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13.2 : Contrôle post-transcriptionnel de l'expression génique - Biologie

13.2 : Contrôle post-transcriptionnel de l'expression génique - Biologie


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Il n'y a pas si longtemps, nous pensions que très peu de génomes eucaryotes étaient transcrits. Nous savons maintenant que d'autres ARN jouent un rôle dans la régulation des gènes et la dégradation de l'ADN cellulaire épuisé ou de l'ADN étranger indésirable. Ceux-ci sont discutés en détail ci-dessous.

A. Ribosomes

Les riboswitches est un mécanisme de transcription bactérien pour réguler l'expression des gènes. Bien que ce mécanisme ne soit pas spécifiquement post-transcriptionnel, il est inclus ici car l'action se produit après l'initiation de la transcription et interrompt l'achèvement d'un ARNm. Lorsque l'ARNm d'une enzyme de la voie de synthèse de la guanine est transcrit, il se replie en structures tige-boucle. La synthèse enzymatique se poursuivra aussi longtemps que la cellule aura besoin de fabriquer de la guanine. Mais si la guanine s'accumule dans la cellule, l'excès de guanine se liera aux éléments tige-boucle près de l'extrémité 5' de l'ARNm, provoquant la dissociation de l'ARN polymérase et de l'ARNm partiellement terminé de l'ADN, mettant ainsi fin prématurément à la transcription. La base de la régulation par riboswitch de la guanine de l'expression d'une enzyme de la voie de synthèse de la guanine est présentée ci-dessous.

La capacité à former des structures tige-boucle repliées aux extrémités 5' des ARNm bactériens semble avoir permis l'évolution des stratégies de régulation de la traduction. Alors que l'interaction de la guanine avec la structure tige-boucle d'un ARNm 5' émergent peut interrompre sa propre transcription, des interactions similaires de petits métabolite/ARNm et même protéine/ARNm peuvent également réguler (dans ce cas empêcher) la traduction. Comme nous le verrons sous peu, les structures repliées de l'ARNm 5' jouent également un rôle dans la régulation de la traduction eucaryote.

B. CRISPR/Cas : complexe ARN-protéine d'un système immunitaire adaptatif procaryote

Dans les organismes supérieurs, le système immunitaire est adaptatif. Il se souvient d'une exposition antérieure à un agent pathogène et peut ainsi préparer une réponse à une deuxième exposition au même agent pathogène. La découverte d'un "système immunitaire adaptatif’ chez de nombreux procaryotes (bactéries, archéobactéries) a donc été une surprise.

CRISPR (Clustré Rrégulièrement jeespacé Scourt Palindromique Repeat) Les ARN sont dérivés de transcrits de phages qui ont interagi avec les protéines associées à CRISPR (Cas). Ils composent le CRISPR/Cas système qui semble avoir évolué pour lutter contre l'infection virale en ciblant l'ADN du phage pour la destruction. Lorsque l'ADN viral pénètre dans une cellule lors d'une infection phagique, il peut générer une matrice de gènes CRISPR/Cas dans le génome bactérien, avec entretoise Séquences d'ADN séparant les répétitions des gènes CRISPR. Ces restes d'une infection phagique sont les Mémoire de ce psystème immunitaire rocaryote. Lorsqu'un phage tente de réinfecter une cellule précédemment exposée, les ARN espaceurs et les gènes Cas sont transcrits. Après la traduction de l'ARNm Cas, la protéine Cas et les ARN espaceurs s'engageront et cibleront l'ADN du phage entrant pour la destruction afin de prévenir l'infection. Ainsi, les systèmes CRISPR/Cas (il y en a plusieurs !) rappelles toi des attaques de phages antérieures et transmettent cette mémoire aux cellules de la descendance. Le système CRISPR/Cas9 en Streptocoque pyogène est l'un des plus simples de ces systèmes de défense immunitaire (illustré ci-dessous).

Le réseau de gènes CRISPR/Cas comprend les composants suivants :

  • Cas : Gènes natifs des cellules hôtes
  • CRISPR : répétitions de 24 à 48 pb natives des cellules hôtes
  • ADN espaceur : ADN entre les répétitions CRISPR : généralement, ADN phagique provenant d'une infection phagique antérieure ou d'une transformation plasmidique
  • ADN leader : contient un promoteur pour la transcription d'ARN CRISPR/espaceur
  • Gène tracr : code pour l'ARN de l'activateur de transcription (tracr) (pas tous les systèmes)

Regardons CRISPR/Cas en action.

