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Teneur en ADN des graines de plantes par rapport à la chair des fruits

Teneur en ADN des graines de plantes par rapport à la chair des fruits


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Existe-t-il une publication comparant le rendement en ADN et/ou l'amplification par PCR après extraction de la chair de fruits (comme des pommes, des oranges, des cerises, etc.) par rapport aux graines des mêmes fruits ?

Je préférerais une référence, mais votre expérience inédite m'intéresse également.


Cela dépend de la graine et du fruit dont vous parlez.

La quantité d'ADN dans votre échantillon de matière végétale broyée ne dépend que d'une seule chose : le nombre de cellules dans votre échantillon. Regardez ce schéma d'un grain de maïs (U d'Indiana) :

Il existe différentes densités cellulaires dans chaque zone - dans l'endosperme, les cellules peuvent être énormes (et ont donc une densité d'ADN inférieure à celle de l'embryon).

Regardons une graine de moutarde tachée (U de Londres) :

Comme vous pouvez le voir, les cellules ici sont très denses. Plus dense signifie plus d'ADN par échantillon unitaire.

En ce qui concerne les fruits, la même règle empirique s'applique. Verner, 1938 montre une histologie intéressante du tissu de la pomme qui pourrait vous donner une idée de la densité cellulaire dans le tissu du fruit (encore une fois, ce sera différent dans différents fruits - recherchez"histologie du nom du fruit"si vous êtes intéressé).

Cependant, maintenant que nous avons parlé de densité, nous devons réellement penser à extraire l'ADN. Le processus d'extraction est en fait beaucoup plus important en termes de rendement final.

De nombreuses graines de plantes contiennent des polyphénols, qui peuvent provoquer une dégradation de l'ADN. Ce protocole (Cornell U) détaille bon nombre des lacunes possibles :

Il a également été rapporté que ces composés causent des difficultés dans la purification de l'ADN chez d'autres espèces végétales ; les polysaccharides (Murray et Thompson, 1980 ; Fang et al., 1992) ; les composés polyphénoliques (Katterman et Shattuck, 1983 ; Couch et Fritz, 1990 ; Howland et al. 1991 ; Collins et Symons, 1992) ; et les matériaux collants et résineux (Webb et Knapp, 1990).

Ces contaminants peuvent dégrader l'ADN, mais aussi le rendre inutilisable dans l'amplification PCR et la digestion des endonucléases (Kim et al. 1997, Cornell U, EPICENTER Biotechnologies).

Dans l'ensemble, il existe certainement des différences spécifiques à l'espèce dans la teneur en ADN des plantes fruitières/graines. Pratiquement, cependant, le facteur le plus important dans le rendement et la viabilité de l'ADN pour une expérimentation future est la pureté et la contamination de l'échantillon. Des fruits et des graines spécifiques peuvent contenir un ou plusieurs des contaminants ci-dessus, donc la réponse à « Graines ou fruits ? » dépend certainement de l'espèce de plante avec laquelle vous travaillez.


  • Les fruits peuvent être classés comme simples, agrégés, multiples ou accessoires.
  • Les fruits simples se développent à partir d'un seul carpelle ou des carpelles soudés d'un seul ovaire, tandis que les fruits agrégés se développent à partir de plusieurs carpelles trouvés sur la même fleur.
  • De multiples fruits se développent à partir d'une grappe de fleurs, tandis que les fruits accessoires ne se développent pas à partir d'un ovaire, mais à partir d'autres parties d'une plante.
  • Les parties principales d'un fruit comprennent l'exocarpe (peau), le mésocarpe (partie médiane) et l'endocarpe (partie interne). Ces trois parties constituent le péricarpe.
  • Les fruits déhiscents libèrent rapidement leurs graines, tandis que les fruits indéhiscents dépendent de la décomposition pour libérer leurs graines.
  • exocarpe: l'enveloppe la plus externe du péricarpe des fruits la peau
  • fruits simples: fruit qui se développe à partir d'un seul carpelle ou des carpelles soudés d'un seul ovaire
  • endocarpe: la partie interne du fruit
  • mésocarpe: partie médiane du fruit
  • fruit accessoire: un fruit non dérivé de l'ovaire mais d'une autre partie de la fleur

Résumé

Bien que le goût soit un aspect important de la qualité des fruits, notre compréhension de son contrôle génétique reste insaisissable dans les cultures de pommes et d'autres fruits. Analyse de séquence génomique de 497 Malus les accessions ont révélé une érosion de la diversité génétique causée par la sélection de pommiers et d'éventuels événements de domestication indépendants des pommes de table et des pommes à cidre. Des signatures de sélection pour l'acidité et la taille des fruits ont été détectées au cours du processus de domestication et d'amélioration, mais pas pour la teneur en sucre des fruits. Mutations uniques dans les principaux gènes affectant le goût des fruits, y compris Ma1, MdTDT, et MdSOT2, diminuent considérablement l'accumulation de malate, de citrate et de sorbitol, respectivement, et correspondent à des événements de domestication importants. Les effets pléiotropes de Ma1 sur la teneur en acides organiques et le rapport sucre:acide suggèrent son rôle vital dans la détermination du goût des fruits. Il est peu probable que le goût des fruits ait été affecté négativement par la traînée de liaison associée à la sélection de fruits plus gros résultant de la mise en pyramide de plusieurs gènes avec des effets mineurs sur la taille des fruits. Notre étude fournit des informations sur la base génétique de la qualité des fruits et sa feuille de route évolutive au cours de la domestication de la pomme, et souligne également les gènes cibles pour la manipulation génétique du goût des fruits.


Résultats

Identification à l'échelle du génome de CLE gènes dans le concombre

La recherche à l'échelle du génome de CLE gènes dans le concombre a été fait en utilisant l'alignement. Nous avons d'abord téléchargé les protéines CLE connues de Arabidopsis pour auto-construire un modèle CLE Markov. En scannant les 24 317 protéines codant le concombre dans la version 3 de l'assemblage du génome à l'aide du modèle CLE Markov conçu, nous avons identifié 26 facteurs de transcription CLE (tableau S1). La vérification manuelle a révélé des facteurs de transcription CLE bien conservés (désignés par le terme « CsCLE » avec un numéro de série et triés par la valeur E du domaine CLE Tableau 1). De nombreux peptides CLE de concombre sont des peptides courts (90 acides aminés de long) à l'exception de CsCLE24 (1021 acides aminés), CsCLE5 (416 acides aminés) et CsCLE6 (404 acides aminés). Le poids moléculaire des protéines CLE de concombre variait de 5293,84 (CsCLE9) à 113 323,11 (CsCLE24), ce qui est très similaire à ceux de Arabidopsis. La plupart des protéines CLE de concombre sont alcalines avec un pI théorique allant de 7,09 (CsCLE17) à 12,11 (CsCLE10), à l'exception d'une protéine faiblement acide, CsCLE24 (pI = 6,52). La protéine CsCLE4 est stable alors que d'autres sont instables. L'indice aliphatique des protéines CLE de concombre variait de 49,03 (CsCLE6) à 106,78 (CsCLE17) et l'indice GRAVY variait de - 0,935 (CsCLE9) à 0,17 (CsCLE21).

Le 26 CLE les gènes sont restés répartis sur les chromosomes, dont 7 sur chr5, 6 sur chr6, 5 chacun sur chr1 et chr2, et un chacun sur chr3, chr4 et chr7 (Fig. 1). Les CLE gènes CsCLE24 et CsCLE25 étaient localisés extrêmement proches avec une courte localisation intergénique de 1 kb. Outre, CsCLE13 et CsCLE14 étaient également situés à proximité, cette découverte indiquait que ces gènes pourraient être dupliqués en tandem. De plus, une paire de gènes, CsCLE5 et CsCLE6, avec une duplication segmentaire a été trouvée dans le CsCLE famille, et les paires de gènes de duplication segmentaire identifiés ont été distribués sur différents chromosomes chez le concombre (Fig. 2).

