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Quelle est une méthode efficace pour mettre des bouchons en caoutchouc butyle bleu ?

Quelle est une méthode efficace pour mettre des bouchons en caoutchouc butyle bleu ?


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Ils ressemblent à ça.

Nous devons faire beaucoup d'échantillonnage de gaz et ceux-ci sont vraiment difficiles à assembler. J'ai cherché des conseils sur internet mais il n'y en a pas. Avez-vous de l'expérience avec ceux-ci? Avez-vous trouvé un bon moyen de les enfiler qui ne détruise pas les mains, les cœurs et les rêves ?


Pour clarifier, la partie difficile est de mettre les bouchons bleus dans les tubes en premier lieu. Une fois qu'ils sont bien enfoncés, nous pouvons les sertir avec notre outil de sertissage manuel. Depuis le temps que j'ai posté ceci, je trouve un (peu) plus de chance en utilisant un morceau de tissu / en mettant le bouchon et la fiole en verre entre un étau. Avec trop de pression, j'ai en fait cassé une fiole et le verre s'est brisé partout. La meilleure façon de les mettre est avec une torsion, mais cela s'accompagne généralement d'une dépense de mains meurtries après une utilisation intensive.

J'aurais aimé avoir un appareil photo sur moi, mais ils ressemblent un peu à ceci :


D'après ce que je peux dire de cette machine (https://www.youtube.com/watch?v=TwRtsAG5Oy4), les bouchons bleus sont d'abord placés sur les bouteilles, puis une version lâche des joints de col en aluminium est placée autour du haut de la capsule, qui est ensuite pressée dans la machine pour sceller le couvercle. Par conséquent, si vous utilisez de nombreuses techniques d'échantillonnage de gaz, il peut être intéressant d'investir dans l'achat d'une machine/technologie similaire pour sceller vos échantillons, ce qui serait le plus efficace à long terme .

EDIT: comme l'a souligné @ user137, il existe également des outils de sertissage manuels, que vous pouvez utiliser, qui sont considérablement moins chers, qui, comme l'a souligné @ user137, peuvent être trouvés ici


La levure a besoin de respirer

Comme les lecteurs l'ont peut-être deviné d'après les articles précédents, mes intérêts de brassage sont minimalement conventionnels. Heureusement, le podcast de Basic Brewing Radio semble s'étendre régulièrement bien au-delà du malt fermenté habituel aromatisé avec une tisane de houblon (je dois essayer de créer ma propre usine de bière au gingembre à partir de zéro un de ces jours & #8230). Il y a quelques semaines, ils ont fait un épisode couvrant une expérience sur les méthodes d'aération qui était très intéressante. Cela fait du bien à mon ego de savoir que j'ai correctement deviné comment les résultats seraient. Vous pouvez obtenir une copie de la belle description de l'expérience elle-même ici, mais voici la version simple :

Il est habituel de commencer à préparer des projets en mélangeant vos ingrédients dans une grande casserole et en les faisant bouillir. En plus des effets potentiels sur la saveur, cela sert également à stériliser ce que vous êtes sur le point de fermenter, ce qui aide à éviter que des choses ne se développent en plus de la levure (et éventuellement des bactéries) que vous y mettez intentionnellement. Malheureusement, ce aussi élimine la majeure partie de l'oxygène dans votre infusion, car les gaz ne restent pas bien dissous dans les liquides aqueux chauds. Afin de permettre à votre levure de se développer suffisamment avant de s'installer dans l'étape de "fermentation" du processus, la levure s'appuie sur l'oxygène pour fournir une puissance biologique par la respiration, ainsi qu'un peu plus d'oxygène qui est utilisé pour générer le matériau de la membrane cellulaire dans un processus séparé. Cela signifie qu'après l'ébullition, vous devez normalement aérer votre liquide d'une manière ou d'une autre une fois qu'il a refroidi.

Traditionnellement, cela se faisait en secouant ou en remuant l'infusion, ou éventuellement en la versant plusieurs fois entre deux récipients. Les humains étant des animaux fondamentalement paresseux, cependant, beaucoup de gens semblent préférer utiliser des pompes à air. Fred Johnson a décidé de comparer l'aération avec des pompes à air (avec et sans pierre à air) avec l'aération par agitation.

Je ne pense pas pouvoir expliquer les résultats sans dévoiler la punchline, alors voilà : secouer fonctionne bien mieux que les pompes à air. Je me souviens avoir lu la raison de cela il y a des années dans un livre sur l'élevage des poissons d'aquarium, la "pompe à air" est ne pas mettant en fait des quantités substantielles d'oxygène dans l'eau. La raison pour laquelle la pompe à air entraîne l'aération de l'eau est que les bulles font circuler l'eau, tirant l'eau avec moins d'oxygène du fond du réservoir vers le haut où elle peut échanger des gaz avec l'air à travers la surface de l'eau. Cela expliquerait également pourquoi l'expérience a semblé montrer que le simple fait de pomper l'eau d'essai bouillie dans le récipient semblait provoquer à lui seul une augmentation substantielle de l'oxygène dissous. Bref, plus la surface de l'eau est exposée à l'air, plus vite elle atteindra son niveau normal de saturation en oxygène.

Parce que je suis extrêmement jaloux de la capacité de Fred Johnson à mettre la main sur des pompes péristaltiques et un compteur d'oxygène dissous alors qu'en ce moment je ne peux même pas me permettre un pH-mètre (sans parler de la configuration de microscope que je veux ]), J'aime prendre quelques paragraphes pour choisir quelques points possibles dans la conception expérimentale pour me sentir mieux. Au moins une de ces lentes me donne une idée cependant…

Tout d'abord, après avoir été refroidie, l'eau bouillie dans l'expérience a été pompée dans les conteneurs pour être testée à travers des tubes en silicone. Le silicone est probablement le caoutchouc le plus perméable à l'oxygène existant[1][4], à tel point qu'il existe des dispositifs médicaux standard qui agissent comme des poumons artificiels, pompant le sang à travers des membranes en silicone dans l'air pour l'oxygéner[2 ]. Si cela fonctionne pour le sang, ce principe pourrait peut-être également être utile pour d'autres liquides. J'adore voir des expériences pour déterminer à quelle vitesse l'eau pompée à travers une longueur de tube en silicone est aérée (je ferais également l'hypothèse que mettre beaucoup de coudes dans le tube induirait des turbulences et augmenterait le taux d'oxygénation par rapport au pompage à travers un tube droit ou doux ensemble de tubes enroulés). J'aime aussi voir la même expérience faite avec des tubes en caoutchouc butyle à titre de comparaison. Le caoutchouc butyle est ce que nous avons utilisé pour les bouchons des tubes de culture anaérobie, car il a très faible perméabilité aux gaz en comparaison[3].

Je serais également curieux de savoir si le barbotage d'azote serait plus efficace pour éliminer l'oxygène de l'eau que ne le ferait l'ébullition. Cela devrait probablement être fait avec des échantillons plus petits, bien qu'au laboratoire, nous faisions barboter de l'azote dans chaque petit tube étroit de 10 ml de milieu de culture pendant environ dix minutes avant de boucher le tube avec un bouchon en caoutchouc butyle pour effectuer une culture anaérobie. . Je soupçonne qu'il serait beaucoup plus difficile de mettre à l'échelle la même méthode jusqu'à 6 gallons

Quoi qu'il en soit, voici quelque chose qui pourrait valoir la peine de jouer avec si le silicone est suffisamment perméable à cet effet : on peut mettre la main sur une longue bobine de silicone échange de gaz hypothétiquement plus rapide), puis installez un moyen de transférer votre moût / moût / quoi que ce soit directement du pot d'ébullition au fermenteur à travers le tube enroulé pour accomplir l'aération sans avoir à secouer, bouillonner ou déranger le liquide, réduisant ainsi la menace de contamination.

Un hack plus simple pourrait être d'installer une tête d'arrosage sur l'extrémité de sortie du tube de transfert. Plus simple encore, peut-être en sertissant à plat (mais en ne fermant pas entièrement) l'extrémité de sortie du tube de sorte que le liquide émergeant ressorte étalé en une feuille plate plutôt qu'en un jet. Dans tous les cas, cela devrait augmenter considérablement la quantité de surface liquide exposée à l'air à la sortie du tube et dans le fermenteur, entraînant une quantité substantielle d'aération accidentelle sans travail supplémentaire ni gadgets motorisés.

Là, ne suis-je pas un mec intelligent qui sait tout ?

[1] Zhang H, Cloud A : “Les caractéristiques de perméabilité du caoutchouc de silicone
“ IN Sampe Fall Technical Conference Global Advances in Materials and Process Engineering: 38th International Sampe Technical Conference Society for the Advancement of Material & Process Engineering 9 novembre 2006 ISBN 0938994727
(Article accessible en PDF à partir d'ici à partir de 20080910)
[2] Carlson RG, Land AJ, Ivey LW, Starek PJ, Rees JR, Subramanian VA, Twichell J,
Baxter J, Bloch JH, Lillehei CW : “Soutien cardio-pulmonaire total avec oxygénateur à membrane jetable pendant les opérations de greffe aorto-coronaire.” Poitrine. 1972 Oct62(4):424-32.
[3] Hungate RE, Smith W, Clarke RT : “Convient aux bouchons en caoutchouc butyle pour la fermeture des tubes de culture en rouleau anaérobie.” J Bacteriol. 1966 fév91(2):908-9.
[4] AZo Journal of Materials Online : “Silicone Rubber” http://www.azom.com/details.asp?ArticleID=920 (consulté en 20080910)


Chapitre seize - Un test simple pour le criblage des micro-organismes pour la production de chalcophores

Récemment, on a découvert que les méthanotrophes exsudaient un craie, c'est-à-dire un ligand métallique ayant une grande affinité et spécificité pour le cuivre. Une méthode de criblage rapide pour l'expression des craieophores a été développée en adoptant le dosage du chrome azurol S (CAS) utilisé à l'origine pour détecter la production de sidérophores dans divers groupes de bactéries et de champignons. Dans cet essai, le chlorure de fer (III) a été remplacé par du chlorure de cuivre (II). Les versions liquide et gélose du dosage Cu-CAS peuvent être utilisées pour examiner l'activité de la méthanobactine isolée ou pour cribler des organismes pour la production d'un craie. Bien que nous décrivions ici l'utilisation de ce test pour cribler les méthanotrophes pour la production de chalophores, il peut être modifié si nécessaire pour cribler également d'autres organismes pour la production de chalophores. De nombreux sidérophores peuvent également se lier au cuivre en présence de CAS. Par conséquent, ce dosage doit être effectué conjointement avec le dosage original fer-CAS pour déterminer si des résultats positifs du dosage Cu-CAS sont dus à une liaison non spécifique du cuivre par un sidérophore. Ce test peu coûteux peut également aider dans les analyses de la génétique de la synthèse des chalophores.


Les règles générales d'adhérence du caoutchouc

Identifier votre type de caoutchouc

Il existe plusieurs sortes de caoutchouc. Il peut être utile de savoir à quel type vous essayez d'adhérer afin de comprendre la flexibilité et la tenue qui seront nécessaires. Ce sont probablement les types de caoutchouc les plus courants que vous essayerez de coller :

  • Caoutchouc nitrile est un caoutchouc courant que l'on trouve souvent dans des applications telles que les tuyaux, les joints toriques, les joints, les bandes transporteuses, les gaines de câbles et les rouleaux d'impression.
  • Caoutchouc butyle est très flexible et est utilisé dans des articles tels que les garnitures, les chambres à air, les joints et les bouchons, et les sièges de soupape.
  • Caoutchouc polyuréthane est utilisé dans les moules et la modélisation.
  • Caoutchouc naturel peut être utilisé pour les fixations, les sous-tapis, les joints et les joints.
  • Caoutchouc en silicone est très résistant à la chaleur élevée, c'est donc un choix populaire pour les joints toriques, les joints, les ustensiles de cuisine, les ustensiles de cuisine, les dispositifs médicaux et les prothèses.
  • Caoutchouc EPDM peuvent être trouvés dans les tuyaux, les joints, etc.

Préparation du caoutchouc pour l'adhérence

En raison de sa variété d'utilisations, votre caoutchouc pourrait très bien avoir un démoulant, des additifs de glissement ou d'autres lubrifiants au moment où vous essayez de le coller. Ainsi, quel que soit le caoutchouc avec lequel vous travaillez, il est conseillé de le dégraisser avec un solvant avant de tenter toute adhérence.

Choisissez l'isopropanol, car l'acétone peut être trop dure pour certains types de caoutchouc. N'oubliez pas que votre caoutchouc peut contenir un plastifiant qui remontera à la surface et menacera votre adhérence à l'avenir. C'est pourquoi il est important d'essayer d'identifier votre caoutchouc et de le faire correspondre avec le meilleur adhésif pour le travail !


Un système flexible pour la culture du méthanocoque et d'autres méthanogènes utilisant du formate.

Les méthanogènes sont des micro-organismes strictement anaérobies appartenant aux Euryarchaeota. En tant que groupe vaste et diversifié, ils se distinguent par leur capacité à obtenir la majeure partie sinon la totalité de leur énergie de croissance à partir de la production de méthane ou de la méthanogenèse [1]. En général, les méthanogènes n'utilisent qu'un nombre limité de substrats pour la méthanogenèse, tels que les composés contenant un groupe méthyle du formiate C[O.sub.2] [H.sub.2] tels que les méthylamines, les sulfures de méthyle et l'acétate de méthanol et quelques faibles alcools de poids moléculaire. Ils n'utilisent pas de sucres, d'acides aminés ou la plupart des autres substrats organiques courants [2]. La plupart des méthanogènes sont des hydrogénotrophes qui utilisent [H.sub.2] comme principal donneur d'électrons pour réduire C[O.sub.2] en méthane. De nombreux méthanogènes hydrogénotrophes peuvent également utiliser le formiate comme principal donneur d'électrons [2]. Comme le montre (1), quatre molécules de formiate de sodium sont oxydées, donnant une molécule de méthane et trois molécules de C[O.sub.2].

4HCOONa + 2[H.sub.2]O [flèche droite] C[H.sub.4] + 3C[O.sub.2] + 4NaOH. (1)

Parce que pas plus d'un ATP est formé par mole de C[H.sub.4] [3], des quantités relativement importantes de formiate sont nécessaires pour une croissance même modeste. La croissance des cellules avec du formiate de sodium entraîne également une accumulation importante de NaOH, ce qui augmente le pH du milieu et inhibe la croissance. Pour les méthanocoques, le pH alcalin provoque également une lyse cellulaire et une destruction rapide [4]. En conséquence, le contrôle du pH devient une préoccupation critique lors de la culture de méthanogènes avec du formiate de sodium.

Une solution consiste à titrer la montée en pH avec de l'acide formique lors de la croissance en fermenteur [5]. Pour la croissance dans des tubes et des plaques de culture, le pH du milieu peut également être contrôlé avec un réservoir d'acide formique intégré [4]. Ce système de culture utilise un réservoir d'acide de 6 x 55 mm contenant 200 [micro]L d'acide formique pour stabiliser le pH du milieu [4]. À mesure que le pH augmente, l'absorption d'acide formique de l'espace de tête augmente également, maintenant le pH à des niveaux qui soutiennent la croissance. Bien que cette méthode permette une bonne croissance sur un milieu contenant du formiate, son exigence de dextérité manuelle l'empêche d'être utilisée en routine. L'utilisation du formiate comme substrat a également été établie dans un système chemostat. Costa et al. [6] ont utilisé du formiate pour cultiver M. maripaludis en chémostat afin d'étudier la régulation transcriptionnelle. Le formiate de sodium a été ajouté à 0,38 M, tandis que le pH a été maintenu à 6,95 par addition automatique de 10 % (v/v) [H.sub.2]S[O.sub.4] [6]. La densité cellulaire et le taux de croissance obtenus avec le formiate ou [H.sub.2]/C[O.sub.2] étaient les mêmes pendant la culture en chemostat [6-9].

Pendant la croissance de M. maripaludis avec le formiate, la formiate déshydrogénase (Fdh) est l'enzyme clé pour l'utilisation du formiate. Fdh est codé par deux ensembles de gènes, fdhA1B1 et fdhA2B2 chez M. maripaludis [10]. Lupa et al. [11] ont découvert que les mutants avec des délétions dans fdhAl se développaient mal sur le formiate seulement après un délai prolongé. En revanche, les mutants avec des délétions dans fdhA2 ont augmenté presque de la même manière que le type sauvage. Pour cette raison et d'autres preuves, il a été proposé que Fdh1 joue un rôle majeur dans l'utilisation du fomate [11].

Au cours de la dernière décennie, de nombreuses méthodologies génétiques ont été développées chez M. maripaludis. Ceux-ci incluent des marqueurs génétiques sélectionnables efficaces [12-16], de multiples vecteurs navettes plasmidiques [17], une transformation à haute efficacité [18], une mutagenèse directe de remplacement de gènes [19], des systèmes de suppression de gènes sans marqueur [20], une mutagenèse aléatoire [21], mutagenèse par transposon in vivo [22, 23], technologies des gènes rapporteurs [24, 25] et culture chimiostatique [6-9]. Ainsi, la manipulation génétique de M. maripaludis est facile et efficace, et ces approches sont devenues des outils puissants pour étudier le métabolisme et la physiologie de plusieurs espèces de Methanococcus. Cependant, l'exigence de croissance [H.sub.2] limite la capacité de ces outils génétiques à être largement appliqués dans les laboratoires qui n'ont pas de systèmes établis pour gérer le gaz [H.sub.2].

Nous rapportons ici un milieu pour cultiver l'espèce marine mésophile M. maripaludis sur du formiate en utilisant un tampon de glycylglycine comme stabilisateur de pH. Ordinairement, M. maripaludis est cultivé dans des tubes scellés en aluminium avec 5 mL de milieu sous mélange [H.sub.2]/C[O.sub.2] (4:1, v/v) à 276kPa [26]. A titre de comparaison, dans notre système de culture au formiate, la pression est réduite à 104 kPa, permettant l'utilisation de bouchons moins chers. De plus, un remplissage fréquent de gaz est évité sans sacrifier considérablement le rendement de croissance. De simples modifications de la verrerie courante permettent également une culture à l'échelle du litre en utilisant uniquement une station de gazage et une pompe à vide. De plus, le milieu solide a une efficacité de placage élevée adaptée aux expériences génétiques. Avec un ajustement mineur de la composition du milieu, la procédure convient également à la croissance de l'extrême thermophile Methanothermococcus okinawensis.

2.1. Souches, milieux et conditions de croissance. La souche S2 de Methanococcus maripaludis a été obtenue de notre collection de laboratoire (Whitman et al.) [27] et cultivée à 37[degrees]C. La souche IH1 de Methanothermococcus okinawensis a été obtenue auprès de Takai et al. et cultivé à 62[degrees]C [28].

Les cultures ont été cultivées dans un milieu [H.sub.2]/C[O.sub.2] (McNA, un milieu minimal avec 10 mM d'acétate de sodium) ou un milieu formiate (McF) réduit avec 3 mM de chlorhydrate de cysteine. Les cultures de 5 ml ont été cultivées dans des tubes scellés en aluminium de 28 ml. Pour McNA, les tubes ont été pressurisés à 276 kPa avec [H.sub.2]/C[O.sub.2] (4 : 1, v/v) et remplis avec le même gaz toutes les 24 heures après l'inoculation. Des protocoles détaillés pour la croissance sur formiate sont donnés à l'annexe A. Brièvement, le milieu McF contenait du formiate de sodium 0,4 M et était tamponné avec de la glycylglycine 0,2 M (pH = 8,0). Le milieu a d'abord été aspergé avec [N.sub.2] pour éliminer la plupart des [O.sub.2], et 3 mM de chlorure de cystéine ont ensuite été ajoutés. Les tubes ont été pressurisés à 103 kPa avec [N.sub.2]/C[O.sub.2] (4:1, v/v) avant autoclavage. Avant l'inoculation, du sulfure de sodium 3 mM a été ajouté comme source de soufre.

Les tampons testés ont été obtenus auprès de Sigma Chemical Co. et comprenaient (avec le contre-ion) Tricine/NaOH (N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine), Bicine/NaOH (N, N-bis(2-hydroxyethyl)glycine) , Tris/HCl (2-amino-2-hydroxy-méthyl-propane-1,3-diol), glycine/NaOH et glycylglycine/NaOH. Au cours de la préparation du milieu formiate, les ingrédients ont été ajoutés comme indiqué dans les annexes, et les tampons organiques ont été ajoutés à partir de solutions mères à pH 7. La concentration de NaCl a été ajustée en fonction de la quantité de formiate de sodium et de sodium dans le tampon utilisé de sorte que le résultat final la concentration en ions sodium était de 0,4 M.

Le milieu final a également été testé pour l'étalement (annexe B) ​​et la croissance de cultures de 1,5 L (annexe C).

2.2. Protocole rapide pour la préparation du milieu formate. Après avoir combiné les composants du milieu McF, la cystéine a été ajoutée et le milieu a été distribué dans des tubes de culture sur la paillasse sans précautions anaérobies (Annexe D). Sans tarder, les tubes ont été scellés avec des bouchons et des scellés en aluminium. Les tubes ont ensuite été connectés à un collecteur de gazage, et l'air a été évacué par trois cycles successifs comprenant 45 secondes de vide suivi de 15 secondes de 104 kPa [N.sub.2] : C[O.sub.2] (4 : 1, v/v). Après échange de gaz, le milieu a été autoclavé pendant 20 min avec échappement rapide.Pour le milieu de contrôle, le milieu a été distribué dans une chambre anaérobie comme décrit dans l'annexe A, et le gaz a été échangé pendant trois cycles avec [N.sub.2]/C[O.sub.2] (4:1, v /v) avant autoclavage.

