améliore respectivement l'expression de HOXB3 et HOXB7 [113, 114]. La protéine de liaison du rétinoblastome 2 (RBP2), un co-régulateur du RE, est surexprimée chez les patientes atteintes d'un cancer du sein résistant au tamoxifène et augmente la stabilité des RTK tels que l'EGFR et le HER2. De plus, le complexe RBP2-ER-NRIP1-HDAC1 active IGF1R par la répression transcriptionnelle des IGFBP4 et 5 [115]. Un autre coactivateur transcriptionnel du RE, la sous-unité médiatrice 1 (MED1) est surexprimé dans les cellules tumorales circulantes et les tissus tumoraux primaires du sein après un traitement au tamoxifène conduisant à une résistance au RE induite par HER2. La phosphorylation médiée par HER2 de MED1 recrute les corépresseurs transcriptionnels tels que HDAC1, N-CoR et SMART au promoteur des gènes régulés par ER dans les cellules HER+ résistantes au tamoxifène [116, 117].

Signalisation RTK dans la résistance aux médicaments. une Les agents chimiothérapeutiques conventionnels réduisent la progression du cancer par l'inhibition de l'axe de signalisation MAPK/PI3K/Akt. L'amplification et la surexpression des RTK, y compris EGFR, HER2 et PDGFR, renforcent l'activation de l'axe PI3K/Akt/YB-1/RTK pour maintenir la résistance aux médicaments, augmente l'activité de la kinase et conduit ainsi à la progression du cancer, à l'efflux de médicaments et à la sévérité du cancer. b Les cellules cancéreuses présentent une résistance à la thérapie RTK en raison de la perturbation de l'interaction entre le médicament et le récepteur ou de l'activation d'une signalisation RTK alternative

Outre l'hormonothérapie, d'autres types de traitements tels que la chirurgie, la radiothérapie et les médicaments cytotoxiques sont également disponibles pour le cancer du sein. Principalement, les anthracyclines (agents endommageant l'ADN) et les taxanes (agents stabilisant les microtubules) sont largement utilisés pour le cancer du sein en tant que thérapies adjuvantes ou néoadjuvantes [118].Cependant, la résistance aux médicaments anticancéreux cytotoxiques est l'inconvénient majeur dans le traitement du cancer. La multirésistance aux médicaments est principalement associée à la souche cancéreuse et à l'efflux de médicaments induits par divers signaux de survie [119]. Il est important de noter que les RTK sont des régulateurs clés de la souche cancéreuse et sont associés à la résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses du sein. En général, divers RTK activent la signalisation PI3K/Akt pour induire l'expression de facteurs de souche cancéreuse, de protéines associées à la multirésistance aux médicaments et de transporteurs membranaires dans les cellules cancéreuses. De plus en plus de preuves suggèrent clairement que la régulation à la hausse des RTK, notamment EGFR, HER2, VEGFR et IGF-1R au cours de la chimiothérapie, est associée à une surexpression/activation des transporteurs d'efflux de médicaments [41, 42]. Jin et al. ont montré la forte corrélation positive entre l'expression de la glycoprotéine p et l'EGFR avec la survie globale et sans maladie [43]. De plus, des expressions plus élevées d'EGFR et de HER2 sont détectées dans les cellules MCF7 résistantes à la doxorubicine par rapport aux cellules MCF7 sensibles à la doxorubicine. La surexpression de HER2 induit également une résistance à divers agents chimiothérapeutiques tels que le taxane, le cyclophosphamide, le méthotrexate, l'épirubicine dans le cancer du sein [120]. De plus, HER2 exprimant les cellules tumorales circulantes (CTC) montre moins de sensibilité aux différents agents chimiothérapeutiques, notamment la doxorubicine, le docétaxel et le 5-fluorouracile, par rapport aux CTC HER-négatives [121]. La surexpression des RTK est corrélée à l'expression de facteurs de transcription liés à la résistance aux médicaments dans le cancer du sein. YB-1 est un régulateur transcriptionnel/traductionnel et surexprimé dans les cellules souches cancéreuses. La localisation nucléaire de YB-1 est rapportée chez les patients atteints de rechute de cancer et résistants aux médicaments, quel que soit le statut ER et HER2. PI3K/Akt régulé par RTK phosphoryle YB-1 à Ser-102 pour faciliter la localisation nucléaire. De plus, le YB-1 nucléaire se lie à la région promotrice spécifique et active de manière transcriptionnelle l'expression des RTK, notamment EGFR, HER2 et VEGFR. La perturbation de la boucle d'auto-renforcement YB-1/RTK réduit considérablement la souche cancéreuse et l'efflux de médicaments dans les cellules cancéreuses du sein [122]. De plus, YB-1 augmente transcriptionnellement l'expression des glycoprotéines p (MDR-1 et MDR-3) provoque la multirésistance dans le cancer du sein (Fig. 3) [123, 124]. Les TAM sont connus pour influencer le maintien d'un microenvironnement approprié pour les cellules souches cancéreuses et la résistance soutenue aux médicaments dans le cancer du sein. Les TAM produisent le plus haut niveau de cytokines, TGFα, EGF, FGF et VEGF dans le microenvironnement tumoral. Des niveaux plus élevés de ces ligands activent la signalisation RTK dans le cancer du sein ainsi que les macrophages [125]. Une forte corrélation entre l'expression de l'EGFR et les macrophages CD163+ a été trouvée chez les patientes atteintes d'un cancer du sein résistant au tamoxifène [126]. De plus, les TAM régulent positivement les gènes associés à la souche cancéreuse ainsi qu'un efflux accru de médicaments et une chimiorésistance dans le modèle préclinique de cancer du sein [127].

Traitements anticancéreux ciblés sur les récepteurs à tyrosine kinase (RTK)

Le cancer du sein est une maladie hétérogène qui a été caractérisée moléculairement en cinq sous-types en fonction de l'expression de ER, PR et HER2. Ces sous-types comprennent Luminal A (bas grade, ER+/PR+, HER2-, faible Ki67), Luminal B (ER+/PR+, HER2+ ou HER2-, high Ki67), TNBC ou basal-like (ER-/PR- et HER2 -), cancer du sein enrichi en HER2 et de type normal [128]. Pour le cancer du sein à récepteurs hormonaux positifs (luminal A et B), l'hormonothérapie composée de modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes (tamoxifène et raloxifène) est couramment utilisée comme traitement adjuvant [129]. Étant donné que le TNBC ou le cancer du sein de type basal et enrichi en HER n'expriment pas de récepteurs hormonaux, l'hormonothérapie n'est donc pas efficace dans ces sous-types. Cependant, en raison de l'expression importante des RTK dans les sous-types enrichis en TNBC et HER2, le blocage des fonctions des RTK est l'une des approches prometteuses pour la gestion du cancer du sein enrichi en TNBC et HER2. Jusqu'à présent, diverses stratégies ont été adoptées pour l'inhibition de la signalisation RTK-dépendante. Des mutations ou une surexpression des gènes de l'EGFR entraînent une progression tumorale et une résistance aux médicaments dans divers types de cancer, dont le sein [127]. Par conséquent, l'EGFR a le potentiel d'être une cible thérapeutique attrayante dans le cancer du sein, et les inhibiteurs de l'EGFR, y compris les inhibiteurs à petites molécules et les anticorps monoclonaux (mAb), ont été développés et certains sont actuellement utilisés en clinique. La surexpression de HER2 est fréquemment retrouvée dans le cancer du sein. Plusieurs médicaments ciblant HER2 ont été développés et sont actuellement utilisés pour le traitement du cancer du sein.

