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16.5 : Micro-rapport 4- Analyse de complémentation - Biologie

16.5 : Micro-rapport 4- Analyse de complémentation - Biologie


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Figure : La figure au cœur de ce micro-rapport est une figure à plusieurs panneaux montrant des plaques de répliques de souches qui ont été transformées avec des plasmides de surexpression. Reportez-vous aux instructions du Micro-rapport 1 pour voir comment configurer des figures avec plusieurs panneaux.

Matériaux et méthodes: Fournir des informations sur les procédures de transformation et de placage de réplique, ainsi que les médias utilisés dans les expériences. Dans la mesure du possible, reportez-vous au manuel de laboratoire, en notant les modifications que vous avez apportées aux procédures.

Souches et plasmides : Voir les micro-rapports 1 et 3.

Médias: Voir le micro-rapport 1.

Transformation: Une personne essayant de reproduire vos résultats devra connaître les détails de la procédure de transformation, car les efficacités de transformation varient considérablement et montrent une forte dépendance vis-à-vis des réactifs et des conditions d'incubation. Vous pouvez consulter le manuel du laboratoire.

Placage réplique : Il s'agit d'une procédure standard. Vous pouvez également consulter le manuel du laboratoire.

Résultats et discussion: Votre silhouette avec les plaques numérisées est le point central de cette section. Incluez un tableau de données unique avec l'efficacité de transformation calculée avec chaque plasmide et la capacité des souches transformées (O/N ou +/-) à se développer sur les différentes plaques de réplique.Les efficacités de transformation doivent être exprimées en nombre de cellules transformées/μg d'ADN plasmidique.

La section R&D devrait raconter une histoire sur la façon dont les répliques de plaques vous ont permis de décider si votre
La protéine Met est conservée entre les deux espèces de levure. Vous pouvez ou non avoir observé une complémentation. Le non-respect de la complémentation n'est pas nécessairement dû à une erreur expérimentale. (Quelles plaques servent de contrôle contre les erreurs expérimentales ?) La complémentation est un essai fonctionnel qui dépend à la fois de l'expression de la protéine de fusion et de la capacité de la protéine de fusion à catalyser une réaction dans la biosynthèse Met. Les protéines de fusion ont de grandes extensions C-terminales qui pourraient affecter leurs fonctions enzymatiques normales. Les résultats négatifs peuvent être tout aussi importants que les résultats positifs pour faire progresser la compréhension scientifique.

Si vous n'avez pas observé de complémentation, discutez des raisons possibles pour lesquelles cela a pu se produire et proposez des expériences futures qui pourraient aider à répondre à ces questions. Vous voudrez peut-être suggérer de nouvelles constructions plasmidiques pour des expériences supplémentaires. Vous pouvez également vouloir apporter des informations à partir de vos analyses BLASTP. (Qu'est-ce que la valeur E ?) Assurez-vous d'inclure suffisamment de justification pour que les expériences que vous proposez fournissent des données utiles.


Gary Ruvkun

Page d'accueil du département de biologie moléculaire du Massachusetts General Hospital :

Intérêts de recherche majeurs

mécanismes d'interférence des microARN et ARN, analyse génétique bactérienne et animale des interactions du microbiome, contrôle neuroendocrinien de la détoxification, de l'immunité et du vieillissement, vie sur d'autres planètes.

Parcours académique

1985 - aujourd'hui Asst, Assoc., professeur de génétique, Harvard Medical School
1982 ‑ 1985 Junior Fellow, Society of Fellows, Harvard University
1982 doctorat Université Harvard (biophysique)
1973 A.B. Université de Californie à Berkeley (biophysique)

Prix ​​Rosenstiel 2004, Brandeis University (avec Victor Ambros, Andy Fire, Craig Mello)
2008 Académie nationale des sciences
2008 Médaille Benjamin Franklin, Franklin Institute (avec Victor Ambros et David Baulcombe)
Prix ​​Albert Lasker 2008 pour la recherche médicale fondamentale (avec Victor Ambros et David Baulcombe)
Prix ​​international Canada Gairdner 2008 (avec Victor Ambros)
2008 Warren Triennial Prize, Massachusetts General Hospital (avec Victor Ambros)
Prix ​​Louisa Gross Horwitz 2009, Columbia University (avec Victor Ambros)
2009 Académie américaine des arts et des sciences
2009 Prix Shaul et Meira Massry (avec Victor Ambros)
2010 Académie Royale des Sciences, des Lettres et des Beaux-Arts de Belgique
2009 Académie nationale de médecine
Prix ​​Dan David 2011 (avec Cynthia Kenyon)
Prix ​​Paul Janssen pour la recherche biomédicale 2012 (avec Victor Ambros)
Prix ​​Longévité Fondation Ipsen 2013
Prix ​​Irving Wright 2013, Fondation américaine pour la recherche sur le vieillissement
Prix ​​Wolf de médecine 2014 (avec Victor Ambros)
Prix ​​Gruber Génétique 2014 (avec Victor Ambros et David Baulcombe)
2015 Breakthrough Prize in Life Sciences (avec Victor Ambros)
Prix ​​March of Dimes 2016 en biologie du développement (avec Victor Ambros)
2019 Société philosophique américaine

Activités professionnelles

2004 - présent Harvard Origins of Life Initiative
2006 - présent Broad Institute Associate
2015 - actuel Président, Comité d'examen scientifique, Smith Family Awards Program in Biomedical Research
2015 - présent Conseil consultatif scientifique de la Fondation médicale Paul Glenn
2018 - aujourd'hui Conseil consultatif scientifique de la California Life Sciences Company (Calico)

Passé
2003 - 2011 Comité d'organisation de la Harvard Microbial Sciences Initiative
2004 - 2007 Conseil consultatif national des NIH sur le vieillissement
2012 - 2014 Conseil consultatif scientifique de la Fondation médicale Ellison
2015 Fondation Vallée Professeur invité
2012 - 2017 NAS Space Studies Board, Committee on Astrobiology and Planetary Science
2017 - 2018 NAS Space Studies Board, Examen des processus d'élaboration des politiques de protection planétaire
2015 – 2019 Chaire, Section de génétique de l'Académie nationale des sciences
2018 - 2019 NASA Mars Sample Return Sterilization Working Group, Jet Propulsion Laboratory, Caltech

Conférences honorifiques invitées

1998 Conférence publique du Nippon Telephone and Telegraph Science Forum, Tokyo
2003 Harvey Conférencier, Université Rockefeller
2008 Conférence Jean Mitchell Watson, Université de Chicago
2012 Mendel 190e anniversaire Symposium, Brno, République tchèque
2013 60e anniversaire de la Double Helix, Cold Spring Harbor

Bibliographie

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Aide à la recherche

5 R01GM44619-27 NIH Contrôle de C. elegans lignée par des gènes hétérochroniques. 01/05/2091 - 30/11/20. Coûts directs 379 000 $ 648 090 $ Coûts totaux par an, 30 % d'effort.