Distribution chromosomique de CLE gènes chez le concombre. Différentes couleurs de lignes représentent différents chromosomes et les marques sur eux sont les gènes correspondants et leurs emplacements

Distribution de la duplication segmentaire CLE gènes CLE5 et CLE6 dans le génome du concombre. Deux gènes de la même paire de gènes dupliqués segmentés sont marqués en rouge

Relations phylogénétiques et divergence des protéines CLE de concombre

Dans la présente étude, nous utilisons principalement l'assemblage du génome du long ‘9930’ chinois.

Seulement 31 CLE gènes ont été identifiés (tableau S2) dans ce rapport, alors qu'un rapport précédent montrait que Arabidopsis contenait 32 CLE gènes [30]. Un total de 25 CLE les gènes ont été identifiés dans le melon (tableau S3) en utilisant l'approche informatique. Pour comprendre l'évolution de CLE gènes chez les cucurbitacées et la plante modèle Arabidopsis, nous avons comparé les gènes de Arabidopsis, le melon et le cultivar de concombre Chinese long ‘9930’ (Fig. 3). Ces CLE ont été divisés en fonction de leur relation phylogénétique en sept groupes paraphylétiques (groupes 1 à 7). Tous les groupes, à l'exception du groupe 2 et du groupe 6, étaient composés de CLE du concombre et d'autres espèces végétales, indiquant la relation étroite entre le concombre CLE et celles des autres plantes. La distribution du concombre CLE était inégal dans ces groupes. Le groupe 7 était le plus grand groupe avec 12 membres, représentant près de la moitié du concombre CLE, suivi des groupes 1 et 5 contenant 6 et 5 concombres CLE, respectivement. Les sous-familles les moins représentées étaient les groupes 2 et 6 sans concombre CLE.

Analyse phylogénétique de CLE gènes de Arabidopsis, concombre et melon. L'analyse a porté sur 26 séquences de protéines CLE de concombre, 31 Arabidopsis séquences protéiques AtCLE et 25 séquences protéiques CLE de melon. Les étoiles rouges représentent les protéines CLE du concombre les carrés bleus représentent les Arabidopsis Les protéines CLE et les cercles verts représentent les protéines CLE du melon

Structure des gènes du concombre CLE gènes

Afin de comparer les gènes du concombre, leurs structures exon-intron ont été prédites (Fig. 4). L'arbre phylogénétique a été construit par la méthode du maximum de vraisemblance en utilisant la séquence protéique conservée du concombre CLE gènes. Quatorze CLE les gènes étaient des gènes à exon unique, dix étaient des gènes à double exon et un était un gène à triple exon. Les modèles exon-intron au sein du même groupe de classification phylogénétique ont montré une similitude. Gène du concombre CLE24 était unique avec ses régions codantes discrètes divisées par 19 introns.

Structures exon-intron prédites du concombre CLE et des motifs conservés de la protéine CLE de concombre. une L'arbre phylogénétique a été construit sur la base des séquences protéiques pleine longueur de 26 protéines CLE de concombre à l'aide du logiciel MEGA V6.06. b Motifs conservés dans les protéines CLE de concombre. Les motifs, les numéros 1 à 10, étaient affichés dans des cases de couleurs différentes. c Structure exon-intron du concombre CLE gènes. Les exons et les introns sont indiqués par des cases vertes et des lignes simples, respectivement

Motifs de protéines CLE de concombre conservés

Le logiciel MEME a été utilisé pour explorer les domaines et les motifs conservés des protéines CLE dans le concombre. Les motifs ont été répertoriés du motif 1 à 10 selon la valeur E ascendante de l'alignement (Fig. 4). Presque toutes les protéines CLE de concombre contenaient le motif 1, qui représente un domaine CLE typique près du C-terminal, à l'exception de CsCLE9. Les protéines CsCLE5 et CsCLE6 étaient différentes au niveau du C-terminal et contenaient toutes deux le motif 4 près du domaine C-terminal du CLE. La protéine CsCLE11 contenait quatre motifs 6 situés en tandem et un domaine CLE, tandis que CsCLE24 contenait deux motifs 2 en tandem. Ces résultats ont indiqué que la caractérisation de la séquence et la fonction biologique différaient largement entre les protéines CLE de concombre dans chaque branche de l'arbre phylogénétique. Ces protéines possédaient également d'autres domaines fonctionnels au N-terminal ou au milieu, tandis que leur domaine CLE était fonctionnel dans les voies de signalisation.

Éléments cis-régulateurs en amont (CRE)

Dans la base de données PlantCARE, la séquence de 1500 pb dans le promoteur en amont a été utilisée pour localiser l'élément cis-régulateur dans la région régulatrice en amont. En analysant les fonctions biologiques des CRE dans la région amont de 26 concombres CLE gènes, on peut conclure que la plupart des composants autres que ceux nécessaires à l'expression normale des promoteurs, tels que AT

La TATA-Box et la CAAT-Box peuvent être divisées en quatre catégories. 1) Le premier type d'élément est constitué d'éléments de réponse hormonale, tels que l'ABRE (élément de réponse ABA), l'élément TCA (élément de réponse à l'acide salicylique), le TATC-Box (élément de réponse gibbérelline) et l'élément TGA (réponse à l'auxine élément), entre autres. Ces éléments ont été tracés dans cette expérience (Fig. 5). 2) Le deuxième type d'élément est constitué d'éléments sensibles à la lumière, tels que ACE, G-box, ATA-motif, LAMP-element, etc. 3). Le troisième type d'élément est celui des éléments d'expression méristématique. Par exemple, HD-zip1 (éléments liés à la différenciation des cellules du mésophylle) et TGACG-motif (éléments liés au développement des méristèmes) jouent un rôle important dans la régulation du gène CLE de la maintenance et de l'organogenèse des méristèmes végétaux. 4) Le quatrième type est constitué d'éléments de réponse au stress, tels que ARE, MBS, répétitions riches en TC, LTR, etc., ainsi que d'autres facteurs régulateurs qui jouent un rôle dans la régulation métabolique.

Éléments de réponse hormonale en amont du concombre CLE. Les éléments qui répondent aux hormones sont affichés dans des cases de couleurs différentes

Paires homologues de protéines CLE de concombre

Pour comprendre la descente verticale d'un seul gène ancestral et la duplication, une analyse comparative a été réalisée pour identifier les paires de gènes orthologues, co-orthologues et paralogues dans Arabidopsis, concombre et melon.

Le logiciel OrthoMCL a identifié 24 orthologues, 23 co-orthologues et 8 paralogues CLE paires de gènes parmi Arabidopsis, concombre et melon. Ce réseau de paires de gènes homologues était très cohérent avec l'arbre phylogénétique, qui est clairement divisé en trois parties. Les gènes orthologues entre ces trois espèces sont illustrés à la Fig. 6. Sur 26 concombres CLE gènes, 15 gènes orthologues dans le melon et 7 dans Arabidopsis ont été trouvés.

Paires de gènes homologues dans Arabidopsis, concombre et melon. Les lignes grises représentent toutes les paires homologues entre différents génomes, et les lignes rouges représentent les paires homologues du CLE famille de gènes

Temps de sélection et de divergence

Afin d'étudier les mécanismes de sélection des CLE gènes au cours de l'évolution, nous avons calculé Ka, Ks et le temps de divergence de la paire homologue CsCLE24-CsCLE25 (Tableau S4). Cette paire avait un Ka de 1,08 et un Ks de 0,82, et un rapport Ka/Ks de 1,31 avec un P-valeur de 0,0098, indiquant que cette paire de gènes subit une sélection positive qui a conduit à une différenciation fonctionnelle.

Modèle d'expression de concombre CLE gènes au cours du développement

Nous avons étudié l'expression de chaque CLE en utilisant les données RNA-seq publiées (tableau S5) pour 23 tissus de concombre différents au cours du développement végétatif et reproducteur. Le niveau d'expression de chaque gène a été normalisé en utilisant la méthode RPKM. Dix concombres CLE gènes, y compris CsCLE1, 2, 4, 5, 14, 25, 24, 23, 15, et 17 ont montré des niveaux d'expression relativement faibles dans les 23 échantillons, montrant qu'ils jouaient un rôle négligeable dans les processus de développement du concombre. Gènes CsCLE9, 10, 18, et 22 ont montré des niveaux d'expression relativement élevés dans plusieurs échantillons (Fig. 7a).