Le trastuzumab (Herceptin) est un mAb humanisé qui cible le domaine extracellulaire de HER2 dans le cancer du sein HER2+ et il a été rapporté qu'il améliore la survie des patientes aux stades précoces et tardifs du cancer du sein [130]. Cependant, le mécanisme exact par lequel le trastuzumab exerce son effet thérapeutique n'est pas bien compris. De et al. ont rapporté que le trastuzumab inhibe l'hétérodimérisation HER2-HER3 qui est connue pour se produire de manière indépendante du ligand dans le cancer du sein HER2+. Plusieurs rapports suggèrent également que le trastuzumab pourrait induire une dégradation de HER2, mais le mécanisme sous-jacent est inexploré [131]. Bien que le traitement par trastuzumab améliore considérablement l'issue de la maladie, la résistance au trastuzumab est un obstacle majeur au traitement du cancer du sein HER2-positif. Environ 65 % des patientes atteintes d'un cancer du sein HER2-positif ne répondent pas au traitement primaire par trastuzumab. De plus, une majorité de patients qui répondent bien au traitement au trastuzumab présentent une rechute tumorale plus tard [132, 133]. En 2013, la FDA a approuvé un conjugué anticorps-médicament T-DM1 ou trastuzumab emtansine ou ado trastuzumab emtansine (nom commercial Kadcyla) pour le traitement des patientes atteintes d'un cancer du sein métastatique HER-positif qui ont déjà été traitées par trastuzumab et un taxane. Le T-DM1 est composé de trastuzumab et d'un agent cytotoxique emtansine (DM1) qui tue les cellules cancéreuses en se liant à la tubuline [134]. Un essai randomisé sur 991 patientes atteintes d'un cancer du sein avancé HER2-positif a montré une survie médiane sans progression plus élevée chez les patientes traitées par T-DM1 par rapport à celles traitées par lapatinib plus capécitabine [135]. Cependant, un essai de phase III récemment achevé utilisant des schémas thérapeutiques de trastuzumab plus taxane, T-DM1 plus placebo, T-DM1 ou T-DM1 plus pertuzumab à des doses standard chez 1095 patientes atteintes d'un cancer du sein avancé HER2-positif. Aucune augmentation significative de la survie sans progression dans les groupes T-DM1 et T-DM1 plus pertuzumab n'a été observée par rapport au trastuzumab plus taxane bien que les bras contenant le T-DM1 aient montré une meilleure tolérance [136]. Le pertuzumab (nom commercial perjeta) est un autre anticorps monoclonal contre HER2 qui a été approuvé pour le traitement néo-adjuvant ou adjuvant du cancer du sein avancé HER2 positif en association avec le trastuzumab et le docétaxel. Les essais cliniques ont démontré que les patientes atteintes d'un cancer du sein recevant une combinaison de pertuzumab, de trastuzumab et de docétaxel avaient une survie sans progression améliorée par rapport au groupe témoin [137, 138].

Le TNBC ou cancer du sein de type basal est connu pour être négatif pour HER2, il a été démontré qu'il exprime l'EGFR chez 40% des patients, parmi lesquels 18% des patients auraient un gène EGFR amplifié. Par conséquent, l'EGFR est l'une des cibles importantes pour le cancer du sein HER2 négatif, y compris les TNBC. Le lapatinib (Tykerb), un double inhibiteur de la tyrosine kinase, se lie à la poche de liaison à l'ATP du domaine EGFR et HER2 kinase et bloque la liaison à l'ATP, entraînant ainsi l'inhibition de l'activité EGFR et HER2 kinase. Les inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITK) sont connus pour être utilisés comme schéma thérapeutique alternatif chez les patientes atteintes d'un cancer du sein HER2+ présentant une résistance au trastuzumab [139, 140]. De plus, le lapatinib a été utilisé en association avec d'autres médicaments anticancéreux, la capécitabine ou le létrozole. Ces thérapies combinées ont montré une survie sans maladie plus élevée chez les patientes atteintes d'un cancer du sein métastatique HER2+ [141, 142]. De nombreux essais cliniques ont été menés pour évaluer l'efficacité et la toxicité des ITK seuls ou en combinaison avec d'autres médicaments dans le cancer du sein. Malheureusement, les résultats de ces essais ont été déçus jusqu'à présent. Peu d'essais et leurs résultats sont répertoriés dans le tableau 2. Les essais cliniques de phase II du géfitinib ou de l'erlotinib ont montré un faible taux de réponse globale (ORR) tandis que l'essai clinique avec le géfitinib en association avec l'épirubicine et le cyclophosphamide n'a montré aucune différence significative dans la réponse pathologique complète dans le RE- cancer du sein négatif [142,143,144,145,146]. De plus, l'afatinib, un ITK EGFR irréversible de deuxième génération, n'a montré aucune réponse objective dans un essai de phase II chez des patients atteints de TNBC métastatique [147].

Il y a eu six essais cliniques avec des mAb anti-EGFR pour explorer leur efficacité et leur sécurité chez les patients TNBC, comme indiqué dans le tableau 2. Carey et al. ont réalisé un essai clinique dans le cancer du sein récidivant avancé métastatique pour examiner l'efficacité du cétuximab ou du cétuximab en association avec le carboplatine. Le cétuximab en association avec le carboplatine a démontré un taux de réponse plus élevé que le carboplatine seul. Cependant, 13 des 18 patients traités ont montré une signalisation EGFR active qui indique que le cetuximab n'a pas réussi à inhiber la voie EGFR [148]. Un taux de réponse plus élevé chez les patients traités par cisplatine-cétuximab (20 %) par rapport au groupe traité par cisplatine (10 %) a été rapporté dans les TNBC avancés. Cependant, les résultats n'étaient pas statistiquement significatifs [149]. De même, un essai de phase II sur l'ixabépilone seule et l'ixabépilone plus cetuximab chez des patients atteints de TNBC avancé/métastatique a été mené par Tredan et al. Cette étude n'a montré aucune amélioration du taux de réponse [150]. Pendant ce temps, l'irinotécan et le cetuximab ont montré un taux de réponse accru chez les patients TNBC par rapport aux autres sous-types, cependant, les résultats n'étaient pas statistiquement significatifs [151]. Une réponse modeste a été observée lorsque les patients TNBC opérables ont été traités par FEC standard (5-fluorouracile, épidoxorubicine et cyclophosphamide) après une chimiothérapie préopératoire consistant en panitumumab ou cetuximab associé au docétaxel [152, 153]. Des lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) CD8+ plus élevés ont été repérés dans le microenvironnement tumoral en réponse au traitement néoadjuvant par mAb EGFR. Dans l'ensemble, le résultat des essais cliniques d'AcM EGFR dans le TNBC semble être légèrement meilleur que celui des ITK EGFR. Plusieurs essais utilisant une thérapie anti-RTK et leurs résultats sont répertoriés dans le tableau 2 [146, 154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174].

Défis du ciblage des RTK dans le cancer du sein : accent sur les éléments compensatoires