1. La réponse immunitaire CRISPR/Cas

Considérez le mécanisme d'action de ce système immunitaire procaryote. L'action commence lorsque l'ADN du phage infectieux pénètre dans la cellule, comme illustré ci-dessous.

Résumons ce qui s'est passé ici :

a) L'ADN phagique entrant a été détecté après l'infection phagique.

b) Ensuite, les gènes tracr et Cas sont transcrits avec la région CRISPR/espaceur. Les ARNm Cas sont traduits pour produire la protéine Cas. N'oubliez pas que les ADN espaceurs dans la région CRISPR sont l'héritage d'une infection phagique antérieure.

c) L'ARN CRISPR/espaceur forme des liaisons hydrogène avec une région complémentaire de l'ARN tracr lorsque les deux ARN s'associent aux protéines Cas.

d) Les endonucelases de la protéine Cas hydrolysent l'ARN espaceur des séquences d'ARN CRISPR. Les ARN espaceurs restent associés au complexe tandis que les séquences CRISPR réelles, imparfaitement palindromiques (représentées en bleu dans l'illustration ci-dessus) tombent.

jeans les prochaines étapes, espaceur dérivé du phage Les ARN, maintenant appelés guider les ARN (ou ARNg) « guider » mature Cas9/tracrRNA/espaceur Des complexes d'ARN à un nouvel ADN de phage entrant résultant d'une attaque de phage. L'association du complexe avec l'ADN phagique entrant et les événements ultérieurs sont illustrés ci-dessous.

Encore une fois, résumons :

a) L'espaceur (c'est-à-dire l'ARNg) dans le complexe cible l'ADN du phage entrant.

b) Cas hélicase déroule l'ADN phagique entrant dans des régions complémentaires.

c) les liaisons H de l'ARNg à l'ADN du phage entrant.

d) Les endonucléases Cas créent une cassure double brin (clivage hydrolytique) au niveau de sites spécifiques dans l'ADN phagique entrant. Parce que le clivage du brin d'ADN au site précis est guidé par des molécules d'ARN, les endonucléases CRISPR/Cas sont classées comme enzymes de restriction de type V.

e) L'ADN phagique entrant est détruit et une nouvelle infection phagique est interrompue.

Découvrez ici pour en savoir plus sur la façon dont les bactéries acquièrent des ADN espaceurs, et donc comment ce système immunitaire adaptatif primitif «se souvient») en premier lieu

2. Utilisation de CRISPR/Cas pour éditer/créer des gènes

Les premières études ont démontré le clivage reproductible de l'ADN du phage entrant à des nucléotides spécifiques. Plusieurs laboratoires ont rapidement réalisé qu'il serait possible d'adapter le système pour couper l'ADN à pratiquement n'importe quel nucléotide spécifique dans un ADN cible ! Il s'est avéré que le système fonctionne à la fois in vivo et in vitro, permettant un potentiel pratiquement illimité d'édition de gènes et d'ARN dans un tube à essai… ou dans n'importe quelle cellule. Voici le processus de base :

a) Générer de l'ADNg avec une séquence d'ADN spécifique à Cas qui cible une cible souhaitée dans l'ADN génomique.

b) Fusionner l'ADNg à l'ADN tracr pour former un seul ADN guide (sgDNA) afin qu'il puisse être fabriqué comme un seul transcrit guide (sgRNA).

c) Concevoir une puce à ADN CRISPR/Cas9 qui substitue cet ADN sg à ses ADN espaceurs d'origine.

d) Placer la matrice modifiée dans un plasmide à côté des promoteurs régulés.

e) Transformer les cellules par « électroporation » (fonctionne pour presque tous les types de cellules !)

f) Activer le promoteur pour transcrire les gènes CRISPR/Cas9…

Les applications sont puissantes… et controversées !

3. Le pouvoir et la controverse

L'application de l'édition de gènes avec les systèmes CRISPR/Cas a déjà facilité les études de la fonction des gènes in vitro, dans les cellules et dans les organismes entiers. Cliquez ici pour une description des applications CRISPR/Cas déjà sur le marché ! L'efficacité de l'édition de gènes spécifiques à l'aide des systèmes CRISPR/Cas est très prometteuse pour comprendre la structure et la fonction de base des gènes, pour déterminer la base génétique de la maladie et pour accélérer la recherche de thérapies géniques. Voici quelques exemples d'application des approches CRISPR/Cas.