5 R01 AG16636-21 NIH Bases génétiques et moléculaires de la longévité. 01.04.1999 - 28.02.21. 20% d'efforts. 262 835 $ Coûts directs, 457 333 $ Coûts totaux.

5 R01 AG043184-23 NIH Inositol signalisation dans la sénescence et la diapause de C. elegans. 20% d'efforts. 01/05/2096 - 31/03/2022 Période budgétaire : 01/09/2017 – 31/03/2018 Période du projet : 15/08/2012 – 31/03/2022 Coûts directs 276 999 $ Coûts totaux 473 668 $.

Grace Science Foundation : Régulation du protéasome par PNG-1/NGLY1 Chercheur principal : Gary Ruvkun Montant total de la subvention : 100 000 $ Date de début : 14 octobre 2016 Date de fin : 31 décembre 2020

L'Ataxia Accelerator de Friedreich soutient la recherche sur le gène du facteur d'assemblage des amas fer-soufre frh-1 recherche.
NUMÉRO DE LA PROPOSITION : 2020A011058 09/01/2020 au 07/14/2023

NASA NNH14ZDA001NMATISSE. Une recherche de génomes extraterrestres (SETG) : un détecteur in-situ de la vie sur Mars lié de façon ancestrale à la vie sur Terre. PI : Maria Zuber 5% d'effort. Ruvkun co-I, 5% d'effort. SETG mature en préparation pour le futur vol. Démontrer l'extraction et la purification d'acides nucléiques suivies d'un séquençage de nanopores à molécule unique de l'ADN. Année 1 970 392,25 $ 1er mai 2015 au 30 avril 2015. Année 2 958 467,88 $ 1er mai 2016 au 30 avril 2016, année 3 998 199,79 $ 1er mai 2017 au 30 avril 2018.

Financement d'une bourse postdoctorale au laboratoire Ruvkun :

1. Kurt Warnhoff, bourse postdoctorale Damon Runyon (jusqu'au 21 juin)

2. Josh Meisel, bourse postdoctorale Jane Coffin Childs (jusqu'au 21/08) plus un K99 sur le point de commencer.

Printemps 2007 Genetics 206 (avec Perrimon, Vidal). 6 conférences et débats.

Automne et printemps 2007, 2008 Sciences de la vie 190, directeur de cours, avec Schrag, Kolter, Cavanaugh.

2004 à 2012 Co-directeur, cours d'été Biologie du vieillissement, Laboratoire de biologie marine, Woods Hole

2016 Quatre conférences Astronomie 305, Thèmes de recherche sur l'origine de la vie.

Présentations invitées 2017 à 2020

2017 Jet Propulsion Laboratory, Caltech

Symposium 2017 sur les ARN de l'Institut Salk

Conférence Gordon 2017 sur la signalisation de l'insuline, Ventura

2017 Université de Californie, Davis

2017 Université de Californie, Santa Cruz

2017 Université de l'Alabama, Birmingham

2017 Fondation Grace, Palo Alto

2017 Centre médical du sud-ouest de l'Université du Texas

2017 Université de Californie, San Francisco, Biochimie et biophysique

2017 Institut canadien de recherches avancées, Toronto

Symposium 2018 Sanford Burnham sur les maladies génétiques rares, San Diego

2018 James Watson 90e anniversaire Cold Spring Harbor

2018 Banc d'ARN au chevet, Université du Massachusetts

Série de conférences distinguées du National Cancer Institute 2018

2018 Buck Institute Symposium 30 ans de recherche sur le vieillissement

Discussion sur les percées en 2018, Migration de la vie à travers la galaxie, Center for Astrophysics, Harvard

2019 Mars Sample Return Planetary Protection meeting, Jet Propulsion Laboratory, Pasadena Caltech

Discussion sur la percée en 2019, Migration de la vie à travers la galaxie, Berkeley

Réunion 2019 de l'Institut canadien de recherches avancées à Santa Cruz

Réunion Keystone 2019 sur l'inflammation et le métabolisme, Vancouver BC

Conférence de recherche Gordon 2019 sur le vieillissement, Sunday River Maine

Conférence Ketsen 2019, Andrus Aging Center, USC

2020 Université de Toronto, Centre de génomique Donnelly

Brevets délivrés

1. Délivré le 01/05/2001 Brevet américain n° 6 225 120 Outils thérapeutiques et diagnostiques pour les troubles de la tolérance au glucose.

2. Délivré le 08/10/2002 Brevet US n° 6,461,854 Méthodes de dépistage des composés utiles pour la prévention des infections ou de la pathogénicité.

3. Délivré le 19/08/2008 Brevet américain n° 7 414 169 Outils thérapeutiques et diagnostiques pour les troubles de la tolérance au glucose

Demandes de brevet

WO-2020162959-A1

Caroténoïdes pour traiter ou prévenir les nausées

US-2019255124-A1

Compositions et procédés pour améliorer la fonction mitochondriale

EP-3677909-A1

Méthodes et compositions pour inhiber la réponse de détoxification

US-2019024080-A1

Méthodes et compositions pour inhiber la réponse de détoxification

US-2017023551-A1

Outils et méthodes pour cibler la toxicité de l'ARN répété des oligonucléotides

US-2007087378-A1

Régulateurs du métabolisme des graisses polynucléotidiques et polypeptidiques et leurs utilisations

US-2005260652-A1

Compositions et méthodes qui modulent l'interférence ARN

WO-2005074560-A3

Compositions et procédés qui améliorent l'interférence de l'ARN

WO-2004113501-A2

Méthodes et compositions relatives à l'accumulation de lipides

WO-2004061087-A2

Méthodes et compositions d'inhibition de la mue des ecdysozoaires

US-2003086871-A1

Méthodes de criblage de composés utiles pour la prévention d'une infection ou d'une pathogénicité

US-2003181364-A1

Outils thérapeutiques et diagnostiques des troubles de la tolérance au glucose

US-7414169-B2

Outils thérapeutiques et diagnostiques pour les troubles de la tolérance au glucose

Méthodes de criblage de composés utiles pour la prévention des infections ou de la pathogénicité

HU-0002199-A2

Outils thérapeutiques et diagnostiques pour les troubles de la tolérance au glucose

CA-2287839-A1

Outils thérapeutiques et diagnostiques pour les troubles de la tolérance au glucose

Procédures d'essai des substances utiles pour la prévention des infections ou de la pathogénicité

HU-0002781-A2

Méthodes de criblage de composés utiles pour la prévention des infections ou de la pathogénicité