Les médicaments thérapeutiques ciblant RTK sont connus pour réduire la multirésistance aux médicaments et le phénotype CSC dans les cellules cancéreuses du sein. Cependant, les cellules cancéreuses présentent une résistance aux inhibiteurs de RTK dans les modèles cliniques et précliniques. Par exemple, les thérapies ciblant HER2 (trastuzumab, pertuzumab, TDM1 et lapatinib) sont connues pour entraver la progression tumorale primaire et la rechute du cancer, mais une résistance aux médicaments est toujours observée chez environ 80 % des patientes atteintes d'un cancer du sein métastatique HER2+ [142]. De même, de nombreux types de cancer, y compris le sein, acquièrent souvent une résistance à divers inhibiteurs de RTK tels que les inhibiteurs de VEGFR (bevacizumab) [175], les inhibiteurs d'EGFR (gefitinib) [176], les inhibiteurs de FGFR (AZD4547) [177]. Plusieurs mécanismes ont été dérivés pour décrire l'apparition d'une résistance aux inhibiteurs de RTK. Plusieurs mutations dans les RTK et leurs cibles en aval et l'activation de plusieurs autres RTK sont les principaux éléments compensatoires à l'origine des voies de survie et de la résistance aux thérapies anti-RTK dans le cancer du sein. IGF1R, EGFR, AXL, VEGFR sont d'autres membres de RTK qui partagent des molécules de signalisation communes en aval telles que PI3K/Akt/mTOR et MAPK avec HER2 dans le cancer du sein [178]. De plus, IGF1R est surexprimé dans le cancer du sein HER2+ et forme un complexe hétéromère avec HER2 et HER3 pour activer la voie de signalisation PI3K. La formation de ces complexes hétéromères avec les protéines de la famille HER a été associée à la résistance au trastuzumab chez les patientes atteintes d'un cancer du sein métastatique HER2+ [179]. Il a été rapporté que la combinaison de médicaments anti-HER2 avec des mAb anti-IGF1R (metformine et figitumumab) produit des effets synergiques dans les cellules cancéreuses du sein. C-Met est le RTK, fréquemment exprimé chez les patientes atteintes d'un cancer du sein HER2+ et contribue à la résistance au trastuzumab. La régulation à la hausse de c-Met protège les cellules cancéreuses du trastuzumab en abrogeant l'induction de p27, tandis que l'inhibition de c-Met sensibilise les cellules cancéreuses au traitement par trastuzumab [180]. La phosphorylation médiée par c-Src de l'EGFR à Tyr845, Tyr992 et Tyr1086 est associée à la résistance à la thérapie anti-EGFR dans le cancer du sein. L'activation de c-Met pendant le traitement par EGFR facilite la phosphorylation associée à la kinase c-Src et la croissance cellulaire dans les cellules cancéreuses du sein. De plus, une combinaison de c-Met ciblant des inhibiteurs de petites molécules avec un inhibiteur d'EGFR diminue la phosphorylation de l'EGFR et l'activité de la kinase via l'inhibition de la kinase c-Src réduit ainsi la résistance à l'EGFR [181]. Une augmentation du nombre de copies de FGF3/4/19 a été rapportée dans des tumeurs résistantes au lapatinib et au trastuzamab. Une expression et une phosphorylation plus élevées de FGFR sont corrélées à une survie sans maladie réduite et à une résistance à la thérapie anti-HER2 chez les patientes atteintes d'un cancer du sein. L'activation du FGFR stimule en outre la phosphorylation de kinases non réceptrices telles que MAPK et PI3K/Akt via l'activation de la phospholipase Cγ dans le cancer du sein résistant au tamoxifène [182]. Les amplifications et les mutations dans les gènes cibles en aval dépendants de RTK (PI3KCA ou Akt) contournent le rôle des RTK dans leur activation afin de produire une activation ininterrompue de la signalisation de croissance dans les cellules cancéreuses du sein. La mutation dans PI3CA est fortement associée à la surexpression d'ErbB2 et aux métastases ganglionnaires [183].

Le bevacizumab est le premier médicament anti-VEGFR approuvé par la FDA américaine pour le traitement du cancer du sein, mais il est finalement arrêté en raison de l'apparition d'une résistance à celui-ci. La thérapie anti-VEGFR induit une hypoxie dans le microenvironnement tumoral et conduit à une augmentation de l'agressivité du cancer du sein. Sous des stimuli hypoxiques, les cellules stromales sécrètent un niveau très élevé de cytokines qui activent des voies angiogéniques alternatives et augmentent la souche cancéreuse et l'autophagie [175]. L'éphrine-A1 et B2 sont des facteurs proangiogéniques, importants pour le remodelage et la maturation des nouveaux vaisseaux sanguins. L'hypoxie médie la régulation positive de l'éphrine et l'expression des éphrines est fortement associée à la résistance à la thérapie VEGFR. Plusieurs facteurs proangiogéniques tels que l'angiopoïétine 2 (ANG-2), l'EGF, le bFGF, le facteur de croissance des kératinocytes, l'IGF-1, le TGF-β, le TNF-α et les interleukines (IL-1, IL-8, IL-12 et IL-17 ) ont été impliqués dans la résistance tumorale associée à l'hypoxie au traitement anti-VEGFR [184]. La sécrétion d'IL-17, G-CSF, IL-6 et SDF1 dans le microenvironnement tumoral recrute des cellules myéloïdes CD11b+Gr1+ dans la tumeur et l'angiogenèse indépendante du VEGFR associée au Bv8 entraîne une résistance à la thérapie anti-VEGFR. La déplétion de l'infiltration des cellules myéloïdes CD11b+Gr1+ par les anticorps neutralisants Bv8 sensibilise les cellules cancéreuses à la thérapie ciblée par VEGFR [185].

L'interaction altérée entre les agents anti-RTK et leur récepteur respectif est une autre raison du développement de la résistance. Cela pourrait être dû à l'existence plus élevée de protéines masquantes à proximité immédiate des récepteurs, aux changements structurels du récepteur et au manque d'expression du domaine ciblé. La mucine-4 et le CD44 sont les protéines de surface cellulaire surexprimées chez les patientes atteintes d'un cancer du sein résistant au trastuzumab. L'expression de ces protéines à proximité immédiate de l'épitope HER2 masque l'interaction entre le trastuzumab et HER2 et augmente la croissance du cancer du sein [186, 187]. D'autre part, l'expression d'une version tronquée de HER2 l'emporte sur la sensibilité au trastuzumab dans le cancer du sein. p95 HER2 forme un hétérodimère avec la protéine HER3 et active la signalisation en aval de manière indépendante du ligand (Fig. 3) [188]. Éliatkine et al. ont montré que 28 % des patients qui développent une résistance au trastuzumab ont une expression plus élevée de p95 HER2. Cependant, un faible niveau d'expression de p95 HER2 est également retrouvé chez les patients sensibles au trastuzumab [189]. De plus, des mutations dans HER2 pourraient perturber la reconnaissance des anticorps ou l'interaction physique entre le médicament et le récepteur. La mutation T798M dans HER2 a montré une activité autocatalytique accrue et l'expression des ligands EGFR a entraîné des changements de 10 fois dans la CI50 du lapatinib dans les cellules cancéreuses du sein humaines. De plus, les anticorps ciblant l'EGFR, le cetuximab ou le lapatinib inversent la résistance au trastuzumab dans ces cellules spécifiques du T798M [190]. Hanker et al. ont montré que les patients présentant une mutation HER2 L869R acquièrent une mutation secondaire à HER2 T798I comme réponse ultérieure au traitement par nératinib. Des études de modélisation moléculaire ont suggéré que HER2 T798I a augmenté la teneur en isoleucine dans sa structure protéique et que cela réduit la liaison entre le nératinib et HER2 [191].


Anatomie de la fonction et de la régulation de Ras du point de vue biologique structural

Structures tertiaires de Ras

L'analyse comparative des séquences d'acides aminés entre Ras et les protéines G hétérotrimériques, suivie d'études de mutagenèse dirigée, a identifié dans les années 1980 des domaines fonctionnels appelés domaines G comprenant cinq motifs G (G1 à G5), qui sont conservés parmi les sous-unités Gα de la protéine G hétérotrimérique et petites GTPases. En 1988, de Vos et al. (8) a signalé la première structure tertiaire de Ras, je.e. H-Ras•GDP, par une approche cristallographique. L'année suivante, la structure cristalline du H-Ras•guanosine 5′-(β, γ-imido) triphosphate (H-Ras•GppNHp), où un analogue du GTP non hydrolysable, GppNHp, a remplacé le GTP lié, a été déterminée par Pai et al. (9). La structure globale de H-Ras a montré un pli Rossmann constitué d'un noyau hydrophobe de 6 feuillets β brins et de 5 hélices , qui sont reliées par 10 boucles (Fig. 2). Cinq de ces boucles jouent des rôles essentiels pour la liaison GDP/GTP et l'hydrolyse du GTP lié. La comparaison structurelle entre H-Ras•GDP et H-Ras•GTP a révélé que l'échange de nucléotides de guanine induit principalement des changements conformationnels dans les deux régions flexibles, nommées Switch I (résidus 32-38) comprenant le motif G2 et Switch II (résidus 60- 75) dont le motif G3 (10). Dans Ras•GTP, le réseau de liaisons hydrogène à travers le -phosphate du nucléotide guanine, Thr35 dans Switch I et Gly60 et Gln61 dans Switch II, stabilise la conformation, alors que les interactions correspondantes sont totalement absentes dans Ras•GDP en raison de l'absence du groupe γ-phosphate ( Fig. 2).