Modèle d'expression de concombre CLE gènes. une Carte thermique représentant le profil d'expression du concombre CLE gènes au cours des différentes étapes de développement analysés par les données RNA-seq. b Carte thermique représentant le profil d'expression du concombre CLE gènes au cours de différents stades de développement validés par qPCR en chinois long ‘9930’

En utilisant qPCR, nous avons analysé l'expression du concombre CLE gènes (tableau S6) dans différents tissus de plantules chinoises longues ‘9930’. Sur 26 concombre CLE gènes, 24 gènes ont été détectés dans 21 échantillons. Gènes CLE1, 2, 7, 8, 9, 17, 18, 19, et 26 ont été exprimés à des niveaux relativement faibles dans tous les échantillons, et d'autres ont été exprimés à des niveaux relativement élevés dans au moins un échantillon. Concombre CLE les gènes ont montré des niveaux d'expression relativement élevés dans les tissus en croissance, y compris la pointe, la tige et la fleur, et des niveaux d'expression relativement faibles dans la racine. Le niveau d'expression de CsCLE4, 6, 11, 14, 21, 23, 24, et 25 était le plus élevé (Fig. 7b). Les résultats de la qPCR sont très cohérents avec les anciennes données RNA-seq disponibles dans la base de données publique.

Surexpression hétérologue de CsCLV3 gène dans Arabidopsis

Le vecteur d'expression a été construit avec succès en portant le gène cible sur le plasmide PHB, puis CsCLV3 gène, le gène représentatif de la CLE famille, était surexprimé dans Arabidopsis nous nous référons à ces plantes transformées en tant que souche positive. Les résultats ont montré que dans le phénotype de la souche positive, une faiblesse s'est développée au point de croissance. Par rapport au type sauvage, le diamètre du point de croissance du type sauvage Arabidopsis était d'environ 0,66 mm (Fig. 8a), et celle de CsCLV3 la surexpression génique de la souche positive était d'environ 0,54 mm (Fig. 8b). Dans les mêmes conditions, le point de croissance de la souche positive était plus petit que celui du type sauvage.

Le point croissant de la surexpression hétérologue de CsCLV3 gène dans Arabidopsis. une Point de croissance du type sauvage. une Le diamètre du point de croissance pour le type sauvage est de 0,6584168 mm. b Point de croissance de la souche positive. b Le diamètre du point de croissance pour la souche positive est de 0,5429444 mm. Le diamètre du point de croissance a été mesuré avec le logiciel IPwin 32

Après repiquage, presque toutes les plantes transformées de la génération T1 ont montré des phénomènes de faiblesse évidente du développement du point de croissance, pas de montaison et une capacité décroissante de croissance des plantes (Fig. 9). Les graines héréditaires obtenues à partir de plantes T1 étaient extrêmement peu nombreuses, rendant l'analyse fonctionnelle dans les générations suivantes irréalisable. En outre, peu de souches positives ont achevé les processus de croissance et de développement. Dans cette étude, seules deux souches boulonnées ont montré que soit la gousse ne s'est pas développée, soit la gousse était courte, et son développement était significativement inférieur à celui du type sauvage (Fig. 10a). Dix transformants ont été sélectionnés au hasard pour la détection par PCR quantitative par fluorescence (Fig. 10b). Les résultats (tableau S7) ont montré que les gènes cibles étaient exprimés dans tous les matériels transgéniques, et le phénotype des n°15 et n°8 avec une expression plus faible était le plus faible, ce qui pouvait porter ses fruits mais pas une grande capacité de fructification. Dans le même temps, les No.1, 12 et 13, qui avaient des niveaux d'expression élevés, avaient des phénotypes capables et un degré élevé d'anomalie, et étaient incapables de monter en flèche ou de fructifier. D'une manière générale, le niveau d'expression de CsCLV3 gène correspond à son phénotype. Les résultats expérimentaux ont prouvé que le concombre CLV3 les gènes fonctionnent d'une manière essentielle pour contrôler le développement des points de croissance et des fruits, et la montaison des plantes.

Surexpression hétérologue de CsCLV3 gène dans Arabidopsis. La souche de type sauvage (WT) a un cycle de croissance et de développement normal, et une structure phénotypique des feuilles de rosette, des tiges, des feuilles, des gousses, etc. La souche positive (4910-13) était le phénomène de surexpression hétérologue de CsCLV3 gène, et il n'a pas de tige, de feuille, de gousse de fruit ou d'autres structures morphologiques, ne montrant que des feuilles de rosette ridées

Pods d'expression plus faible dans les souches positives. une Les phénotypes de gousse de type sauvage (col-0) et de coloration positive (4910-15) pouvaient monter en flèche mais ne pas porter de fruits, tandis que 4910-8 pouvaient monter en flèche et porter des fruits mais les entre-nœuds étaient plus courts que dans le WT. Phénotypes de gousse de Arabidopsis ont été observés au microscope Nikon D3300. Les bandes représentées sur la figure sont l'expression génique correspondant aux phénotypes. b Dix transformants ont été sélectionnés au hasard pour la détection par PCR quantitative par fluorescence


Quelle est la différence entre l'ADN végétal et l'ADN animal ?

Au centre de chaque cellule végétale, des algues aux orchidées, et au centre de chaque cellule animale, des méduses à vous et moi, il y a une copie du matériel génétique de l'organisme. Cet ADN porte un plan complet de l'organisme. C'est ce qui transfère les caractéristiques d'une génération à l'autre.

Il existe des différences assez évidentes entre les plantes et les animaux, mais – au niveau chimique – les cellules de toutes les plantes et de tous les animaux contiennent de l'ADN sous la même forme – la fameuse “double hélice” qui ressemble à un échelle tordue. De plus, toutes les molécules d'ADN, à la fois chez les plantes et les animaux, sont fabriquées à partir des mêmes quatre éléments constitutifs chimiques, appelés nucléotides.

Ce qui est différent, c'est la façon dont ces quatre nucléotides de l'ADN sont arrangés. C'est leur séquence qui détermine quelles protéines seront fabriquées. La façon dont les nucléotides sont disposés et les informations qu'ils codent déterminent si l'organisme produira des écailles ou des feuilles, des pattes ou une tige.

La recherche montre que les plantes et les animaux peuvent produire des protéines en commun. Un exemple important est connu sous le nom de cytochrome C. Mais comme le processus de copie de l'ADN est imparfait, les erreurs s'accumulent au fil du temps, rendant le cytochrome C légèrement différent selon les créatures. Les régions génétiques qui spécifient la séquence d'acides aminés dans le cytochrome C humain sont plus similaires à celles d'un autre mammifère comme un lapin, et moins similaires à une créature plus éloignée sur le plan de l'évolution, comme un tournesol.

Le schéma de classification des animaux et des plantes en royaumes est confronté à la concurrence. Plus récemment, un système alternatif est apparu, basé sur des informations évolutives et moléculaires. Le cytochrome c est peut-être la molécule canonique ou paradigmatique dans cette approche.

Chaque espèce possède un nombre caractéristique de chromosomes, appelé nombre de chromosomes. Les animaux ont plus de chromosomes, les plantes en ont moins.


Utiliser les similitudes dans l'ADN pour classer les organismes

Cependant, grâce à la technologie moderne, l'analyse des relations génétiques entre les espèces et les organismes est désormais possible et a conduit à considérer différemment les relations entre les formes de vie. En 1990, Carl Woese a proposé le &ldquoThree Domains System&rdquo de classification basée sur les similitudes génétiques entre les organismes. Le système montre un ancêtre commun de toute vie divisé en trois grands domaines : les bactéries, les archées et les eucaryotes (les organismes dotés d'un noyau pour stocker leur ADN).