US-201016332-A1

Polypeptides de l'âge-1 et molécules et procédés associés

EP-0828520-A1

Méthodes de criblage de composés utiles pour la prévention d'une infection ou d'une pathogénicité


Introduction

La mobilisation des acides gras libres (FFA) des triglycérides stockés est un processus cellulaire fondamental qui est médié dans de nombreux tissus par l'interaction fonctionnelle du domaine alpha-bêta hydrolase 5 (ABHD5) avec la triglycéride lipase adipeuse (ATGL). Les mutations nulles ABHD5 perturbent la lipolyse et entraînent une accumulation ectopique de lipides chez Arabidopsis 1 , C. elegans 2,3, souris 4,5 et humains (syndrome de Chanarin-Dorfman 6). ABHD5 est essentiel pour l'activation de l'ATGL dans la graisse et le muscle où il intègre des signaux extracellulaires et intracellulaires dans le contrôle de la lipolyse 7,8,9. De plus, l'activation de la lipase par ABHD5 supprime la progression du cancer du côlon 10,11 et favorise la réplication virale de l'hépatite C 12 .

Les déterminants structurels de l'activation ABHD5 de l'ATGL sont mal compris. Bien qu'ABHD5 soit un membre de la famille des alpha-bêta hydrolases, il lui manque le nucléophile sérine de la triade catalytique consensus, et donc manque d'activité hydrolytique 8 . Dans les adipocytes, la fonction d'activation de la lipase d'ABHD5 est réprimée par sa liaison à la périlipine 1 (PLIN1), un échafaudage de gouttelettes lipidiques (LD).Les signaux extracellulaires qui activent la protéine kinase A (PKA) conduisent à la phosphorylation de PLIN1 et ABHD5 et stimulent la libération d'ABHD5, qui active ensuite ATGL 7,13,14. En outre, ABHD5 est la cible directe de ligands endogènes et synthétiques qui modulent sa fonction d'activation de la lipase en régulant ses interactions avec les protéines PLIN inhibitrices 9 . Bien que ABHD5 se lie à ATGL 8,15 et que les protéines PLIN régulent indirectement cette interaction 13,16,17,18, la base moléculaire de l'activation d'ATGL par ABHD5 reste incertaine.

Pour mieux comprendre le mécanisme d'activation de l'ATGL, nous avons effectué une analyse structurelle et évolutive comparative de ABHD5 et ABHD4, un paralogue fonctionnellement distinct présent chez les mammifères et les poissons osseux qui partage 50 à 55 % d'identité de séquence avec ABHD5. ABHD4 hydrolyse la n-acyl phosphatidylsérine et la n-acyl phosphatidyléthanolamine et ne favorise pas l'activité ATGL 19,20. Nous avons identifié deux acides aminés ABHD5 hautement conservés (R299 et G328) qui sont nécessaires à l'activation de l'ATGL par ABHD5 et suffisants pour permettre cette activité dans ABHD4 (ABHD4 N303R/S332G). Il est important de noter que l'analyse des mutants ABHD5 inactifs en lipolyse a démontré que l'activation de l'ATGL était dissociable de la translocation de l'ATGL à la surface LD et des interactions ABHD5 avec les protéines PLIN et les ligands synthétiques ABHD5. La modélisation structurelle basée sur l'analyse de forme a identifié une nouvelle surface fonctionnelle dans ABHD5 et un gain de fonction ABHD4 qui contient les résidus critiques pour l'activation de l'ATGL.


Discussion

Le phénotype des patients humains atteints d'anémie de Fanconi indique que la voie FA est importante pour le développement embryonnaire normal, le maintien de la stabilité génomique et la préservation de plusieurs types de cellules souches (Auerbach et al. 2001). La récente découverte que le gène du cancer du sein, BRCA2, est un gène FA (Howlett et al. 2002) a relié cette maladie rare à une forme courante de cancer. Néanmoins, la ou les fonctions précises de la voie FA/BRCA restent inconnues (D'Andrea et Grompe 2003). Nous et d'autres avons déjà créé des souches de souris avec des délétions ciblées de la souris Fanca, Fancc, et Fancg gènes, tous les composants du complexe nucléaire FA. Ces mutants ont des phénotypes très similaires (Chen et al. 1996 Whitney et al. 1996 Cheng et al. 2000 Yang et al. 2001 Koomen et al. 2002 Noll et al. 2002), soutenant un modèle dans lequel les composants du complexe participent dans une fonction commune. Pour déterminer si Fancd2 participe uniquement à cette fonction in vivo ou a des rôles supplémentaires, nous avons généré une souche de souris avec un allèle nul dans ce gène.

Des études antérieures ont suggéré que FANCD2 peut avoir des rôles uniques qui sont distincts des autres protéines FA. Premièrement, il agit en aval du complexe nucléaire FA et est la cible de la monoubiquitination médiée par le complexe (Garcia-Higuera et al. 2001 Timmers et al. 2001). Par conséquent, l'intégrité du complexe nucléaire FA n'est pas perturbée dans les cellules FA-D2, contrairement à d'autres groupes de complémentation (Garcia-Higuera et al. 1999 de Winter et al. 2000c). Deuxièmement, FANCD2 est la seule protéine FA connue pour former des foyers nucléaires après des dommages à l'ADN et pour se colocaliser avec les protéines de réparation BRCA1 et RAD51 (Garcia-Higuera et al. 2001 Taniguchi et al. 2002a). Enfin, FANCD2 est directement phosphorylé par ATM en réponse à l'IR mais pas en réponse aux ICL (Nakanishi et al. 2002 Taniguchi et al. 2002b). D'autres protéines FA ne sont pas connues pour être des cibles de la kinase ATM.

Malgré ces différences biochimiques, les patients FA-D2 humains ne diffèrent pas significativement sur le plan clinique des patients FA appartenant à d'autres groupes de complémentation (Timmers et al. 2001). Cependant, FA-D2 est un groupe de complémentation rare, et tous les patients humains rapportés à ce jour ont au moins un allèle mutant qui pourrait avoir une fonction résiduelle et, par conséquent, le phénotype d'un vrai FANCD2-mutation nulle est restée incertaine. Les Fancd2 les souris mutantes rapportées ici présentent toutes les caractéristiques des souches précédemment rapportées de souris FA knock-out, mais présentent également des différences importantes.