Structures tertiaires de H-Ras•GDP et H-Ras•GppNHp et dynamique conformationnelle de Ras•GppNHp. Ras fonctionne comme un commutateur moléculaire en faisant un cycle entre les formes actives liées au GTP et les formes inactives liées au GDP dans diverses voies de signaux intracellulaires.L'interconversion entre les deux formes est réciproquement catalysée par les GEF et les GAP. Ras•GTP présente un équilibre conformationnel entre deux états, l'état 1 et l'état 2. L'état 1, correspondant à une forme inactive, possède une poche superficielle, invisible à l'état 2, qui peut accueillir des composés de petites molécules. Les commutateurs I et II sont respectivement colorés en jaune et en vert. Les nucléotides Thr35, Gly60, Gln61 et guanine sont représentés en bâtonnets. Les codes de la banque de données de protéines pour H-Ras•GDP, H-Ras•GppNHp état 2 et M-RasP40D•GppNHp état 1 sont respectivement 4Q21, 5P21 et 3KKP. #3 représente le numéro de catégorie d'inhibiteur de Ras dans le tableau I.

Structures tertiaires de H-Ras•GDP et H-Ras•GppNHp et dynamique conformationnelle de Ras•GppNHp. Ras fonctionne comme un commutateur moléculaire en faisant un cycle entre les formes actives liées au GTP et les formes inactives liées au GDP dans diverses voies de signaux intracellulaires. L'interconversion entre les deux formes est réciproquement catalysée par les GEF et les GAP. Ras•GTP présente un équilibre conformationnel entre deux états, l'état 1 et l'état 2. L'état 1, correspondant à une forme inactive, possède une poche superficielle, invisible à l'état 2, qui peut accueillir des composés de petites molécules. Les commutateurs I et II sont respectivement colorés en jaune et en vert. Les nucléotides Thr35, Gly60, Gln61 et guanine sont représentés en bâtonnets. Les codes de la banque de données de protéines pour H-Ras•GDP, H-Ras•GppNHp état 2 et M-RasP40D•GppNHp état 1 sont respectivement 4Q21, 5P21 et 3KKP. #3 représente le numéro de catégorie d'inhibiteur de Ras dans le tableau I.

Régulation de l'activité Ras par GEF et GAP

La base structurelle de la régulation médiée par GEF et GAP de l'activité Ras a été découverte par Wittinghofer, Kuryan et leurs collaborateurs à la fin des années 1990 grâce à la détermination des structures cristallines de H-Ras en complexe avec le catalyseur (cycle de division cellulaire 25 homologue) domaine de Sos et p120GAP, respectivement (11, 12). Au cours de l'échange de nucléotides médié par Sos de Ras•GDP à Ras•GTP, l'interaction étroite de GDP avec Ras est perturbée par le domaine catalytique de Sos des deux manières suivantes. Tout d'abord, l'épingle à cheveux -hélicoïdale de Sos est insérée dans le commutateur I de Ras, déplaçant ainsi le commutateur I et ouvrant par la suite le site de liaison des nucléotides. Ensuite, les chaînes latérales des résidus dans l'épingle à cheveux et celles de Switch II, qui suppose une conformation désordonnée résultant des changements structurels survenus à la première étape, modifient les environnements chimiques entourant le site de liaison des groupes phosphate du nucléotide et du Mg. 2+. Par conséquent, la consolidation du PIB n'est plus privilégiée et le PIB est libéré de Ras. La forme sans nucléotide résultante est préférentiellement convertie en Ras•GTP plutôt qu'en Ras•GDP car la concentration cellulaire de GTP est beaucoup plus élevée que celle de GDP.

L'hydrolyse intrinsèque du GTP de Ras dépend des emplacements et des orientations de la chaîne latérale de Gln61 dans Switch II et d'une molécule d'eau catalytique activée par la chaîne latérale de Gln61 pour exercer une attaque nucléophile sur le -phosphate de GTP. On pense que la chaîne latérale Val12 volumineuse du mutant G12V abaisse l'activité GTPase par une interférence stérique sur ce processus catalytique. La stimulation de l'hydrolyse du GTP par le GAP est réalisée des manières suivantes. Premièrement, la liaison de la boucle α7 variable de GAP au Switch I de Ras•GTP établit la spécificité d'appariement entre les deux protéines. Ensuite, une interaction de haute affinité de Ras avec le motif Phe-Leu-Arg (FLA) de GAP est établie, ce qui stabilise les deux régions de commutation. La boucle Arg-finger de GAP, qui est hautement conservée parmi les GAP pour diverses petites GTPases, est insérée dans un site actif pour neutraliser les charges en développement dans l'état de transition, facilitant ainsi l'hydrolyse Gln61/catalytique du GTP à médiation par l'eau.

Reconnaissance effectrice et dynamique conformationnelle de Ras

Les analyses de la structure cristalline de H-Ras•GppNHp en complexe avec les effecteurs en aval, tels que Raf, PI3K et RalGDS (13-16), ont démontré que les structures de squelette de H-Ras•GppNHp dans les complexes étaient similaires à celles de H- Ras•GppNHp seul. Switch I et Switch II, contenant des boucles flexibles, constituent une interface de liaison principale pour la reconnaissance effectrice. De plus, la propriété flexible de ces régions est vraisemblablement instrumentale dans la reconnaissance d'une variété d'effecteurs avec une diversité de séquence substantielle dans leurs domaines de liaison Ras.

Parallèlement aux études cristallographiques ci-dessus, en 1996, Geyer et al. (17) ont montré que H-Ras•GppNHp adopte deux états conformationnels en solution, appelés état 1 et état 2 ( Fig. 2) et que les deux états présentent un équilibre en s'interconvertissant dans une échelle de temps de la milliseconde à travers des analyses 31 P RMN de la atomes de phosphore nucléotidique. Les deux états ont été caractérisés par des signaux avec des valeurs de déplacement chimique différentes dans le spectre RMN 31 P acquis à basse température. Les signaux correspondants ont également été observés pour H-Ras en complexe avec le GTP ou d'autres analogues du GTP non hydrolysables, tels que la guanosine 5′-3-O-(thio)triphosphate (18, 19). Cette caractéristique structurelle dynamique est partagée entre les petites GTPases de la famille Ras, y compris Rap, Ral et M-Ras, bien que les distributions d'état présentent de grandes variations (20). L'état 2 représente une conformation active car la liaison aux effecteurs a induit un changement d'équilibre vers l'état 2 (8) indiquant que les structures cristallines précédemment résolues de Ras•GppNHp seul ou en complexe avec les effecteurs correspondaient à l'état 2. L'état 1 est considéré comme inactif conformation avec une capacité fortement altérée de se lier aux effecteurs (21). Contrairement aux informations structurelles étendues accumulées sur l'état 2, celle sur l'état 1 est très limitée, ce qui s'explique vraisemblablement par une difficulté à déterminer une seule conformation stabilisée en raison de sa propriété structurelle flexible. Les analyses structurelles de l'état 1 ont été principalement menées en utilisant des mutants artificiels H-Ras, tels que T35S, T35A et G60A, et un homologue Ras, M-Ras, qui adoptent tous principalement l'état 1 en solution (21-23). La première structure cristalline de l'état 1 de H-RasT35S•GppNHp résolue en 2001 n'a pas pu montrer sa figure complète car les informations structurelles sur les deux régions de commutation étaient complètement manquantes (21). En 2005, nous avons rapporté la structure cristalline de l'état 1 de M-Ras•GppNHp, cependant, les informations structurelles sur cinq résidus dans Switch II manquaient (23). En 2010, la structure complète de l'état 1 a finalement été dévoilée à l'aide de M-Ras portant une substitution d'acide aminé de type H-Ras P40D à une résolution élevée de 1,35 Å (24). L'année prochaine, nous avons abordé le mécanisme de la transition d'état à travers les analyses cristallographiques et RMN de M-RasD41E et H-RasT35S (25, 26). Comme déduit des études précédentes ( 27), l'état 1 présente une conformation ouverte accompagnée de la perte des réseaux de liaisons hydrogène à travers les deux régions de commutation et du nucléotide guanine trouvé dans les structures de l'état 2, entraînant la formation d'une poche de surface appropriée pour accepter des composés à petites molécules ( Fig. 2). Parce que l'absence d'une telle poche dans les structures de l'état 2 avait rendu Ras « indrigable », notre découverte de la poche « droguable » a mis en lumière la conception médicamenteuse basée sur la structure (SBDD) d'inhibiteurs spécifiques qui bloquent allostériquement l'activation de Ras en stabilisant la conformation de l'état 1 inactif (28, 29).