3.1. Optimisation du milieu formaté et des conditions de croissance. Pour déterminer si les tampons organiques étaient inhibiteurs pour la croissance, ils ont été ajoutés au milieu pendant la croissance de M. maripaludis sur [H.sub.2]/C[O.sub.2]. Parce que le milieu était fortement tamponné avec du bicarbonate et du C[O.sub.2], les tampons n'ont pas affecté le pH initial. Dans ces conditions, la Tricine était fortement inhibitrice (Figure 1). Alors que la glycine et la Bicine ont eu peu d'effet sur le rendement cellulaire, les deux ont augmenté la phase de latence à des concentrations plus élevées (données non présentées). En revanche, le Tris et la glycylglycine n'étaient pas inhibiteurs et ont entraîné des diminutions modérées de la phase de latence, vraisemblablement en maintenant un pH optimal au début de la phase de croissance (données non présentées). Par conséquent, Tricine et Bicine ont été omis d'autres expériences.

Le tris, la glycine et la glycylglycine ont en outre été testés pour leur capacité tampon pendant la croissance avec du formiate de sodium 200 mM. En présence de tampon 100 mM, la culture a atteint une absorbance maximale d'environ 0,4-0,45 après 20 h (figure 2). Pendant les deux premiers jours d'incubation à 37[degrees]C, les trois tampons ont maintenu le pH du milieu autour de 7,2-7,6. Cependant, pendant des incubations prolongées, une diminution de l'absorbance et de la lyse cellulaire ont été observées dans des milieux tamponnés avec du Tris et de la glycine (figure 2, données non présentées). En revanche, l'absorbance des cultures supplémentées en glycylglycine est restée stable pendant six jours à 37°C (Figure 2). De plus, dans un milieu tamponné à la glycylglycine, l'absorbance de la culture n'a pas changé jusqu'à six semaines à température ambiante, et il était toujours possible de transférer les cultures mères sur du milieu frais. Des cultures en milieu McF ont également été utilisées pour préparer des stocks de congélation à -80 [degrés] C dans 30 % (v/v) de glycérol [26, 29], et ces cultures ont conservé leur viabilité pendant au moins cinq ans.

Afin de réduire le coût de préparation du milieu anaérobie, l'influence de différents types de bouchons sur la croissance a également été testée. La culture sur [H.sub.2]/C[O.sub.2] est généralement effectuée à 276 kPa dans des tubes scellés en aluminium de 28 ml. Pour cette raison, des bouchons épais en caoutchouc butyle (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ, numéro de catalogue : 2048-11800) sont couramment utilisés. Ces bouchons sont conçus pour minimiser les fuites de gaz et supporter plusieurs piqûres d'aiguille pendant la préparation du milieu, l'inoculation et l'échantillonnage. Comme alternative, les bouchons gris en caoutchouc butyle (Wheaton Science Products, numéro de catalogue : W224100-202) sont beaucoup moins chers bien que plus minces. Bien que ces bouchons ne puissent pas maintenir une pression élevée, ils pourraient convenir à la croissance sur du formiate à une pression plus basse. Comme le montre la figure 2, les cultures fermées par des bouchons Wheaton ont montré des profils de croissance et une stabilité comparables, en particulier dans un milieu supplémenté en glycylglycine. En revanche, des précipités blancs ont été observés dans les cultures supplémentées en Tris et en glycine (données non présentées). La composition du milieu ressemble à celle de l'eau de mer et contient des niveaux élevés de cations divalents. Lors de l'autoclavage, le pH de ce milieu augmente en raison de la solubilité réduite du C[O.sub.2] à haute température. Vraisemblablement, ces précipités représentent des sels de phosphate qui deviennent insolubles à pH alcalin. Les précipités ont été rarement observés après autoclavage avec les bouchons les plus épais, probablement parce qu'ils retenaient mieux le C[O.sub.2] pendant l'autoclavage.

En présence de 100 mM de glycylglycine, les rendements de croissance ont augmenté avec les concentrations de formiate de manière non linéaire et étaient maximaux à 0,6 M. La croissance a été inhibée avec du formiate de sodium 1 M, probablement en raison de la toxicité du sodium (données non présentées). A des concentrations élevées de formiate et 100 mM de glycylglycine, les cellules se sont lysées en phase stationnaire, probablement en raison de l'alcalinisation du milieu. L'augmentation de la concentration de glyclyglycine à 200 mM avec du formiate 0,4 M s'est avérée optimale pour la croissance par lots. Dans cette condition, le taux de croissance était similaire à celui du milieu [H.sub.2]/C[O.sub.2]. De plus, la DO600nm maximale de 1,0 était comparable à 1,4 dans le milieu [H.sub.2]/C[O.sub.2] (Figure 3). Ainsi, les rendements cellulaires par mole de donneur d'électrons étaient presque équivalents. Par exemple, le milieu avec 0,4 M de formiate contenait environ 2 mmol de formiate dans 5 mL, et le rendement de croissance était d'environ 340 mg de poids sec [L-1] ou 0,85 g de poids sec [mol-1] de formater. Pour des cultures de 5 mL [H.sub.2]/C[O.sub.2] avec 2,7 mmol de [H.sub.2], le rendement de croissance était d'environ 400 mg de poids sec [L.sup.-1] ou 0,74 g de poids sec [mol.sup.-1] de [H.sub.2].

Une bonne croissance a également été trouvée sur du milieu formiate contenant de la gélose à 1,0 % (p/v) dans des flacons de sérum. Des détails sur la préparation sont donnés dans l'annexe B, mais il est similaire aux protocoles décrits précédemment [30, 31]. Semblable à la croissance avec le milieu [H.sub.2]/C[O.sub.2], des colonies isolées sont apparues après 3 à 5 jours d'incubation, et l'efficacité du placage était de 100 %.

3.2. Un système de culture simple à moyenne échelle pour M. maripaludis et M. okinawensis avec formate. Le milieu formiate modifié était également utile pour la culture de M. maripaludis et M. okinawensis au litre ou à moyenne échelle pour la préparation de biomasse pour des études enzymatiques et autres. À cette fin, un système de culture simple a été développé à l'aide de verrerie et d'équipements de laboratoire courants (annexe C). Composé en grande partie d'une bouteille de culture de 2 L, d'un piège à eau et d'un piège à gaz, chaque ensemble supportait la croissance de 1,5 L de culture. Pendant la croissance, la ligne d'échappement a permis aux C[H.sub.4] et C[O.sub.2] formés de s'échapper, le piège à eau a empêché le reflux de l'eau dans la culture et le piège à gaz a empêché la rétrodiffusion de l'air dans la bouteille de culture. Un protocole a également été élaboré pour assurer une réduction complète du milieu avant l'inoculation (Annexe C). Bien que le milieu ait été aspergé avant l'inoculation, aucun gazage n'était nécessaire après l'inoculation et le système pouvait être facilement déplacé vers une hotte, un incubateur ou un autre espace bien ventilé. Avec un inoculum de 2 %, M. maripaludis S2 a atteint environ [OD.sub.600 nm] = 0,8 après 15 heures d'incubation à 37[degrés]C. Dans le même milieu, M. okinawensis IH1 a poussé jusqu'à une [OD.sub.600 nm] = 0,6 (Figure 4). Cependant, la réduction du pH de la solution stock tampon de glycylglycine à 6,5 a réduit la phase de latence de M. okinawensis à 12 h à 62[degrees]C sans réduire le rendement (données non présentées). Pour les deux cultures, le rendement cellulaire était d'environ 1 g (poids humide) par L.

3.3. Préparation rapide du milieu sans chambre anaérobie. Une chambre anaérobie est souvent utilisée pour préparer le milieu pour les méthanogènes, mais elle est coûteuse et occupe une grande quantité d'espace de laboratoire. Pour déterminer si le milieu formiate pouvait être préparé dans des laboratoires avec un équipement anaérobie limité, il a été préparé en aérobie, et le gaz a été échangé avec une pompe à vide et une conduite de gaz connectée à un simple collecteur de gazage contrôlé par une vanne à boisseau sphérique à trois voies. Le système a été construit à partir de raccords à compression standard, de sorte que sa fabrication nécessite peu d'équipement et aucune expertise particulière. Il a été conçu pour que dix tubes ou flacons de sérum puissent être préparés à la fois. Un manomètre à vide a été utilisé pour surveiller le gaz. Après avoir distribué le milieu en aérobie, des cycles de gazage/vide ont été effectués pour éliminer [O.sub.2] du milieu (annexe D). Il est intéressant de noter que la croissance dans le milieu avec même un cycle de gazage/vide était presque la même que dans le milieu préparé de manière conventionnelle (données non présentées). Les cultures de M. maripaludis sont souvent tolérantes à [O.sub.2], et la croissance des cultures en phase logarithmique n'est pas affectée par [O.sub.2] des pressions partielles < 20 kPa selon notre expérience. Par conséquent, il était possible que la grande taille de l'inoculum ait protégé les cellules des résidus [O.sub.2]. Pour examiner la pertinence de cette méthode pour les petits inoculums, une expérience du nombre le plus probable (MPN) a été réalisée dans un milieu préparé avec trois cycles d'échange gazeux (tableau 1). Les nombres les plus probables étaient de 50 et 160 dans les milieux préparés par le protocole rapide ou standard avec une chambre anaérobie, respectivement [32]. Ces nombres élevés n'étaient pas significativement différents et ne seraient possibles que si la croissance pouvait être initiée par seulement une ou deux cellules dans les deux milieux.

Ce protocole convenait également à la préparation de milieu solide et à l'étalement pour l'isolement de mutants ou d'autres cultures clonales (annexe D). Des plaques de gélose ont été formées dans des flacons de sérum comme décrit à l'annexe B. Après croissance, des colonies uniques ont été prélevées avec une aiguille de seringue et transférées dans un bouillon sous un courant de gaz [N.sub.2].

Le milieu et le système de culture des méthanogènes développés ici ont tenté de répondre à de multiples préoccupations. Premièrement, les réactifs et l'équipement doivent être accessibles à de nombreux laboratoires de recherche. Le remplacement de [H.sub.2] par du formiate comme substrat majeur pour la méthanogenèse a supprimé le besoin d'un système de manipulation de [H.sub.2], réduisant le coût et augmentant la sécurité de la culture. Le coût de la préparation du milieu peut être encore réduit en utilisant des bouchons de septum beaucoup moins chers. De plus, un simple collecteur de gazage était suffisant et une chambre anaérobie n'était pas nécessaire. Ces méthodes sont simples et ne nécessitent pas de formation approfondie. À l'Université de Géorgie, ce système de culture a été largement utilisé par les étudiants de premier cycle pour isoler et cultiver des mutants de M. maripaludis. Bien qu'une formation soit toujours nécessaire, en particulier pour l'utilisation sûre des seringues et de la verrerie sous pression, bon nombre des manipulations élaborées de la méthode Hungate [33] sont évitées. Pour de nombreuses études biologiques, il est souvent nécessaire de générer des cultures à partir de cellules individuelles ainsi que de générer de grandes quantités de biomasse. Les deux sont souvent difficiles avec des anaérobies exigeants. Le système développé ici avait une efficacité de placage élevée et il était possible de développer des cultures à partir de quelques cellules seulement. Par conséquent, il convient à l'isolement de mutants ou à d'autres expériences génétiques. De plus, il a été possible de générer suffisamment de biomasse pour les dosages enzymatiques et autres analyses biochimiques. Le tampon glycylglycine a empêché l'alcalinisation du milieu et a permis aux cultures de rester viables plusieurs semaines sur la paillasse. L'ajout de glycérol a permis le maintien de cultures viables pendant au moins cinq ans à -80[degrees]C. Néanmoins, le milieu formiate permet un taux de croissance et un rendement cellulaire similaires à ceux du milieu [H.sub.2]/C[O.sub.2]. De plus, ce milieu et ce protocole ont été adaptés par Weimar et al. [34] pour une méthode de plaque multipuits pour cribler des bibliothèques de composés chimiques [34]. M. maripaludis a été cultivé dans des plaques de microtitrage à 96 puits scellées dans un sac compact AGS AnaeroGen (Oxoid) et incubé à 37[degrees]C dans une chambre anaérobie contenant 5% [H.sub.2], 5% C[O. sub.2], et 90 % [N.sub.2] [34]. Par conséquent, ces méthodes peuvent être facilement adaptées à un certain nombre d'approches expérimentales.

A. Milieu basal pour la croissance des formiates (McF) de Methanococcus maripaludis et Methanothermococcus okinawensis

(1) Sélectionnez la verrerie appropriée.

Ce support contient 0,4 M de formiate. Pendant la croissance, les méthanogènes convertissent le formiate en gaz C[O.sub.2] et C[H.sub.4] et provoquent une augmentation de la pression. Ainsi, pour chaque litre de milieu, les cellules peuvent produire environ 10 litres de gaz. En conséquence, les cuves de culture peuvent exploser si l'espace libre n'est pas assez grand pour empêcher une accumulation de pression de gaz. Pour cette raison, nous recommandons que le volume de l'espace de tête ne soit pas inférieur à cinq fois le volume de milieu dans des récipients de culture pouvant être pressurisés jusqu'à 276 kPa. Les volumes de milieu maximum recommandés pour les tubes scellés en aluminium de 28 ml, les bouteilles de sérum de 160 ml et les bouteilles de 1 L sont respectivement de 5 ml, 20 ml et 100 ml. Lorsque vous utilisez des bouteilles de 1 L, réduisez la pression de démarrage de [N.sub.2]/C[O.sub.2] à 34 kPa (voir ci-dessous).

(2) Désoxygéner toute la verrerie et l'équipement avant utilisation dans la chambre anaérobie. Apportez des tubes ou des bouteilles de culture, des bouchons, des entonnoirs et des pipettes et tous les articles en plastique dans la chambre au moins un jour avant de préparer le milieu pour permettre à [O.sub.2] de se désorber ou de se diffuser.

(3) Pour la composition du milieu (a) voir le tableau 2.

Mélanger les ingrédients moyens et asperger avec un flux de gaz [N.sub.2] pendant 60 minutes.

(4) Ajouter 0,05 g de cystéine-HCl ou de DTT par 100 ml et poursuivre le barbotage pendant 10 minutes.

(5) Transférer le milieu dans une chambre anaérobie, distribuer le milieu dans des récipients de culture et sceller les tubes avec des bouchons en butyle gris (Wheaton Science Products, numéro de cat. : W224100-202) et sertir avec des joints en aluminium (Fisher Scientific, numéro de cat. : 11 -126-12).

(6) Après avoir retiré de la chambre anaérobie, pressuriser les tubes et les flacons de sérum à 103 kPa avec [N.sub.2]/C[O.sub.2] (4:1, v/v) et autoclaver. Le pH après autoclavage doit être d'environ 7,7-7,8. Pour les bouteilles d'un litre, pressuriser à 34 kPa [N.sub.2]/C[O.sub.2] avant l'autoclavage. Autoclave sur cycle gravitaire (échappement rapide) pendant 20 minutes. Toujours autoclaver ces bouteilles sécurisées avec des cylindres métalliques ou des paniers métalliques pour limiter les projections de verre en cas d'explosion.

(7) Avant l'inoculation, ajouter 0,1 mL de 2,5% [Na.sub.2]S x 9[H.sub.2]O (w/v) par 5mL de milieu [ajouter 2mL de 2,5% [Na.sub. .2]S x 9[H.sub.2]O (w/v) par 100 ml de milieu, si fabriqué dans une bouteille de 1 litre]. Pour les expériences de routine, ajouter le sulfure immédiatement avant l'inoculation. Pour les expériences critiques, ajouter le sulfure 8-24 h avant l'inoculation.

A.1. Modifications pour la croissance de Methanothermococcus okinawensis. Pour la culture de M. okinawensis, réduire le pH du tampon glycylglycine à 6,5 et augmenter la concentration finale de 0,2 M à 0,4 M. Les autres ingrédients du milieu restent les mêmes.

Pour la composition du milieu, voir le tableau 3.

A.2. Préparation des solutions de stock

A.2.1. Préparation d'une solution de glycylglycine (1 M, pH = 8,0). Utilisez 20 ml pour 100 ml de milieu et les étapes sont les suivantes :

(i) Dissoudre 132 g de glycylglycine (AMRESCO, numéro de catalogue : 556-50-3) avec 800 ml de dd[H.sub.2]O.

(ii) Ajuster à pH 8,0 avec environ 18 ml de NaOH (5 M).

(iii) Ajustez le volume à 1 litre. Conserver à 4[degrees]C dans une bouteille hermétiquement fermée.

A.2.2. Préparation de la solution saline générale. Utiliser 50 ml pour 100 ml de milieu (voir tableau 4).

A.2.3. Préparation de la solution mère de fer [35]. Utiliser 0,5 ml pour 100 ml de milieu.

Dans une petite bouteille à bouchon à vis, ajoutez 0,2 g de Fe[(N[H.sub.4]).sub.2] [(S[O.sub.4]).sub.2] x 6[H.sub .2]O puis ajouter 2 gouttes d'HCl concentré suivi de 100 mL d'eau distillée au verre.

A.2.4. Préparation de la solution minérale trace [27]. Utiliser 10 ml pour 1 litre de milieu (voir tableau 5).

Dissoudre l'acide nitriloacétique dans environ 800 mL de di[H.sub.2]O et ajuster le pH à 6,5 avec du KOH. Ajoutez les minéraux dans l'ordre, en permettant à chacun de se dissoudre avant d'ajouter le minéral suivant, et ajustez le pH à 7,0.

A.2.5. Préparation d'une solution de sulfure de sodium à 2,5%. Les étapes de préparation d'une solution de sulfure de sodium à 2,5 % sont les suivantes :

(i) Ajouter 100 ml de dd[H.sub.2]O dans un flacon et marquer la ligne d'eau. Pour limiter la formation d'hydrogène sulfuré volatil à partir de sulfure de sodium, ajoutez une pastille de NaOH (environ 0,1 g). Ajouter 10 ml supplémentaires de dd[H.sub.2]O dans le ballon.

(ii) Faites bouillir les 110 ml dd[H.sub.2]O tout en rinçant avec [N.sub.2] jusqu'à ce que le niveau d'eau atteigne la ligne d'eau marquée de 100 ml.

(iii) Laisser refroidir le ballon tout en rinçant avec [N.sub.2] et transférer le ballon à la station de gazage sous la hotte. Continuez à rincer avec [N.sub.2].

(iv) Pendant que le ballon refroidit, peser un peu plus de 2,5 g [Na.sub.2]S x 9[H.sub.2]O. Portez des gants et effectuez les étapes suivantes sous la hotte. Nettoyer le cristal de sulfure de sodium en rinçant brièvement le cristal avec du di[H.sub.2]O. Pour ce faire, faites tourbillonner le cristal dans un petit bécher avec un peu d'eau jusqu'à ce qu'il soit propre. Éponger sécher le cristal avec une serviette en papier. Pesez à nouveau le cristal pour vous assurer que le poids final est de 90 à 110 % du poids souhaité.

(v) Ajouter le sulfure de sodium nettoyé et pesé dans le ballon refroidi tout en rinçant avec [N.sub.2] et mélanger jusqu'à dissolution partielle.

(vi) Boucher le flacon, arrêter le rinçage et transférer dans la chambre anaérobie. Distribuer en aliquotes de 5 ml dans des tubes scellés en aluminium de 28 ml.

(vii) Retirez les tubes de la chambre et pressez avec [N.sub.2] à 103 kPa.

(viii) Autoclaver en cycle gravitaire (échappement rapide) pendant 20 minutes.

(ix) Stocker ces tubes de sulfure de sodium dans une chambre anaérobie. Ils devraient rester bons pendant un à deux mois. Jeter si un précipitant se forme.

A. 2.6. Préparation d'une solution de sulfure de sodium à 25 %. Les étapes de préparation d'une solution de sulfure de sodium à 25 % sont les suivantes :

(i) Préparez comme ci-dessus mais avec 25 g [Na.sub.2]S x 9[H.sub.2]O. Distribuer en aliquotes de 5 ml dans des tubes scellés en aluminium de 28 ml. Pour les cultures de 0,5, 1,0 et 1,5 L, utilisez respectivement 1,0, 2,0 et 3,0 ml.

(ii) Stockez ces tubes de sulfure de sodium dans une chambre anaérobie. Ils devraient rester bons pendant deux mois. Jeter si un précipitant se forme.

B. Milieu solide pour la croissance des formiates (McF) de Methanococcus maripaludis

Ce protocole prépare un milieu gélosé à 1 % dans des flacons de sérum de 70 ml pour l'ensemencement de M. maripaludis et est modifié à partir de Tumbula et al. [18].

(1) Le milieu solide est préparé avec de la gélose à 1 % (p/v), en ajoutant 10 ml de milieu dans un flacon de sérum de 70 ml. Ajouter 0,1 g de gélose dans chaque flacon de sérum individuel avant la préparation du milieu. Les autres ingrédients sont les mêmes que pour le bouillon.

(2) Transférer le milieu de bouillon (sans sulfure) et les flacons contenant de la gélose dans la chambre anaérobie, verser le milieu dans des flacons de gélose, sceller les flacons avec des bouchons en butyle gris (Wheaton Science Products, numéro de catalogue : W224100-202), et sertissage avec joints en aluminium (Fisher Scientific, n° cat. : 11-126-12).

(3) Retirez les bouteilles scellées de la chambre anaérobie, pressurisez chaque bouteille à 103 kPa avec [N.sub.2]/C[O.sub.2] (4:1, v/v) et autoclave. Autoclave sur cycle gravitaire (échappement rapide) pendant 20 minutes. Après l'autoclavage, laisser les bouteilles refroidir au toucher et ajouter du sulfure à une concentration finale de 2 mM. Mélangez doucement et laissez les bouteilles de gélose refroidir complètement sur leurs côtés pendant au moins cinq heures (la solidification pendant la nuit fonctionne mieux).

(4) Pour obtenir des colonies individuelles de M. maripaludis, effectuer une dilution en série dans un bouillon de culture à environ 100 cellules/mL. Plaquer la culture diluée et non diluée (contrôle positif) en ajoutant 0,5 ml de la suspension de culture à des bouteilles de gélose à l'aide de seringues de 1 ml. Ajouter le liquide à la surface de la gélose, avec la bouteille reposant sur le côté. Agiter doucement le flacon de gélose pour permettre à la suspension de culture de se répartir uniformément sur la surface de la gélose. Reposez la bouteille de gélose sur le côté pendant encore quatre heures pour permettre à la suspension de culture d'être complètement absorbée dans la gélose. Assurez-vous que la surface de la gélose est plate et horizontale, sinon les colonies ne se formeront que sur un côté de la gélose.