Fancd2, rayonnement ionisant et voie de signalisation ATM

Le Ser 222 de FANCD2 humain est phosphorylé par ATM en réponse à l'IR, et cette modification post-traductionnelle a été corrélée à une sensibilité accrue à l'IR dans les fibroblastes immortalisés (Taniguchi et al. 2002b). De plus, la phosphorylation de Ser 222 a été associée à un arrêt radio-induit de la synthèse d'ADN. Par conséquent, pour tester si Fancd2 a joué un rôle important dans la réponse à l'IR, la survie des cellules primaires isogéniques de Fancc mutant et Fancd2 les cellules mutantes ont été comparées. De façon intéressante, Fancd2-les cellules nulles n'étaient pas différemment sensibles à l'IR ou aux ICL par rapport à Fancc-cellules nulles. De plus, bien qu'une légère hypersensibilité à l'IR ait été observée in vivo (LD50 = ∼9,5 Gy), cette sensibilité n'était pas non plus supérieure à celle observée pour Fancc souris mutantes (Noll et al. 2001).

De plus, et contrairement à Au m mutants, Fancd2-les cellules déficientes n'ont pas présenté de synthèse d'ADN résistant aux radiations. Par conséquent, dans les cellules primaires murines, Fancd2 n'est pas nécessaire pour l'arrêt de la phase S médié par l'ATM après IR. Globalement, le phénotype de Fancd2 souris mutantes est significativement différente de celle des Au m-des souris nulles, qui présentent une sensibilité marquée aux rayonnements, un déficit immunitaire et des tumeurs hématologiques (Xu et al. 1996). Ensemble, nos observations suggèrent que Fancd2 ne joue pas un rôle significatif dans les réponses physiologiques à médiation ATM à l'IR. Peut-être que le FANCD2 humain et le Fancd2 murin diffèrent dans cet aspect de leur fonction, bien que les protéines soient hautement homologues et que Ser 222 soit conservé entre les espèces. Alternativement, Fancd2 peut jouer un rôle de médiateur de la fonction ATM dans seulement certaines circonstances spécifiques, par exemple, les fibroblastes immortalisés par l'antigène T.

Nouveaux phénotypes dans Fancd2 souris knock-out

Même si Fancd2 les souris mutantes ne diffèrent pas de façon mesurable de Fancc mutants en termes de réponse aux dommages à l'ADN, ils présentent certaines caractéristiques que l'on ne voit pas dans Fanca, Fancc, ou Fancg animaux mutants. Ces phénotypes comprennent la microphtalmie, la létalité périnatale, un hypogonadisme plus sévère et le développement tumoral. La fonction normale du complexe nucléaire FA est nécessaire à la monoubiquitination de FANCD2 en réponse aux dommages à l'ADN ou à la réplication de l'ADN (Garcia-Higuera et al. 2001 Taniguchi et al. 2002a). Par conséquent, deux modèles de base existent pour expliquer la divergence des phénotypes entre les mutants dans Fancd2 et les gènes du complexe nucléaire. Premièrement, la protéine Fancd2 non ubiquitinée, telle qu'elle est présente dans Fanca, Fancc, et Fancg souris knock-out, peuvent avoir une certaine activité résiduelle dans la fonction commune à la voie FA. Dans ce modèle, les knock-outs des gènes du complexe nucléaire seraient similaires à des mutations hypomorphes du Fancd2 gène. Les phénotypes seraient le résultat d'une déficience dans la même fonction biochimique, mais ils seraient plus sévères dans Fancd2 souris mutantes. Dans le deuxième modèle, FANCD2 est une protéine multifonctionnelle avec un domaine qui fonctionne dans la voie FA et d'autres domaines qui interviennent dans des fonctions non liées. Les phénotypes supplémentaires de Fancd2 les mutants seraient alors causés par une déficience de ces fonctions supplémentaires.

La plupart des caractéristiques observées dans Fancd2-les souris nulles peuvent être interprétées comme des manifestations plus sévères des défauts qualitativement similaires observés dans d'autres knockouts FA. Ceci est le plus évident avec les défauts des cellules germinales. Bien que le poids testiculaire soit nettement plus affecté dans Fancd2 souris mutantes, l'histologie est similaire à d'autres modèles FA. De même, nous avons observé une microphtalmie chez la descendance mutante de certains Fancc couples reproducteurs (M. Grompe, inédit), indiquant qu'il ne s'agit pas d'un phénotype vraiment nouveau mais d'une manifestation plus complète d'un défaut commun à toutes les souris FA. La susceptibilité accrue des cellules AF à la mort cellulaire par apoptose après des dommages à l'ADN pourrait fournir une explication commune à la carence en cellules germinales observée, à la microphtalmie, à la petite taille et à la létalité périnatale. Dans le cas de ces défauts de développement, les cellules répondraient à des dommages spontanés à l'ADN. Globalement, le phénotype de Fancd2 souris mutantes n'établit pas de manière convaincante l'existence de domaines fonctionnels supplémentaires dans la protéine Fancd2.

Fancd2, Brca2 et carcinomes

Bien que les patients humains atteints d'AF développent une variété de cancers, des tumeurs n'ont jamais été signalées chez les autres souris knock-out pour l'AF, même lorsqu'elles sont suivies à des âges très tardifs. En revanche, il est bien établi que les souris présentant une mutation tronquante dans Brca2 courent un risque accru de développer une variété de néoplasmes (Connor et al. 1997 McAllister et al. 2002). Fait intéressant, le spectre tumoral de la Brca2 souris hypomorphes était comparable à celle observée chez Fancd2 mutants (McAllister et al. 2002). Dans les deux cas, une prédisposition aux cancers épithéliaux a été observée et l'âge d'apparition était similaire. Brca2 les souris hypomorphes ont également d'autres similitudes telles qu'un défaut des cellules germinales de type FA, une petite taille et une létalité périnatale. Pris ensemble, ce chevauchement phénotypique étendu est cohérent avec l'hypothèse que le domaine C-terminal de Brca2 fonctionne dans la même voie que Fancd2.

Le BRCA2 humain est connu pour interagir avec et moduler l'activité de RAD51, un acteur central de la recombinaison homologue, et Brca2 les cellules mutantes sont connues pour avoir des défauts de recombinaison sans erreur (Moynahan et al. 2001b Tutt et al. 2001). Par conséquent, l'identification de Brca2 en tant que gène FA soutient un rôle pour la voie FA dans la réparation de l'ADN par recombinaison. Cette hypothèse est renforcée par l'observation que les chromosomes au stade pachytène de la méiose se désapparient, comme décrit ici. Une fonction potentielle de la voie FA pourrait être de contrôler l'interaction entre Rad51 et Brca2 et ainsi moduler les événements de recombinaison homologue sur les sites de dommages à l'ADN. Cependant, l'analyse par Western blot de Fancd2 les tissus mutants ont montré des niveaux normaux de Rad51 ainsi qu'une interaction normale des protéines Brca2 et Rad51 comme déterminé par co-immunoprécipitation. De plus, la formation de foyers Rad51 suite à des dommages à l'ADN était normale dans Fancd2 –/– MEF. Ainsi, nos données ne supportent pas un modèle simple dans lequel la voie FA contrôle la stabilité/le taux d'interaction Brca2/Rad51.