Modifications post-traductionnelles de Ras essentielles pour le ciblage de la membrane plasmique

Les modifications lipidiques post-traductionnelles de Ras sont nécessaires non seulement pour leur ciblage sur la membrane plasmique (Fig. 1B) mais aussi pour l'activation complète des effecteurs tels que c-Raf-1 (30). Bien que les séquences des 25 résidus C-terminaux, appelées région hypervariable, des trois isoformes Ras soient très divergentes, elles se terminent par la séquence du motif CAAX (C : cystéine, A : acides aminés aliphatiques, X : tous acides aminés) ( 31). Une fraction farnésyle est liée de manière covalente aux polypeptides Ras cytoplasmiques nouvellement synthétisés par l'enzyme farnésyltransférase (FTase). Cette réaction de prénylation est suivie d'un clivage protéolytique de la séquence AAX, catalysé par l'enzyme de conversion Ras-1 (RCE1), puis par la carboxyméthylation du Cys186 C-terminal nouvellement formé par l'isoprénylcystéine carboxyméthytransférase-1 (ICMT1). De plus, une autre étape de modification, où une fraction palmitoyle est attachée aux résidus Cys immédiatement en amont du motif CAAX par l'enzyme palmitoyltransférase (PTase), joue un rôle crucial dans l'ancrage membranaire des H-Ras, N-Ras prénylés. et K-Ras4A. Dans le cas de K-Ras4B, la région polybasique en amont du motif CAAX se substitue à la palmitoylation pour l'ancrage membranaire. Les enzymes d'une série de modifications post-traductionnelles et leurs substrats sont des cibles prometteuses pour le développement d'inhibiteurs de Ras.

État actuel du développement des inhibiteurs de Ras

Dans cette section, nous résumons les récentes tentatives de développement d'inhibiteurs de Ras dans les universités et l'industrie, qui sont classées en trois catégories sur la base des concepts de travail (tableau I). Tout d'abord, nous nous concentrons sur les stratégies visant à bloquer le ciblage membranaire de Ras, y compris la dernière ciblant les protéines de liaison au prényl qui escortent Ras jusqu'à la membrane plasmique. Deuxièmement, nous discutons des stratégies visant à empêcher la formation de Ras•GTP en bloquant l'interaction Ras–GEF. Troisièmement, nous discutons des stratégies visant à bloquer l'interaction Ras–effecteur, y compris celles pour le développement d'inhibiteurs de Ras allostériques en ciblant la dynamique conformationnelle de Ras•GTP comme la nôtre.

Classification des inhibiteurs de Ras selon les concepts de travail

. Les références .
.
#1 : Localisation de la membrane plasmique .
FTase TLN-4601 ( 49)
galectine Salirasib ( 37, 38)
APP-1/2 Palmostatine B, Palmostatine M ( 36, 50)
PDEδ Deltarasin ( 39)
ICMT Cysméthynil ( 51)
#2 : Échange PIB-GTP
Ras•PIB SCH53239 ( 52, 53)
HBS ( 44)
Andrographolide ( 54)
DCAI ( 42)
13 ( 55)
bisphénol A ( 56)
K-RasG12C•PIB SML-8-73-1, SML-10-70-1 ( 43)
VSA9, AA12 ( 44)
#3 : Interactions effectrices en aval
Ras•GTP Complexe métal-cyclène, Complexe métal-bis(2-picolyl)amine ( 57–59)
Fragment d'anticorps ( 60)
Sulfure de Sulindac ( 61)
Composés MCP ( 48)
Composés de la famille Kobe ( 62)
. Les références .
.
#1 : Localisation de la membrane plasmique .
FTase TLN-4601 ( 49)
galectine Salirasib ( 37, 38)
APP-1/2 Palmostatine B, Palmostatine M ( 36, 50)
PDEδ Deltarasin ( 39)
ICMT Cysméthynil ( 51)
#2 : Échange PIB-GTP
Ras•PIB SCH53239 ( 52, 53)
HBS ( 44)
Andrographolide ( 54)
DCAI ( 42)
13 ( 55)
bisphénol A ( 56)
K-RasG12C•PIB SML-8-73-1, SML-10-70-1 ( 43)
VSA9, AA12 ( 44)
#3 : Interactions effectrices en aval
Ras•GTP Complexe métal-cyclène, Complexe métal-bis(2-picolyl)amine ( 57–59)
Fragment d'anticorps ( 60)
Sulfure de Sulindac ( 61)
Composés MCP ( 48)
Composés de la famille Kobe ( 62)

Classification des inhibiteurs de Ras selon les concepts de travail

. Les références .
.
#1 : Localisation de la membrane plasmique .
FTase TLN-4601 ( 49)
galectine Salirasib ( 37, 38)
APP-1/2 Palmostatine B, Palmostatine M ( 36, 50)
PDEδ Deltarasin ( 39)
ICMT Cysméthynil ( 51)
#2 : Échange PIB-GTP
Ras•PIB SCH53239 ( 52, 53)
HBS ( 44)
Andrographolide ( 54)
DCAI ( 42)
13 ( 55)
bisphénol A ( 56)
K-RasG12C•PIB SML-8-73-1, SML-10-70-1 ( 43)
VSA9, AA12 ( 44)
#3 : Interactions effectrices en aval
Ras•GTP Complexe métal-cyclène, Complexe métal-bis(2-picolyl)amine ( 57–59)
Fragment d'anticorps ( 60)
Sulfure de Sulindac ( 61)
Composés MCP ( 48)
Composés de la famille Kobe ( 62)
. Les références .
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#1 : Localisation de la membrane plasmique .
FTase TLN-4601 ( 49)
galectine Salirasib ( 37, 38)
APP-1/2 Palmostatine B, Palmostatine M ( 36, 50)
PDEδ Deltarasin ( 39)
ICMT Cysméthynil ( 51)
#2 : Échange PIB-GTP
Ras•PIB SCH53239 ( 52, 53)
HBS ( 44)
Andrographolide ( 54)
DCAI ( 42)
13 ( 55)
bisphénol A ( 56)
K-RasG12C•PIB SML-8-73-1, SML-10-70-1 ( 43)
VSA9, AA12 ( 44)
#3 : Interactions effectrices en aval
Ras•GTP Complexe métal-cyclène, Complexe métal-bis(2-picolyl)amine ( 57–59)
Fragment d'anticorps ( 60)
Sulfure de Sulindac ( 61)
Composés MCP ( 48)
Composés de la famille Kobe ( 62)