En examinant les gènes de différentes espèces, à la fois animales et fongiques, des changements mutationnels peuvent être observés et des relations généalogiques peuvent être déterminées qui remontent à des millions d'années.

Il s'avère que les animaux et les champignons partagent un ancêtre commun et se sont éloignés des plantes il y a environ 1,1 milliard d'années. Seul plus tard les animaux et les champignons se sont-ils séparés sur l'arbre généalogique de la vie, ce qui rend les champignons plus étroitement liés aux humains qu'aux plantes. Très probablement, cet ancêtre commun était un organisme unicellulaire qui présentait des caractéristiques semblables à celles d'un spermatozoïde (comme un animal), puis un stade de développement ultérieur avec une paroi cellulaire plus solide (champignons).

Un arbre phylogénétique basé sur l'analyse des ARNr. Sur le côté droit, notez la divergence des plantes, des champignons et des animaux. (Crédit photo : Sting &ndash fr : Sting/Wikimedia Commons)

Les champignons sont-ils des légumes ?

Réponse simple ? Non, un champignon n'est pas un légume. Les champignons sont des fructifications de champignons filamenteux macroscopiques. Lorsque la mycologie (l'étude des champignons) est apparue pour la première fois, elle faisait partie de la botanique car les champignons étaient considérés comme des plantes primitives.

La principale différence entre une plante (légume) et un champignon réside dans la manière dont ils acquièrent leur nourriture. Les plantes possèdent de la chlorophylle et produisent leur nourriture par photosynthèse. Les champignons existent sur les matériaux en décomposition dans la nature. De plus, il existe des différences structurelles évidentes, telles que le manque de feuilles, de racines et de graines. Ainsi, les champignons ont désormais leur propre règne basé sur l'organisation cellulaire.

Cependant, c'est le côté scientifique des choses, mais jetons un coup d'œil à l'autre côté et la nourriture! Dans la vie de tous les jours, nous n'utilisons pas la science pour classer nos aliments. Les tomates et les concombres sont scientifiquement les fruits d'une plante, mais nous les appelons toujours des légumes. De même, les champignons ne sont pas des légumes ou des fruits, ni même de la viande. Ils sont en eux-mêmes une catégorie différente, mais pour plus de commodité, nous les regroupons avec les légumes.

Différents types de champignons ont divers avantages pour la santé. À un moment donné de l'histoire, les champignons étaient si appréciés qu'il était en fait interdit au commun des mortels de les manger ! Ils étaient réservés uniquement aux familles royales.


Teneur en ADN des graines de plantes vs chair des fruits - Biologie

Quelle quantité d'ADN les plantes partagent-elles avec les humains ? Plus de 99% ?

C'est un chiffre avec lequel nous devons être prudents.

Premièrement, il n'y a qu'un seul type d'ADN ! TOUS les animaux et les plantes partagent le même ADN qui est fondamentalement un code de seulement 4 « lettres » qui codent pour les mêmes acides aminés à partir desquels toutes les protéines sont fabriquées. Il y a une complication que certains acides aminés ont plus d'un code qui le spécifie - il y a beaucoup d'exemples où un changement de codes (par exemple une mutation) peut entraîner AUCUN CHANGEMENT dans l'acide aminé qui est spécifié.

Il n'est pas surprenant que tous les animaux et les plantes aient la majorité de leurs GÈNES en commun. Le mécanisme par lequel les sucres sont oxydés pour libérer leur énergie (respiration) est presque universel. Il existe des dizaines d'enzymes impliquées dans ce seul processus. Chaque enzyme est une protéine et chacune doit être codée dans l'ADN. Il existe de nombreuses enzymes impliquées dans la réplication de l'ADN lui-même. D'autres processus sont également presque universels.

En revanche, certains gènes sont très importants. Il n'y a, je crois, qu'un seul gène responsable de la mise d'un embryon humain sur la voie de la masculinité plutôt que de la féminité. Cependant, ce gène agit comme un interrupteur et dirige d'autres gènes pour produire l'énorme gamme de différences entre les hommes et les femmes.

Certains gènes sont présents, mais jamais utilisés (jamais allumés). Il semble y avoir une énorme quantité d'ADN que nous avons hérité de notre passé et cela peut ne plus être utile, mais n'a pas été « éliminé ». Certains gènes sont interrompus par de longues séquences d'ADN "silencieux" dont nous ne connaissons pas la fonction. Nous avons peut-être cartographié l'ensemble du génome de quelques organismes (humains, Aarabidopsis, etc.), mais ce n'est guère plus qu'une « feuille de route » et nous devons encore identifier les « maisons » et, plus significativement, les « habitants » de ces Maisons.

Vous savez que les empreintes génétiques peuvent identifier un individu par rapport à un autre. Il existe clairement des fragments d'ADN que nous ne partageons même pas avec nos proches (sauf les vrais jumeaux) - plus la relation est étroite, plus nous partageons de « bandes » sur notre empreinte digitale. Mes enfants ne partagent que la moitié de mon empreinte ADN.

On dit que nous partageons environ 60% de nos gènes avec une banane. Mais vous pouvez voir qu'une telle déclaration peut être très trompeuse.

Il y a eu des études intéressantes sur les protéines que TOUS les organismes partagent. L'un d'eux est le cytochrome C qui est impliqué dans une partie de la respiration. Le nombre de différents acides aminés/mutations entre l'homme et d'autres organismes a été largement étudié. De telles informations peuvent donner une différence numérique entre l'homme et d'autres espèces (y compris les plantes). Cependant, ces différences ne concernent pas la partie de la molécule qui compte - la partie de la molécule qui permet au cytochrome C de remplir sa fonction. De telles données sont utiles pour les études pour dire à quel point les organismes sont étroitement liés (et en fait nous renseignent sur les relations au sein de cet arbre), mais elles ne nous disent pas à quel point nous sommes "différents", car le cytochrome C fonctionne de la même manière dans TOUS les organismes !


Comment naissent les fruits sans pépins et comment se propagent-ils ?

Le développement du fruit commence normalement lorsqu'un ou plusieurs ovules du compartiment ovulaire de la fleur sont fécondés par des noyaux de spermatozoïdes provenant du pollen. Chez certaines plantes, cependant, les fruits se développent sans fécondation, un phénomène connu sous le nom de parthénocarpie. Les fruits parthénocarpiques présentent des avantages par rapport aux fruits à pépins : une durée de conservation plus longue et un plus grand attrait pour le consommateur.

Les raisons les plus fréquentes du manque de développement des graines sont l'échec de la pollinisation, ou des œufs ou des spermatozoïdes non fonctionnels. Chez de nombreuses plantes, les gènes d'auto-incompatibilité limitent la fécondation réussie à la pollinisation croisée entre des parents mâles et femelles génétiquement différents. Cette propriété est exploitée par des producteurs d'agrumes qui cultivent des fruits sans pépins, comme les oranges navel et les clémentines. Parce que ces cultivars sont auto-incompatibles, ils ne produisent pas de graines lorsqu'ils sont plantés dans des vergers de plantes identiques (clones). Ces plantes ont une fréquence élevée de parthénocarpie, cependant, elles produisent toujours des fruits. Ces arbres n'ont pas besoin de graines pour la propagation. En fait, la multiplication par graines serait désavantageuse car la descendance serait différente du parent. Au lieu de cela, les pépiniéristes multiplient fréquemment les arbres fruitiers de manière asexuée, généralement par greffage.

Une autre raison fréquente de l'absence de fécondation réussie est le déséquilibre chromosomique. Par exemple, la banane commune est triploïde. En d'autres termes, il a trois ensembles de chromosomes. Au lieu d'avoir un jeu de chromosomes de chaque parent, il a deux jeux d'un parent et un jeu de l'autre parent. Les triploïdes produisent rarement des œufs ou des spermatozoïdes qui ont un ensemble équilibré de chromosomes et donc un ensemble de graines réussi est très rare. Les bananes sont également parthénocarpiques et produisent des fruits en l'absence d'une fécondation réussie. Ces bananes sont propagées de manière asexuée. Une fois que la tige a fleuri et a porté ses fruits, elle meurt. Mais il y a des pousses latérales ou des drageons à la base de la tige principale, qui peuvent être enlevés et replantés pour continuer le cultivar. Les producteurs multiplient également les bananes par culture de tissus.