Chez l'homme, l'hétérozygotie pour l'inactivation BRCA2 Les mutations germinales sont associées au cancer du sein, de l'ovaire et du pancréas, toutes des tumeurs d'origine épithéliale. On ignore actuellement pourquoi ces tissus sont particulièrement touchés, mais il est intéressant de noter que les tumeurs épithéliales chez les rongeurs ont été associées à un raccourcissement des télomères (Artandi et al. 2000 Chang et al. 2001). Les patients AF humains sont connus pour présenter des télomères significativement raccourcis dans les cellules hématopoïétiques (Leteurtre et al. 1999 Adelfalk et al. 2001 Brummendorf et al. 2001 Hanson et al. 2001), et il est donc intéressant de supposer que la voie FA/BRCA pourrait être impliqué dans le maintien des télomères dans certains tissus.

L'incidence élevée de tumeurs épithéliales observée dans Fancd2 mutants ici soulève également la question de savoir si FANCD2 pourrait être un gène important dans certains cancers épithéliaux humains, en particulier du sein et des ovaires. Il est important de noter que certains cas de cancer de l'ovaire familial ont été précisément liés à la région où FANCD2 réside dans le génome humain (Sekine et al. 2001 Simsir et al. 2001 Zhang et Xu 2002). De futures études sur des patients humains atteints de ces troubles seront nécessaires pour déterminer si les gènes FA jouent un rôle dans les cancers humains sporadiques ou héréditaires.


16.5 : Micro-rapport 4- Analyse de complémentation - Biologie

1) Description : La manipulation génétique de cellules de mammifères cultivées représente une approche expérimentale moderne majeure des questions de différenciation cellulaire, de régulation génique, de structure et de fonction cellulaires ainsi que de processus génétiques authentiques tels que la mutation et la recombinaison. La manipulation génétique de loin la plus courante est la transfection de cellules de mammifères avec des gènes clonés. La puissance de cette procédure a transformé presque tous les laboratoires travaillant avec des cellules de mammifères cultivées en un laboratoire de génétique des cellules de mammifères, et aucun cours ne pouvait traiter de telles expériences de manière unifiée. Ce cours comprendra une certaine considération du processus de transfection en soi ainsi que des transfections inhérentes aux travaux les plus récents. Cependant, l'accent sera également mis sur trois autres manipulations génétiques distinctes : (1) la mutation et l'isolement et l'exploitation de mutants (2) la juxtaposition de génomes à l'aide d'hétérocaryons et d'hybrides formés par fusion cellulaire et (3) la recombinaison homologue. Ces manipulations représentent le plus souvent des outils génétiques plutôt que des processus étudiés à part entière, et elles seront pour la plupart discutées dans ce sens. En conséquence, les lectures comprendront diverses questions biologiques comme sujets de ces approches. Les lectures et conférences sont conçues pour fournir un contexte conceptuel et historique à ces approches et un échantillon des travaux actuels de ce type. Si le temps le permet, nous étudierons certaines des méthodes de biologie moléculaire utilisées dans ces études.

2) Format : Les réunions hebdomadaires de 2 à 2,5 heures (les jeudis 2 à 4 ou 4:30 dans la salle 800) comprendront à la fois des conférences et des présentations d'articles dans la littérature classique et actuelle. Après les premières réunions, qui seront principalement des conférences, il y aura une discussion sur la lecture de la semaine. Les étudiants seront invités au hasard à commenter l'une des lectures ou à présenter un court résumé. Le commentaire peut être une question détaillée, une critique ou une nuance d'une conclusion, ou une conclusion particulièrement intéressante ou importante. Il y aura également une présentation pré-arrangée d'un document en détail (voir ci-dessous). Après la discussion et la présentation des étudiants, il y aura une conférence (

30 minutes) qui fournit un aperçu/contexte de la lecture assignée pour la semaine à venir.

3) Présentations des étudiants : Chaque étudiant sera responsable de 1 à 2

présentations d'une trentaine de minutes d'articles au cours du semestre. Une lecture de fond sera nécessaire pour faire une bonne présentation. Les étudiants peuvent substituer leur propre choix pour un papier plutôt que celui indiqué pour une session, avec l'approbation (bien à l'avance) par l'instructeur. Les étudiants peuvent travailler en équipe pour ces présentations s'ils souhaitent qu'une présentation d'équipe compte pour la moitié d'une présentation pour chaque membre de l'équipe.

4) Examens et notation : Il y aura un court document comme devoir à mi-parcours. Le sujet est la proposition d'une expérimentation à partir des thèmes abordés jusque-là. La proposition pourrait être une extension du travail décrit dans les documents lus. Les articles doivent être envoyés par courrier électronique et seront publiés sur le site Web du cours pour une éventuelle discussion plus tard dans le cours, si le temps le permet. Il y aura un examen final écrit à la maison, conçu pour être répondu en une heure. Les notes seront basées sur les présentations (25 %), l'examen de mi-session (20 %), l'examen final (25 %) et la capacité de fournir un commentaire/une question significatif sur la lecture (30 %, sur la base de la proportion de commentaires réussis (sur un base tout ou rien : 0 ou 1) par requête Le dernier paramètre est évidemment conçu pour favoriser la lecture en temps opportun et la participation en classe.

5) Préparation : Ce cours est destiné aux étudiants diplômés en biologie, mais est ouvert aux étudiants de premier cycle ou de troisième cycle qui ont une connaissance de la biochimie, de la génétique et de la biologie moléculaire au niveau intermédiaire du premier cycle et une certaine familiarité avec la biologie cellulaire. Toutes les lectures seront tirées de la littérature scientifique.

6) Calendrier des conférences et sujets de discussion (sous réserve de modifications)