Inhibition du ciblage membranaire de Ras

La localisation intracellulaire correcte dépendant d'une série de modifications post-traductionnelles est essentielle pour la signalisation Ras efficace. Ainsi, l'inhibition pharmacologique des enzymes catalysant divers processus de modification devrait présenter un effet anti-tumoral envers les cellules cancéreuses porteuses des mutations Ras oncogènes en bloquant la signalisation Ras activée. Un certain nombre d'inhibiteurs de la FTase (FTI) ont été développés, et certains d'entre eux ont atteint le stade avancé des essais cliniques. Cependant, il a finalement été conclu que la monothérapie avec les FTI n'a montré aucune efficacité clinique pour les tumeurs solides avancées (32), probablement parce qu'une prénylation alternative, la géranylgéranylation, de K-Ras4B et N-Ras catalysée par la géranylgéranyl transférase I, a contourné l'effet inhibiteur de FTI en se substituant fonctionnellement à la farnésylation. Cependant, des études récentes ont rapporté une efficacité prometteuse des FTI utilisés en monothérapie ou en association avec d'autres agents cytotoxiques conventionnels (33) tandis que les inhibiteurs de la géranylgéranyltransférase n'ont montré aucune efficacité clinique (34). Fondamentalement, les essais cliniques pour les FTI doivent être axés sur le traitement des tumeurs malignes dépendantes de H-Ras, car seul H-Ras est totalement dépendant de la farnésylation pour son ciblage membranaire. Il a été rapporté que les inhibiteurs de RCE1 et d'ICMT présentaient un effet moins profond par rapport aux FTI, ce qui s'explique vraisemblablement par leurs activités non spécifiques envers d'autres petites GTPases (35). Il a été démontré que des inhibiteurs ciblant la palmitoylation de H-Ras et N-Ras provoquent une réversion phénotypique partielle dans une lignée cellulaire de fibroblastes transformée par H-RasG12V, cependant, leur effet anti-tumoral sur les xénogreffes de lignées cellulaires cancéreuses humaines reste à démontrer (36 ). Collectivement, les inhibiteurs ciblant les enzymes pour la farnésylation et la palmitoylation n'ont finalement pas réussi à empêcher efficacement le ciblage membranaire de K-Ras4B, activé par mutation le plus fréquemment dans les cancers humains. Récemment, le blocage des interactions entre Ras et les protéines de liaison au prényl, qui escortent Ras jusqu'aux membranes plasmiques, a attiré l'attention sur le développement d'inhibiteurs de K-Ras4B. Le salirasib, un mimétique de la farnésylcystéine interférant avec la liaison du K-Ras4B farnésylé à la protéine Ras-escort Galectin, s'est révélé efficace au début des essais cliniques (37, 38). Très récemment, il a été rapporté que la deltarasine, découverte en utilisant la technologie de dosage immuno-enzymatique Alpha en combinaison avec le SBDD, inhibe l'interaction de K-Ras4B avec la protéine d'escorte phosphodiestérase 6 delta (PDEδ) portant une cavité de surface qui accueille la fraction farnésyle des protéines de la famille Ras ( 39). Bien que la deltarasine ait montré une activité pour inhiber la signalisation Ras-dépendante à la fois in vitro et in vivo, une optimisation structurelle supplémentaire serait nécessaire compte tenu de son activité inhibitrice non spécifique envers d'autres petites GTPases, telles que Rheb (40) (tableau I, #1).

Inhibition de la formation Ras•GTP en bloquant l'interaction Ras•GDP-GEF

Il n'est pas clair si le ciblage de l'interaction Ras•GDP-GEF est une stratégie efficace pour l'inhibition des mutants Ras activés de manière constitutive, car ils sont susceptibles d'échapper à la régulation par les GEF compte tenu de la grande réduction de leur activité GTPase et d'un vaste excès de la concentration de GTP libre supérieure à celle du PIB dans les cellules. Cependant, il pourrait être efficace pour certains types de cancer, étant donné que la fonction de Ras de type sauvage serait requise pour la croissance de tumeurs porteuses de l'oncogène. ras mutations (41). Le criblage de ligands à base de fragments par RMN ciblant le K-RasG12D lié au GDP ou au GppNHp a été appliqué pour identifier les échafaudages de ligands, entraînant l'isolement de 25 composés hit. L'analyse de la structure cristalline du complexe entre K-RasG12D•GDP et les composés a révélé une poche superficielle capable d'accueillir les composés à petites molécules (42). Parmi eux, deux composés, appelés DCAI et DCIE, ont inhibé l'échange de nucléotides médié par Sos sur K-Ras•GDP in vitro. Cependant, il n'y avait aucune preuve de leur effet inhibiteur sur Ras au niveau cellulaire. Une stratégie alternative, la fixation spécifique au mutant oncogène de la forme liée au GDP, a été appliquée par deux groupes, Gray et Shockat (43, 44). Ils ont sélectionné K-RasG12C, un mutant oncogène souvent observé dans les adénocarcinomes pulmonaires, comme cible car le groupe thiol de Cys12 était très utile pour le piégeage covalent des inhibiteurs via la formation de liaisons disulfure. Gray et ses collègues ont criblé des analogues dérivés du GDP et identifié SML-10-70-1, qui était capable d'imiter fonctionnellement GDP lorsqu'il était lié à Ras et a montré une activité anti-proliférative envers les cellules porteuses de K-RasG12C (43). Cependant, une efficacité similaire de ce composé vis-à-vis des cellules porteuses de K-RasG12S suggère la nature non spécifique de son activité cellulaire. Shockat et ses collaborateurs ont effectué un criblage basé sur des fragments de composés à petites molécules capables de former une liaison disulfure avec Cys12 sans s'appuyer sur des analogues nucléotidiques. La détermination de la structure des co-cristaux des composés hit résultants avec le K-RasG12C•GDP a conduit à l'identification d'un nouveau site de liaison au médicament. L'optimisation ultérieure basée sur la structure de leurs dérivés a permis d'identifier l'acrylamide AA12 le plus puissant (44). Ce composé a modifié K-RasG12C mais pas de type sauvage in vitro et induit l'apoptose des cellules cancéreuses du poumon portant K-RasG12C. Cependant, une dissociation substantielle du CI50 les valeurs entre les tests biochimiques et cellulaires suggèrent son mode d'action non sélectif dans les cellules. Les peptides synthétiques de substitution de liaison hydrogène (HBS) ont été conçus par Bar-Sagi et ses collègues comme inhibiteurs orthostériques imitant le domaine -hélicoïdal de Sos. Parmi eux, HBS3 a perturbé l'interaction Sos-Ras et a régulé à la baisse la signalisation Ras-Raf-MEK-ERK en réponse à la stimulation de l'EGF malgré son affinité de liaison 10 fois plus faible pour Ras•GDP par rapport au parent Sos ( 45) ( Tableau I , #2).

Inhibition des interactions Ras–effecteur

Le blocage des interactions de Ras•GTP avec les effecteurs en aval est la stratégie la plus prometteuse pour l'inhibition de l'action dominante des mutants Ras activés de manière constitutive dans les cellules cancéreuses. Sulindac, un médicament anti-inflammatoire non stéroïdien, inhibe fortement la transformation maligne induite par H-Ras des cellules MDCK-F3 et l'activation de Raf dépendante de Ras (46, 47). Bien qu'une étude RMN ait révélé son site de liaison directe à proximité de Switch I dans H-Ras (47), le manque de preuves expérimentales de l'efficacité sur les lignées cellulaires cancéreuses humaines et de l'effet anti-tumoral suggère qu'une nouvelle amélioration de sa puissance , la sélectivité et la ressemblance avec les médicaments seraient une tâche difficile.Les composés MCP ont été identifiés à l'aide du système à deux hybrides de levure par Khazak, Tamanoi et leurs collaborateurs. Ils ont découvert plusieurs composés à succès qui inhibent la liaison Ras-Raf et l'échange de nucléotides médié par le GEF sur Ras (48). Le composé le plus puissant MCP110 a inhibé la signalisation Ras/Raf/MEK/ERK dans les tests cellulaires et a montré in vivo efficacité. Pour autant, il est quelque peu déroutant que la cible de l'action de ce composé, qu'il s'agisse de Ras ou de Raf, n'ait pas été assignée sans ambiguïté (tableau I, #3).