Les pastèques sans pépins sont particulièrement intéressantes car elles doivent être multipliées par graines, et pourtant les producteurs peuvent toujours exploiter la parthénocarpie. Une façon de faire des pastèques sans pépins est de produire des graines triploïdes. Comme dans le cas des bananes, les pastèques triploïdes ne peuvent pas produire de graines fonctionnelles, mais elles développent toujours de bons fruits par parthénocarpie. Les sélectionneurs de plantes produisent des graines triploïdes en croisant un parent diploïde normal avec un parent tétraploïde, qui lui-même est fabriqué en manipulant génétiquement des diploïdes pour doubler leur nombre de chromosomes. Dans le cas des pastèques, cette manipulation doit être effectuée à chaque génération, c'est donc une proposition un peu coûteuse mais qui en vaut la peine.

Les phytobiologistes ont appris que si l'auxine, une hormone végétale, est produite au début du développement de l'ovule, les fruits parthénocarpiques peuvent pousser sur des plantes qui ne présentent généralement pas cette propriété. Ainsi, le génie génétique donnera très probablement aux consommateurs des fruits parthénocarpiques dans de nombreuses autres espèces dans un avenir proche.


Discussion

P. trifoliata est une espèce chinoise à feuilles caduques à feuilles trifoliolées qui a longtemps été utilisée comme porte-greffe pour les cultivars d'agrumes. Il est résistant au Phytophthora, aux nématodes et au virus de la tristeza et peut supporter une température froide de -26 °C 50,51 . Les anciens ont observé que l'union de greffe de mandarine et P. trifoliata cultivé dans le sud de la Chine était le mandarin, tandis qu'en Chine du nord, le point de greffe cultivé était l'oranger trifolié. Ceci est maintenant facile à expliquer, car seul le porte-greffe orange trifolié est très résistant aux températures froides et peut survivre en hiver dans le nord de la Chine, tandis que le scion mandarine avec une bonne qualité de fruit est vulnérable aux températures froides. P. trifoliata est également sexuellement compatible avec le Agrumes et l'hybride sexuel le plus largement cultivé est le citrange de Troyer, qui est également un porte-greffe d'agrumes très important dans de nombreux pays 23 . Dans cette étude, nous avons séquencé et assemblé un génome de haute qualité d'une race locale de P. trifoliata de la province du Shanxi sur la base de l'évaluation génétique d'un ensemble de 169 accessions. Ainsi, ce génotype représente un type original de P. trifoliata par rapport au fond génétique étroit aux États-Unis d'ailleurs, ce génome est plus complet que le génome 52 récemment publié (tableau supplémentaire 6). Les deux génomes fournissent une ressource génomique précieuse pour la génétique des porte-greffes d'agrumes et l'amélioration de la sélection. Ce génome ainsi que les génomes des agrumes cultivés (en tant que scions) devraient faciliter une compréhension approfondie des interactions greffon–porte-greffe au niveau génomique. En outre, les informations génomiques peuvent également être utiles pour une enquête plus approfondie sur la base des utilisations médicales et d'autres traits biologiques uniques de l'orange trifoliée, tels que la résistance au froid, le caractère de la feuille trifoliée et la résistance au virus de la tristeza des agrumes.

Le greffage a été largement utilisé pour améliorer les performances des plantes horticoles depuis des milliers d'années. Bien que de plus en plus de preuves physiologiques indiquent l'existence d'interactions porte-greffe-greffe chez les plantes 53 , les preuves moléculaires aux niveaux génétique et épigénétique révélant l'influence des interactions porte-greffe-greffe sont rares. Récemment, la découverte d'éléments génétiques mobiles tels que l'ADN, l'ARN et les protéines a progressivement révélé les mécanismes moléculaires sous-jacents à plusieurs traits agronomiques affectés par les interactions porte-greffe-greffe 16 . Par exemple, le microARN399 a été identifié comme un signal longue distance pour la régulation de l'homéostasie du phosphate végétal dans le colza et la citrouille 54 . Epigenetic modification may also play important roles in creating heritable phenotypic variation by grafting. In this study, we found that the DNA methylation level in the scion grafted on P. trifoliata decreased by

3% (Fig. 5). A previous study reported that DNA methylation levels in grafted cucumber and melon were significantly increased when pumpkin was used as rootstock, while there was no significant change in grafted watermelon 19 . Grafting between plant species of Solanaceae caused extensive DNA methylation variation, and some variation could be stably passed on to offspring 18 . Thus, we can conclude that grafting does cause variations in DNA methylation, but the degree and trend of DNA methylation variation may vary based on species and graft combinations. The effect of grafting on DNA methylation may be a regulatory mechanism for intercell interactions between scions and rootstocks 21 .

Our observation that the DNA demethylation pattern in the scions of heterografted plants is concomitant with reduced abundance of 24-nt sRNAs implies a possible mechanism of graft-induced alteration in DNA methylation. sRNA-mediated graft-transmissible epigenetic modifications have been confirmed in Arabidopsis thaliana by grafting experiments. Molnar et al. demonstrated that the movement of transgene-derived and endogenous sRNAs from shoot to root across graft unions can cause epigenetic changes in rootstock cells 55 . A subsequent study showed that mobile sRNAs originating in the shoots guided RdDM at thousands of loci in the roots 56 . Our finding that the sRNAs are associated with the methylation levels of the sRNA-overlapping regions suggests that the DNA demethylation in the scion of heterografted plants may be attributed to the reduction in sRNAs leading to reduced RdDM. As the genotypes of both the rootstock and scion in autografted plants are the same, it is difficult to determine whether the highly expressed sRNAs in the scions of autografted plants are from the rootstock. However, the higher expression of the sRNAs in the roots of sweet orange than in those of Poncirus, combined with the downregulation of the highly expressed sRNAs in the scions of autografted plants after griding treatment, suggested the possibility that the reduction in the rootstock-to-scion movement of sRNAs leads to decreased sRNA abundance in the scions of heterografted plants. Based on the above finding, the DNA demethylation in the scion of SWO/Pt was possibly caused by the reduced graft-transmissible epigenetic modifications mediated by rootstock-to-scion movement of sRNAs.

The high-quality citrus rootstock genome provides an important basis for future studies on rootstock genetic improvement, and our multiomic analysis of P. trifoliata may promote a deeper understanding of graft biology, not only in citrus plants but also in other horticultural crops. Given the important biological roles played by DNA methylation in plants, it is reasonable to suspect that graft-transmissible epigenetic modifications may have functional consequences. In the future, the use of transgenic plants as rootstocks for grafting will further enhance the opportunity to improve practical nontransgenic cultivars in the field.


METHODS

Plant Materials and Phenotypic Evaluation

Diploid Fragaria vesca Germplasm

An F2 mapping population of 145 lines between the everbearing, non-runnering Fragaria vesca cv Reine des Vallées (ESP138.660 RV660) and the WF F. vesca ESP138.596 (WV596) was developed from one F1 plant (F1-14) that was able to produce runners and had RFs. The population was grown in a greenhouse in Málaga, Spain and phenotyped for two years. The two traits, runnering and red/white fruits, were found to segregate independently as two single mutations. The remaining F. vesca accessions were grown under the same conditions and are described in Supplemental Data Set 3 and include cv South Queensferry, GER1, and GER2 from the Günter Staudt collection (Dresden, Germany) and UK13, SE100, and FIN12 from the T. Hytönen and D. Posé collection.

Octoploid Fragaria Germplasm

The University of Florida breeding population 17.66 was derived from a cross between FL 13.65-160 (red) and FL 14.29-1 (white) selections ( Supplemental Figure 4 Supplemental Data Sets 3 and 8 ). The population (102 individuals) was grown under open field conditions with two plants per plot. Fruit skin color was assayed three times from December 2018 to February 2019 at the UF/IFAS Gulf Coast Research and Education Center (Balm, Florida).