Session DateSujet de cours
1 1/20 Lignées cellulaires. Mutation. Taux de mutation spontanée. Le problème de la diploïdie. Mutagenèse.
2 1/27 Lignées cellulaires. Mutation. Mutagenèse. Le problème de la diploïdie. Pas de présentation étudiante. Sélection de mutants. Voies métaboliques exploitables. La résistance aux médicaments. FACS. Anticorps.
3 2/3 Sélection de mutants. Fusion cellulaire. Hétérocaryons.
4 2/10 Fusion cellulaire. Hétérocaryons. Cellules hybrides : complémentation. Dominance/récessivité. Extinction des phénotypes différenciés
5 2/17 Cellules hybrides : extinction des phénotypes différenciés Transfection. Co-transfection. Clonage de gènes transfectés.
6 2/24 Transfection. Clonage de gènes transfectés. Recombinaison. Ciblage génétique, knock-out, remplacement. Effets de la position des gènes. Éléments de frontière de gène.
7 3/2 Ciblage génétique. KO de gène. Remplacement de gène. Effets de la position des gènes. Instabilité génétique. Génétique des cellules cancéreuses. Gènes suppresseurs de tumeurs. Instabilité génétique.
8 3/9 Génétique des cellules cancéreuses. Gènes suppresseurs de tumeurs. Instabilité génétique. Amplification des gènes. Co-amplification de gènes transfectés. Pas de mission, mais un document de mi-parcours est attendu lors de la prochaine réunion.
3/16 Vacances de printemps Vacances de printemps
9 3/23 Discussion sur les méthodes et rattrapage. Plus d'instabilité génétique. Cellules mutantes : mutants de transduction du signal, mutants d'épissage d'ARNm, mutants du métabolisme du cholestérol
10 3/30 Cellules mutantes Identification des gènes par transfection : déclencheurs de la différenciation des cellules musculaires - (1) MyoD (2) 3' UTR
11 4/6 Identification des gènes par transfection : déclencheurs de la différenciation musculaire - (1) MyoD (2) 3' UTR Blocage phénotypique induit par la transfection
12 4/13 Blocage phénotypique induit par la transfection Isolement de molécules mutantes par SELEX.
13 4/20 Isolement de molécules mutantes par SELEX. brassage d'ADN. Caractérisation des mutants par microarrays ?
14 4/27 brassage d'ADN. Caractérisation des mutants par microarrays ?

Biol. G4054y Semaine 1 20 janvier 2000 Session 1

Lignées cellulaires de mammifères
Le problème de la diploïdie et de l'hétéroploïdie
Mesure des taux de mutation spontanée. Taux vs fréquence. Analyse des fluctuations.
Mutagenèse. Agents chimiques et physiques. Dosage. Période d'expression. Coopération métabolique.
Mutations dominantes vs mutations récessives
Spécificité mutagène. Spectres mutationnels. Spécificité du brin.

Lecture à discuter la prochaine fois :

1. La plupart des loci sont diploïdes même dans les cellules CHO
Siciliano, M.J., J. Siciliano et R.M. Humphrey. 1978. Mutants de décalage électrophorétique dans les cellules d'ovaire de hamster chinois : Preuve de la diploïdie génétique. Proc. Natl.Acad.Sci. États-Unis 75 : 1919-1923.

2. Les deux brins d'ADN sont différemment sensibles à la mutagenèse
Carothers, A.M., J. Mucha et D. Grunberger. 1991. Mutations spécifiques à un brin d'ADN induites par (")-3?,4?-dihydroxy-1?,2?-époxy-1,2,3,4-tétrahydrobenzo[c]phénanthrène dans le gène de la dihydrofolate réductase. Proc. National Acad. Sci. États-Unis 88 : 5749-5753

3. Les mutations se produisent de manière aléatoire et comment mesurer le taux de mutation spontanée .
Luria, S.E. et M. Delbrüumlck. 1943. Mutations de bactéries de la sensibilité aux virus à la résistance aux virus. Génétique 8:491-511. Réimprimé dans « Papers on Bacterial Genetics », E. Adelberg, éd. Little Brown, Boston, 1960.p. 3-24. Voir en variante une description plus courte dans G. Stent, "Molecular Genetics," Freeman, San Francisco, 1971, pp. 148-157. En plus d'être un article vraiment classique en génétique qui montre la nature aléatoire de la mutation, cet article décrit l'utilisation de l'analyse de fluctuation comme moyen de mesurer le taux de mutation spontanée, ce qui s'avère n'est pas facile à faire. Vous n'avez pas besoin de suivre tous les calculs pour voir ce qui se faisait ici, alors relisez-le quand même.

4. Une base biochimique pour l'immortalisation de lignées cellulaires cultivées.
A.G. Bodnar, M. Ouellette, M. Frolkis, S.E. Holt, C. Chiu, G.B. Morin, C.B. Harley, J.W. Shay, S. Lichtsteiner, W.E. 16 janvier 1998. Science 279 : 349-352. Extension de la durée de vie par l'introduction de la télomérase dans les cellules humaines normales. http://www.sciencemag.org/feature/data/telomerase/telomerase.shl

Allèles instables
Adair, G.M., R.S. Nairn, K.A. Brotherman et M.J. Siciliano. 1989. Les hétérozygotes CHO APRT spontanés reflètent une délétion à haute fréquence, spécifique d'un allèle, du gène APRT du chromosome Z4. Somat. Molec cellulaire. Genet. 15 : 535-544

Perte d'hétérozygotie par perte de chromosomes
Li-C-Y. Yandell-D-W. Petit-J-B. 1992 . Mécanismes moléculaires de la perte spontanée et induite d'hétérozygotie dans les cellules humaines in vitro. Somat-Cell-Mol-Genet. 18 : 77-87.

Les mutations multiples peuvent ne pas se produire indépendamment
Li-C-Y. Yandell-D-W. Petit-J-B. 1992. Preuve de mutations coïncidentes dans des clones de lymphoblastes humains sélectionnés pour la perte fonctionnelle d'un gène de la thymidine kinase. Mol. Carcinogenèse. 5 : 270-7. (à la bibliothèque P&S)

Une sous-population de cellules traitées au mutagène continue de muter à haute fréquence pendant de nombreuses générations
Little JB, Nagasawa H, Pfenning T, Vetrovs H. Radiat Res 1997 Oct148(4):299-307. Instabilité génomique radio-induite : effets mutagènes et cytogénétiques retardés des rayons X et des particules alpha.

Traiter le problème de ploïdie pour isoler les mutants récessifs : sélection par force brute des doubles mutants
Chasin, L.A., 1974. Mutations affectant l'activité de l'adénine phosphoribosyltransférase dans les cellules de hamster chinois. Cellule 2 : 37-41

La ploïdie peut être un problème pour isoler les mutants récessifs, l'importance de la densité cellulaire et du temps d'expression.
Chasin, L.A., 1973. L'effet de la ploïdie sur la mutagenèse chimique dans des cellules de hamster chinois en culture. J. Cell. Physiol. 82 : 299-308

Quels types de modifications de l'ADN se produisent spontanément dans les cellules de mammifères ?
Zhang, L-H., H. Vrieling, A.A. van Zeeland et D. Jenssen. 1992. Spectre de mutations se produisant spontanément dans le gène hprt des cellules de hamster chinois V79. J. Mol. Biol. 223 : 627-635.