(5) Incuber les bouteilles plaquées en les tenant debout à 37[degrees]C. Par conséquent, l'eau qui se forme pendant l'incubation s'écoulera au fond de la bouteille.

(6) Les colonies apparaîtront après trois à cinq jours d'incubation.En raison du liquide qui s'accumule au fond de la bouteille, une croissance confluente se produira sur le fond de 1 cm. Évitez de secouer le flacon pendant l'incubation pour éviter l'inoculation par inadvertance de la partie supérieure de la gélose.

(7) Pour prélever des colonies individuelles dans un bouillon dans la chambre anaérobie, ajouter 2 mM de sulfure (préparation du stock de sulfure, voir Annexe A) dans des tubes de bouillon 24 heures avant utilisation. Ouvrez le bouchon de la bouteille d'agar dans la chambre anaérobie, stérilisez l'ouverture avec un élément chauffant électrique et insérez une seringue de 1 ml dans la bouteille d'agar, en touchant soigneusement le haut d'une seule colonie avec l'aiguille. Ensuite, enfoncez l'aiguille dans un tube de bouillon et rincez la seringue avec du milieu deux fois pour introduire quelques cellules dans le bouillon. La pleine croissance est souvent observée après 1-2 jours.

C. Système de culture à moyenne échelle pour M. maripaludis et M. okinawensis

Ce protocole est adapté à la croissance de cultures de 1,5 L sur milieu formiate en utilisant de la verrerie modifiée pour permettre l'évacuation du gaz produit.

C.1. Jour 1 : Préparation et dégazage du milieu

(1) En préparation de l'inoculum, un jour avant le début de la culture à moyenne échelle, inoculer 0,3 mL de culture fraîche dans un ou plusieurs flacons de sérum contenant 30 mL de milieu formiate. Incuber sans agiter à la bonne température.

(2) Distribuer 1,5 L de milieu McF dans un flacon de stockage modifié de 2 L (Figure 5).

(3) Pour arroser le milieu après l'autoclavage, insérez une seringue à filtre en verre interchangeable de 2 cc (Micro-Mate, référence : 14-825-1B) avec un connecteur Luer-à-tubulure (Sigma-Aldrich, 1/16- 3/32 in., numéro de catalogue : Z118028) dans un bouchon en caoutchouc butyle (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ, numéro de catalogue : 2048-11800). À l'extrémité de l'aiguille insérée, fixez environ 20 cm de tube fin (tube à paroi légère en PTFE Zeus, P/N : TFT22-NT, AWG 22, numéro de LOT : 623928). Insérez le bouchon dans le bras latéral de la cuve de culture. Le bouchon n'est pas scellé en place afin qu'il puisse tomber et relâcher toute pression qui pourrait se former en cas d'obstruction des lignes d'échappement.

(4) Avec le bouchon de la bouteille de 2 L attaché sans serrer, autoclavez cet ensemble avec le piège à gaz (flacon de sérum de 165 ml, scellé avec un bouchon en caoutchouc butyle bleu et serti de joints en aluminium), le tube et les seringues qui relient la bouteille de milieu , piège à gaz et piège à eau.

(5) Après l'autoclavage, laissez le milieu stérile refroidir à au moins 90[degrees]C avant d'assembler les conduites de gazage et de ventilation. Tout d'abord, commencez à barboter [N.sub.2]/C[O.sub.2] (4 : 1 v/v) à travers le milieu à un débit de

25 ml/min. En même temps, connectez la bouteille moyenne au piège à gaz et au piège à eau. Ajouter environ 300 ml d'eau dans le piège à eau. Fermez le bouchon de la bouteille de 2 L pour commencer le flux de gaz à travers le système d'échappement.

(6) Le barbotage doit changer l'espace libre de la bouteille au moins dix fois. A un débit de 25 mL/min, le milieu doit être aspergé pendant 200 min ou environ 5 L de gaz.

(7) Pendant le barbotage, ajouter du chlorhydrate de cystéine à une concentration finale de 0,5 g [L-1]. Pour préparer cette solution mère de chlorhydrate de cystéine, fixez un filtre 0,2 [micro]M stérile (Whatman[TM], référence : 6780-2502) à une seringue de 5 ml avec embout Luer-Lok (BD[TM], référence : 309646) avec le piston retiré. Ajouter 3 ml de dd[H.sub.2]O à la seringue puis ajouter 0,75 g de chlorhydrate de cystéine (Sigma, n° cat. : 52-89-1). Agiter doucement la solution pour dissoudre complètement la cystéine. Placez une aiguille (BD, 15 G x 3 1/2 in., cat. number: 511108) sur la pointe du filtre 0,2 [micro]M et injectez rapidement la solution de chlorhydrate de cystéine fraîchement préparée dans le flacon de culture de 1,5 L à travers le butée de bras latéral.

(8) Lorsque le gazage est terminé et que le milieu a refroidi à la température de croissance ou en dessous, incuber l'ensemble entier à la température de croissance, 37[degrees]C pour M. maripaludis ou 62[degrees]C pour M. okinawensis, pendant la nuit .

C.2. Jour 2 : Inoculation et incubation suivante

(1) Le lendemain matin, ajoutez du sulfure de sodium à 2 mM avec une seringue à travers le bras latéral. Il est souvent pratique d'ajouter 3 ml d'une solution stérile à 25 % (p/v) préparée comme dans l'annexe A. Continuer à incuber le milieu à la température de croissance pendant encore six heures pour permettre au milieu de se réduire complètement.

(2) Inoculer le flacon avec 30 ml de culture (environ [DO.sub.600 nm] = 0,6) à partir du jour 1. Pendant la nuit ou environ 15 h, M. maripaludis S2 peut atteindre une [DO.sub.600 nm] = 0,8 à 37[degrés]C. De même, M. okinawensis IH1 peut atteindre environ [OD.sub.600 nm] = 0,6 à 62[degrees]C.

D. Préparation rapide du milieu de formate pour la culture de Methanococcus maripaludis

Ce protocole rapide est conçu pour les laboratoires qui ont un équipement anaérobie limité. Toutes les procédures peuvent être effectuées sans utiliser une chambre anaérobie.

D.1. Préparation du milieu liquide

(1) Sur la paillasse, combiner tous les ingrédients du milieu comme décrit à l'annexe A. Ajouter le chlorhydrate de cystéine (0,05 g/100 ml) sans asperger le milieu peu de temps avant de distribuer le milieu dans des tubes.

(2) Distribuer le milieu dans des tubes scellés en aluminium en aérobie. Sceller chaque tube avec un bouchon en butyle gris (Wheaton Science Products, référence : W224100-202) et sertir avec des joints en aluminium (Fisher Scientific, référence : 11-126-12).

(3) Apportez les tubes scellés à une station de gazage comme illustré à la figure 6. Exécutez trois cycles d'échange de gaz sur chaque tube. Chaque cycle est composé de 45 s de vide suivi de 15 s de pressurisation à 103 kPa par [N.sub.2]/C[O.sub.2] (4:1, v/v) A ce stade, le milieu peut encore être rose car la résazurine n'est pas réduite. Lors de l'autoclavage, le milieu doit devenir incolore. Si vous utilisez des flacons de sérum avec des volumes plus importants, augmentez les temps de cycle. Par exemple, des flacons de sérum de 160 ml, un vide de 90 s et une pressurisation de 30 s sont suffisants pour un système avec une ligne de vide puissant.

(4) Autoclave sur cycle gravitaire (échappement rapide) pendant 20 min.

D.2. Préparation de milieu solide. Le protocole rapide prépare un milieu gélosé à 1 % dans des flacons de sérum de 70 ml.

Sur la paillasse, combiner tous les ingrédients du milieu comme décrit à l'annexe A et ajouter le chlorhydrate de cystéine (0,05 g/100 ml) sans asperger le milieu mais peu de temps avant de le distribuer dans les flacons.

(1) Le milieu solide est préparé avec de la gélose à 1 % (p/v) pour 10 mL de milieu dans un flacon de sérum de 70 mL. Ajouter 0,1 g de gélose dans chaque flacon de sérum avant la préparation du milieu.

(2) Distribuer le milieu dans des flacons de sérum contenant de la gélose en aérobie. Fermez chaque bouteille avec un bouchon en butyle gris (Wheaton Science Products, numéro de cat. : W224100-202) et sertissez avec des scellés en aluminium (Fisher Scientific, numéro de cat. : 11-126-12).

(3) Apportez la bouteille scellée à la station de gazage comme illustré à la figure 6. Exécutez trois cycles d'échange de gaz sur chaque bouteille, chaque cycle est composé de 45 s de vide suivi de 15 s de pressurisation à 103 kPa par [N.sub. 2]/C[O.sub.2] (4:1, v/v). A ce stade, le milieu peut encore être rose car la résazurine n'est pas réduite. Lors de l'autoclavage, le milieu deviendra incolore.

(4) Autoclave sur cycle gravitaire (échappement rapide) pendant 20 min. Après l'autoclavage, laissez les bouteilles refroidir au toucher, en utilisant la station de gazage pour ajouter de manière anaérobie du sulfure de sodium à une concentration finale de 2 mM (pour la préparation de la solution mère de sulfure, voir l'annexe A). Mélangez doucement, puis laissez les bouteilles de gélose refroidir complètement sur leurs côtés pendant au moins cinq heures (la solidification pendant la nuit fonctionne mieux).

D.3. Placage et cueillette des colonies sur le banc. La technique de Hungate [33] est utilisée pour effectuer des transferts anaérobies à la station de gazage. Brièvement, avant un transfert, stériliser à la flamme une canule et commencer le flux de gaz [N.sub.2]. Rincer une seringue stérile avec [N.sub.2] en insérant l'aiguille dans la canule et en pompant la seringue trois fois pour éliminer l'air. Remplissez la seringue de gaz [N.sub.2]. Après avoir stérilisé le haut du bouchon, expulsez immédiatement le [N.sub.2] de la seringue tout en poussant l'aiguille à travers le bouchon. Cette procédure élimine tout l'air qui a été introduit dans la pointe de l'aiguille.

(1) Le placage est effectué comme décrit dans les étapes 4 à 6 de l'annexe B, mais en utilisant la station de gazage pour tous les transferts anaérobies.

(2) Pour prélever des colonies individuelles dans un bouillon, utilisez la technique de Hungate [33]. À la station de gazage, retirez le bouchon en aluminium scellé par sertissage de la bouteille d'agar et flambez l'ouverture. Pour garder la bouteille de sérum [O.sub.2]-libre, introduire un flux de gaz [N.sub.2] avec une canule de gazage stérile [N.sub.2] (Figure 7(a)). Pour transférer une colonie, utilisez une seringue de 1 ml et une aiguille de 22 Ga x 1 pouce. Pliez l'aiguille à environ 45 degrés en pliant l'extrémité de l'aiguille contre le capuchon de l'aiguille. Assurez-vous que le trou sur la pointe de l'aiguille est sur le côté inférieur après le coude (Figure 7(b)). Cela facilite la collecte d'une colonie à l'intérieur de la pointe de l'aiguille. Insérez cette seringue dans la bouteille d'agar, en pompant le piston plusieurs fois pour remplir la seringue de N2. Avec le cylindre de la seringue tiré vers l'arrière d'environ 1 cm, touchez soigneusement le haut d'une seule colonie avec l'aiguille (Figure 7 (a)). Retirez la seringue de la bouteille et piquez l'aiguille dans un tube de milieu de bouillon. Rincer la seringue deux fois avec 0,2 ml de milieu pour laver les cellules de l'aiguille. La pleine croissance est souvent observée après 1-2 jours.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts.

[1] R. Hedderich et W. B. Whitman, "Physiologie et biochimie des archées productrices de méthane," Procaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria, vol. 2, 2006.

[2] Y. C. Liu et W. B. Whitman, « Diversité métabolique, phylogénétique et écologique des archées méthanogènes », Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1125, pages 171-189, 2008.

[3] R. K. Thauer, K. Jungermann et K. Decker, "Conservation de l'énergie dans les bactéries anaérobies chimiotrophes," Bacteriological Reviews, vol. 41, p. 100-180, 1977.

[4] N. L. Schauer et W. B. Whitman, "Formate croissance et contrôle du pH par les acides formique et acétique volatils dans les cultures par lots de méthanocoques," Journal of Microbiological Methods, vol. 10, pages 1-7, 1989.

[5] N. L. Schauer et J. G. Ferry, "Métabolisme du formiate dans Methanobacterium formicicum," Journal of Bacteriology, vol. 142, pages 800-807, 1980.

[6] KC Costa, SH Yoon, M. Pan, JA Burn, NS Baliga et JA Leigh, "Effets de [H.sub.2] et du formate sur le rendement de croissance et la régulation de la méthanogenèse chez Methanococcus maripaludis," Journal of Bacteriology , vol. 195, pages 1456-1462, 2013.

[7] A. K. Haydock, I. Porat, W. B. Whitman et J. A. Leigh, "Culture continue de Methanococcus maripaludis dans des conditions nutritionnelles définies," FEMS Microbiology Letters, vol. 238, p. 85-91, 2004.

[8] EL Hendrickson, AK Haydock, BC Moore, WB Whitman et JA Leigh, "Gènes fonctionnellement distincts régulés par la limitation de l'hydrogène et le taux de croissance chez les archées méthanogènes," Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique, vol. . 104, pages 8930-8934, 2007.

[9] J. A. Leigh, "Growth of methanogens under Defined Hydrogen conditions," Methods in Enzymology, vol. 494, pages 111-118, 2011.

[10] G. E. Wood, A. K. Haydock et J. A. Leigh, "Fonction et régulation des gènes formiate déshydrogénase de l'archéon méthanogène Methanococcus maripaludis," Journal of Bacteriology, vol. 185, pages 2548-2554, 2003.

[11] B. Lupa, E. L. Hendrickson, J. A. Leigh et W. B. Whitman, "Production dépendante du format [H.sub.2] par le méthanogène mésophile Methanococcus maripaludis," Microbiologie appliquée et environnementale, vol. 74, pages 6584-6590, 2008.

[12] G.S. Beckler, L.A. Hook et J.N. Reeve, "La chloramphénicol acétyltransférase ne devrait pas fournir aux méthanogènes une résistance au chloramphénicol," Applied and Environmental Microbiology, vol. 47, pages 868-869, 1984.

[13] A. Bock et O. Kandler, « sensibilité aux antibiotiques des archaebactéries », Archabactéries, vol. 8, pages 525-544, 1985.

[14] P. Gernhardt, O. Possot, M. Foglino, L. Sibold et A. Klein, "Construction d'un vecteur d'intégration à utiliser dans l'archaebactérie Methanococcus voltae et expression d'un gène de résistance eubactérien", Molecular & amp General Genetics , vol. 221, pages 273-279, 1990.

[15] W. G. Weisburg et R. S. Tanner, "Sensibilité aux aminosides des archaebactéries," FEMS Microbiology Letters, vol. 14, pages 307-310, 1982.

[16] C. A. Franke, C. M. Rice, J. H. Strauss et D. E. Hruby, "La résistance à la néomycine en tant que marqueur sélectionnable dominant pour la sélection et l'isolement des recombinants du virus de la vaccine", Biologie moléculaire et cellulaire, vol. 5, pages 1918-1924, 1985.

[17] W. L. Gardner et W. B. Whitman, "Vecteurs d'expression pour Methanococcus maripaludis: surexpression de l'acétohydroxyacide synthase et de la bêta-galactosidase," Genetics, vol. 152, pages 1439-1447, 1999.

[18] D. L. Tumbula, R. A. Makula et W. B. Whitman, "Transformation de Methanococcus maripaludis et identification d'un système de restriction de type Pst I", FEMS Microbiology Letters, vol. 121, pages 309-314, 1994.

[19] JE Kim, KH Kim, SW Lee, W. Seol, K. Shiba et S. Kim, "Un domaine associant un facteur d'élongation est inséré dans la cystéinyl-ARNt synthétase humaine par épissage alternatif," Nucleic Acids Research, vol . 28, pages 2866-2872, 2000.

[20] B. C. Moore et J. A. Leigh, "La mutagenèse sans marqueur chez Methanococcus maripaludis démontre les rôles de l'alanine déshydrogénase, de l'alanine racémase et de l'alanine perméase," Journal of Bacteriology, vol. 187, pages 972-979, 2005.

[21] J. Ladapo et WB Whitman, "Méthode d'isolement des auxotrophes dans les archaebactéries méthanogènes: rôle de la voie acétyl-CoA de la fixation autotrophe C[O.sub.2] chez Methanococcus maripaludis," Actes de la National Academy of Sciences des États-Unis d'Amérique, vol. 87, pages 5598-5602, 1990.

[22] I. Porat et W. B. Whitman, "Les auxotrophes du tryptophane ont été obtenus par des insertions aléatoires de transposons dans l'opéron tryptophane de Methanococcus maripaludis," FEMS Microbiology Letters, vol. 297, p. 250-254, 2009.

[23] F. Sarmiento, J. Mrazek et W. B. Whitman, "Analyse à l'échelle du génome de la fonction des gènes dans l'archéon méthanogène hydrogénotrophe Methanococcus maripaludis," Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique, vol. 110, pages 4726-4731, 2013.

[24] T. J. Lie et J. A. Leigh, "Réponse réglementaire de Methanococcus maripaludis à l'alanine, une source d'azote intermédiaire," Journal of Bacteriology, vol. 184, pages 5301-5306, 2002.

[25] T. J. Lie et J. A. Leigh, "Dépistage génétique des mutations régulatrices chez Methanococcus maripaludis et son utilisation dans l'identification de mutants déficients en induction du répresseur eulyarchéen NrpR," Applied and Environmental Microbiology, vol. 73, pages 6595-6600, 2007.

[26] B. F. Sarmiento, J. A. Leigh et W. B. Whitman, « Systèmes génétiques pour les méthanogènes hydrogénotrophes », Methods in Enzymology, vol. 494, pages 43-73, 2011.

[27] W. B. Whitman, J. Shieh, S. Sohn, D. S. Caras et U. Premachandran, "Isolement et caractérisation de 22 méthanocoques mésophiles," Microbiologie systématique et appliquée, vol. 7, p. 235-240, 1986.

[28] K. Takai, A. Inoue et K. Horikoshi, "Methanothermococcus okinawensis sp. nov., un archéon thermophile produisant du méthane isolé d'un système de ventilation hydrothermale en eaux profondes du Pacifique occidental," International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiologie, vol. 52, pages 1089-1095, 2002.

[29] D. Tumbula, J. Keswani, J. Shieh et W. Whitman, Maintenance des cultures mères de méthanogène dans du glycérol à -70 [degrés]C. Archaea-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, États-Unis, 1995.

[30] W. J. Jones, W. B. Whitman, R. D. Fields et R. S. Wolfe, "Growth and placage efficient of methanococci on agar media," Applied and Environmental Microbiology, vol. 46, pages 220-226, 1983.

[31] R. L. Uffen et R. S. Wolfe, "Croissance anaérobie de bactéries violettes non soufrées dans des conditions d'obscurité," Journal of Bacteriology, vol. 104, pages 462-472, 1970.

[32] J. De Man, "Tables MPN, corrigées," European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 17, pages 301-305, 1983.

[33] M. P. Bryant, "Commentaire sur la technique Hungate pour la culture de bactéries anaérobies," The American Journal of Clinical Nutrition, vol. 25, pages 1324-1328, 1972.

[34] M. Weimar, J. Cheung, D. Dey et al., "Développement de méthodes de plaques multipuits utilisant des cultures pures de méthanogènes pour identifier de nouveaux inhibiteurs pour supprimer les émissions de méthane des ruminants," Applied and Environmental Microbiology, vol. 83, article e00396-17, 2017.

[35] W. E. Balch et R. S. Wolfe, "Nouvelle approche de la culture de bactéries méthanogènes : croissance dépendante de l'acide 2-mercaptoéthanesulfonique (HS-CoM) de Methanobacterium ruminantium dans une atmosphère pressurisée", Applied and Environmental Microbiology, vol. 32, pages 781-791, 1976.

[36] JA Romesser, RS Wolfe, F. Mayer, E. Spiess et A. Walthermauruschat, "Methanogenium, un nouveau genre de bactéries méthanogènes marines, et caractérisation de methanogenium cariaci sp. nov. et Methanogenium marisnigri sp. nov., " Archives de microbiologie, vol. 121, pages 147-153, 1979.

Feng Long, Liangliang Wang, Boguslaw Lupa et William B. Whitman

Département de microbiologie, Université de Géorgie, Athènes, GA 30602-2605, États-Unis

La correspondance doit être adressée à William B. Whitman [email protected]

Reçu le 22 juin 2017 Accepté le 24 août 2017 Publié le 19 novembre 2017

Éditeur académique : William W. Metcalf

Légende : Figure 1 : Effet des tampons sélectionnés sur la croissance. M. maripaludis S2 a été cultivé dans un milieu McN ([H.sub.2]/C[O.sub.2]) avec différentes concentrations de tampons testés. L'absorbance de la culture a été déterminée après un jour.

Légende : Figure 2 : Croissance de M. maripaludis S2 avec 200 mM de formiate et 100 mM de tampons Tris, glycine et glycylglycine. Deux types de bouchons de flacon de sérum ont été utilisés. Les bouchons bleus sont des bouchons épais en caoutchouc butyle (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ, numéro de catalogue : 2048-11800, 704,82 USD/1000). Ils sont couramment utilisés pour le milieu [H.sub.2]/C[O.sub.2]. Des bouchons en caoutchouc butyle gris (Wheaton Science Products, numéro de catalogue : W224100-202, 174,2 USD/1000) ont également été testés pour leur durabilité lors de la culture de M. maripaludis.