  • On peut concevoir un sgRNA avec les mutations souhaitées ciblant des sites spécifiques dans l'ADN chromosomique. Puis clonez le sgRNA dans la matrice CRISPR/Cas9 sur un plasmide. Après transformation des cellules appropriées, le CRISPR/Cas9 modifié forme un complexe avec des séquences d'ADN cibles. Après avoir coupé les deux brins de l'ADN cible, la réparation de l'ADN peut insérer les séquences guides mutées dans l'ADN cible. Le résultat est la perte ou l'acquisition de séquences d'ADN à des sites précis et précis, ou Édition de gène de précision. C'est la capacité de le faire dans des cellules vivantes qui a enthousiasmé les communautés de recherche fondamentale et clinique.
  • Avant de transformer les cellules, ingénieur le CRISPR/Cas9 puce à ADN sur le plasmide pour éliminer à la fois endonucléase activités de la protéine Cas. Lors de la transcription de la puce dans les cellules transformées, le CRISPR/Cas9-sgRNA trouve encore un sgRNA-gène ciblé. Cependant, en l'absence d'activités d'endonucléase de la protéine CAS, le complexe qui se forme se trouve juste là blocage de la transcription. Cette technique est parfois appelée CRISPRi (interférence CRISPER), par analogie à ARNi. Appliquée aux organismes (et pas seulement in vitro ou aux cellules), elle mime les plus difficiles Assommer expériences de mutation qui ont été utilisées dans des études du comportement de cellules ou d'organismes rendus incapables d'exprimer une protéine spécifique.
  • Il existe maintenant plusieurs systèmes CRISPR/Cas fonctionnels capables de Édition de gène de précision. Ils sont passionnants pour leur rapidité, leur précision, leurs perspectives de thérapies géniques rapides et ciblées pour lutter contre la maladie, et leurs possibilités de modifier des populations entières (appelées Génération de gènes). En insérant des gènes modifiés dans les cellules germinales des organismes cibles, le forçage génétique peut rendre inoffensives des populations entières de moustiques porteurs du paludisme, afin d'éliminer la résistance aux pesticides, par ex. insectes, éliminer la résistance aux herbicides des plantes indésirables ou éliminer génétiquement les espèces envahissantes. Pour plus d'informations, cliquez sur Gene drive ; pour une lecture facile sur ce processus et les controverses entourant les applications des technologies CRISPR aux moustiques en particulier, consultez J. Adler, (2016) Un monde sans moustiques. Smithsonian, 47(3) 36-42, 84.
  • Il est même possible de supprimer un chromosome entier des cellules. Ce morceau de génie génétique mondial repose sur l'identification de plusieurs séquences uniques sur un seul chromosome, puis sur le ciblage de ces sites pour CRISPR/Cas. Lorsque le système est activé, le chromosome est coupé à ces sites, le fragmentant au-delà de la capacité des mécanismes de réparation de l'ADN à corriger la situation. Cliquez ici pour en savoir plus.

Ne serait-ce que pour son efficacité et sa simplicité, l'édition de gènes de précision avec les techniques CRISPR/Cas a soulevé des problèmes éthiques. De toute évidence, il existe un potentiel d'abus, voire d'utilisation sans aucun but bénéfique. Il est significatif que, comme dans toutes les discussions sur l'éthique biologique, les scientifiques soient très engagés dans la conversation. Malgré la controverse, nous continuerons sans aucun doute à éditer des gènes avec CRISPR/Cas, et nous pouvons chercher un futur proche Prix Nobel pour sa découverte et son application ! Si vous avez encore des scrupules, peut-être que l'édition d'ARN sera la réponse. Consultez le lien sur Pourquoi modifier l'ARN? pour un aperçu des possibilités !

Enfin, « les souris et les hommes » (ainsi que les femmes et les bébés) possèdent des anticorps contre les protéines Cas9, suggérant une exposition antérieure aux antigènes microbiens CRISPR/Cas9. Cette observation peut limiter les applications cliniques de la technologie ! Voir Avenir incertain de la technologie CRISPR-Cas9.

C. Les petits ARN : miARN et siARN chez les eucaryotes

Les micro-ARN (miARN) et les petits ARN interférents (siARN) se trouvent dans C. elegans, un petit nématode (ver rond) qui est rapidement devenu un modèle pour les études de biologie et de développement cellulaire et moléculaire. Les attraits particuliers C. elegans sont que (a) son génome a ~ 21 700 gènes, comparables aux ~ 25 000 gènes dans un génome humain ! ; (b) il utilise les produits de ces gènes pour produire un ver adulte composé de seulement 1031 cellules organisées dans tous les organes principaux trouvés dans les organismes supérieurs ; (c) Il est possible de retracer les origines embryonnaires de chaque cellule de son corps ! C. elegans est illustré ci-dessous.