To generate the SS×FcL F2 population of 105 progenies, a cross between Fragaria ×ananassa cv Senga Sengana and F. chiloensis ssp. lucida USA2 was performed at Hansabred, Germany in 2008 ( Supplemental Figure 5 ). An F1 seedling, cloned under the number P-90999, was selected among the progeny based on key breeding traits such as tolerance to two spotted spider mite (Tetranychus urticae Koch), yield, and fruit aroma and color. The selected F1 individual was self-pollinated to obtain the F2 mapping population. The population was grown under field conditions at Hansabred and scored for fruit skin, flesh, and core color in three seasons (2014, 2016, and 2019). Skin color was evaluated using a five-score scale from completely white to dark red. Flesh and core color was evaluated using a three-score scale: 1, white 2, light red and 3, red ( Supplemental Figure 10 ). The parental line F. chiloensis ssp. lucida USA2 is a male individual that does not set fruit, and therefore USA1, a sister female plant collected from the same area, was included in phenotypic and molecular analyses, as were other F. chiloensis accessions from diverse origins ( Supplemental Data Set 3 ).

DNA Extraction and QTL-Seq Analysis of Diploid Fragaria vesca

DNA was extracted from young leaves of parental plants, F1 plants, and each F2 line using the CTAB method ( Doyle and Doyle, 1990) with minor modifications. For rapid mapping of the fruit color mutation, we performed whole-genome resequencing of DNA from two bulked populations as previously described by Takagi et al. (2013). The RF and WF pools were produced by mixing equal amounts of DNA from 34 RF and 32 WF F2 lines, respectively.

Pair-end sequencing libraries with insert sizes of ∼350 bp were prepared, and 100-bp sequences were produced with 50× genome coverage using an Illumina HiSeq 2000. The reads from the RF and WF pools were mapped independently against the latest version of the Fragaria vesca reference genome, F_vesca_H4_V4.1 ( Edger et al., 2018). The low-quality reads (<Q20 Phred scale) were filtered using the samtools method ( Li et al., 2009). Duplicates that originated from PCR were eliminated using the picard-tools program.

For the single nucleotide variants and small INDELs calling process, the gatk algorithm ( McKenna et al., 2010) was applied. The large INDELs were identified using the Manta algorithm ( Chen et al., 2016). The variants with coverage less than 20 reads in both samples were not considered in downstream analyses.

SNP frequencies in each pool were calculated as the proportion of reads harboring the SNP different from the reference genome. Thus, SNP frequency = 0 if all short reads match the reference sequence and 1 if they correspond to the alternative allele. SNP positions with read depth <7 and frequencies <0.3 in both pools were excluded, as they may represent spurious SNPs called due to sequencing or alignment errors. The parameter ΔSNP-index was calculated as the absolute difference between SNP frequencies in the RF and WF pool samples. To detect significant genomic regions, the genome was split into 3-Mb sliding windows with 10-kb increments. For each window, the average ΔSNP-index was calculated and used for the sliding window plot. To identify statistically significant regions, a Wilcoxon test was applied using a confidence P-value of 0.03.

Whole Genome Resequencing of FIN12 and Data Analysis

Whole genome resequencing of the FIN12 accession was performed at DNA Sequencing and Genomics Laboratory, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland using an Illumina NextSeq 500 sequencer. Library preparation, pair-end sequencing (150 + 150 bp), and the alignment of the sequencing reads on the F. vesca H4 reference genome v4.1 ( Edger et al., 2018) were performed as described by Koskela et al. (2017).

GWAS Analysis of F. × ananassa Breeding Germplasm

A total of 95 individuals from UF family 17.66 were used for GWAS. Total genomic DNA was isolated from leaf tissues using a modified CTAB method described by Noh et al. (2018). Whole-genome SNP Genotyping was performed using the FanaSNP 50K Array ( Hardigan et al., 2020). A GLM, mixed linear model (MLM), and MLMM were used for association tests using GAPIT v2 performed in R ( Team, 2014 Liu et al., 2016 Tang et al., 2016). Manhattan plots were created using the R package qqman version 0.1.4 ( Turner, 2014).

Linkage Mapping and Detection of QTL in Octoploid Fragaria

DNA was extracted from young leaves of parental plants, F1 plants, and the 105 F2 lines using the same CTAB method described for diploid Fragaria. A total of 16,070 SNP markers were produced using the strawberry DArTseq platform ( Sánchez-Sevilla et al., 2015). SNP markers that were monomorphic in the progeny were removed, and markers that did not fit the expected 3:1 segregation ratio using the χ 2 test (P = 0.05). Next, markers with rowSums <400 were also removed. Finally, markers with more than 5% missing scores (more than five progeny lines) were excluded, resulting in a total of 9005 dominantly scored SNP markers. For 5856 markers, the reference and the alternative allele segregated at a 1:2:1 ratio (as expected for a F2 population) and were transformed into 2523 codominant markers (COD-SNPs). The 2523 COD-SNPs were used together with 2446 dominant SNPs (DOM-SNPs) for mapping using JoinMap 4.1 ( van Ooijen, 2006). First, JoinMap software was used (coding the markers as a CP population) to infer the phases of markers heterozygous in both parental lines and thus of unknown origin in the F1 ligne. Phase information was then used to assign phases and to code the SNP markers as a F2 population. Grouping was performed using independence LOD and the default settings in JoinMap 4.1, and LGs were chosen at a LOD of 9 for all 28 groups obtained. Map construction was performed using the maximum likelihood mapping algorithm and the following parameters: chain length 5,000, initial acceptance probability 0.250, cooling control parameter 0.001, stop after 30,000 chains without improvement, length of burn-in chain 10,000, number of Monte Carlo EM cycles 4, chain length per Monte Carlo EM cycle 2,000, and sampling period for recombination frequency matrix samples 5. A total of 422 identical loci and 517 loci with similarity > 0.99 were removed. The seven HGs were named HG 1 to 7 based on the corresponding LGs in the diploid Fragaria reference map. BLAST analysis was performed using the SNP marker sequences as queries against the recently published Camarosa genome and assigned to the best matching chromosome. LGs within homoeologous groups were then named 1 to 4 according to the corresponding Camarosa chromosome number ( Edger et al., 2019).

QTL analyses were performed using MapQTL 6 ( van Ooijen, 2009). The raw relative data were first analyzed using a nonparametric Kruskal-Wallis rank-sum test. A stringent significance level of P ≤ 0.005 was used as a threshold to identify markers linked to QTLs. Second, transformed data sets for nonnormally distributed traits were used to identify and locate mQTLs using Interval Mapping with a step size of 1 cM and a maximum of five neighboring markers. Significance LOD thresholds were estimated with a 1,000-permutation test for each trait. The most significant markers were then used as cofactors for restricted multiple QTL mapping analysis. mQTLs with LOD scores greater than the genome-wide threshold at P ≤ 0.05 were declared significant. Linkage maps and QTLs were drawn using MapChart 2.2 ( Voorrips, 2002).

RNA Extraction and RT-quantitative PCR

Total RNA was extracted from three independent pools (20 to 25 ripe fruits each) of each WF and RF phenotype. Fruits for these biological triplicates were collected from the same F2 lines of the ‘RV660’ × ‘WV596’ population used for QTL-seq. We followed a CTAB method described by Gambino et al. (2008), with minor modifications. Briefly, 300 mg of powdered fruit sample was used as starting material and RNA was resuspended in 30 μL sterile water. Following digestion with a TURBO DNA-free Kit (Thermo Fisher Scientific AM1907), cDNA was synthesized from 1 μg of RNA using a High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific 4,368,814). RT-qPCR analysis was performed with iQ SYBR Green Supermix in an iCycler iQ5 system (Bio-Rad) following the manufacturer's instructions. Three technical replicates (within each experiment) were performed for each biological replicate. The relative expression level of a gene of interest in each sample was calculated as E -ΔCq and normalized by the E -ΔCq value for GADPH as the internal reference gene. The sequences of primers used in this study are listed in Supplemental Data Set 11 .