Légende : Figure 3 : Croissance de M. maripaludis S2 dans [H.sub.2]/C[O.sub.2] ([??]) et milieu formiate ([??s ]). La taille de l'inoculum était de 5 x [10 4] cellules pour 5 ml de culture. Toutes les valeurs étaient les moyennes de cinq cultures.

Légende : Figure 4 : Croissance de M. maripaludis S2 ([??]) et M. okinawensis ([??]) dans le système d'élevage à moyenne échelle. L'inoculum était de [10 10] cellules pour 1,5 L de culture. Toutes les valeurs sont les moyennes de trois cultures.

Légende : Figure 5 : Système de culture à moyenne échelle avec bouteille de culture, barbotage et échappement. Le système de culture comprend un flacon de culture de 2 L (A), un piège à eau (B : flacon de sérum de 160 ml avec un bouchon en butyle bleu et un joint en aluminium) et un piège à gaz (C : erlenmeyer de 150 ml). La bouteille de culture est construite à partir d'une bouteille en Pyrex (numéro de cat. : 06-414-1E) avec le haut d'un tube scellé en aluminium de 28 mm fixé comme un bras latéral.Le bras latéral est scellé avec un bouchon en caoutchouc butyle bleu sans joint en aluminium (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ, numéro de catalogue : 2048-11800). Laisser le joint en aluminium permet au bouchon de se détacher et de libérer toute pression qui pourrait se former si la ligne d'échappement se bouche. La ligne de gazage (D, E et F) sert à barboter le milieu après l'autoclavage et est assemblée avec F, un cylindre de seringue à filtre en verre interchangeable de 2 cc (Micro-Mate[TM], numéro de cat. : 14-825- 1B) emballé avec du coton et scellé avec un bouchon en caoutchouc numéro 00 (Balch and Wolfe [35]), D : connecteur luer-to-tubing (Sigma-Aldrich, 1/16-3/32 in., cat. number: Z118028 ) et E : aiguille (BD, 22 G x 1 in., référence : 305155) avec un tube fin (tube à paroi légère Zeus[TM] PTFE, P/N : TFT22-NT, AWG 22) connecté. Après le barbotage, l'aiguille est retirée avant l'inoculation en laissant le tube dans la culture. Les autres composants incluent G : Tubulure Nalgene[TM] (80 tubulures PVC-FDA/USPVI, 1/8 ID x 3/16 OD x 1/32 paroi, numéro de référence Thermo Scientific : 8000-0010) H : Monoject[TM] aiguille (16 G x 1 1/2", n° cat. : 140394) et I : aiguille (BD, 15 G x 3 1/2 in., n° cat. : 511108).


Désinfectants chimiques

Dans le cadre des soins de santé, &ldquoalcool&rdquo fait référence à deux composés chimiques solubles dans l'eau&mdashéthyle et alcool isopropylique&mdash qui ont généralement des caractéristiques germicides sous-estimées 482 . La FDA n'a autorisé aucun stérilisant chimique liquide ou désinfectant de haut niveau contenant de l'alcool comme principal ingrédient actif. Ces alcools sont rapidement bactéricides plutôt que bactériostatiques contre les formes végétatives de bactéries, ils sont également tuberculocides, fongicides et virucides mais ne détruisent pas les spores bactériennes. Leur activité cidale chute fortement lorsqu'ils sont dilués en dessous de 50 % de concentration, et la concentration bactéricide optimale est de 60 % à 90 % de solutions dans l'eau (volume/volume) 483, 484 .

Mode d'action.

L'explication la plus plausible de l'action antimicrobienne de l'alcool est la dénaturation des protéines. Ce mécanisme est étayé par l'observation que l'alcool éthylique absolu, un agent déshydratant, est moins bactéricide que les mélanges d'alcool et d'eau car les protéines se dénaturent plus rapidement en présence d'eau 484, 485 . La dénaturation des protéines est également cohérente avec les observations selon lesquelles l'alcool détruit les déshydrogénases de Escherichia coli 486 , et que l'alcool éthylique augmente la phase de latence de Enterobacter aerogenes 487 et que l'effet de phase de latence pourrait être inversé en ajoutant certains acides aminés. On croyait que l'action bactériostatique était causée par l'inhibition de la production de métabolites essentiels à la division cellulaire rapide.

Activité microbicide.

L'alcool méthylique (méthanol) a l'action bactéricide la plus faible des alcools et est donc rarement utilisé dans les soins de santé 488 . L'activité bactéricide de diverses concentrations d'alcool éthylique (éthanol) a été examinée contre divers micro-organismes pendant des périodes d'exposition allant de 10 secondes à 1 heure 483 . Pseudomonas aeruginosa a été tué en 10 secondes par toutes les concentrations d'éthanol de 30 % à 100 % (v/v), et Serratia marcescens, E, coli et Salmonella typhosa ont été tués en 10 secondes par toutes les concentrations d'éthanol de 40 % à 100 %. Les organismes à Gram positif Staphylococcus aureus et Streptocoque pyogène étaient légèrement plus résistants, étant tués en 10 secondes par des concentrations d'alcool éthylique de 60 à 95 %. L'alcool isopropylique (isopropanol) était légèrement plus bactéricide que l'alcool éthylique pour E. coli et S. aureus 489 .

L'alcool éthylique, à des concentrations de 60 à 80 %, est un puissant agent virucide inactivant tous les virus lipophiles (p. ex., virus de l'herpès, de la vaccine et de la grippe) et de nombreux virus hydrophiles (p. virus de l'hépatite A (VHA) 58 ou poliovirus) 49 . L'alcool isopropylique n'est pas actif contre les entérovirus non lipidiques mais est pleinement actif contre les virus lipidiques 72 . Des études ont également démontré la capacité de l'alcool éthylique et isopropylique à inactiver le virus de l'hépatite B (VHB) 224, 225 et le virus de l'herpès 490 et l'alcool éthylique à inactiver le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) 227 , le rotavirus, l'échovirus et l'astrovirus 491 .

Dans les tests de l'effet de l'alcool éthylique contre M. tuberculose, l'éthanol à 95 % a tué les bacilles tuberculeux dans les expectorations ou la suspension aqueuse en 15 secondes 492 . En 1964, Spaulding a déclaré que les alcools étaient le germicide de choix pour l'activité tuberculocide, et ils devraient être la norme par laquelle tous les autres tuberculocides sont comparés. Par exemple, il a comparé l'activité tuberculocide de l'iodophore (450 ppm), d'un phénol substitué (3 %) et de l'isopropanol (70 %/volume) à l'aide du test de la boucle de mucine (10 6 M. tuberculose par boucle) et a déterminé que les temps de contact nécessaires pour une destruction complète étaient de 120&ndash180 minutes, 45&ndash60 minutes et 5 minutes, respectivement. Le test de la boucle de mucine est un test sévère développé pour produire de longues durées de survie. Ainsi, ces chiffres ne doivent pas être extrapolés aux temps d'exposition nécessaires lorsque ces germicides sont utilisés sur du matériel médical ou chirurgical 482 .

L'alcool éthylique (70 %) était la concentration la plus efficace pour tuer la phase tissulaire de Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis, Coccidioïdes immitis, et Histoplasma capsulatum et les phases de culture de ces trois derniers organismes aérosolisés sur diverses surfaces. La phase de culture était plus résistante à l'action de l'alcool éthylique et nécessitait environ 20 minutes pour désinfecter la surface contaminée, contre <1 minute pour la phase tissulaire 493, 494.

L'alcool isopropylique (20 %) est efficace pour tuer les kystes de Acanthamoeba culbertsoni (560) tout comme la chlorhexidine, le peroxyde d'hydrogène et le thimérosal 496 .

Les alcools ne sont pas recommandés pour stériliser le matériel médical et chirurgical principalement parce qu'ils manquent d'action sporicide et qu'ils ne peuvent pas pénétrer dans les matériaux riches en protéines. Infections postopératoires mortelles des plaies avec Clostridium se sont produits lorsque des alcools ont été utilisés pour stériliser des instruments chirurgicaux contaminés par des spores bactériennes 497 . Les alcools ont été utilisés efficacement pour désinfecter les thermomètres buccaux et rectaux 498, 499 , les téléavertisseurs d'hôpitaux 500 , les ciseaux 501 et les stéthoscopes 502 . Des alcools ont été utilisés pour désinfecter les endoscopes à fibre optique 503, 504 mais l'échec de ce désinfectant a conduit à une infection 280, 505. Les lingettes alcoolisées sont utilisées depuis des années pour désinfecter les petites surfaces telles que les bouchons en caoutchouc des flacons de médicaments à doses multiples ou des flacons de vaccins. De plus, l'alcool est occasionnellement utilisé pour désinfecter les surfaces externes de l'équipement (par exemple, les stéthoscopes, les ventilateurs, les sacs de ventilation manuelle) 506 , les mannequins de RCR 507 , les instruments à ultrasons 508 ou les zones de préparation des médicaments. Deux études ont démontré l'efficacité de l'alcool isopropylique à 70 % pour désinfecter les têtes de transducteur réutilisables dans un environnement contrôlé 509, 510 . En revanche, trois éclosions d'infections sanguines ont été décrites lorsque de l'alcool a été utilisé pour désinfecter les têtes de transducteur dans un établissement de soins intensifs 511 .

Les défauts documentés des alcools sur l'équipement sont qu'ils endommagent les montures en gomme-laque des instruments à lentilles, ont tendance à gonfler et durcir le caoutchouc et certains tubes en plastique après une utilisation prolongée et répétée, blanchir les tuiles en caoutchouc et en plastique 482 et endommager les pointes du tonomètre (par détérioration de la colle ) après l'équivalent d'une année de travail en usage courant 512 . Les biprismes du tonomètre trempés dans l'alcool pendant 4 jours ont développé des surfaces avant rugueuses qui pourraient potentiellement causer des dommages cornéens, cela semblait être causé par l'affaiblissement des substances de cimentation utilisées pour fabriquer les biprismes 513 . Une opacification cornéenne a été signalée lorsque les pointes du tonomètre ont été tamponnées avec de l'alcool juste avant la mesure de la pression intraoculaire 514 . Les alcools sont inflammables et doivent donc être stockés dans un endroit frais et bien ventilé. Ils s'évaporent également rapidement, ce qui rend difficile l'obtention d'un temps d'exposition prolongé à moins que les articles ne soient immergés.

Chlore et composés chlorés

Aperçu.

Les hypochlorites, le plus largement utilisé des désinfectants chlorés, sont disponibles sous forme liquide (par exemple, l'hypochlorite de sodium) ou solide (par exemple, l'hypochlorite de calcium). Les produits chlorés les plus répandus aux États-Unis sont des solutions aqueuses d'hypochlorite de sodium à 5,25 % et 6,15 % (voir glossaire), généralement appelées eau de Javel. Ils ont un large spectre d'activité antimicrobienne, ne laissent pas de résidus toxiques, ne sont pas affectés par la dureté de l'eau, sont peu coûteux et à action rapide 328 , éliminent les organismes séchés ou fixés et les biofilms des surfaces 465 , et ont une faible incidence de toxicité grave 515-517 . L'hypochlorite de sodium à la concentration utilisée dans l'eau de Javel domestique (5,25 à 6,15 %) peut provoquer une irritation oculaire ou des brûlures oropharyngées, œsophagiennes et gastriques 318, 518-522 . D'autres inconvénients des hypochlorites comprennent la corrosivité des métaux à des concentrations élevées (>500 ppm), l'inactivation par la matière organique, la décoloration ou le &ldquoblanchiment&rdquo des tissus, la libération de chlore gazeux toxique lorsqu'il est mélangé avec de l'ammoniac ou de l'acide (par exemple, des agents de nettoyage ménagers) 523-525, et stabilité relative 327 . L'activité microbicide du chlore est largement attribuée à l'acide hypochloreux non dissocié (HOCl). La dissociation du HOCI en la forme la moins microbicide (ion hypochlorite OCl ‑) dépend du pH. L'efficacité désinfectante du chlore diminue avec une augmentation du pH qui correspond à la conversion du HOCI non dissocié en OCl ‑ 329, 526 . Un danger potentiel est la production de l'éther bis(chlorométhylique) cancérigène lorsque les solutions d'hypochlorite entrent en contact avec le formaldéhyde 527 et la production du trihalométhane cancérigène animal lorsque l'eau chaude est hyperchlorée 528 . Après avoir examiné le devenir dans l'environnement et les données écologiques, l'EPA a déterminé que les utilisations actuellement enregistrées des hypochlorites n'entraîneront pas d'effets nocifs déraisonnables sur l'environnement 529 .

Les composés alternatifs qui libèrent du chlore et qui sont utilisés dans les établissements de soins de santé comprennent le dioxyde de chlore à la demande, le dichloroisocyanurate de sodium et la chloramine-T. L'avantage de ces composés par rapport aux hypochlorites est qu'ils retiennent le chlore plus longtemps et exercent ainsi un effet bactéricide plus prolongé. Les comprimés de dichloroisocyanurate de sodium sont stables et, pour deux raisons, l'activité microbicide des solutions préparées à partir de comprimés de dichloroisocyanurate de sodium peut être supérieure à celle des solutions d'hypochlorite de sodium contenant le même chlore total disponible. Tout d'abord, avec le dichloroisocyanurate de sodium, seulement 50 % du chlore total disponible est libre (HOCl et OCl &ndash ), tandis que le reste est combiné (monochloroisocyanurate ou dichloroisocyanurate), et que le chlore libre disponible est utilisé, ce dernier est libéré pour restaurer la équilibre. Deuxièmement, les solutions de dichloroisocyanurate de sodium sont acides, tandis que les solutions d'hypochlorite de sodium sont alcalines, et on pense que le type de chlore le plus microbicide (HOCl) prédomine 530-533 . Les désinfectants à base de dioxyde de chlore sont préparés frais selon les besoins en mélangeant les deux composants (solution de base [acide citrique avec conservateurs et inhibiteurs de corrosion] et la solution d'activateur [chlorite de sodium]). Des tests de suspension in vitro ont montré que des solutions contenant environ 140 ppm de dioxyde de chlore atteignaient un facteur de réduction supérieur à 10 6 de S. aureus en 1 minute et de Bacillus atropheus spores en 2,5 minutes en présence de 3 g/L d'albumine bovine. Le potentiel d'endommager l'équipement doit être pris en compte car une utilisation à long terme peut endommager le revêtement plastique extérieur du tube d'insertion 534 . Dans une autre étude, des solutions de dioxyde de chlore à 600 ppm ou 30 ppm ont tué Mycobacterium avium-intracellulare dans les 60 secondes suivant le contact, mais la contamination par des matières organiques a affecté de manière significative les propriétés microbicides 535 .

L'activité microbicide d'un nouveau désinfectant, "l'eau superoxydée", a été examinée. l'environnement. Les principaux produits de cette eau sont l'acide hypochloreux (par exemple, à une concentration d'environ 144 mg/L) et le chlore. Comme pour tout germicide, l'activité antimicrobienne de l'eau superoxydée est fortement affectée par la concentration de l'ingrédient actif (chlore libre disponible) 536 . Un fabricant génère le désinfectant au point d'utilisation en faisant passer une solution saline sur des électrodes en titane revêtues à 9 ampères. Le produit généré a un pH de 5,0&ndash6,5 et un potentiel d'oxydoréduction (redox) de >950 mV. Bien que l'eau superoxydée soit destinée à être produite fraîche au point d'utilisation, lorsqu'elle est testée dans des conditions de propreté, le désinfectant s'est révélé efficace en 5 minutes à l'âge de 48 heures 537 . Malheureusement, l'équipement requis pour produire le produit peut être coûteux car des paramètres tels que le pH, le courant et le potentiel redox doivent être étroitement surveillés. La solution est non toxique pour les tissus biologiques. Bien que le fabricant britannique affirme que la solution est non corrosive et non dommageable pour les endoscopes et l'équipement de traitement, un fabricant d'endoscopes flexibles (Olympus Key-Med, Royaume-Uni) a annulé la garantie sur les endoscopes si de l'eau superoxydée est utilisée pour les désinfecter 538 . Comme pour toute formulation germicide, l'utilisateur doit vérifier auprès du fabricant de l'appareil la compatibilité avec le germicide. Des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si cette solution pourrait être utilisée comme alternative à d'autres désinfectants ou antiseptiques pour le lavage des mains, l'antisepsie de la peau, le nettoyage des chambres ou la désinfection du matériel (par exemple, endoscopes, dialyseurs) 400, 539, 540 . En octobre 2002, la FDA a autorisé l'eau superoxydée comme désinfectant de haut niveau (FDA, communication personnelle, 18 septembre 2002).

Mode d'action.

Le mécanisme exact par lequel le chlore libre détruit les micro-organismes n'a pas été élucidé. L'inactivation par le chlore peut résulter d'un certain nombre de facteurs : oxydation des enzymes sulfhydryles et des acides aminés chloration du cycle des acides aminés perte du contenu intracellulaire diminution de l'absorption des nutriments inhibition de la synthèse des protéines diminution de l'absorption d'oxygène oxydation des composants respiratoires diminution de la production d'adénosine triphosphate ruptures dans l'ADN et synthèse d'ADN déprimée 329, 347 . Le mécanisme microbicide réel du chlore pourrait impliquer une combinaison de ces facteurs ou l'effet du chlore sur des sites critiques 347 .

Activité microbicide.

Faibles concentrations de chlore libre disponible (par exemple, HOCl, OCl et ndash et chlore élémentaire-Cl2) ont un effet biocide sur les mycoplasmes (25 ppm) et les bactéries végétatives (<5 ppm) en quelques secondes en l'absence de charge organique 329, 418 . Des concentrations plus élevées (1 000 ppm) de chlore sont nécessaires pour tuer M. tuberculose en utilisant le test tuberculocide de l'Association of Official Analytical Chemists (AOAC) 73 . Une concentration de 100 ppm tuera &ge99.9% de B. atrophaeus spores en 5 minutes 541, 542 et détruisent les agents mycotiques en <1 heure 329 . L'eau de Javel acidifiée et l'eau de Javel ordinaire (5 000 ppm de chlore) peuvent inactiver 10 6 Clostridium difficile spores en &le10 minutes 262 . Une étude a rapporté que 25 virus différents ont été inactivés en 10 minutes avec 200 ppm de chlore disponible 72 . Plusieurs études ont démontré l'efficacité de l'hypochlorite de sodium dilué et d'autres désinfectants pour inactiver le VIH 61 . Le chlore (500 ppm) a montré une inhibition de Candidose après 30 secondes d'exposition 54 . Dans des expériences utilisant la méthode de dilution d'utilisation AOAC, 100 ppm de chlore libre ont tué 10 6 &ndash10 7 S. aureus, Salmonella choleraesuis, et P. aeruginosa en <10 minutes 327 . Étant donné que l'eau de Javel domestique contient 5,25 % et 6,15 % d'hypochlorite de sodium, ou 52 500 et 61 500 ppm de chlore disponible, une dilution de 1:1000 fournit environ 53 et 62 ppm de chlore disponible, et une dilution de 1:10 d'eau de Javel domestique fournit environ 5 250 et 6 150 ppm.

Des données sont disponibles pour le dioxyde de chlore qui appuient les allégations des fabricants sur les étiquettes bactéricides, fongicides, sporicides, tuberculocides et virucides 543-546. Un générateur de dioxyde de chlore s'est avéré efficace pour décontaminer les endoscopes flexibles 534 mais il n'est actuellement pas autorisé par la FDA à être utilisé comme désinfectant de haut niveau 85 . Le dioxyde de chlore peut être produit en mélangeant des solutions, telles qu'une solution de chlore avec une solution de chlorite de sodium 329 . En 1986, un produit à base de dioxyde de chlore a été volontairement retiré du marché lorsque son utilisation a provoqué une fuite des membranes du dialyseur à base de cellulose, ce qui a permis aux bactéries de migrer du côté fluide de dialyse du dialyseur vers le côté sang 547 .

Le dichloroisocyanurate de sodium à 2 500 ppm de chlore actif est efficace contre les bactéries en présence de jusqu'à 20 % de plasma, contre 10 % de plasma pour l'hypochlorite de sodium à 2 500 ppm 548 .

&ldquoL'eau superoxydée&rdquo a été testée contre les bactéries, les mycobactéries, les virus, les champignons et les spores 537, 539, 549 . L'eau superoxydée fraîchement générée est rapidement efficace (<2 minutes) pour atteindre un 5 log10 réduction des micro-organismes pathogènes (c. M. tuberculose, M. chelonae, poliovirus, VIH, multirésistant S. aureus, E. coli, Candida albicans, Enterococcus faecalis, P. aeruginosa) en l'absence de charge organique. Cependant, l'activité biocide de ce désinfectant a diminué considérablement en présence de matière organique (par exemple, 5% de sérum de cheval) 537, 549, 550. Aucune bactérie ni aucun virus n'ont été détectés sur des endoscopes contaminés artificiellement après une exposition de 5 minutes à de l'eau suroxydée 551 et l'ADN-VHB n'a été détecté dans aucun endoscope contaminé expérimentalement avec des sérums mixtes positifs pour le VHB après un temps d'exposition au désinfectant de 7 minutes 552 .