1. Petit ARN interférent (siARN)

siARN a été trouvé pour la première fois dans les plantes ainsi que dans C. elegans. Cependant, les siARN (et les miARN) sont courants dans de nombreux organismes supérieurs. Les siARN ont été ainsi nommés parce qu'ils interférer avec la fonction d'autres ARN étrangers à la cellule ou à l'organisme. Leur action a été baptisée ARN interférence (ARNi). Pour leur découverte des siARN, A.Z. Fire et C.C. Mello se sont partagé le prix Nobel 2006 de physiologie ou médecine. L'action de l'ARNsi ciblant l'ADN étranger est illustrée ci-dessous.

Lorsque les cellules reconnaissent des ARN double brin étrangers (par exemple, certains génomes d'ARN viraux) comme étrangers, le DÉCOUPE une nucléase appelé les hydrolyse. Les produits d'hydrolyse bicaténaire courts résultants (le siARN) combiner avec RNAi jeinduit Sencliquetage Ccomplexe, ou RISC protéines. Les antisens brin siRNA dans le résultat siRNA-RISC complexe se lie à des régions complémentaires d'ARN étrangers, les ciblant pour la dégradation. L'utilisation cellulaire de RISC pour contrôler l'expression des gènes de cette manière peut provenir de l'utilisation de protéines RISC par des miARN dans le cadre d'un mécanisme de défense cellulaire, qui sera discuté ensuite.

Des siARN conçus sur mesure ont été utilisés pour désactiver l'expression de gènes spécifiques afin d'étudier leur fonction in vivo et in vitro. Les siARN et les miARN sont à l'étude comme outils thérapeutiques possibles pour interférer avec les ARN dont l'expression conduit au cancer ou à d'autres maladies.

Pour un exemple, regardez une vidéo Youtube des résultats inattendus d'une expérience ARNi sur ce lien. Dans l'expérience décrite, l'ARNi a été utilisé pour bloquer l'expression embryonnaire de la orthodenticule (bizarre) gène qui est normalement requis pour la croissance des cornes chez un bousier. L'effet de cette mutation knock-out était, comme prévu, d'empêcher la croissance de la corne. Ce qui était inattendu cependant, c'était le développement d'un œil au milieu de la tête du scarabée («troisième œil» sur la micrographie).

Le 3ème œil ressemble non seulement à un œil, mais il est fonctionnel. Cela a été démontré en empêchant le développement normal des yeux chez les bizarre-mutants knock-out. Le 3ème œil est apparu…, et a réagi à la lumière ! Gardez à l'esprit qu'il s'agissait d'un scarabée avec un troisième œil, pas Drosophile! Pour citer Justin Kumar de l'Université de l'Indiana, qui, bien que n'étant pas impliqué dans la recherche, a déclaré que « ... les leçons tirées de Drosophile peut ne pas être aussi généralement applicable que moi ou d'autres drosophiles, aimerions le croire… La possibilité d'utiliser l'ARNi dans des systèmes modèles non traditionnels est une énorme avancée qui conduira probablement à une vision plus équilibrée du développement.

2. Micro ARN (miARN)

les miARN ciblent les indésirables endogène ARN cellulaires pour la dégradation. Ils sont transcrits à partir de gènes maintenant connus pour être largement distribués chez les eucaryotes. La voie de la transcription du pré-miARN jusqu'au traitement et à la dégradation de l'ARNm cible est illustrée à la page suivante.

Au fur et à mesure qu'ils sont transcrits, les pré-miARN se replient en une structure tige-boucle qui est perdue pendant le traitement cytoplasmique. Comme les SiARN, les miARN matures se combinent avec les protéines RISC. Les RISC Le complexe protéine-miARN cible des ARNm anciens ou devenus inutiles ou des ARNm endommagés lors de la transcription.

On estime que 250 miARN chez l'homme peuvent être suffisants pour se lier à divers ARN cibles ; seules les cibles à forte complémentarité avec un complexe protéine RISC-miARN seront dégradées.

D. ARN longs non codants

ARN longs non codants (lncRNAs) sont une autre classe d'ARN eucaryotes. Ils comprennent des transcrits d'ADN antisens, intronique, intergénique, pseudogène et rétroposon. Les rétroposons sont un type de transposon, ou élément d'ADN mobile ; les pseudogènes sont des gènes reconnaissables avec des mutations qui les rendent non fonctionnels. Alors que certains ARNnc peuvent s'avérer être des transcrits accidentels que la cellule détruit simplement, d'autres jouent un rôle dans la régulation de l'expression des gènes.