Semi-polar Metabolite Analysis Using UPLC-Orbitrap-MS/MS

To investigate the effect of FvMYB10 mutation, three independent pools of 20 to 25 ripe fruits from each phenotype (RF and WF) were analyzed. Fruits were collected from the same F2 lines used for QTL-seq and RT-qPCR. Fruit tissue from each pool was ground in liquid nitrogen and stored at −80°C. Secondary metabolite profiles of RF and WF pools were obtained as described by Vallarino et al. (2018) using a Waters Acquity UPLC system. Full documentation of metabolite profiling data acquisition and interpretation is provided in Supplemental Data Set 2 .

Quantification of Fruit Quality Parameters

To determine SSC, TA, Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), and ascorbic acid levels, frozen fruit powder from the same samples (in biological triplicate) used for expression and metabolomic studies were used. For SSC, ∼0.5 g of sample was defrosted to room temperature and the puree deposited onto the lens of a refractometer (Atago PR32, Japan). Titratable acidity was evaluated with an automatic titrator (Titroline easy, Schott North America) as previously described by Zorrilla-Fontanesi et al. (2011). Polyphenols were extracted in 80% (v/v) methanol, and the antioxidant capacity of fruit samples was measured based on the ability of antioxidant molecules to quench the ABTS •+ radical cation [2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Sigma–Aldrich] compared with the antioxidant activity of standard amounts of Trolox. TEAC assays were performed as described ( Pellegrini et al., 1999 Re et al., 1999) using 2 μL of sample and 250 μL of radical reagent. The absorbance at 734 nm was measured after 5 min at 25°C in a spectrophotometer. Results were expressed as μmoles of Trolox equivalents per gram of fresh weight (μmol TE/g FW).

L-Ascorbic acid (L-AA) was measured by HPLC ( Davey et al., 2006 Zorrilla-Fontanesi et al., 2011). In brief, 0.25 g of fruit powder was homogenized in 1 mL cold extraction buffer (metaphosphoric acid 2% [w/v], EDTA 2 mM) and incubated at 0°C for 20 min. The samples were centrifuged at 14,000 rpm for 20 min at 4°C, and the supernatant was filtered (0.45-mm membrane) and transferred to HPLC vials kept on ice. Finally, a 5-mL sample was injected in a Rx-C18 reverse-phase HPLC column (4.6 × 100 mm, 3.5 mM, Agilent Technologies) and detection was performed at 254 nm in a photodiode array detector (G1315D, Agilent Technologies). The mobile phase consisted of a filtered and degassed solution of 0.1 M NaH2Bon de commande4, 0.2 mM EDTA pH 3.1 ( Harapanhalli et al., 1993), and the flow rate was 0.7 mL/ min. L-AA content was calculated by comparison with values obtained from a standard curve and were expressed as mg L-AA per 100 g of fresh weight.

Amplicon Sequence Analysis

Amplicon sequencing was performed using cDNA from WF and RF accessions from UF family 17.66. The fruits from each white-skinned and red-skinned accession were collected in the field, and 2-mm-thick fruit skin samples were collected for RNA extraction using a surgical blade. Total RNA was extracted from each sample with a RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany), and cDNA synthesis was performed using LunaScript RT SuperMix Kit (New England Biolabs, USA) following the manufacturer's instructions. For amplicon sequencing, primer sets were developed for the coding region of MYB10 (cv Camarosa, maker-Fvb1-2-snap-gene-157.15-mRNA-1) using IDT's PrimerQuest Software ( Supplemental Data Set 11 ). The PCR products were checked in 3% (w/v) agarose gels and further purified for amplicon sequencing at GENEWIZ (South Plainfield, NJ). The sequencing reads from each WF and RF pool (10 samples per pool) were mapped to the MYB10 gene (maker-Fvb1-2-snap-gene-157.15-mRNA-1) with Geneious v.11.0.5 using default values. The consensus sequences of the MYB10 coding region of white and red strawberry pools were aligned using T-coffee ( Notredame et al., 2000).

Gene and Promoter Cloning and Sequence Homology Analysis

Gene and promoter amplification were performed using MyFi™ DNA Polymerase (Bioline). FvMYB10-gypsy and Fvb1 FIN12 genomic fragments flanking the deleted region were amplified with the 5Prime PCR Extender System (5Prime) using the provided 10× Tuning Buffer following the manufacturer instructions.

PCR products <8 kb were purified with a FavorPrep GEL/PCR Purification Kit (Favorgen). PCR products >8 kb were precipitated (30% [w/v] PEG8000 30mN MgCl2). Purified products were cloned into the pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) for Sanger sequencing.

Alignement de séquences multiples de MYB10 promoter fragments was performed using the Geneious algorithm (Gap open penalty = 30 Gap extension penalty = 0 50 refinement iterations) and used for homology tree construction (Genetic distance model: Jukes-Cantor Tree build method: Neighbor-Joining Resampling method: Bootstrap 1000 replicates), both in Geneious 7.1.9 ( Kearse et al., 2012). F. vesca MYB10 pro sequence was chosen as outgroup as it belongs to a different species. Promoter sequence alignment and machine-readable tree files are provided as Supplemental Data Sets 12 and 13 .

RNA-Seq Analysis, Differential Gene Expression, and Variant Calling

Total RNA was extracted from two biological replicates of ripe fruits from the seven selected octoploid accessions as described above. Each replicate consisted of a pool of 3 to 5 fruits collected throughout different days at the same time of day (Zeitgeber Time 7). The fruits were immediately frozen in liquid N2 and stored at −80°C until processing. RNA quantity, quality, and integrity were determined based on absorbance ratios at 260 nm/280 and 260 nm/230 nm using a NanoDrop spectrophotometer (ND-1000 V3.5, NanoDrop Technologies, Inc.) and agarose gel electrophoresis and further verified using a 2100 Bioanalyzer (Agilent, Folsom, CA). Sample RIN values ranged from 7.4 to 8.4. Libraries were produced following Illumina´s recommendations at Sistemas Genómicos facilities, where they were sequenced by pair-end sequencing (100 bp × 2) in an Illumina HiSeq 2500 sequencer. Over 200.4 million reads were generated and filtered for high-quality reads by removing reads containing adapters, reads shorter than 50 bp, and reads with Q-value ≤30 using Fastq-mcf from ea-utils ( Aronesty, 2011) with the parameters -q 30 -l 50. The following analyses were performed on processed clean reads.

Read mapping, differential gene expression analysis, and clustering of reads from the seven selected octoploid accessions and the previously described cv Camarosa’ tissues ( Sánchez-Sevilla et al., 2017) were performed using the Tuxedo suit (Hisat2/Cufflinks/CummRbund) following standard procedures ( Trapnell et al., 2012). For the reference genome ( Edger et al., 2019), we used the latest assembled F. ×ananassa genome (Camarosa Genome Assembly v1.0.a1: F_ana_Camarosa_6-28-17.fasta) and annotation (Fxa_v1.2_makerStandard_MakerGenes_woTposases.gff) downloaded from the Genome Database for Rosaceae website (https://www.rosaceae.org/). The overall alignment rate was 90.72%.

Variant calling was performed using the haplotype-based variant detector FreeBayes v1.0.2-16-gd466dde-dirty ( Garrison and Marth, 2012). To identify the different variants at each position in the reference F. ×ananassa genome, alignment BAM files of the different accessions were labeled with samtools. A VCF file was generated with FreeBayes with all parameters set to default. All bioinformatic processes were performed at the Picasso cluster facilities at Servicio de Supercomputación y Bioinformática Málaga (http://scbi.uma.es).