Les hypochlorites sont largement utilisés dans les établissements de santé dans divers contextes. 328 La solution de chlore inorganique est utilisée pour désinfecter les têtes de tonomètre 188 et pour la désinfection localisée des plans de travail et des sols. Une dilution 1:10&ndash1:100 d'hypochlorite de sodium à 5,25 % et 6,15 % d'hypochlorite de sodium (c. Pour les petits déversements de sang (c'est-à-dire des gouttes de sang) sur des surfaces non critiques, la zone peut être désinfectée avec une dilution 1:100 d'hypochlorite de sodium de 5,25 % à 6,15 % ou un désinfectant tuberculocide enregistré par l'EPA.Étant donné que les hypochlorites et autres germicides sont sensiblement inactivés en présence de sang 63, 548, 555, 556 , les déversements importants de sang nécessitent que la surface soit nettoyée avant un désinfectant enregistré par l'EPA ou une solution 1:10 (concentration finale) d'eau de Javel domestique est appliqué 557 . Si une blessure par objets tranchants est possible, la surface doit d'abord être décontaminée 69, 318 , puis nettoyée et désinfectée (concentration finale 1:10) 63 . Des précautions extrêmes doivent toujours être prises pour éviter les blessures percutanées. Au moins 500 ppm de chlore disponible pendant 10 minutes sont recommandés pour la décontamination des mannequins de formation à la RCP 558 . L'eau de Javel à pleine puissance a été recommandée pour l'auto-désinfection des aiguilles et des seringues utilisées pour l'injection de drogues illicites lorsque les programmes d'échange d'aiguilles ne sont pas disponibles. La différence dans les concentrations recommandées d'eau de Javel reflète la difficulté de nettoyer l'intérieur des aiguilles et des seringues et l'utilisation d'aiguilles et de seringues pour l'injection parentérale 559 . Les cliniciens ne devraient pas modifier leur utilisation du chlore sur les surfaces environnementales sur la base de méthodologies de test qui ne simulent pas les pratiques de désinfection réelles 560, 561 . D'autres utilisations dans les soins de santé incluent comme agent d'irrigation dans le traitement endodontique 562 et comme désinfectant pour les mannequins, le linge, les appareils dentaires, les réservoirs d'hydrothérapie 23, 41, les déchets médicaux réglementés avant élimination 328 et le système de distribution d'eau dans les centres d'hémodialyse et les machines d'hémodialyse 563 .

Le chlore a longtemps été utilisé comme désinfectant dans le traitement de l'eau. Hyperchloration d'un Legionella-la contamination du réseau d'eau de l'hôpital 23 a entraîné une diminution spectaculaire (de 30 % à 1,5 %) de l'isolement des L. pneumophila des points d'eau et un arrêt de la maladie du légionnaire associée aux soins dans une unité touchée 528, 564 . La désinfection de l'eau à la monochloramine par les stations d'épuration municipales a considérablement réduit le risque de maladie du légionnaire associée aux soins de santé 565, 566 . Le dioxyde de chlore a également été utilisé pour contrôler Legionella dans l'approvisionnement en eau d'un hôpital. 567 La chloramine T 568 et les hypochlorites 41 ont été utilisés pour désinfecter le matériel d'hydrothérapie.

Les solutions d'hypochlorite dans l'eau du robinet à un pH >8 stockées à température ambiante (23°C) dans des récipients en plastique opaques fermés peuvent perdre jusqu'à 40%&ndash50% de leur niveau de chlore libre disponible sur 1 mois. Ainsi, si un utilisateur souhaite avoir une solution contenant 500 ppm de chlore disponible au jour 30, il doit préparer une solution contenant 1 000 ppm de chlore au temps 0. La solution d'hypochlorite de sodium ne se décompose pas après 30 jours lorsqu'elle est stockée dans un endroit fermé. bouteille brune 327 .

L'utilisation de poudres, composées d'un mélange d'agent libérant du chlore avec une résine hautement absorbante, pour désinfecter les déversements de fluides corporels a été évaluée par des tests de laboratoire et des essais en salle d'hôpital. L'inclusion de particules de résine acrylique dans les formulations augmente considérablement le volume de fluide qui peut être absorbé car la résine peut absorber 200 à 300 fois son propre poids de fluide, selon la consistance du fluide. Lorsque des formulations expérimentales contenant 1 %, 5 % et 10 % de chlore disponible ont été évaluées par un test de surface standardisé, celles contenant 10 % ont démontré une activité bactéricide. Un problème avec les granules libérant du chlore est qu'ils peuvent générer des vapeurs de chlore lorsqu'ils sont appliqués à l'urine 569 .

Formaldéhyde

Aperçu.

Le formaldéhyde est utilisé comme désinfectant et stérilisant à la fois dans ses états liquide et gazeux. Le formaldéhyde liquide sera examiné brièvement dans cette section, et la forme gazeuse est examinée ailleurs 570 . Le formaldéhyde est vendu et utilisé principalement sous forme de solution à base d'eau appelée formol, qui contient 37 % de formaldéhyde en poids. La solution aqueuse est un bactéricide, un tuberculocide, un fongicide, un virucide et un sporicide 72, 82, 571-573 . L'OSHA a indiqué que le formaldéhyde devrait être manipulé sur le lieu de travail en tant que cancérogène potentiel et a établi une norme d'exposition des employés pour le formaldéhyde qui limite une concentration d'exposition moyenne pondérée sur 8 heures de 0,75 ppm 574 575 . La norme comprend une deuxième limite d'exposition admissible sous la forme d'une limite d'exposition à court terme (STEL) de 2 ppm qui est l'exposition maximale autorisée pendant une période de 15 minutes 576 . L'ingestion de formaldéhyde peut être mortelle, et une exposition à long terme à de faibles niveaux dans l'air ou sur la peau peut provoquer des problèmes respiratoires de type asthme et une irritation de la peau, comme une dermatite et des démangeaisons. Pour ces raisons, les employés devraient avoir un contact direct limité avec le formaldéhyde, et ces considérations limitent son rôle dans les processus de stérilisation et de désinfection. Les principales dispositions de la norme OSHA qui protègent les travailleurs contre l'exposition au formaldéhyde figurent au titre 29 de la partie 1910.1048 du Code of Federal Regulations (CFR) (et des réglementations équivalentes dans les États dotés de plans d'État approuvés par l'OSHA) 577 .

Mode d'action.

Le formaldéhyde inactive les microorganismes en alkylant les groupes amino et sulfhydrique des protéines et les atomes d'azote du cycle des bases puriques 376 .

Activité microbicide.

Des concentrations variables de solutions aqueuses de formaldéhyde détruisent un large éventail de micro-organismes. L'inactivation du poliovirus en 10 minutes nécessitait une concentration de 8% de formol, mais tous les autres virus testés ont été inactivés avec 2% de formol 72 . Quatre pour cent de formaldéhyde est un agent tuberculocide, inactivant 10 4 M. tuberculose en 2 minutes 82 , et 2,5% de formaldéhyde inactivé environ 10 7 Salmonelle Typhi en 10 minutes en présence de matière organique 572 . L'action sporicide du formaldéhyde était plus lente que celle du glutaraldéhyde dans des tests comparatifs avec 4 % de formaldéhyde aqueux et 2 % de glutaraldéhyde contre les spores de B. anthracis 82 . La solution de formaldéhyde a nécessité 2 heures de contact pour atteindre un facteur d'inactivation de 10 4 , alors que le glutaraldéhyde n'a nécessité que 15 minutes.

Bien que le formaldéhyde-alcool soit un stérilisant chimique et que le formaldéhyde soit un désinfectant de haut niveau, les utilisations du formaldéhyde dans les soins de santé sont limitées par ses vapeurs irritantes et son odeur piquante même à de très faibles niveaux (<1 ppm). Pour ces raisons et d'autres, telles que son rôle de cancérogène présumé pour l'homme lié au cancer du nez et au cancer du poumon 578 , ce germicide est exclu du tableau 1. Lorsqu'il est utilisé, l'exposition directe des employés est généralement limitée, cependant, des expositions excessives au formaldéhyde ont ont été documentés pour les employés des unités de transplantation rénale 574, 579 et les étudiants d'un laboratoire d'anatomie macroscopique 580 . Le formaldéhyde est utilisé dans le cadre des soins de santé pour préparer des vaccins viraux (par exemple, le poliovirus et la grippe) en tant qu'agent d'embaumement et pour préserver les spécimens anatomiques. Une enquête de 1997 a révélé que le formaldéhyde était utilisé pour le retraitement des hémodialyseurs par 34 % des centres d'hémodialyse aux États-Unis et une diminution de 60 % par rapport à 1983 249 581. En cas d'utilisation à température ambiante, une concentration de 4 % avec une exposition minimale de 24 heures est nécessaire pour désinfecter les hémodialyseurs jetables réutilisés sur le même patient 582, 583 . Des solutions aqueuses de formaldéhyde (1%&ndash2%) ont également été utilisées pour désinfecter les voies de fluide internes des machines de dialyse 583 . Pour minimiser un risque potentiel pour la santé des patients dialysés, l'équipement de dialyse doit être soigneusement rincé et testé pour le formaldéhyde résiduel avant utilisation.

Le paraformaldéhyde, un polymère solide de formaldéhyde, peut être vaporisé par la chaleur pour la décontamination gazeuse des enceintes de sécurité biologique à flux laminaire lorsque des travaux de maintenance ou des changements de filtre nécessitent l'accès à la partie scellée de l'enceinte.

Glutaraldéhyde

Aperçu.

Le glutaraldéhyde est un dialdéhyde saturé largement accepté comme désinfectant de haut niveau et stérilisant chimique 107 . Les solutions aqueuses de glutaraldéhyde sont acides et généralement dans cet état ne sont pas sporicides. Ce n'est que lorsque la solution est &ldquoactivée&rdquo (rendue alcaline) par l'utilisation d'agents alcalinisants à pH 7,5&ndash8,5 que la solution devient sporicide. Une fois activées, ces solutions ont une durée de conservation d'au moins 14 jours en raison de la polymérisation des molécules de glutaraldéhyde à des niveaux de pH alcalins. Cette polymérisation bloque les sites actifs (groupes aldéhydes) des molécules de glutaraldéhyde qui sont responsables de son activité biocide.

De nouvelles formulations de glutaraldéhyde (p. ex., glutaraldéhyde-phénol-phénate de sodium, glutaraldéhyde acide potentialisé, glutaraldéhyde alcalin stabilisé) produites au cours des 30 dernières années ont surmonté le problème de la perte rapide d'activité (p. ex., durée d'utilisation de 28 à 30 jours) tout en maintenant généralement une excellente activité 584-588 . Cependant, l'activité antimicrobienne dépend non seulement de l'âge mais aussi des conditions d'utilisation, telles que la dilution et le stress organique. La littérature des fabricants pour ces préparations suggère que les glutaraldéhydes neutres ou alcalins possèdent des propriétés microbicides et anticorrosion supérieures à celles des glutaraldéhydes acides, et quelques rapports publiés corroborent ces revendications 542, 589, 590. Cependant, deux études n'ont trouvé aucune différence dans l'activité microbicide des glutaraldéhydes alcalins et acides 73, 591 . L'utilisation de solutions à base de glutaraldéhyde dans les établissements de santé est répandue en raison de leurs avantages, notamment d'excellentes propriétés biocides, une activité en présence de matière organique (20% de sérum bovin) et une action non corrosive sur les équipements endoscopiques, les thermomètres, le caoutchouc ou les équipements en plastique (Tableaux 4 et 5).

Mode d'action.

L'activité biocide du glutaraldéhyde résulte de son alkylation des groupes sulfhydryle, hydroxyle, carboxyle et amino des micro-organismes, ce qui altère la synthèse de l'ARN, de l'ADN et des protéines. Le mécanisme d'action des glutaraldéhydes est examiné en détail ailleurs 592, 593 .

Activité microbicide.

L'inactivation in vitro des micro-organismes par les glutaraldéhydes a été largement étudiée et examinée 592, 593 . Plusieurs chercheurs ont montré que des solutions aqueuses à 2 % de glutaraldéhyde, tamponnées à un pH de 7,5 et 8,5 avec du bicarbonate de sodium, tuaient efficacement les bactéries végétatives en moins de 2 minutes. M. tuberculose, champignons et virus en <10 minutes et spores de Bacille et Clostridium espèces en 3 heures 542, 592-597 . Spores de C. difficile sont tués plus rapidement par le glutaraldéhyde à 2 % que les spores d'autres espèces de Clostridium et Bacille 79, 265, 266 . Des micro-organismes présentant une résistance importante au glutaraldéhyde ont été signalés, notamment certaines mycobactéries (M. chelonae, Mycobacterium avium-intracellulare, M. xenopi) 598-601 , Methylobacterium mesophilicum 602 , Trichosporon, ascospores fongiques (p. Microascus cinereus, Cheatomium globosum), et Cryptosporidium 271, 603 . M. chelonae persistaient dans une solution de glutaraldéhyde à 0,2 % utilisée pour stocker des prothèses valvulaires cardiaques porcines 604 .

Solution alcaline de glutaraldéhyde à deux pour cent inactivée 10 5 M. tuberculose cellules à la surface des pénicylindres dans les 5 minutes à 18°C ​​589 . Cependant, des études ultérieures 82 ont remis en question les prouesses mycobactéricides des glutaraldéhydes. Le glutaraldéhyde alcalin à deux pour cent a une action lente (20 à >30 minutes) contre M. tuberculose et se compare défavorablement aux alcools, aux formaldéhydes, à l'iode et au phénol 82 . Suspensions de M. avium, M. intracellulare, et M. gordonae étaient plus résistants à l'inactivation par un glutaraldéhyde alcalin à 2 % (temps estimé pour terminer l'inactivation :

60 minutes) que d'être virulent M. tuberculose (temps estimé pour terminer l'inactivation

25 minutes) 605 . Le taux de destruction était directement proportionnel à la température, et une suspension standardisée de M. tuberculose n'a pas pu être stérilisé dans les 10 minutes 84 . Un stérilisant chimique approuvé par la FDA contenant 2,5 % de glutaraldéhyde utilise une température accrue (35 °C) pour réduire le temps nécessaire pour obtenir une désinfection de haut niveau (5 minutes) 85, 606, mais son utilisation est limitée aux retraiteurs d'endoscopes automatiques équipés d'un élément chauffant. Dans une autre étude utilisant des filtres à membrane pour la mesure de l'activité mycobactéricide du glutaraldéhyde alcalin à 2 %, une inactivation complète a été obtenue en 20 minutes à 20°C lorsque l'inoculum d'essai était de 10 6 M. tuberculose par membrane 81 . Plusieurs chercheurs 55, 57, 73, 76, 80, 81, 84, 605 ont démontré que les solutions de glutaraldéhyde inactivent 2,4 à >5,0 log10 de M. tuberculose en 10 minutes (y compris multirésistants M. tuberculose) et le journal 4.0&ndash6.410 de M. tuberculose Dans 20 Minutes. Sur la base de ces données et d'autres études, 20 minutes à température ambiante sont considérées comme le temps d'exposition minimum nécessaire pour tuer de manière fiable Mycobactéries et d'autres bactéries végétatives avec &ge2% de glutaraldéhyde 17, 19, 27, 57, 83, 94, 108, 111, 117-121, 607 .

Le glutaraldéhyde est généralement dilué pendant l'utilisation, et des études ont montré une baisse de la concentration de glutaraldéhyde après quelques jours d'utilisation dans un laveur d'endoscope automatique 608, 609 . Le déclin se produit parce que les instruments ne sont pas complètement séchés et que l'eau est transportée avec l'instrument, ce qui augmente le volume de la solution et dilue sa concentration effective 610 . Cela souligne la nécessité de s'assurer que l'équipement semi-critique est désinfecté avec une concentration acceptable de glutaraldéhyde. Les données suggèrent que 1,0% & ndash 1,5% de glutaraldéhyde est la concentration minimale efficace pour les solutions >2% de glutaraldéhyde lorsqu'elles sont utilisées comme désinfectant de haut niveau 76, 589, 590, 609 . Des bandelettes de test chimiques ou des moniteurs chimiques liquides 610, 611 sont disponibles pour déterminer si une concentration efficace de glutaraldéhyde est présente malgré une utilisation et une dilution répétées. La fréquence des tests doit être basée sur la fréquence d'utilisation des solutions (p. utiliser la vie au-delà de la date d'expiration. Les données suggèrent que les produits chimiques contenus dans la bandelette de test se détériorent avec le temps 612 et qu'une date de péremption du fabricant doit être indiquée sur les bouteilles. Le flacon de bandelettes réactives doit être daté lorsqu'il est ouvert et utilisé pendant la période de temps indiquée sur le flacon (par exemple, 120 jours). Les résultats de la surveillance des bandelettes réactives doivent être documentés. Les kits de test de glutaraldéhyde ont été évalués au préalable pour la précision et la plage 612 mais la fiabilité a été mise en doute 613 . Pour garantir la présence d'une concentration efficace minimale du désinfectant de haut niveau, les fabricants de certaines bandelettes de test chimiques recommandent l'utilisation de procédures de contrôle de la qualité pour s'assurer que les bandelettes fonctionnent correctement. Si le fabricant de la bandelette de test chimique recommande une procédure de contrôle qualité, les utilisateurs doivent se conformer aux recommandations du fabricant. La concentration doit être considérée comme inacceptable ou dangereuse lorsque le test indique une dilution inférieure à la concentration efficace minimale (MEC) du produit (généralement à &le1,0%&ndash1,5% de glutaraldéhyde) par l'indicateur ne changeant pas de couleur.

Un produit à 2,0% de glutaraldéhyde&ndash7,05 % de phénol&ndash1,20 % de phénate de sodium qui contenait 0,125 % de glutaraldéhyde&ndash0,44 % de phénol&ndash0,075 % de phénate de sodium lorsqu'il est dilué à 1:16 n'est pas recommandé comme désinfectant de haut niveau car il manque d'activité bactéricide en présence de matière organique et manque d'activité tuberculocide, fongicide, virucide et sporicide 49, 55, 56, 71, 73-79, 614 . En décembre 1991, l'EPA a émis un ordre d'arrêter la vente de tous les lots de ce produit en raison des données d'efficacité montrant que le produit n'est pas efficace contre les spores et peut-être d'autres micro-organismes ou objets inanimés comme indiqué sur l'étiquette 615 . La FDA a autorisé un concentré de glutaraldéhyde et de phénol/phénate en tant que désinfectant de haut niveau qui contient 1,12 % de glutaraldéhyde avec 1,93 % de phénol/phénate à sa concentration d'utilisation. D'autres stérilisants au glutaraldéhyde approuvés par la FDA et contenant 2,4 % et 3,4 % de glutaraldéhyde sont utilisés non dilués 606 .

Le glutaraldéhyde est utilisé le plus souvent comme désinfectant de haut niveau pour les équipements médicaux tels que les endoscopes 69, 107, 504, les tubes de spirométrie, les dialyseurs 616, les transducteurs, les équipements d'anesthésie et de thérapie respiratoire 617, les systèmes de dosage d'hémodialyse et de distribution de dialysat 249, 618 et la réutilisation de trocarts en plastique jetables laparoscopiques 619 . Le glutaraldéhyde n'est pas corrosif pour le métal et n'endommage pas les instruments à lentilles, le caoutchouc. ou plastiques. Le glutaraldéhyde ne doit pas être utilisé pour nettoyer les surfaces non critiques car il est trop toxique et coûteux.

Une colite que l'on croit causée par l'exposition au glutaraldéhyde de la solution désinfectante résiduelle dans les canaux de solution d'endoscope a été signalée et peut être évitée par un rinçage soigneux de l'endoscope 318, 620-630. Une étude a révélé que les niveaux résiduels de glutaraldéhyde étaient plus élevés et plus variables après une désinfection manuelle (<0,2 mg/L à 159,5 mg/L) qu'après une désinfection automatique (0,2&ndash6,3 mg/L) 631 . De même, la kératopathie et la décompensation cornéenne ont été causées par des instruments ophtalmiques insuffisamment rincés après trempage dans du glutaraldéhyde à 2 % 632, 633 .

Le personnel de santé peut être exposé à des niveaux élevés de vapeur de glutaraldéhyde lorsque l'équipement est traité dans des pièces mal ventilées, lorsque des déversements se produisent, lorsque des solutions de glutaraldéhyde sont activées ou modifiées 634 , ou lorsque des bains d'immersion ouverts sont utilisés. Une exposition aiguë ou chronique peut entraîner une irritation de la peau ou une dermatite, une irritation des muqueuses (yeux, nez, bouche) ou des symptômes pulmonaires 318, 635-639 . L'épistaxis, la dermatite allergique de contact, l'asthme et la rhinite ont également été signalés chez des travailleurs de la santé exposés au glutaraldéhyde 636, 640-647 .

L'exposition au glutaraldéhyde doit être surveillée pour garantir un environnement de travail sûr. Le test peut être effectué par quatre techniques : un tube de gel de silice/chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme, une cassette filtrante imprégnée de dinitrophénylhydrazine (DNPH)/une chromatographie liquide haute performance (HPLC) avec un détecteur ultraviolet (UV), un badge passif/ HPLC, ou un moniteur d'air de glutaraldéhyde portable 648 . Le tube de gel de silice et la cassette imprégnée de DNPH conviennent pour surveiller la limite plafond de 0,05 ppm. Le badge passif, avec une limite de détection de 0,02 ppm, est considéré comme marginal au niveau plafond du Conseil américain des hygiénistes industriels gouvernementaux (ACGIH). Le niveau plafond est considéré comme trop proche de la limite de détection de 0,03 ppm du compteur de glutaraldéhyde pour donner confiance dans les lectures 648 . L'ACGIH n'exige pas de programme de surveillance spécifique pour le glutaraldéhyde, cependant, un programme de surveillance est nécessaire pour s'assurer que le niveau est inférieur à la limite plafond.Par exemple, la surveillance devrait être effectuée initialement pour déterminer les niveaux de glutaraldéhyde, après des changements de procédure ou d'équipement, et en réponse aux plaintes des travailleurs 649 . En l'absence d'une limite d'exposition admissible par l'OSHA, si le niveau de glutaraldéhyde est supérieur à la limite plafond de 0,05 ppm de l'ACGIH, des mesures correctives et une surveillance répétée seraient prudentes 649 .