Des mutants affectés dans le génome mitochondrial peuvent également être sélectionnés.
Hofhaus, G. et G. Attardi. 1995. Sélection et caractérisation efficaces des lignées cellulaires humaines qui sont défectueuses dans les sous-unités codées par l'ADN mitochondrial de la NADH déshydrogénase. Mol. Cellule. Biol. 15:964-974 (correction 15:3461)

G4054y Semaine 2 27 janvier 2000 Session 2

Conférence : Sélection de mutants

Voies métaboliques exploitables : biosynthèse des purines et des pyrimidines. Biosynthèse des acides aminés.
Résistance aux médicaments : 6-thioguanine (TG), 5-bromodésoxyunridine (BrdU, BUdR), ouabaïne
FACS (Trieur de cellules activé par fluorescence)
Anticorps. Lyse avec complément. Auxotrophes. Mutants thermosensibles : suicide au tritium.
Sélection Sib, placage réplique
Sélection de révertants
Période d'expression
Effets de densité cellulaire : alimentation croisée, coopération métabolique.

Lecture à discuter la prochaine fois :

1. Auxotrophes via le suicide BrdU
Kao FT, Puck TT. Proc Natl Acad Sci U S A 1968 60 : 1275-81. Génétique des cellules somatiques de mammifères, VII. Induction et isolement de mutants nutritionnels dans des cellules de hamster chinois.

2.La coloration indicatrice de mutation tue le mutant, qui peut être isolé par "sélection de clan"
Rosenstraus M, Chasin LA. Proc Natl Acad Sci U S A 1975 72 : 493-7. Isolement de mutants de cellules de mammifères déficients en activité glucose-6-phosphate déshydrogénase: liaison à l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase.

3. Identification des mutants par détection du produit sécrété (échec de la sécrétion).
Coffino P, Scharff MD. Proc Natl Acad Sci U S A 1971 J 68 : 219-23 Taux de mutation somatique dans la production d'immunoglobulines par les cellules de myélome de souris.

4. Tour de force de plusieurs techniques modernes (beaucoup n'ont pas encore été abordées, mais faites de votre mieux).
Rice GC, Goeddel DV, Cachianes G, Woronicz J, Chen EY, Williams SR, Leung DW. Proc Natl Acad Sci U S A 1992 89 : 5467-71. Criblage par mutagenèse aléatoire par PCR de protéines sécrétées par expression directe dans des cellules de mammifères.

Résistance aux médicaments, avec une manipulation fine du dosage
Jones, GE et Sargent, PA. 1974. Cellule 2 : 43-54. Mutants de cellules de hamster chinois en culture déficientes en adénine phosphoribosyltransférase.

Sélection pour le génotype au lieu du phénotype.
Khrapko K, Coller H, Andre P, Li XC, Foret F, Belenky A, Karger BL, Thilly WG Nucleic Acids Res 1997 25 : 685-693 Spectrométrie mutationnelle sans sélection phénotypique : ADN mitochondrial humain.

Placage de répliques de cellules de mammifères.
Stamato TD, Jones C Somatic Cell Genet 1977 3: 639-47. Isolement d'un mutant CHO-K1 déficient en lactique déshydrogénase A par placage de répliques en tissu de nylon.

Sélection de mutants amateurs impliquant un criblage de colonies
Nagan N, Hajra AK, Das AK, Moser HW, Moser A, Lazarow P, Purdue PE, Zoeller RA Proc Natl Acad Sci USA 1997 Apr 2994(9):4475-4480 Une lignée cellulaire de fibroblastes défectueuse en alkyl-dihydroxyacétone phosphate synthase : un nouveau défaut dans la biosynthèse du plasmalogène.

Sélection de résistance aux médicaments plus sophistiquée
Nohturfft A, Hua X, Brown MS, Goldstein JL Proc Natl Acad Sci USA 1996 novembre 2693 (24) : 13709-13714. La substitution récurrente G-à-A dans un seul codon de la protéine d'activation du clivage SREBP provoque une résistance aux stérols dans trois lignées cellulaires mutantes d'ovaire de hamster chinois.

Biol. G4054y Semaine 3 3 février 2000 Session 3

Cours 3 : Fusion cellulaire - Heterokaryons.

Agents fusogènes : PEG, virus Sendai (promoteur des syncytia, comme le VIH).
Hétérocaryons. Hybrides.
Cytoplastes (cellules énucléées de cytochalasine), caryoplastes, cellules reconstruites, hérédité mitochondriale [CAP R , valinomycine R ])
Microcellules (via des micronoyaux induits par le colcémide + cytochalasine) et fusion. Voir ci-dessous pour la cartographie)

Edidine : motilité des protéines de la membrane plasmique

Complémentation (par exemple, X. pigmentosum ADN non programmé syn. [réparation])

Etudes de régulation génique : Contrôle du cycle cellulaire (Rao et Johnson) :

G2 x S = pulvérisation de S, G2 --> M retardé pas de syn ADN dans G2 nuc.
G1 x S = S dans les deux. Les chromosomes G1 sont de bons substrats pour l'ADN syn (n'attendez pas)
G1 x G2 = G1 --> S normal, G2 --> M retardé, G2 n'inhibe pas la synthèse d'ADN de G1

Réactivation des noyaux pycnotiques (Henry Harris, erthyrocytes de poule x HeLa)
RBC = le noyau du cytoplasme négligeable gonfle Hu nuc. Ag les nucléoles s'agrandissent, ARN syn produits de poussin = surface Ag HPRT synthèse d'ADN (H. Harris)

Simulation de fusion virale VIH : cellule de souris CD4+ + cellule CHO GP120/GP41+. Tester les réactifs thérapeutiques (par exemple, les protéines compétitrices du sCD4)

Activation de gènes spécialisés (gènes musculaires dans les cellules non musculaires - aperçu) (article à discuter la prochaine fois)

Fusion transitoire pour analyse biochimique (FB x GH3 -> PRL-CAT dans les fibroblastes) (article à discuter la prochaine fois)

Lecture à discuter la prochaine fois : 1. Activation de gènes spécialisés dans les hétérocaryons
Blau, H., C.-P. Chiu et C. Webster. 1983. Activation cytoplasmique de gènes nucléaires humains dans des hétérocaryons stables. Cellule 32 : 1171-1180.