L'inhibition allostérique de Ras•GTP, en particulier celle ciblant sa dynamique conformationnelle, est une autre stratégie prometteuse pour l'inhibition des interactions Ras–effecteur. Comme déjà mentionné, Ras•GTP existe en équilibre dynamique entre au moins deux états conformationnels distincts, l'état 1 et l'état 2, qui correspondent respectivement à des conformations inactives et actives, indépendamment de la présence ou de l'absence des mutations oncogènes (17). Kalbitzer et ses collaborateurs ont découvert des dérivés de cyclène métallique, qui étaient capables de déplacer l'équilibre conformationnel de H-Ras•GTP vers l'état 1 (57-59). Des études RMN et cristallographiques ont révélé deux sites de liaison pour eux, qui sont situés au sommet du -phosphate et du Loop7. Cependant, le manque de preuves de l'efficacité cellulaire, une faible affinité de liaison pour Ras•GTP à un ordre millimolaire et un faible effet inhibiteur sur la liaison Ras-Raf peuvent décourager leur optimisation ultérieure. Comme déjà mentionné, la structure d'état 1 de Ras•GTP possède une poche de surface entourée de Switch I, Switch II et GTP ( Fig. 2). Partant de l'hypothèse que les composés qui rentrent dans cette poche et maintiennent Ras à l'état 1 peuvent bloquer les fonctions Ras, nous avons réalisé in silico criblage pour découvrir de tels composés. Sur la base des informations sur la structure cristalline de l'état 1 de M-RasP40D•GppNHp (24), une simulation d'amarrage informatique utilisant la méthode de surface de Poisson-Boltzman de Molecular Mechanics a été réalisée pour sélectionner des composés candidats à partir d'une bibliothèque virtuelle contenant plus de 40 000 composés. Les 97 composés sélectionnés ont été examinés in vitro pour leur effet inhibiteur sur la liaison Ras-Raf, qui a abouti à la découverte d'un composé à succès Kobe0065 ( 62). Recherche de similarité ultérieure basée sur la structure de base de Kobe0065, suivie de la in vitro dosage, a donné deux dérivés de Kobe0065, Kobe2601 et Kobe2602 (62). Les composés de la famille Kobe0065 ont inhibé l'association Ras-Raf dans les cellules et réduit les niveaux de phosphorylation des molécules en aval, telles que MEK et ERK. En plus de l'effet inhibiteur sur la voie Ras–Raf–MEK–ERK, ils ont inhibé les voies Ras-PI3K-Akt et Ras-RalGDS-RalA et de plus l'activité d'échange de nucléotides Ras•GTP-dépendante de Sos ( 62). De plus, les composés ont inhibé la prolifération de plusieurs lignées cellulaires cancéreuses, telles que les carcinomes colorectaux et pancréatiques, porteurs de l'oncogène ras mutations et a montré une inhibition de la croissance tumorale sur un modèle de xénogreffe (62). La structure RMN d'un complexe de Kobe2601 avec H-RasT35•GppNHp, qui adopte principalement l'état 1, a révélé une poche de liaison de composé à proximité du site de liaison DCAI de K-RasG12D•GDP (62).


Mécanismes émergents pour activer de manière aberrante les RTK

MicroARN

Les microARN peuvent moduler directement l'expression des RTK et fonctionner à la fois comme suppresseurs de tumeurs et comme oncogènes [158]. Par exemple, le microARN-10a favorise la métastase en régulant directement la transition épithéliale-mésenchymateuse médiée par EPH4A et l'adhésion dans le carcinome hépatocellulaire [159]. Le microARN-145 supprime le développement de l'adénocarcinome pulmonaire en modulant directement EGFR expressions à la fois au niveau de l'ARNm et des protéines [160]. MicroRNA-219-5p supprime le développement de GBM en réprimant EGFR expression en se liant directement à son 3'-UTR [161]. De plus, il a également été démontré que les microARN sont impliqués dans la signalisation RTK et la régulation de la formation de tumeurs. Des données récentes ont démontré que les RTK, tels que MET, EGFR et PDGFR, régulent le microARN-134 dans le GBM, tandis que le microARN-134 agit comme un hub suppresseur de tumeur et contrôle les niveaux d'expression de KRAS et STAT5B [162]. Les connaissances sur les microARN oncogènes et la signalisation RTK permettront d'exploiter et d'améliorer les thérapies contre le cancer. Par exemple, la combinaison d'un anticorps monoclonal contre l'EGFR et d'un inhibiteur du microARN-21 améliore les résultats du traitement dans le GBM [163]. De plus, les microARN pourraient fonctionner comme des marqueurs pronostiques potentiels et aider à la stratification des patients. La signature microARN (MiR-99a/Let-7c/miR-125b) pourrait servir de biomarqueur pour le pronostic des patients atteints de cancer colorectal traités par des anticorps anti-EGFR [164]. Une meilleure compréhension des microARN impliqués dans la signalisation RTK pourrait avoir des implications futures dans la détection, la thérapie et le pronostic du cancer.

Altérations du microenvironnement tumoral

Plusieurs avancées notables ont été réalisées au cours de la dernière décennie dans la reconnaissance de l'importance du microenvironnement tumoral, en particulier de la vascularisation tumorale et du stroma tumoral [165]. Les membres de la famille des récepteurs Eph médient l'interaction cellule-cellule dans le stroma tumoral et la vascularisation tumorale [166]. Les macrophages fonctionnent comme des composants cellulaires clés du microenvironnement tumoral. AXL est fortement exprimé dans les macrophages associés aux tumeurs où AXL peut favoriser les phénotypes immunosuppresseurs et pré-néoplasiques [167]. Il a été démontré que RET et GFRA1 sont exprimés dans les cellules stromales du microenvironnement de la moelle osseuse et impliqués dans le développement des leucémies myéloïdes aiguës [168]. De nombreux autres RTK se sont avérés importants dans le microenvironnement tumoral, notamment le VEGFR [169, 170] et le PDGFR [171]. En tant que tels, ces RTK représentent des cibles potentielles intéressantes pour la conception de médicaments. De nombreux inhibiteurs de l'AXL ont été détectés et sont efficaces dans les études précliniques contre le cancer [167].

Atténuation du signal par les régulateurs négatifs

L'activité des RTK doit être étroitement régulée et correctement équilibrée afin de réguler leurs activités cellulaires normales et leurs processus physiologiques. L'atténuation du signal et la régulation négative des voies RTK ont des implications importantes dans la thérapeutique du cancer et plusieurs régulateurs négatifs bien caractérisés dans la signalisation RTK (tels que PTEN, LRIG1 et ERRFI1) sont de véritables suppresseurs de tumeurs [172,173,174].

ERRFI1 (Inhibiteur de rétroaction du récepteur ErbB 1) qui code pour la protéine MIG6 – est située dans le chromosome 1p36.1–3, une région de hotspot fréquemment supprimée dans un large éventail de cancers humains, y compris les cancers du sein, du foie et du rein [175]. MIG6 a été décrit comme étant muté dans différents cancers humains [176, 177]. L'expression de MIG6 est également diminuée ou réduite au silence dans les carcinomes de la peau, du sein, du pancréas et de l'ovaire [178, 179]. Perte de Errfi1 chez la souris conduit à une activation anormale de la signalisation EGFR et est associée à une incidence élevée de lésions néoplasiques [178]. Ces résultats suggèrent que MIG6 a joué un rôle suppresseur de tumeur potentiellement impliqué dans la signalisation de l'EGFR. MIG6 contient deux régions fonctionnelles, appelées segments 1 et 2 qui sont au total 77 acides aminés [174]. Des études structurelles indiquent que MIG6 (segment 1) est capable d'inhiber l'activité de la kinase EGFR en présence du dimère asymétrique. MIG6 (segment 1) se lie à la kinase « activateur » et empêche l'activation de l'EGFR, tandis que le segment 2 est requis pour l'inhibition de l'activité kinase de l'EGFR activé, et que les segments 1 et 2 sont essentiels pour la puissante inhibition de l'activité de l'EGFR [174]. Les résidus dans l'interface de liaison entre EGFR et MIG6 (segment 1) sont conservés dans tous les membres de la famille ErbB plutôt que dans d'autres protéines kinases [9]. Cependant, dans une autre étude structurelle, MIG6 n'a pas pu inhiber efficacement les mutants oncogènes de l'EGFR (par exemple L858R) , probablement parce que les mutants EGFR peuvent former des dimères asymétriques à un coût énergétique inférieur à celui de l'EGFR de type sauvage [36]. Le lobe C est moins accessible par MIG6 dans des configurations qui favorisent plus fortement la formation de dimères asymétriques [32]. Ces deux études nous donnent des indices sur le fait que MIG6 peut potentiellement inhiber EGFR-KDD, EGFR-RAD51 et EGFR-PURB, car ces protéines mutantes EGFR ont une TKD de type sauvage intacte qui pourrait potentiellement agir comme une kinase « activatrice » sous la forme d'une dimérisation asymétrique activante. .