Les contrôles techniques et pratiques de travail qui peuvent être utilisés pour résoudre ces problèmes comprennent des hottes d'évacuation avec conduits, des systèmes d'air qui fournissent 7&ndash15 échanges d'air par heure, des hottes sans conduit avec absorbants pour la vapeur de glutaraldéhyde, des couvercles hermétiques sur les bains d'immersion, une protection personnelle ( par exemple, des gants en caoutchouc nitrile ou butyle mais pas des gants en latex naturel, des lunettes de protection) pour minimiser le contact avec la peau ou les muqueuses, et des processeurs d'endoscope automatisés 7, 650 . Si les contrôles techniques ne parviennent pas à maintenir les niveaux sous la limite plafond, les établissements peuvent envisager l'utilisation de respirateurs (par exemple, un respirateur demi-masque avec cartouche pour vapeurs organiques 640 ou un respirateur à adduction d'air de type &ldquoC&rdquo avec un masque complet fonctionnant en mode de pression positive) 651 . En général, les contrôles techniques sont préférés aux contrôles pratiques et administratifs, car ils ne nécessitent pas la participation active du travailleur de la santé. Même si l'application de la limite plafond de l'OSHA a été suspendue en 1993 par la Cour d'appel des États-Unis 577 , il est prudent de limiter l'exposition des employés à 0,05 ppm (selon l'ACGIH) car, à ce niveau, le glutaraldéhyde peut irriter les yeux, la gorge et le nez 318 , 577, 639, 652 . Si l'élimination du glutaraldéhyde par le système d'égout sanitaire est restreinte, le bisulfate de sodium peut être utilisé pour neutraliser le glutaraldéhyde et le rendre sûr pour l'élimination.

Peroxyde d'hydrogène

Aperçu.

La littérature contient plusieurs comptes rendus des propriétés, de l'efficacité germicide et des utilisations potentielles du peroxyde d'hydrogène stabilisé dans le cadre des soins de santé. Les rapports publiés attribuent une bonne activité germicide au peroxyde d'hydrogène et attestent de ses propriétés bactéricides, virucides, sporicides et fongicides 653-655 . (Tableaux 4 et 5) Le site Web de la FDA répertorie les stérilisants chimiques liquides autorisés et les désinfectants de haut niveau contenant du peroxyde d'hydrogène et leurs conditions de contact autorisées.

Mode d'action.

Le peroxyde d'hydrogène agit en produisant des radicaux libres hydroxyles destructeurs qui peuvent attaquer les lipides membranaires, l'ADN et d'autres composants cellulaires essentiels. La catalase, produite par des organismes aérobies et des anaérobies facultatifs qui possèdent des systèmes de cytochromes, peut protéger les cellules du peroxyde d'hydrogène produit métaboliquement en dégradant le peroxyde d'hydrogène en eau et en oxygène. Cette défense est dépassée par les concentrations utilisées pour la désinfection 653, 654 .

Activité microbicide.

Le peroxyde d'hydrogène est actif contre un large éventail de micro-organismes, y compris les bactéries, les levures, les champignons, les virus et les spores 78, 654 . Un peroxyde d'hydrogène accéléré à 0,5 % a démontré une activité bactéricide et virucide en 1 minute et une activité mycobactéricide et fongicide en 5 minutes 656 . L'efficacité bactéricide et la stabilité du peroxyde d'hydrogène dans l'urine ont été démontrées contre une variété d'organismes pathogènes associés aux soins de santé avec une activité catalase cellulaire élevée (par exemple, S. aureus, S. marcescens, et Proteus mirabilis) nécessitaient 30 à 60 minutes d'exposition à 0,6 % de peroxyde d'hydrogène pour une réduction de 10 8 du nombre de cellules, tandis que les organismes ayant une activité catalase plus faible (par exemple, E. coli, Streptocoque espèces, et Pseudomonas espèces) n'a nécessité que 15 minutes d'exposition 657 . Dans une étude de 3 %, 10 % et 15 % de peroxyde d'hydrogène pour réduire les populations bactériennes des engins spatiaux, une destruction complète de 10 6 spores (c'est-à-dire, Bacille espèces) s'est produite avec une concentration de 10 % et un temps d'exposition de 60 minutes. Une concentration de 3 % pendant 150 minutes a tué 106 spores dans six des sept essais d'exposition 658 . Une solution de peroxyde d'hydrogène à 10 % a entraîné une diminution de 10 3 de B. atrophaeus spores, et une diminution de &ge10 5 lorsqu'elle est testée contre 13 autres agents pathogènes en 30 minutes à 20°C 659, 660 . Une solution de peroxyde d'hydrogène à 3,0 % s'est révélée inefficace contre les ERV après des temps d'exposition de 3 et 10 minutes 661 et n'a provoqué qu'un effet de 2 log10 réduction du nombre de Acanthamoeba kystes en 2 heures environ 662 . Un peroxyde d'hydrogène stabilisé à 7 % s'est avéré sporicide (6 heures d'exposition), mycobactéricide (20 minutes), fongicide (5 minutes) à pleine puissance, virucide (5 minutes) et bactéricide (3 minutes) à une dilution de 1:16 lorsque un test quantitatif des porteurs a été utilisé 655 . La solution à 7 % de peroxyde d'hydrogène, testée après 14 jours de stress (sous forme de porteurs chargés de germes et de matériel de thérapie respiratoire), était sporicide (>7 log10 réduction en 6 heures), mycobactéricide (>6,5 log10 réduction en 25 minutes), fongicide (>5 log10 réduction en 20 minutes), bactéricide (>6 log10 réduction en 5 minutes) et virucide (5 log10 réduction en 5 minutes) 663 . Des effets sporicides synergiques ont été observés lorsque les spores étaient exposées à une combinaison de peroxyde d'hydrogène (5,9 % et 23,6 %) et d'acide peracétique 664 . D'autres études ont démontré l'activité antivirale du peroxyde d'hydrogène contre le rhinovirus 665 . Le temps nécessaire pour inactiver trois sérotypes de rhinovirus à l'aide d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 3% était de 6&ndash8 minutes cette fois augmenté avec des concentrations décroissantes (18-20 minutes à 1,5%, 50&ndash60 minutes à 0,75%).

Des concentrations de peroxyde d'hydrogène de 6 % à 25 % sont prometteuses en tant que stérilisants chimiques. Le produit commercialisé comme stérilisant est un produit chimique prémélangé et prêt à l'emploi qui contient 7,5 % de peroxyde d'hydrogène et 0,85 % d'acide phosphorique (pour maintenir un pH bas) 69 . L'activité mycobactéricide du peroxyde d'hydrogène à 7,5% a été corroborée dans une étude montrant l'inactivation de >10 5 multirésistants M. tuberculose après une exposition de 10 minutes 666 . Trente minutes ont été nécessaires pour une inactivation de >99,9% du poliovirus et du VHA 667 . 3 % et 6 % de peroxyde d'hydrogène ont été incapables d'inactiver le VHA en 1 minute dans un test de porteur 58 . Lorsque l'efficacité de 7,5% de peroxyde d'hydrogène à 10 minutes a été comparée à 2% de glutaraldéhyde alcalin à 20 minutes dans la désinfection manuelle des endoscopes, aucune différence significative dans l'activité germicide n'a été observée 668 . ). Aucune plainte n'a été reçue du personnel infirmier ou médical concernant l'odeur ou la toxicité. Dans une étude, le peroxyde d'hydrogène à 6 % (le produit non utilisé était de 7,5 %) était plus efficace pour la désinfection de haut niveau des endoscopes flexibles que la solution à 2 % de glutaraldéhyde 456 . Une nouvelle formulation de peroxyde d'hydrogène à action rapide de 13,4 % (qui n'est pas encore approuvée par la FDA) a démontré une efficacité sporicide, mycobactéricide, fongicide et virucide. Les données du fabricant démontrent que cette solution stérilise en 30 minutes et assure une désinfection de haut niveau en 5 minutes 669 . Ce produit n'a pas été utilisé assez longtemps pour évaluer la compatibilité des matériaux avec les endoscopes et autres dispositifs semi-critiques, et une évaluation plus approfondie par les fabricants d'instruments est nécessaire.

Dans des conditions normales, le peroxyde d'hydrogène est extrêmement stable lorsqu'il est correctement stocké (par exemple, dans des conteneurs sombres). La décomposition ou la perte d'activité dans les petits contenants est inférieure à 2 % par an à température ambiante 670 .

Le peroxyde d'hydrogène à 3 % disponible dans le commerce est un désinfectant stable et efficace lorsqu'il est utilisé sur des surfaces inanimées. Il a été utilisé à des concentrations de 3 % à 6 % pour désinfecter les lentilles cornéennes souples (p. Le peroxyde d'hydrogène s'est avéré efficace pour la désinfection localisée des tissus dans les chambres des patients 397 . Des lésions cornéennes causées par une pointe de tonomètre imbibée de peroxyde d'hydrogène qui n'a pas été correctement rincée ont été signalées 674 . Du peroxyde d'hydrogène a également été instillé dans des poches de drainage urinaire pour tenter d'éliminer la poche en tant que source de bactériurie de la vessie et de contamination de l'environnement 675 . Bien que l'instillation de peroxyde d'hydrogène dans le sac réduise la contamination microbienne du sac, cette procédure n'a pas réduit l'incidence de la bactériurie associée au cathéter 675 .

Une irritation chimique ressemblant à une colite pseudomembraneuse causée soit par du peroxyde d'hydrogène à 3 % ou par un glutaraldéhyde à 2 % a été signalée 621 . Une épidémie d'entérite et de colite pseudomembranaires chez sept patients dans une unité d'endoscopie gastro-intestinale a également été associée à un rinçage inadéquat de l'endoscope à 3 % de peroxyde d'hydrogène 676 .

Comme pour les autres stérilisants chimiques, la dilution du peroxyde d'hydrogène doit être surveillée en testant régulièrement la concentration minimale efficace (c'est-à-dire 7,5 % et 6,0 %). Les tests de compatibilité effectués par Olympus America sur le peroxyde d'hydrogène à 7,5% ont révélé à la fois des changements cosmétiques (par exemple, une décoloration des finitions métalliques anodisées noires) 69 et des changements fonctionnels avec les endoscopes testés (Olympus, communication écrite, 15 octobre 1999).

Iodophores

Aperçu.

Les solutions ou teintures d'iode ont longtemps été utilisées par les professionnels de la santé principalement comme antiseptiques sur la peau ou les tissus. Les iodophores, en revanche, ont été utilisés à la fois comme antiseptiques et comme désinfectants. La FDA n'a autorisé aucun stérilisant chimique liquide ou désinfectant de haut niveau contenant des iodophores comme principal ingrédient actif. Un iodophore est une combinaison d'iode et d'un agent ou support solubilisant, le complexe résultant fournit un réservoir d'iode à libération prolongée et libère de petites quantités d'iode libre en solution aqueuse. L'iodophore le plus connu et le plus largement utilisé est la povidone-iode, un composé de polyvinylpyrrolidone avec de l'iode. Ce produit et d'autres iodophores conservent l'efficacité germicide de l'iode mais, contrairement à l'iode, ils ne tachent généralement pas et sont relativement exempts de toxicité et d'irritation 677, 678 .

Plusieurs rapports documentant la contamination microbienne intrinsèque des formulations antiseptiques de povidone-iode et de poloxamère-iode 679-681 ont entraîné une réévaluation de la chimie et de l'utilisation des iodophores 682 . &ldquoLibre&rdquo d'iode (je2) contribue à l'activité bactéricide des iodophores et les dilutions d'iodophores démontrent une action bactéricide plus rapide qu'une solution de povidone-iode à pleine concentration. La raison de l'observation selon laquelle la dilution augmente l'activité bactéricide n'est pas claire, mais la dilution de la povidone-iode pourrait affaiblir la liaison de l'iode au polymère porteur avec une augmentation concomitante de l'iode libre dans la solution 680 . Par conséquent, les iodophores doivent être dilués conformément aux instructions du fabricant pour obtenir une activité antimicrobienne.

Mode d'action.

L'iode peut pénétrer rapidement dans la paroi cellulaire des micro-organismes, et on pense que les effets létaux résultent de la perturbation de la structure et de la synthèse des protéines et des acides nucléiques.

Activité microbicide.

Les rapports publiés sur l'efficacité antimicrobienne in vitro des iodophores démontrent que les iodophores sont bactéricides, mycobactéricides et virucides, mais peuvent nécessiter des temps de contact prolongés pour tuer certains champignons et spores bactériennes 14, 71-73, 290, 683-686. Trois marques de solution de povidone-iode ont démontré une destruction plus rapide (de quelques secondes à quelques minutes) de S. aureus et M. chelonae à une dilution de 1:100 que la solution mère 683 . L'activité virucide de 75 à 150 ppm d'iode disponible a été démontrée contre sept virus 72 . D'autres chercheurs ont mis en doute l'efficacité des iodophores contre le poliovirus en présence de matière organique 685 et de rotavirus SA-11 dans l'eau distillée ou du robinet 290 . Les données des fabricants démontrent que les iodophores commerciaux ne sont pas sporicides, mais qu'ils sont tuberculocides, fongicides, virucides et bactéricides à leur dilution d'utilisation recommandée.

Outre leur utilisation comme antiseptique, les iodophores ont été utilisés pour désinfecter les flacons d'hémoculture et le matériel médical, tels que les réservoirs d'hydrothérapie, les thermomètres et les endoscopes. Les iodophores antiseptiques ne conviennent pas comme désinfectants pour surfaces dures en raison des différences de concentration. Les iodophores formulés comme antiseptiques contiennent moins d'iode libre que ceux formulés comme désinfectants 376 . L'iode ou les antiseptiques à base d'iode ne doivent pas être utilisés sur les cathéters en silicone car ils peuvent endommager la tubulure en silicone 687 .

Ortho-phtalaldéhyde (OPA)

Aperçu.

L'ortho-phtalaldéhyde est un désinfectant de haut niveau qui a reçu l'autorisation de la FDA en octobre 1999. Il contient 0,55% de 1,2-benzènedicarboxaldéhyde (OPA). La solution d'OPA est un liquide bleu pâle clair avec un pH de 7,5. (Tableaux 4 et 5)

Mode d'action.

Des études préliminaires sur le mode d'action de l'OPA suggèrent que l'OPA et le glutaraldéhyde interagissent avec les acides aminés, les protéines et les micro-organismes. Cependant, l'OPA est un agent de réticulation moins puissant. Ceci est compensé par la nature aromatique lipophile de l'OPA qui est susceptible d'aider son absorption à travers les couches externes de mycobactéries et de bactéries gram-négatives 688-690. L'OPA semble tuer les spores en bloquant le processus de germination des spores 691 .

Activité microbicide.

Des études ont démontré une excellente activité microbicide in vitro 69, 100, 271, 400, 692-703 . Par exemple, l'OPA a une activité mycobactéricide supérieure (5 log10 réduction en 5 minutes) en glutaraldéhyde. Les temps moyens nécessaires pour produire un 6-log10 réduction pour M. bovis l'utilisation d'OPA à 0,21 % était de 6 minutes, contre 32 minutes pour l'utilisation de glutaraldéhyde à 1,5 % 693 . L'OPA a montré une bonne activité contre les mycobactéries testées, y compris les souches résistantes au glutaraldéhyde, mais l'OPA à 0,5 % n'était pas sporicide après 270 minutes d'exposition. L'augmentation du pH de son niveau non ajusté (environ 6,5) à pH 8 a amélioré l'activité sporicide de l'OPA 694 . Le niveau d'activité biocide était directement lié à la température. Un log supérieur à 510 réduction de B. atrophaeus les spores ont été observées en 3 heures à 35°C, qu'en 24 heures à 20°C. De plus, avec un temps d'exposition &le5 minutes, l'activité biocide diminuait avec l'augmentation de la concentration sérique. Cependant, l'efficacité ne différait pas lorsque le temps d'exposition était de &ge10 minutes 697 . De plus, l'OPA est efficace (>5-log10 réduction) contre un large éventail de micro-organismes, y compris les mycobactéries résistantes au glutaraldéhyde et B. atrophaeus spores 694 .

L'influence de l'adaptation en laboratoire des souches d'essai, telles que P. aeruginosa, à 0,55% OPA a été évalué. Les souches résistantes et multirésistantes ont augmenté considérablement leur sensibilité à l'OPA après adaptation en laboratoire (log10 facteurs de réduction augmentés de 0,54 et 0,91 pour les souches résistantes et multirésistantes, respectivement) 704 . D'autres études ont trouvé des cellules naturelles de P. aeurginosa étaient plus résistantes à une variété de désinfectants que les cellules repiquées 705 .

L'OPA présente plusieurs avantages potentiels par rapport au glutaraldéhyde. Il a une excellente stabilité sur une large plage de pH (pH 3&ndash9), n'est pas un irritant connu pour les yeux et les voies nasales 706, ne nécessite pas de surveillance de l'exposition, a une odeur à peine perceptible et ne nécessite aucune activation. L'OPA, comme le glutaraldéhyde, a une excellente compatibilité avec les matériaux. Un inconvénient potentiel de l'OPA est qu'il tache les protéines en gris (y compris la peau non protégée) et doit donc être manipulé avec prudence 69 . Cependant, une coloration de la peau indiquerait une mauvaise manipulation qui nécessite une formation supplémentaire et/ou un équipement de protection individuelle (p. Les résidus d'OPA restant sur des sondes d'écho transœsophagiennes insuffisamment rincées à l'eau peuvent tacher la bouche du patient 707 . Un nettoyage méticuleux, en utilisant le bon temps d'exposition à l'OPA (par exemple, 12 minutes) et un rinçage abondant de la sonde avec de l'eau devraient éliminer ce problème. Les résultats d'une étude ont fourni une base pour une recommandation selon laquelle le rinçage des instruments désinfectés avec de l'OPA nécessitera au moins 250 ml d'eau par canal pour réduire les résidus chimiques à un niveau qui ne compromettra pas la sécurité du patient ou du personnel (<1 ppm) 708 . Un équipement de protection individuelle doit être porté lors de la manipulation d'instruments, d'équipements et de produits chimiques contaminés 400 . De plus, l'équipement doit être soigneusement rincé pour éviter la décoloration de la peau ou des muqueuses d'un patient.

En avril 2004, le fabricant de l'OPA a diffusé des informations aux utilisateurs sur les patients qui auraient présenté une réaction de type anaphylactique après une cystoscopie où l'endoscope avait été retraité à l'aide d'OPA. Sur environ 1 million d'interventions urologiques réalisées à l'aide d'instruments retraités à l'aide d'OPA, 24 cas (17 cas aux États-Unis, six au Japon, un au Royaume-Uni) de réactions de type anaphylactique ont été signalés après des cystoscopies répétées (généralement après quatre à neuf traitements). Les mesures préventives comprennent l'élimination des résidus d'OPA par un rinçage abondant et l'absence d'utilisation d'OPA pour le retraitement des instruments urologiques utilisés pour traiter les patients ayant des antécédents de cancer de la vessie (Nevine Erian, communication personnelle, 4 juin 2004 Product Notification, Advanced Sterilization Products, 23 avril 2004 ) 709 .

Quelques études cliniques OPA sont disponibles. Dans une étude d'utilisation clinique, l'exposition à l'OPA de 100 endoscopes pendant 5 minutes a entraîné un >5-log10 réduction de la charge bactérienne. De plus, l'OPA a été efficace sur un cycle d'utilisation de 14 jours 100 . Les données du fabricant montrent que l'OPA durera plus longtemps dans un retraiteur d'endoscope automatique avant d'atteindre sa limite MEC (MEC après 82 cycles) que le glutaraldéhyde (MEC après 40 cycles) 400 . La chromatographie liquide à haute pression a confirmé que les niveaux d'OPA sont maintenus au-dessus de 0,3 % pendant au moins 50 cycles 706, 710 . L'OPA doit être éliminé conformément aux réglementations locales et nationales. Si l'élimination de l'OPA par le système d'égout sanitaire est restreinte, la glycine (25 grammes/gallon) peut être utilisée pour neutraliser l'OPA et le rendre sûr pour l'élimination.

Les allégations sur l'étiquette du désinfectant de haut niveau pour la solution OPA à 20 °C varient dans le monde entier (par exemple, 5 minutes en Europe, en Asie et en Amérique latine, 10 minutes au Canada et en Australie et 12 minutes aux États-Unis). Ces allégations d'étiquettes diffèrent dans le monde entier en raison de différences dans la méthodologie de test et les exigences d'autorisation d'exercer. Dans un retraiteur d'endoscope automatisé doté d'une capacité approuvée par la FDA pour maintenir la température de la solution à 25 °C, le temps de contact pour l'OPA est de 5 minutes.

L'acide peracétique

Aperçu.

L'acide peracétique, ou peroxyacétique, se caractérise par une action rapide contre tous les micro-organismes. Les avantages particuliers de l'acide peracétique sont qu'il ne contient pas de produits de décomposition nocifs (c'est-à-dire, l'acide acétique, l'eau, l'oxygène, le peroxyde d'hydrogène), améliore l'élimination des matières organiques 711 et ne laisse aucun résidu. Il reste efficace en présence de matière organique et est sporicide même à basse température (tableaux 4 et 5). L'acide peracétique peut corroder le cuivre, le laiton, le bronze, l'acier ordinaire et le fer galvanisé, mais ces effets peuvent être réduits par des additifs et des modifications du pH.Il est considéré comme instable, notamment lorsqu'il est dilué par exemple, une solution à 1% perd la moitié de sa force par hydrolyse en 6 jours, alors que l'acide peracétique à 40% perd 1%&ndash2% de ses principes actifs par mois 654 .

Mode d'action.

On sait peu de choses sur le mécanisme d'action de l'acide peracétique, mais on pense qu'il fonctionne de la même manière que d'autres agents oxydants, c'est-à-dire qu'il dénature les protéines, perturbe la perméabilité de la paroi cellulaire et oxyde les liaisons sulfhydryle et soufre dans les protéines, les enzymes et d'autres métabolites 654 .

Activité microbicide.

L'acide peracétique inactivera les bactéries, les champignons et les levures gram-positives et gram-négatives en &le5 minutes à <100 ppm. En présence de matière organique, 200&ndash500 ppm sont requis. Pour les virus, la gamme de dosage est large (12&ndash2250 ppm), avec le poliovirus inactivé dans l'extrait de levure en 15 minutes avec 1500&ndash2250 ppm. Dans une étude, l'acide peracétique à 3,5 % s'est révélé inefficace contre le VHA après une minute d'exposition à l'aide d'un test de support 58 . L'acide peracétique (0,26 %) était efficace (log10 facteur de réduction >5) contre toutes les souches de test de mycobactéries (M. tuberculosis, M. avium-intracellulare, M. chelonae et M. fortuitum) dans les 20&ndash30 minutes en présence ou en l'absence d'une charge organique 607, 712 . Avec des spores bactériennes, 500 à 10 000 ppm (0,05 % à 1 %) inactivent les spores en 15 secondes à 30 minutes à l'aide d'un test de suspension de spores 654, 659, 713-715 .