Un lncRNA récemment découvert est XistAR qui, avec le produit du gène Xist, est nécessaire pour former Corps de barre. Les corps de Barr se forment chez les femmes humaines lorsqu'un des chromosomes X des cellules somatiques est inactivé. Pour une revue des lncRNAs, voir Lee, J.T. (2012. Régulation épigénétique par les ARN longs non codants; Sciences 338, 1435-1439).

Un article encore plus récent (à lncRNAs et smORFs) résume la découverte que certains longs ARN non codants contiennent de courts cadres de lecture ouverts (smORF) qui sont en fait traduits en peptides courts de plus de 30 acides aminés ! Qui sait? Le génome humain peut en effet contenir plus de 21 000 à 25 000 gènes codant pour des protéines !

E. ARN circulaires (circRNA)

Bien que découverts il y a plus de 20 ans, les ARN circulaires (circARN) sont fabriqués dans différents types de cellules eucaryotes. Cliquez sur Circular RNAs (circRNA) pour en savoir plus sur ce résultat particulier de alternative épissage. Au début, les circARN étaient difficiles à isoler. Lorsqu'ils ont été isolés, les circRNAs contenaient des séquences exoniques « brouillées » et étaient donc considérés comme des erreurs non fonctionnelles de l'épissage des ARNm.

En fait, les circRNAs sont assez stables. Leurs niveaux peuvent monter et descendre selon des schémas suggérant qu'il s'agit de molécules fonctionnelles. Les niveaux d'un circRNA, appelé circRims1, augmentent spécifiquement pendant le développement neural. Chez la souris, d'autres circARN s'accumulent pendant la formation des synapses, influençant probablement la façon dont ces neurones se développeront et fonctionneront finalement. Ainsi, les circARN ne semblent pas être des « erreurs moléculaires ». En réalité, erreurs dans leur propre synthèse peut être corrélé à la maladie ! Les spéculations sur les fonctions des circARN incluent également des rôles dans la régulation des gènes, en particulier les gènes ou les ARNm dont ils sont eux-mêmes dérivés.

F. « L'ADN indésirable » en perspective

Il n'y a pas si longtemps, nous pensions que moins de 5 % d'un génome eucaryote était transcrit (c'est-à-dire en ARNm, ARNr et ARNt), et qu'une grande partie du génome non transcrit remplissait une fonction structurelle… ou aucune fonction du tout. Ce dernier, l'ADN indésirable marqué, comprenait des séquences intergéniques indescriptibles, des pseudogènes, des transposons « morts », de longues étendues d'ADN intronique, etc. Ainsi, l'ADN indésirable était un ADN dont nous pouvions nous passer. On pensait que les ADN indésirables étaient des coureurs accidentels dans nos génomes, des auto-stoppeurs ramassés sur la route de l'évolution.

Alors que les gènes miARN représentent une petite proportion d'un génome eucaryote, leur découverte et celle d'ARN lnc plus abondants suggèrent une quantité beaucoup plus importante d'ADN fonctionnel dans le génome. Pourrait-il y avoir en fait, rien de tel que « de l'ADN indésirable » ? Le débat sur la quantité de notre ADN génomique est une relique d'expériences évolutives passées et sans but génétique se poursuit. Lisez tout à ce sujet sur Junk DNA - pas si inutile après tout et seulement 8,2% de l'ADN humain est fonctionnel.

Peut-être devons-nous repenser ce que signifie pour l'ADN d'être « indésirable » ou d'être sans « objectif génétique ». Le maintien de plus de 90 % de notre propre ADN sans but génétique connu a sûrement un coût énergétique. Dans le même temps, tout cet ADN apporte de l'eau à une sélection future, source de la diversité nécessaire à la survie à long terme. La même sélection naturelle qui récupère les séquences d'ADN « auto-stoppeurs », comme nous l'avons vu, peut à un moment donné, les mettre au travail !

G. L'ARN Méthylome

Appelez ça un ARN épi-transcriptome si tu veux! Rappelons que les groupes méthyle dirigent le clivage des ARN ribosomiques des transcrits de pré-ARN 45S eucaryotes. Les ARNt, parmi d'autres transcrits, sont également modifiés de manière post-transcriptionnelle. Connues depuis les années 1970, ces modifications étaient considérées comme non fonctionnelles. Mais le sont-ils ?


Voir la vidéo: DNA:n ja RNA:n rakenne (Janvier 2023).