Transient Overexpression by Agro-infiltration of Fruit

Transient expression studies in strawberry fruits were performed as described ( Hoffmann et al., 2006) with minor modifications. Full-length wild-type FvMYB10 and the truncated fvmyb10-2 cDNAs were amplified from total cDNA from ripe fruits of the F2 RV660 × WV596 population RF or WF pools, respectively. Primers FvMYB10-attB1 F and FvMYB10-attB2 R were used to amplify wild-type FvMYB10, and FvMYB10-attB1 F and ccm29 were used to amplify fvmyb10-2 ( Supplemental Data Set 11 ). Primer ccm29 is complementary to a region of the retrotransposon 45 to 70 bp downstream of the insertion point, which includes the first stop codon generated after the insertion. Each gene version was cloned into the Gateway transfer vector pDONR221 and then into the binary vector pK7WG2D under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter (Gateway BP and LR Clonase II Enzyme mix, Invitrogen). The resulting plasmids were introduced into Agrobacterium strain AGL0 following the protocol of Höfgen and Willmitzer (1988). Immature fruits in the late green/early white stage were used for agro-infiltration using 1 mL suspension of each culture in combination (1:1) with a suspension of Agrobacterium LBA4404 with the p19 suppressor of gene silencing ( Voinnet et al., 2003). Agro-infiltrated fruits were labeled and left to ripen in planta for ∼7 to 10 d.

HRM Marker Development and Marker Data Analysis

The primer set targeting the 8-bp mutation was designed using IDT's PrimerQuest Software and ordered from IDT (San Jose, California Supplemental Data Set 11 ). PCR amplification was performed in a 5 μL reaction containing 0.5 μM of each primer set, 2× AccuStart TM II PCR ToughMix (Quantabio, Beverly, Massachusetts ), 1× LC Green Plus HRM dye (BioFire, Salt Lake City, Utah), and 0.5 μL of DNA. The PCR conditions were as follows: an initial denaturation at 95°C for 5 min 45 cycles of denaturation at 95°C for 10 s, annealing at 62°C for 10 s, and extension at 72°C for 20 s. After PCR amplification, the samples were heated to 95°C for 1 min and cooled to 40°C for 1 min. Melting curves were obtained by melting over the desired range (60° to 95°C) at a rate of 50 acquisitions per 1°C. The HRM assay was performed with the LightCycler 480 System II (Roche Life Science, Germany). The HRM data were analyzed using Melt Curve Genotyping and Gene Scanning Software (Roche Life Science, Germany). Analysis of HRM variants was based on differences in the shapes of the melting curves and Tm values.

SNP Genotyping using KASP

An SNP in MYB10-2 at position −20 from the initial ATG associated with white/red flesh color in the sequenced accessions was targeted for the KASP assay. To produce a subgenome-specific assay, a combination of four primers was used in each reaction: two common forward primers (ccm90 and ccm91) to account for a background-specific G/A SNP, and two allele-specific primers (ccm92 and ccm93), each carrying the standard FAM or HEX dye tails and the targeted SNP at the 3′ end. A single common primer is generally used for standard KASP assays, but the high degree of polymorphism in the targeted region made it necessary to include an extra common forward primer to account for a different, background-associated G/A SNP not linked to the white-fleshed trait. Reaction volumes of 5 μL for 384-well plates were used 2.5 μL of MasterMix, 0.07 μL of assay/primer mix, and 2.5 μL of DNA (12.5 ng total) were used for genotyping. The final primer concentrations in the reaction mix were 210 nM for ccm90 and ccm91 150 nM for ccm92 and 190 nM for ccm93. PCR was conducted in a BioRad CFX-384 instrument using the following protocol: An initial denaturation step at 94°C for 15 min, 12 touchdown cycles (94°C for 20 s, 65°C for 80 s, dropping 0.6°C per cycle), 29 cycles (94°C for 20 s, 58°C for 80 s), and a final recycling for 2 cycles (94°C for 20 s, 60°C for 80 s). BioRad software was used to estimate the final results.

Accession Numbers

F. vesca FIN12 accession sequencing data are stored at National Center for Biotechnology Information Short Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) under accession number PRJNA655237.

The raw reads data from (1) Illumina high-throughput sequencing of RF and WF DNA pools from F2 lines of the F. vesca RV660 × WV596 population and (2) RNA-seq from ripe fruits of white and red octoploid accessions were stored at the Sequence Read Archive (SRA) of the European Nucleotide Archive (ENA) under project reference number PRJEB38128. In the same project, Sanger sequences were stored under the following specific codes: (1) fvmyb10-3 mutant alleles sequences from SE100, GER1, and GER2: LR862245, LR862246, and LR862247 (2) MYB10 promoter sequences from F. chiloensis ssp. chiloensis FC157 MYB10-1 pro/MYB10-3B pro, MYB10-2 pro, et MYB10-3A pro (LR862237-LR862239), F. chiloensis ssp. lucida USA2 MYB10-3A pro, MYB10-1 pro/MYB10-3B pro, et MYB10-2 pro (LR862240-LR862242), Fragaria × ananassa cv Senga Sengana MYB10-3A pro et MYB10-1 pro/MYB10-3B pro (LR862243- LR862244) and (3) The FvMYB10-gypsy LTR-TE sequence from fvmyb10-2: LR8622681.

Données supplémentaires

Supplemental Figure 1. . The LTR-TE insertion in FvMYB10 cosegregates with the white fruit phenotype in the entire RV660xWF596 population.

Supplemental Figure 2. . TEAC, soluble solid content (SSC), titratable acidity (TA), and L-ascorbic acid (L-AA) content in RF and WF F2 pools of the RV660 x WV596 population.

Supplemental Figure 3. . F. vesca accession FIN12 has a large deletion affecting an ∼100 kb region in Fvb1 that results in the loss of seven predicted genes including FvMYB10 (FvH4_1g22020).

Supplemental Figure 4. . Fruit skin color in UF population 17.66 (FL 13.65-160 × FL 14.29-1).

Supplemental Figure 5. . Fruit flesh and skin color phenotypes in the Hansabred SS×FcL population.

Supplemental Figure 6. . Senga Sengana x F. chiloensis ssp. lucida linkage map and comparison to the physical positions in the F. vesca reference genome.

Supplemental Figure 7. . Expression of cv Camarosa FaMYB10 homoeologs in different tissues and during fruit ripening.

Supplemental Figure 8. . Sequence alignment of WT and mutant MYB10-2 in UF breeding population 17.66.

Supplemental Figure 9. . Alignment of the MYB10 upstream region showing the SNP targeted for KASP genotyping.

Supplemental Figure 10. . Fruit color scale used to phenotype octoploid accessions.

Supplemental Data Set 1 .. List of significant SNPs and INDELs in the RV660 × WV596 population.

Supplemental Data Set 3 .. List of Fragaria ssp. included in this study and description of mutations detected in MYB10.

Supplemental Data Set 4 .. QTLs detected for fruit color traits in the cv Senga Sengana × Fragaria chiloensis ssp. lucida F2 population by Kruskal-Wallis (KW) and restricted multiple QTL mapping (rMQM) analysis.

Supplemental Data Set 5 .. Polymorphisms at MYB10 homoeologs from F. chiloensis accessions and cv Senga Sengana vs. the cv Camarosa reference genome.

Supplemental Data Set 6 .. Expression of anthocyanin pathway genes in cv Senga Sengana and white-fleshed F. chiloensis accessions.

Supplemental Data Set 7 .. Predicted putative cis-elements specific to cv Camarosa FaMYB10-2 pro.

Supplemental Data Set 8 .. Predicted putative cis-elements specific to cv Camarosa FaMYB10-2 pro potentially significant in the context of fruit ripening and anthocyanin production.

Supplemental Data Set 9 .. Putative cis-elements predicted in FvMYB10 pro overlapping with those exclusively predicted in cv Camarosa FaMYB10-2 pro.

Supplemental Data Set 10 .. Phenotypes and WS_CID_1 marker genotypes of UF breeding population 17.66 (FL 13.65-160 × FL 14.29-1).

Supplemental Data Set 12 .. Sequence alignment file in fasta format of MYB10 pro variants.


Voir la vidéo: - Les graines, les fruits et la germination (Janvier 2023).