Une machine automatisée utilisant de l'acide peracétique pour stériliser chimiquement les instruments médicaux (par exemple, endoscopes, arthroscopes), chirurgicaux et dentaires est utilisée aux États-Unis 716-718. Comme indiqué précédemment, les pièces à main dentaires doivent être stérilisées à la vapeur. Le stérilisant, 35 % d'acide peracétique, est dilué à 0,2 % avec de l'eau filtrée à 50°C. Des essais d'utilisation simulée ont démontré une excellente activité microbicide 111, 718-722 et trois essais cliniques ont démontré à la fois une excellente destruction microbienne et aucun échec clinique conduisant à une infection 90, 723, 724 . La haute efficacité du système a été démontrée dans une comparaison des efficacités du système avec celle de l'oxyde d'éthylène. Seul le système d'acide peracétique a complètement tué 6 log10 de M. chelonae, E. faecalis, et B. atrophaeus spores avec un défi à la fois organique et inorganique 722 . Une enquête comparant les coûts, les performances et la maintenance de l'équipement endoscopique urologique traité par désinfection de haut niveau (avec du glutaraldéhyde) avec ceux du système à l'acide peracétique n'a signalé aucune différence clinique entre les deux systèmes. Cependant, l'utilisation de ce système a entraîné des coûts plus élevés que la désinfection de haut niveau, y compris les coûts de traitement (6,11 $ contre 0,45 par cycle), d'achat et de formation (24 845 $ contre 16 $), d'installation (5 800 $ contre ) et réparations d'endoscopes (6 037 $ contre 445 $) 90 . En outre, trois groupes d'infection utilisant le retraiteur d'endoscope automatisé à l'acide peracétique ont été liés à des bronchoscopes traités de manière inadéquate lorsque des connecteurs de canaux inappropriés ont été utilisés avec le système 725 . Ces groupes soulignent l'importance de la formation, des systèmes de connecteurs d'endoscopes spécifiques au modèle et des procédures de contrôle de la qualité pour garantir la conformité aux recommandations du fabricant d'endoscopes et aux directives de l'organisation professionnelle. Un autre désinfectant de haut niveau disponible au Royaume-Uni contient 0,35% d'acide peracétique. Bien que ce produit soit rapidement efficace contre une large gamme de micro-organismes 466, 726, 727 , il ternit le métal des endoscopes et est instable, ce qui se traduit par une durée d'utilisation de seulement 24 heures 727 .

Acide peracétique et peroxyde d'hydrogène

Aperçu.

Deux stérilisants chimiques sont disponibles qui contiennent de l'acide peracétique plus du peroxyde d'hydrogène (c.

Activité microbicide.

Les propriétés bactéricides de l'acide peracétique et du peroxyde d'hydrogène ont été démontrées 728 . Les données du fabricant ont démontré que cette combinaison d'acide peracétique et de peroxyde d'hydrogène inactivait tous les micro-organismes à l'exception des spores bactériennes en 20 minutes. Le produit à 0,08 % d'acide peracétique plus 1,0 % de peroxyde d'hydrogène a inactivé efficacement les mycobactéries résistantes au glutaraldéhyde 729 .

La combinaison d'acide peracétique et de peroxyde d'hydrogène a été utilisée pour désinfecter les hémodialyseurs 730 . Le pourcentage de centres de dialyse utilisant un désinfectant à base d'acide peracétique et de peroxyde d'hydrogène pour le retraitement des dialyseurs est passé de 5 % en 1983 à 56 % en 1997 249 . Olympus America n'approuve pas l'utilisation de 0,08 % d'acide peracétique plus 1,0 % de peroxyde d'hydrogène (Olympus America, communication personnelle, 15 avril 1998) sur tout endoscope Olympus en raison de dommages esthétiques et fonctionnels et n'assumera aucune responsabilité pour les dommages chimiques résultant de l'utilisation de ce produit. Ce produit n'est pas disponible actuellement. La FDA a autorisé un stérilisant chimique plus récent avec 0,23 % d'acide peracétique et 7,35 % de peroxyde d'hydrogène (tableaux 4 et 5). Après avoir testé le produit de peroxyde d'hydrogène à 7,35 % et d'acide peracétique à 0,23 %, Olympus America a conclu qu'il n'était pas compatible avec les endoscopes gastro-intestinaux flexibles de la société. couche du tube (Olympus America, communication personnelle, 13 septembre 2000).

Phénoliques

Aperçu.

Le phénol a occupé une place prépondérante dans le domaine de la désinfection hospitalière depuis son utilisation initiale comme germicide par Lister dans ses travaux pionniers sur la chirurgie antiseptique. Au cours des 30 dernières années, cependant, les travaux se sont concentrés sur les nombreux dérivés phénoliques ou phénoliques et leurs propriétés antimicrobiennes. Les dérivés du phénol apparaissent lorsqu'un groupe fonctionnel (par exemple, alkyle, phényle, benzyle, halogène) remplace l'un des atomes d'hydrogène sur le cycle aromatique. Deux dérivés du phénol que l'on trouve couramment comme constituants des désinfectants hospitaliers sont ortho-phénylphénol et ortho-benzyle-para-chlorophénol. Les propriétés antimicrobiennes de ces composés et de nombreux autres dérivés du phénol sont bien améliorées par rapport à celles du produit chimique parent. Les composés phénoliques sont absorbés par les matériaux poreux et le désinfectant résiduel peut irriter les tissus. En 1970, la dépigmentation de la peau a été signalée comme étant causée par des détergents germicides phénoliques contenant para-butylphénol tertiaire et para-amylphénol tertiaire 731 .

Mode d'action.

À des concentrations élevées, le phénol agit comme un gros poison protoplasmique, pénétrant et perturbant la paroi cellulaire et précipitant les protéines cellulaires. De faibles concentrations de phénol et de dérivés de phénol de poids moléculaire plus élevé provoquent la mort bactérienne par inactivation des systèmes enzymatiques essentiels et la fuite de métabolites essentiels de la paroi cellulaire 732 .

Activité microbicide.

Les rapports publiés sur l'efficacité antimicrobienne des composés phénoliques couramment utilisés ont montré qu'ils étaient bactéricides, fongicides, virucides et tuberculocides 14, 61, 71, 73, 227, 416, 573, 732-738 . Une étude a démontré peu ou pas d'effet virucide d'un phénolique contre le coxsackie B4, l'échovirus 11 et le poliovirus 1 736 . De même, 12% orthole -phénylphénol n'a réussi à inactiver aucun des trois virus hydrophiles après un temps d'exposition de 10 minutes, bien que 5 % de phénol ait été mortel pour ces virus 72 . Une dilution à 0,5% d'un phénolique (2,8% ortho-phénylphénol et 2,7% ortho-benzyle-para-chlorophénol) inactivé le VIH 227 et une solution à 2 % d'un composé phénolique (15 % d'ortho-phénylphénol et 6,3 % de para-tert-amylphénol) a inactivé tous les 11 champignons testés sauf un 71 .

Les données des fabricants utilisant les méthodes AOAC standardisées démontrent que les composés phénoliques commerciaux ne sont pas sporicides mais sont tuberculocides, fongicides, virucides et bactéricides à leur dilution d'utilisation recommandée. Les tentatives pour étayer les allégations bactéricides de l'étiquette des composés phénoliques à l'aide de la méthode AOAC Use-Dilution ont parfois échoué 416, 737 . Cependant, les résultats de ces mêmes études ont considérablement varié entre les laboratoires testant des produits identiques.

De nombreux germicides phénoliques sont enregistrés par l'EPA en tant que désinfectants pour une utilisation sur les surfaces environnementales (par exemple, les tables de chevet, les barrières de lit et les surfaces de laboratoire) et les dispositifs médicaux non critiques. Les composés phénoliques ne sont pas approuvés par la FDA en tant que désinfectants de haut niveau pour une utilisation avec des articles semi-critiques, mais pourraient être utilisés pour pré-nettoyer ou décontaminer les dispositifs critiques et semi-critiques avant la stérilisation terminale ou la désinfection de haut niveau.

L'utilisation de composés phénoliques dans les pouponnières a été remise en question en raison de l'hyperbilirubinémie chez les nourrissons placés dans des berceaux où des détergents phénoliques ont été utilisés 739 . En outre, il a été signalé que les niveaux de bilirubine augmentaient chez les nourrissons exposés aux phénols, par rapport aux nourrissons non exposés aux phénols, lorsque le phénolique était préparé selon la dilution recommandée par les fabricants 740 . Si des composés phénoliques sont utilisés pour nettoyer les sols des pépinières, ils doivent être dilués tel que recommandé sur l'étiquette du produit. Les composés phénoliques (et autres désinfectants) ne doivent pas être utilisés pour nettoyer les moïses et les incubateurs des nourrissons lorsqu'ils sont occupés. Si des composés phénoliques sont utilisés pour le nettoyage final des moïses et des incubateurs pour nourrissons, les surfaces doivent être rincées abondamment à l'eau et séchées avant la réutilisation des moïses et des incubateurs pour nourrissons 17 .

Composés d'ammonium quaternaire

Aperçu.

Les composés d'ammonium quaternaire sont largement utilisés comme désinfectants. Des infections associées aux soins de santé ont été signalées à partir de composés d'ammonium quaternaire contaminés utilisés pour désinfecter les fournitures ou l'équipement de soins aux patients, tels que les cystoscopes ou les cathéters cardiaques 741, 742 . Les quaternaires sont de bons agents de nettoyage, mais la dureté de l'eau 743 élevée et les matériaux tels que le coton et les tampons de gaze peuvent les rendre moins microbicides en raison des précipités insolubles ou des tampons de coton et de gaze absorbent les ingrédients actifs, respectivement. Une étude a montré une baisse significative (

40%&ndash50% inférieur à 1 heure) dans la concentration de quaternaires libérés lorsque des chiffons en coton ou des chiffons à base de cellulose ont été utilisés dans le système à seau ouvert, par rapport aux chiffons non tissés spunlace dans le système à seau fermé. 744 Comme avec plusieurs autres désinfectants (p.

Chimiquement, les quaternaires sont des composés d'ammonium organiquement substitués dans lesquels l'atome d'azote a une valence de 5, quatre des radicaux substituants (R1-R4) sont des radicaux alkyles ou hétérocycliques d'une taille ou d'une longueur de chaîne donnée, et le cinquième (X &# 8209) est un halogénure, un sulfate ou un radical 745 similaire. Chaque composé présente ses propres caractéristiques antimicrobiennes, d'où la recherche d'un composé aux propriétés antimicrobiennes exceptionnelles. Certains des noms chimiques des composés d'ammonium quaternaire utilisés dans les soins de santé sont le chlorure d'alkyl diméthyl benzyl ammonium, le chlorure d'alkyl didécyl diméthyl ammonium et le chlorure de dialkyl diméthyl ammonium. Les nouveaux composés d'ammonium quaternaire (c.

Quelques rapports de cas ont documenté l'asthme professionnel à la suite d'une exposition au chlorure de benzalkonium 747 .

Mode d'action.

L'action bactéricide des quaternaires a été attribuée à l'inactivation des enzymes productrices d'énergie, à la dénaturation des protéines cellulaires essentielles et à la rupture de la membrane cellulaire 746 . Il existe des preuves qui soutiennent ces possibilités et d'autres 745 748 .

Activité microbicide.

Les résultats des fiches techniques des fabricants et de la littérature scientifique publiée indiquent que les quaternaires vendus comme désinfectants hospitaliers sont généralement fongicides, bactéricides et virucides contre les virus lipophiles (enveloppés). 54-56, 58, 59, 61, 71, 73, 186, 297, 748, 749 . Les faibles activités mycobactéricides des composés d'ammonium quaternaire ont été démontrées 55, 73 . Les composés d'ammonium quaternaire (ainsi que 70 % d'alcool isopropylique, phénolique et une lingette contenant du chlore [80 ppm]) éliminent efficacement (>95 %) et/ou inactivent les contaminants (c. S. aureus, résistant à la vancomycine Entercoque, P. aeruginosa) à partir de claviers d'ordinateur avec un temps d'application de 5 secondes. Aucun dommage fonctionnel ou changement esthétique n'est survenu sur les claviers d'ordinateur après 300 applications des désinfectants 45 .

Les tentatives de reproduire les allégations bactéricides et tuberculocides des fabricants en utilisant les tests AOAC avec un nombre limité de composés d'ammonium quaternaire ont parfois échoué 73, 416, 737 . Cependant, les résultats des tests ont considérablement varié entre les laboratoires testant des produits identiques 416, 737 .


Discussion

Nous discutons ci-dessous d'importantes considérations et recommandations pour N2Mesures de taux d'O à l'aide de 15 incubations de N-traceurs, y compris la déclaration et l'archivage des données.

Maintien des conditions anoxiques avant et pendant les incubations

Des précautions sont nécessaires pendant les incubations de 15 N des eaux anoxiques pour déterminer le N2O production ou consommation à N2. Un domaine de préoccupation est O2 contamination de l'air lors de l'échantillonnage des bouteilles Niskin, ce qui a été signalé comme entraînant une augmentation de l'O dissous2 jusqu'à 1 μM (De Brabandere et al., 2012). Si possible, il est préférable de remplacer l'espace libre créé dans la bouteille Niskin par du CO2 ou N2 tandis que l'eau est retirée plutôt que de simplement permettre l'invasion de l'air. Il est également recommandé d'éviter les composants en plastique et en caoutchouc dans la mesure du possible car O2 peuvent diffuser à travers ou à partir de ces matériaux (par exemple, De Brabandere et al., 2012) et les bouchons doivent être désoxygénés et conservés dans une chambre anaérobie ou sous atmosphère d'He avant les incubations (voir la section « bouchons » ).

Les systèmes de collecte d'eau diffèrent par leur degré de contamination par l'oxygène. Le système de profilage de pompe (PPS) permet un échantillonnage directement à partir de la colonne d'eau, ce qui minimise l'O2 contamination lors du prélèvement des échantillons (p. ex. Padilla et al., 2016). L'échantillonnage des bouteilles Niskin introduit une contamination par l'oxygène dans l'échantillon (De Brabandere et al., 2012), ainsi la plupart des groupes de recherche purgent généralement avec He pour éliminer l'O.2 dans des flacons d'incubation (par exemple, Holtappels et al., 2011 Kalvelage et al., 2013 Frey et al., 2020 Sun et al., 2020). La purge de la phase liquide avec He avant les incubations modifie les conditions ambiantes et élimine les gaz tels que N2O, CH4, et H2S qui sont intimement liés au cycle N. Par conséquent, des taux potentiels sont obtenus comme c'est généralement le cas pour ce type d'incubation en raison de changements dans les conditions expérimentales. Si vous le souhaitez, ces substrats doivent être rajoutés après la purge. La création d'un espace libre peut également aider à dessiner l'O dissous2 dans l'espace libre tandis que le N plus soluble2O reste dissous dans l'échantillon d'eau. La surveillance non invasive de l'O2 Les concentrations à l'intérieur du flacon d'incubation sont fortement conseillées (voir la section “Incubation”).

Types de bouteilles

Une gamme de types et de tailles de flacons a été utilisée pour les incubations de dénitrification 15 N, y compris, par exemple, des flacons en verre ambré de 1 ou 0,5 L avec bouchons en téflon contenant deux longueurs de tube Tygon 1/8″ avec valves (Devol et al., 2006 Bourbonnais et al., 2012), des sacs de 500 mL (Ward et al., 2009 Bourbonnais et al., 2012), ou des extainers de 12 mL (Holtappels et al., 2011 Bourbonnais et al., 2012). Les sacs Tedlar ® sont généralement difficiles à remplir sans formation de bulles et les valves ne sont généralement pas complètement étanches. Ainsi, l'incubation dans des sacs est déconseillée. Des flacons de sérum plus grands (au moins 60 ml) avec des bouchons en caoutchouc butyle sont recommandés pour mesurer N2O taux de production comme N2L'O produit dans des extainers de petit volume pourrait ne pas être suffisant pour être détecté avec l'IRMS si les taux sont faibles.

Bouchons

Niemann et al. (2015) ont découvert que les bouchons épais en caoutchouc butyle noir non halogéné lixiviaient de grandes quantités de divers composés organiques qui avaient des effets toxiques pendant les incubations d'oxydation aérobie du méthane. Les types de bouchons gris bromo- et chlorobutyle testés ne semblaient pas lessiver les matières organiques. Nous recommandons donc d'utiliser ces types de bouchons, mais d'autres tests étudient les effets toxiques potentiels de ces bouchons pendant N2O production et consommation 15 incubations marquées au N sont nécessaires. Avant anoxique ou faible O2 incubations, les bouchons d'extainer doivent être conservés sous une atmosphère d'hélium pour éliminer l'O2. Les bouchons en caoutchouc butyle gris pour flacons en verre à sérum doivent être bouillis pendant environ 5 minutes dans de l'eau purifiée (par exemple, Milli-Q) et conservés sous atmosphère de He pour éliminer l'O2 (De Brabandere et al., 2012).

15 Ajout de N-Tracer

Idéalement, la concentration finale de traceur ajoutée doit être aussi proche que possible des concentrations ambiantes. Cependant, cela est difficile à réaliser pour les échantillons de colonne d'eau oxique où le NH dissous4 + et NON2 – ne s'accumulent généralement pas de manière significative. Pour les incubations de dénitrification, des ajouts d'au moins 5� μM de 15 N-NO2 – ou 15 N-NO3 Des traceurs – ont été utilisés [par exemple, Devol et al. (2006) Bourbonnais et al. (2012)] afin de détecter la production de N marqué2O ou N2 produits lorsque les taux sont bas. Par conséquent, les traceurs sont généralement ajoutés à des concentrations de 10 à 100 % des concentrations ambiantes, d'où les taux potentiels sont étudiés. La concentration finale du traceur est généralement de 0,5𠄵 μM 15 N-NH4 + ou 15 N-NO2 – pour les échantillons de colonnes d'eau provenant d'eaux oligotrophes (voir Ji et al., 2015 Frame et al., 2017).

Choisir un fixateur

Bien qu'une comparaison complète des différents fixateurs fasse encore défaut, l'utilisation de HgCl2 est conseillé. Ostrom et al. (2016) ont montré que ZnCl2 ou HgCl2 agit comme catalyseur pour l'azote abiotique2Production d'O à partir de l'oxydation de Fe 2+ couplée au NO2 – réduction des milieux anoxiques où les concentrations de Fe 2+ sont relativement élevées (lac Antarctique, eaux interstitielles des sédiments). Cela ne devrait pas être un problème pour les échantillons de colonne d'eau car Fe 2+ et NO2 – les concentrations sont généralement trop faibles pour que ce processus abiotique soit significatif. Cependant, dans le même temps, on est de plus en plus conscient de l'impact des activités anthropiques sur le cycle du mercure et des efforts sont déployés pour réduire ces émissions. En 2017, lors de la convention de Minamata, l'Europe a accepté de réduire l'utilisation de Hg, y compris HgCl2. Depuis lors, la Suède a interdit le HgCl2 des navires de recherche et d'autres pays européens suivent. Il est urgent de trouver de bonnes alternatives.

Reporting et archivage des données

Nous recommandons de soumettre toutes les métadonnées et données pertinentes à un référentiel de données public à code source ouvert tel que Pangea 3 , le Bureau de gestion des données océanographiques biologiques et chimiques (BCO-DMO 4 ) ou l'Infrastructure paneuropéenne pour la gestion des données océaniques et marines (SeaDataNet 5 ). Les métadonnées doivent inclure la date d'échantillonnage, l'emplacement de la station et du site GPS, la profondeur (m), le traitement 15 N, la quantité de traceur 15 N ajoutée, le volume de la bouteille et de l'espace libre (le cas échéant), si l'échantillon a été purgé ou non et le gaz utilisé pour purger le phase liquide, temps d'incubation, conservateur utilisé ainsi que in situ température, oxygène et nutriments (NO3 – , NON2 – , et NH4 + ) concentration. δ 15 N (vs air) et δ 18 O (vs. VSMOW) ainsi que les quantités calculées de [ 44 N2O], [ 45 N2O], et [ 46 N2O] (en nmol N2O L 𠄱 ou nmol N L 𠄱 ) (voir la section “Rate Calculs”) doit également être déclaré pour chaque point dans le temps. N2Les taux de production et de consommation d'O peuvent être indiqués en nmol-N2O (ou N) L 𠄱 d 𠄱 ou nmol N2O (ou N) kg 𠄱 d 𠄱 tant que les unités sont cohérentes et clairement énoncées. Des vocabulaires communs doivent être utilisés dans toutes les bases de métadonnées et formats de données, conformément aux directives établies par le British Oceanographic Data Center (BODC) au moyen du serveur de vocabulaire du National Environment Research Council (NERC) (NVS2.0). Par exemple, les termes suivants ont été soumis au serveur de vocabulaire NERC (NVS2.0) pour faciliter l'archivage et la recherche de données futures.

N2OPR = La production de protoxyde d'azote [N2O CAS 10024-97-2] par jour et par unité de volume de l'échantillon d'eau expérimental par addition d'un traceur marqué par un isotope 15 N [ 15 N CAS 14390-96-6, CAS 68378-96-1 et CAS 31432-46-9] , incubation et mesure de purge et de piégeage au GC-IRMS.

N2OCON = La consommation de protoxyde d'azote [N2O CAS 10024-97-2] par jour et par unité de volume de l'échantillon d'eau expérimental par addition de traceur marqué aux isotopes 15 N [ 15 N CAS 10024-97-2], incubation et mesure de purge et de piège au GC-IRMS.

Tout ensemble de données auxiliaires disponibles (par exemple, les séquences microbiologiques) doit également être mentionné dans les métadonnées.