Méthodes

Analyse des animaux et du génotype

La génération des différents allèles de signalisation du rencontré gène utilisé dans cette étude (rencontré , rencontré 2P et rencontré 2S ) a été décrit précédemment [9],[15]. Les allèles néo + originaux, qui contenaient une cassette de sélection néo flanquée de sites LoxP, ont été appelés met 2Pneo et met 2Sneo. allèles sans néo ont été obtenus après excision de la néo cassette en croisant des souris mutantes avec les transgéniques Deleter-Cre [9]. L'analyse du génotype par PCR a été réalisée comme décrit [9],[12]. Les rencontré LacZ allèle est un allèle knock-in/knock-in alternatif de rencontré dans lequel la LacZ Le gène rapporteur reflète également l'expression de l'endogène rencontré gène [4]. Dans l'allèle d'origine, LacZ l'expression est conditionnée par le retrait d'une cassette Lox-stop-Lox [4]. Dans l'allèle utilisé ici, en croisant avec une lignée deleter-cre, nous avons dérivé une lignée de souris dans laquelle la cassette d'arrêt a été définitivement supprimée. L'analyse du génotype a été réalisée par PCR comme décrit [4]. Pois3-lacZ les souris ont été utilisées avec la permission d'Arber et Jessell, et génotypées comme décrit précédemment [32]. Les animaux ont été entretenus et sacrifiés conformément aux directives institutionnelles. Des souris adultes ont été euthanasiées par dislocation cervicale.

In situhybridation

Les embryons ont été collectés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixés dans du paraformaldéhyde à 4% (PFA). Les ISH ont été réalisées avec la sonde d'ARN appropriée sur des embryons entiers, des membres disséqués ou des moelles épinières, selon les procédures précédemment publiées [16]. L'ISH de la moelle épinière entière a été réalisée comme décrit [74], avec des sondes d'ARN marquées à la digoxigénine pour rencontré, MyoD (obtenu de Ponzetto), Pois3, (de Jessell), Ret (de Rosenthal) et Discuter (choline acétyl transférase de Henderson). Les moelles épinières ont été montées à plat sous forme de préparations à livre ouvert avec des MN sur la face supérieure, et imagées à l'aide d'un Zeiss Axiophot (Marly le Roi, France) ou d'un stéréomicroscope Leica (Wetzlar, Allemagne). Des embryons entiers ont été partiellement nettoyés dans 50 % de glycérol et imagés à l'aide d'un stéréomicroscope.

Coloration X-Gal et Salmon-Gal pour l'activité β-galactosidase

La coloration pour l'activité β-galactosidase a été réalisée en utilisant deux méthodes alternatives. Pour la moelle épinière des embryons porteurs de la pois3 LacZ allèle, nous avons utilisé le protocole traditionnel utilisant un substrat X-Gal en combinaison avec des ions ferriques et ferreux. En bref, la moelle épinière a été disséquée à partir d'embryons fraîchement collectés, fixée dans du PFA à 4 % dans du PBS (40 min), rincée dans du PBS et incubée dans du X-Gal en combinaison avec du ferricyanure et du ferrocyanure de potassium (FeCN). Pour détecter la β-galactosidase dans la moelle épinière des embryons porteurs de la rencontré LacZ allèle, nous avons utilisé une méthode alternative basée sur Salmon-Gal (6-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside d'Appolo Scientific, Maschester, Royaume-Uni) en combinaison avec du sel de tétrazolium [75]. Brièvement, des moelles épinières ont été disséquées à partir d'embryons fraîchement prélevés, fixées dans 1% de PFA et 0,2% de glutaraldéhyde dans du PBS (10 min), rincées trois fois dans du PBS, puis incubées pendant un minimum de 7 h pendant une nuit à 37°C en pré-coloration. solution sans substrat (ferricyanure de potassium 200 mM, ferrocyanure de potassium 200 mM, 4 mM de MgCl2 et 0,04 % de NP40 dans du PBS) pour réduire l'activité endogène de la β-galactosidase. Les échantillons ont ensuite été rincés trois fois dans du PBS et incubés dans une solution de coloration (1 × PBS, avec 0,04 % de NP40, 2 mM de MgCl2, 1 mg/ml Salmon-Gal (solution mère 40 mg/ml dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)) et 0,33 mg/ml NBT (solution mère 75 mg/ml dans 70% DMF)), pendant environ 30 à 40 min à 37 °C. Dans tous les cas (X-Gal et Salmon-Gal), la coloration a été interrompue par rinçage dans du PBS et post-fixation dans du PFA à 4 %. Les moelles épinières ont été montées à plat dans 1 volume de glycérol/1 volume de PFA à 4 % pour l'imagerie.

Cultures de motoneurones embryonnaires

Des embryons de souris E12.5 ont été collectés dans du milieu Hibernate (E) (Life Technology) avec un supplément B-27 (Life Technology) et conservés sur glace jusqu'à la dissection, tandis que le génotype a été déterminé par PCR. Les moelles épinière ventrales d'un nombre égal d'embryons WT et mutants ont été disséquées. Les MN ont été isolées soit des segments brachiaux + lombaires, soit des segments cervicaux + thoraciques + sacrés, par une méthode précédemment décrite [34] impliquant une combinaison de centrifugation sur coussins BSA et une centrifugation en gradient de densité de métrizamide. A la fin de la procédure, la suspension cellulaire était fortement enrichie en MNs. Pour les tests de survie, les MN ont été étalées dans des boîtes de culture tissulaire à quatre puits revêtues de polyornithine/laminine (1 500 neurones par puits) dans du milieu Neurobasal (Life Technology, Saint Aubain 91190, France). Des facteurs neurotrophiques recombinants et des inhibiteurs ont été ajoutés 2 h après l'ensemencement. Les MN ont été conservés pendant 3 jours soit dans du milieu Neurobasal, soit en présence de GDNF ou de HGF (tous deux obtenus auprès de R&D, Minneapolis, MN, USA). Tous les inhibiteurs (LY294002, PD98059, PP2 et PP3) ont été obtenus auprès de Calbiochem (Darmstadt, Allemagne). PP3 a été utilisé comme contrôle négatif pour PP2 (non représenté). La survie MN a été quantifiée en comptant de gros neurones unipolaires brillants avec de longs processus axonaux sur toute la surface de chaque puits.

Immunohistochimie anti-neurofilament en monture entière

Les embryons ont été collectés dans du PBS froid, fixés pendant 2 h dans du PFA à 4 % dans du PBS, et post-fixés pendant la nuit dans le fixateur de Dent (80 % de méthanol, 20 % de DMSO) à 4 °C. L'immunohistochimie anti-neurofilament en montage entier a été réalisée comme décrit précédemment [29]. En bref, les embryons ont été blanchis pendant 4 h dans 6% H2O2 dans la solution de Dent et encore réhydraté par une série progressive de méthanol. Les incubations d'anticorps ont été réalisées dans 80 % de sérum de veau nouveau-né, 20 % de DMSO, 0,5 % de triton avec du thimérosal. Les anticorps utilisés étaient les suivants : anticorps anti-neurofilament (2H3 et DSHB) et anticorps anti-souris de chèvre conjugué à HRP (Sigma). La coloration a été développée à l'aide de comprimés DAB (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France). Les embryons ont été effacés pour l'imagerie dans BABB (1:2, alcool benzylique/benzoate de benzyle).

Traitement et analyses d'images

La quantification de l'intensité du signal a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ. En bref, les images d'ISH ont d'abord été converties en échelle de gris et inversées en échelle négative (la correspondance d'intensité de signal la plus élevée étant le blanc et le noir le plus faible). L'intensité du signal a été mesurée le long d'une ligne horizontale d'une longueur de pixel donnée (correspondant à la moitié d'une moelle épinière montée à plat, toujours positionnée à l'endroit indiqué par des lignes pointillées sur la figure 3). Après soustraction de fond et de seuil, les valeurs ont été moyennées entre plusieurs échantillons de chaque génotype (en considérant les côtés gauche et droit séparément, pour le nombre de côtés de la moelle épinière utilisés, pour chaque tracé indiqué dans les figures correspondantes) pour générer un tracé de distribution de signal moyen. L'intensité totale du signal a également été calculée pour chaque échantillon et tracée individuellement (figures 2 et 5, fichier supplémentaire 1 : figure S1 et fichier supplémentaire 4 : figure S4).

Analyses statistiques

Les résultats ont été exprimés en moyenne ± erreur standard de la moyenne. Des différences statistiquement significatives ont été évaluées par des étudiants non appariés. t-test lorsque les données montraient une distribution normale, et par le test de Mann-Whitney dans le cas contraire. * indique P < 0.05 et ** indique P < 0,001.


Voir la vidéo: EGF EGFR Signaling Pathway Creative Diagnostics (Janvier 2023).