Comment éviter d'attirer des créatures

  • Idéalement, garez-vous loin des endroits connus pour attirer les rongeurs, comme près des poubelles ou des sources de nourriture naturelles, comme les jardins potagers.
  • Garez-vous dans un garage scellé, si possible, et gardez les portes fermées.
  • Assurez-vous que le garage n'a pas entreposé de nourriture et de matériaux de premier choix comme des journaux, du carton, de la paille, des chiffons et des coussins de meubles de patio.
  • Recherchez des espaces autour des fenêtres et des portes de garage pour les endroits possibles où les rongeurs peuvent se faufiler. Des coupe-froid sous les portes latérales peuvent aider à les sceller. De même, inspectez les joints verticaux des portes de garage escamotables pour détecter tout dommage.
  • Ne rangez pas les poubelles utilisées pour les déchets alimentaires dans le garage.
  • Gardez l'intérieur de la voiture exempt d'emballages alimentaires, leur odeur peut attirer les rongeurs.
  • Déplacez la voiture régulièrement, décourageant les vermines de s'installer. Et de temps en temps, klaxonnez avant de démarrer la voiture pour effrayer les créatures qui font la sieste.

Top 10 des expériences sur la respiration | Les plantes

Une fiole conique, un tube coudé, des graines en germination, de la potasse caustique dans un petit récipient, une coupelle au mercure.

Les graines en germination sont prélevées dans une fiole conique dans laquelle est également mis un récipient de potasse caustique. L'embouchure de cette fiole conique est fermée par un bouchon en liège à un seul trou à travers lequel est inséré un tube de verre coudé deux fois à angle droit. L'extrémité éloignée de ce tube est placée dans la coupelle de mercure. Maintenant, cet appareil est laissé au repos pendant un certain temps.

Le mercure à l'extrémité du tube de verre courbé s'élève à une hauteur de 15 cm.

Les graines en germination subissent une respiration aérobie car elles utilisent l'oxygène disponible à l'intérieur de la fiole conique. Comme tout l'oxygène est utilisé par les graines en germination, la pression à l'intérieur du ballon est diminuée. Par conséquent, par conséquent, le niveau de mercure s'élève à l'extrémité du tube de verre courbé.

Ce niveau n'atteint qu'une hauteur de 15 cm dans le tube de verre. Comme ce niveau est d'environ un cinquième de l'air. Comme l'oxygène constitue un cinquième de la composition totale, il est raisonnable de déduire que les graines ont utilisé ce gaz de l'air dans la respiration.

2. Expérience pour démontrer que l'énergie est produite sous forme de chaleur pendant la respiration :

Bouteille thermos (2), bouchon, thermomètre (2), 50 graines en germination, 50 graines sèches.

1. Prenez deux bouteilles thermos munies d'un bouchon uni-trou.

2. Dans un thermos, remplissez environ 50 graines en germination et dans l'autre remplissez environ 50 graines sèches.

3. Par le trou du bouchon, insérez un thermomètre dans chaque thermos de manière à ce que son bulbe soit enfoui dans les graines (Fig. 47).

4. Notez la température initiale dans le thermomètre et conservez-les ainsi pendant quelques heures. Notez la température finale.

Il n'y a pas de changement de température dans le thermomètre placé dans les graines sèches tandis que la température monte dans l'autre thermomètre qui est installé dans le thermos contenant les graines en germination.

Dans le cas des graines sèches, il n'y a pas de changement dans la lecture du thermomètre car elles ne subissent pas le processus de respiration. Mais une nette élévation de température en cas de graines en germination est évidemment due à la libération d'énergie thermique par le substrat respiratoire, c'est-à-dire les graines en germination.

3. Expérience pour démontrer la respiration aérobie :

Quelques graines ou boutons floraux en germination sont mis dans un flacon muni d'un bouchon en liège. Il faut prendre soin d'enlever toutes les parties vertes des boutons floraux, sinon le CO2, libéré sera aussitôt utilisé dans la photosynthèse.

Un tube de verre est inséré à travers le bouchon. Maintenant, un ou deux bâtons de potasse caustique sont introduits dans le ballon. Deux tampons de coton sont mis en place pour maintenir en place les boutons floraux et les bâtons de potasse caustique. Le ballon avec le tube est renversé sur un creux de mercure, coupant ainsi la connexion avec l'air extérieur. Il est fixé en position avec une pince et un support.

Au bout de quelques heures on constate que le mercure est monté dans le tube couvrant près d'un cinquième du volume total. Le volume de mercure levé peut à son maximum être un cinquième du volume total de la fiole, pour O2 dans l'atmosphère n'est que d'environ 20 %.

Cela est dû au fait que le dioxyde de carbone émis pendant la respiration a été absorbé par la potasse caustique produisant un vide partiel. L'oxygène présent dans le ballon a été utilisé pour la respiration. Le gaz qui reste dans le ballon est l'azote.

Nous savons que près d'un cinquième du volume d'air est constitué d'oxygène. Ainsi, cette expérience, en plus de montrer l'apport d'oxygène et l'émission de dioxyde de carbone, a également prouvé que le volume d'oxygène absorbé est presque égal au volume de dioxyde de carbone émis.

4. Expérience pour démontrer la respiration anaérobie :

Graines en germination, tube à essai, mercure, cristaux de KOH, boîte de Pétri, etc.

Le mercure est rempli dans le tube à essai jusqu'au bord. Prenez une boîte de Pétri pleine de mercure et mettez le tube à essai rempli de mercure à l'envers à l'aide du pouce. Le pouce est retiré à l'intérieur de la boîte de Pétri. Introduisez maintenant quelques graines (germinées ou trempées) dans l'éprouvette à l'aide d'une pince. Que cet appareil soit mis comme tel pour quelque temps.

Après un certain temps, le niveau de mercure dans le tube à essai baisse. Introduisez maintenant des cristaux de KOH dans le tube à essai ci-dessus. Au bout d'un moment, le niveau de mercure remontera à la position précédente.

L'abaissement du niveau de mercure dans le tube à essai indique que du gaz a été libéré par la germination des graines. CO seulement2 le gaz peut être absorbé par les cristaux de KOH. Nous voyons qu'avec l'introduction de cristaux de KOH le niveau de mercure devient élevé, d'où les graines ont libéré du CO2 dans des conditions anaérobies.

5. Expérience pour démontrer la production de dioxyde de carbone dans la respiration aérobie :

Bouteille, graines en germination, liège, bouchon, tube en verre, eau, tube à large goulot avec robinet, eau de chaux.

1. Prenez une bouteille à col large et placez-y quelques graines en germination.

2. Fermez le goulot de la bouteille avec un bouchon en liège à deux trous.

3. Insérez un tube en verre, courbé deux fois à angle droit, dans l'un des trous du bouchon et dans l'autre trou, insérez un tube à large goulot servant de réservoir d'eau et muni d'un robinet.

4. Plongez l'autre extrémité du tube en verre courbé dans l'eau d'un bécher (Fig. 43).

5. Gardez l'expérience telle quelle pendant quelques heures en laissant les graines respirer.

6. Remplacez maintenant le bécher rempli d'eau par un bécher rempli de chaux et ouvrez le robinet du réservoir d'eau pour permettre à l'eau d'entrer dans la bouteille contenant les graines.

Après un certain temps, les bulles d'air sortent et l'eau de chaux devient laiteuse.

L'eau de chaux devient laiteuse en raison du dioxyde de carbone dégagé pendant le processus de germination des graines. Lorsque l'eau est versée en ouvrant le robinet d'arrêt du réservoir d'eau, elle chasse l'air à travers le tube coudé, et lorsque l'air passe à travers l'eau de chaux, cette dernière devient laiteuse en raison du fait que l'air contient du dioxyde de carbone.

6. Expérience to démontrer ce qui suit dans la respiration des plantes en utilisant la méthode de l'autoclave :

je. Que les graines sèches pour ne pas respirer

ii. Que dans la respiration O2 absorbé est égal au CO2 libéré et

iii. que le CO2 est produit lors de la respiration.

Cornues (3), béchers (3), supports (3), graines trempées, graines sèches, solution saline, solution de potasse caustique.

1. Prenez trois cornues et connectez-les séparément avec trois supports séparés.

2. Dans le bulbe d'une cornue, introduire des graines sèches et plonger son tube dans un bécher rempli de solution de potasse caustique (fig. 45).

3. Dans le bulbe de la seconde cornue, introduire les graines trempées, et plonger son tube dans un bécher contenant une solution saline.

4. Dans le bulbe de la troisième cornue, introduire également les graines trempées et plonger son tube dans un bécher contenant une solution de potasse caustique.

5. Conservez l'appareil tel quel pendant quelques heures et observez.

Dans les première et deuxième cornues et béchers, il n'y a pas de changement, mais dans le troisième appareil, la solution de potasse caustique monte dans le tube de la cornue. Les conclusions pour ces trois conditions peuvent être tirées comme suit :

Dans le premier appareil, il n'y a pas de changement car les substrats respiratoires, c'est-à-dire les graines, sont secs et ne respirent pas. Si la respiration avait été là le CO2 libérée aurait été absorbée par la potasse caustique. Ainsi, finalement, la solution doit s'être précipitée dans le tube de la cornue. Donc, il n'y a pas de respiration.

Dans le second appareil également, il n'y a pas de changement car les graines trempées respirent. Ils absorbent l'oxygène présent dans la cornue et produisent une quantité presque égale de dioxyde de carbone. Maintenant parce que le dioxyde de carbone, ainsi libéré, est insoluble dans la solution saline, il n'y aura donc pas de changement.

Dans le troisième bécher, la solution de potasse caustique s'engouffre dans le tube de la cornue. C'est à cause du fait que les graines trempées respirent. Ils absorbent l'oxygène et libèrent une quantité égale de dioxyde de carbone. Le dioxyde de carbone ainsi libéré est absorbé par la potasse caustique et ainsi un vide est créé. Pour surmonter ce vide, une solution de potasse caustique se précipite dans le tube, indiquant le fait que pendant la respiration CO2 est produit.

7. Expérience to déterminer la valeur du quotient respiratoire (Q.R.) des substrats respiratoires suivants à l'aide du respiromètre de Ganong :

Respiromètre Ganong, substrat respiratoire, eau saline, potasse caustique, support, eau, papier filtre, bécher, balance avec boîte de pesée.

1. Versez de l'eau dans l'extrémité inférieure du bulbe du respiromètre, et en mettant un papier filtre introduisez des graines en germination (ou un autre substrat respiratoire dans le bulbe).

2. Remplissez maintenant partiellement le respiromètre avec de l'eau salée. L'utilisation d'eau salée est due au fait que le CO2 ne peut pas s'y dissoudre (fig. 51).

3. Tournez le bouchon de l'ampoule de manière à ce que les deux trous se trouvent juste en face l'un de l'autre. Dans cette condition, l'air extérieur peut passer dans les bulbes.

4. Ajustez maintenant le niveau du tube de nivellement et du tube gradué de manière à ce que la solution saline soit présente au même niveau dans les deux tubes.

5. Maintenant, tournez à nouveau le bouchon de manière à séparer les deux trous et à fermer l'ampoule.

6. Noter le niveau de l'eau saline et laisser respirer le substrat respiratoire pendant quelques heures.

7. Notez le niveau final. Introduisez un cristal de potasse caustique et notez les changements.

(A) Si le substrat respiratoire est un hydrate de carbone (par exemple, blé, maïs, avoine, gramme, pois, etc.) :

Observations et résultats :

Il n'y a pas de changement dans le niveau d'eau saline car dans les glucides le volume de l'O2 absorbé est égal au volume de CO2 libéré comme le montre l'équation suivante :

Le volume de CO2 libéré peut être estimé en ajoutant des cristaux de KOH. Ce dernier va absorber le CO2 produit par les graines résultant finalement dans l'élévation du niveau salin. Le volume de CO2 peut être calculé en déduisant le deuxième niveau du premier. Supposons qu'il soit de 35 cc.

Alors, R.Q. = Vol. de CO2/Vol. d'O2= 35/35 = 1

(B) Si le substrat respiratoire est gras (par exemple, graines de moutarde ou de ricin) :

Observations et résultats :

Dans le cas où le substrat respiratoire est gras, moins de quantité de CO2 sera libéré que le O2 absorbé. Un vide sera créé, et pour surmonter ce vide, le niveau de solution saline augmentera dans le tube. Cette augmentation sera égale à l'excès d'oxygène. Notons-le comme V1.

On peut le montrer par l'équation suivante :

Ajouter des cristaux de KOH dans une solution saline. Le niveau de solution saline augmente à nouveau car le KOH absorbe le CO2. Un vide est créé et pour le surmonter le niveau de solution saline augmente. Notons-le comme V2.

Calculer le volume de CO2 par V2 (en déduisant la deuxième montée de la première montée de niveau) et le volume de O2 en ajoutant à la fois les montées de niveau, c'est-à-dire V1+ V2.

(C) Si le substrat respiratoire est une plante succulente (par exemple, Cactus):

Observations et résultats :

Les plantes succulentes présentent une oxydation incomplète la nuit. Ainsi, si l'expérience se déroule de nuit ou si le bulbe est recouvert de papier noir, il y aura une oxydation incomplète des glucides.

Les acides organiques sont produits au cours du processus, comme le montre l'équation suivante :

Mais dans la journée, il y aura oxydation de ces acides organiques comme le montre l'équation suivante :

Alors R.Q. = 4/3 = 1,3, c'est-à-dire plus d'un.

(d) Si le substrat respiratoire est un acide organique :

Dans ce cas plus de quantité de CO2 est libéré par rapport à l'oxygène absorbé comme le montre l'équation suivante :

Ainsi, il y a une diminution initiale du niveau d'eau saline dans le tube gradué. Notons-le comme V1. Le niveau monte lors de l'ajout de solution de KOH car cette dernière absorbe le CO2 et donc le niveau augmente. Notons-le comme V2.

Alors, V1 équivaut à l'excès de dioxyde de carbone et V2 équivaut à la quantité totale de CO2 produit. Avec l'aide de cela, le volume de O2 absorbé sera V2– V1.

8. Expérience de mesure du quotient respiratoire (Q.R.) au moyen d'une paire de respiroscopes :

Respiroscopes (2), béchers (2), un petit tube, KOH, fil, support en bois, eau, graines féculentes comme le maïs, le blé etc., graines huileuses comme le ricin, la moutarde etc., thermomètre.

1. Fixez une paire de respiroscopes sur un support en bois.

2. Dans les parties gonflées des deux tubes, prélevez des quantités égales du matériau donné, c'est-à-dire des graines.

3. Un petit tube contenant du KOH est attaché dans l'un des tubes à l'aide d'un fil (Fig. 52).

4. Tremper les extrémités inférieures des deux tubes dans l'eau présente dans les béchers.

5. Fixer un thermomètre dans l'appareil pour noter la température à laquelle se déroule la respiration dans la matière.

6. Gardez les robinets des deux tubes ouverts et aspirez l'air à l'aide d'un tube en caoutchouc jusqu'à ce que l'eau dans les tubes gradués atteigne une marque prédéterminée. Le niveau initial dans les deux tubes doit être le même et notez-le.

7. Fermer immédiatement le robinet et rendre les tubes étanches. Attendez environ une heure et notez les niveaux finaux dans les tubes gradués.

8. Prenez d'autres substrats respiratoires, c'est-à-dire des graisses et des acides organiques et répétez l'expérience comme indiqué ci-dessus.

Dans le cas des glucides utilisés comme substrat respiratoire, le niveau d'eau reste inchangé dans le tube A mais augmente dans le tube B.

Si les graines grasses sont utilisées comme substrat respiratoire, le niveau d'eau monte dans les deux tubes.

Dans le cas où les acides organiques sont le substrat respiratoire, il y a une diminution du niveau d'eau dans le tube A tandis que le niveau d'eau monte dans le tube B.

Dans le cas des glucides, le niveau dans le tube A reste inchangé, indiquant que le CO2 libéré est égal au O2 absorbé dans la respiration.

Dans le tube B le niveau de l'eau monte car le CO2 libéré est absorbé par le KOH. Par elle, le CO2 le montant peut être calculé. Alors, R.Q. est 1.

Dans le cas où les graisses sont le substrat respiratoire, le niveau dans le tube A augmente car plus d'oxygène est absorbé et moins de CO2 est libérée. Pour surmonter cela, le niveau monte. L'augmentation du niveau du tube B est due au CO2 libéré dans la respiration. Alors, R.Q. peut être calculé, et il est inférieur à un.

Dans le cas où les acides organiques sont le substrat respiratoire, le niveau dans le tube A diminue, indiquant le fait que dans de tels cas, plus de quantité de CO2 est libéré et moins de quantité d'O2 est absorbé par la respiration. L'augmentation du niveau dans le tube B indique la quantité de CO2 libéré dans la respiration. Le résultat dans ce cas indique que R.Q. est plus d'un parce que C02 libéré est plus que le O2 absorbé dans le processus.

9. Expérience pour démontrer les enzymes respiratoires (oxydase, peroxydase, déshydrogénase et catalase) dans les tissus végétaux :

Pomme de terre, boîte de Pétri, gomme de gaïac (benzidine), alcool, eau, lampe à alcool, peroxyde d'hydrogène, chlorure de 2, 3, 5-triphényltétrazolium, tube à essai, etc.

1. Coupez une fine section transversale de pomme de terre avec un rajor et mettez-la dans une boîte de Pétri.

2. Immerger la coupe dans une solution alcoolique à 2 % de gomme de gaïa (benzidine). Attendez environ 15 minutes et observez les changements.

3. Prenez une autre tranche de pomme de terre fraîche, faites-la bouillir dans de l'eau et répétez la même procédure mentionnée ci-dessus aux points (1) et (2).

1. Prenez une autre section de pomme de terre fraîche et répétez la même procédure mentionnée ci-dessus aux points (1) et (2) pour l'oxydase.

2. Après 15 minutes, retirez toute la solution de gomme de gaïac (benzidine) en ajoutant une solution diluée de peroxyde d'hydrogène (3% H2O2 dans 30 parties d'eau).

3. Prenez une autre tranche de pomme de terre fraîche, faites-la bouillir dans de l'eau et répétez la même procédure que celle mentionnée ci-dessus aux points (1) et (2).

1. À une tranche mince de pomme de terre, ajoutez une solution à 0,5 % de chlorure de 2, 3, 5, triphényltétrazolium dans une boîte de Pétri et observez la couleur.

2. Prenez une autre section fraîche, faites-la bouillir avec de l'eau, répétez la même procédure mentionnée ci-dessus au point (1) et observez.

1.Prenez une fine tranche de pomme de terre, ajoutez-y une solution diluée de peroxyde d'hydrogène (1 partie de H2O2 dans 30 parties d'eau) et observez les changements.

2. Prenez une autre section fraîche, faites-la bouillir avec de l'eau, répétez la même procédure que celle mentionnée ci-dessus au point (1) et observez.

Observations et résultats :

Le développement de la couleur bleue est dû à l'oxydation de la solution alcoolique de gomme guaiacum (benzidine).

La couleur bleue se développe comme dans le cas de l'oxydase, mais la rapidité avec laquelle l'intensité de la couleur bleue se développe est modifiée. C'est parce qu'en présence de H2O2 les peroxydases oxydent divers substrats tels que les amines, les phénols, etc.

L'eau se forme lorsque H2O2 réagit avec des atomes d'hydrogène et des électrons en présence de peroxydase comme indiqué ci-dessous :

La couleur rouge se développe en raison de l'ajout de sel de tétrazolium.

C'est parce que les déshydrogénases éliminent l'atmosphère d'hydrogène pour oxyder le substrat. De tels atomes d'hydrogène sont reçus par les accepteurs, qui sont ainsi réduits.

Des bulles d'oxygène se dégagent.

Cela se produit parce que la catalase provoque la décomposition du peroxyde d'hydrogène en eau comme ci-dessous :

10. Expérience pour comparer les phénomènes de respiration et de photosynthèse :

Deux flacons à long col, deux auges contenant du mercure, des feuilles vertes fraîches, des fleurs, des cristaux de potasse caustique, des supports (2).

1. Prenez quelques feuilles vertes fraîchement cueillies et placez-les dans un flacon à long col.

2. Dans un autre flacon, placez quelques jeunes fleurs fraîchement cueillies.

3. Avec un peu d'eau, humidifiez les feuilles et les fleurs.

4. Retourner les deux flacons sur des auges contenant du mercure distinctes. Connectez les deux flacons au support pour les maintenir dans une position définie et maintenez l'ensemble de l'appareil en lumière diffuse. (Fig. 50).

5. Après environ 12 heures, insérez un cristal de potasse caustique dans les deux flacons et observez.

Dans le flacon contenant des feuilles vertes, il y a une légère élévation du niveau de mercure, mais une augmentation soudaine et importante du niveau de mercure est observée dans le flacon contenant les jeunes fleurs.

Dans le flacon contenant des feuilles vertes, la photosynthèse ainsi que la respiration se déroulent simultanément. L'O2 évolué dans le processus de photosynthèse est absorbé dans le processus de respiration. Au contraire le CO2 libérée dans la respiration est absorbée dans la photosynthèse. Parce que les processus se déroulent dans la lumière diffuse, le taux de photosynthèse n'est donc pas très élevé et du dioxyde de carbone peut s'accumuler dans le ballon et provoquer une petite augmentation du niveau de mercure après avoir été absorbé par la potasse caustique.

Dans le flacon contenant les jeunes fleurs, une augmentation soudaine et importante du niveau de mercure est observée car le processus de photosynthèse est absent et, dans le processus de respiration, l'accumulation de CO2 se passe continuellement dans le ballon. Les cristaux de potasse caustique absorbent le CO2 du ballon, provoquant l'augmentation soudaine du niveau de mercure.


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Voir la vidéo: 9 Signes Que tu es Plus Intelligent Que tu ne le Crois (Septembre 2022).


Commentaires:

  1. Tarif

    à emporter !!! ATP énorme !!!!

  2. Bonnar

    Probablement. Probablement.



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