2. Utiliser des hétérocaryons pour prouver que certains hnRNP sortent puis retournent dans le noyau
Pinol-Roma S et G. Dreyfuss. 1992. La navette des protéines de liaison pré-ARNm entre le noyau et le cytoplasme. Nature 355:730-2

3. Une expérience de fusion transitoire pour montrer la présence d'activateurs de gènes spécialisés dans les cellules hypophysaires
Lufkin, T. et Bancroft, C. 1987. Identification par fusion cellulaire de séquences de gènes qui interagissent avec des facteurs agissant en trans positifs. Science 237 : 283-286 Suggestions supplémentaires :

Utilisation d'hétérocaryons pour effectuer une analyse de complémentation entre des mutants de réparation d'ADN
Kraemer et al. 1975. Hétérogénéité génétique dans Xeroderma pigmentosum : groupes de complémentation et leur relation avec les taux de réparation de l'ADN. P.N.A.S. 72 : 59-63

Contrôle du cycle cellulaire dans les hétérocaryons formés entre les cellules à différents stades du cycle cellulaire
Rao, P. et R.T. Johnson 1970. Fusion de cellules de mammifères : I. Études sur la régulation de la synthèse de l'ADN et de la mitose. Nature 225 : 159-164

Trans-activation de gènes dormants par exposition à un cytoplasme différent dans des hétérocaryons
Harris, H. 1965. Comportement des noyaux différenciés dans les hétérocaryons de cellules animales de différentes espèces. Nature 206 : 583-588.

La fluidité de la membrane cellulaire est démontrée car des hétérocaryons sont formés par fusion cellulaire
Frye, L.D., et M. Edidin. 1970. Le mélange rapide des antigènes de surface cellulaire après la formation d'hétérocaryons souris-humains.

L'utilisation la plus étendue des hétérocaryons pour sonder les déterminants de la différenciation cellulaire
Blau, H. 1985. Revue de ses travaux sur les hétérocaryons myoblastes. Sciences 230 : 758

Utiliser des hétérocaryons pour révéler la présence de facteurs régulateurs positifs spécifiques au muscle
Miller, S.C., G.K. Pavlath, B.T. Blakely et S.M. Blau. 1988. Les composants des cellules musculaires dictent l'expression des gènes des hépatocytes et la distribution de l'appareil de Golgi dans les hétérocaryons. Gènes et Dev. 2 : 330-340.

Début de l'extinction peu après la fusion cellulaire
Junker S, Lamm M, Nielsen V, Matthias P. J Cell Sci 1997 Oct110 ( Pt 20):2579-2587 L'extinction de l'expression du gène des immunoglobulines dans les cellules B lors de la fusion avec les cellules HeLa est précédée d'une déplétion nucléaire rapide des facteurs de transcription essentiels et est accompagnée d'une inactivation généralisée des gènes exprimés de manière spécifique aux cellules B.

(Biol G4054 Liste de lecture 2 : Semaines 4 et 5 : 10 et 17 février 2000)

Biol. G4054y Semaine 4 : 10 février 2000

Conférence : Fusion cellulaire - hybrides cellulaires
Sélection de véritables cellules hybrides (fusion nucléaire)
Pour : cartographie complémentation analyse dom./évidement. et un contrôle génétique différencié.
Sélection HAT (TK - x HPRT - ) Hybridizer universel (ex., oua R HPRT - x WT) exog. gènes : neoR=G418R
Fréquences : hétérocaryons = 10 %, hybrides = 0,1 % (cycle cellulaire ? la synchronisation aide)
Sélection sans marqueurs (poisons : ricine x dipth. toxine iodoacétamide x DEPC ?)
Cellules reconstruites de cybrides
Évaluation de la dominance par rapport à la récessivité (par exemple, MTX R : permeat=recess, other=dom :par exemple, enzymes plus intelligentes, loci amplifiés).
Tests de complémentation (gly [4] , ade [-9] auxotrophie)
Cartographie génétique
Hybrides intraspécifiques et ségrégation rapide des chromosomes
Ségrégation concordante. Suivez via : bandes chromosomiques, peinture chromosomique, isozymes, PCR.
Panneaux permanents souris-humain et hamster-humain (différents combos humains).
(5 hybrides peuvent dire toutes les synténies : 5 bits=32 : 1-6 1-8,17-24 1-4,9-12,17-20 12, 56,etc impair)
Fusion de microcellules de panneaux de chromosomes humains uniques
Cartographie sous-chromosomique : hybrides de rayonnement de translocations naturelles (en lecture pour la prochaine fois)
Extinction ou activation de gènes tissu-spécifiques :
mélanomes et pigmentation (Ephrussi, Davidson)
hépatomes : albumine, enzymes hépatiques (Weiss). Indépendance (via la ségrégation) vs programmatique (variantes dédifférenciées)
dosage et activation des gènes (nucléaires) (Darlington)
extinction mutuelle (mélanome X hépatome) (Weiss)
extinction = répression génique, répression activateur, dilution activateur ??
Méthylation de novo
Exemple Karin : hypophyse x FB = prolactine : l'extinction est corrélée au manque d'activateur pit-1 (en lecture) :
Cartographie des extincteurs (Fournier [2 articles])
Définir la cible cis pour l'extinction : l'article d'Eckhardt sera discuté la prochaine fois

Hybridation cellulaire : mécanismes d'extinction

Lecture à discuter la prochaine fois :
1. Comment sélectionner des hybrides cellulaires
Littlefield, J. 1964. Sélection d'hybrides à partir d'accouplements de fibroblastes in vitro et de leurs recombinants présumés. Sciences 145 : 709-710.

2. Un exemple de cartographie génique intra-chromosomique utilisant l'hybridation cellulaire
Gyapay G, Schmitt K, Fizames C, Jones H, Vega-Czarny N, Spillett D, Muselet
D, Prud'Homme JF, Dib C, Auffray C, Morissette J, Weissenbach J, Goodfellow
PN (1996) Une carte hybride de rayonnement du génome humain. Hum Mol Genet 1996 Mar5(3):339-46

3. L'extinction peut impliquer la régulation de l'expression du facteur de transcription.
McCormick, A., D. Wu, J.L. Castrillo, S. Dana, J. Strobl, E.B. Thompson et M. Karin. 1988. L'extinction de l'expression de l'hormone de croissance dans les hybrides de cellules somatiques implique la répression du trans-activateur spécifique GHF-1.

4. Utilisation de transgènes sélectionnables pour montrer l'extinction affectant les éléments amplificateurs classiques,
Yu, H., Porton, B., Shen, L.Y. et Eckhardt, L.A. 1989. Rôle du motif octamère dans l'extinction des cellules hybrides de l'expression du gène des immunoglobulines : l'extinction est dominante dans un système à deux amplificateurs. Cellule. 58 : 441-8l 55 : 379-389. Suggestions supplémentaires :

Construction d'une carte à l'échelle du génome à l'aide d'hybrides de rayonnement.
Stewart EA, et al. Genome Res 1997 mai 7:5 422-33. Une carte hybride de rayonnement basée sur STS du génome humain.

Des cellules d'hépatome variant dédifférenciées peuvent être isolées et elles éteignent les gènes spécifiques du foie
Deschatrette, J. et M.C. Weiss. 1975. Extinction des fonctions spécifiques du foie dans les hybrides entre les cellules d'hépatome de rat différenciées et dédifférenciées. Genet des cellules somatiques. 1 : 279-292

L'extinction peut être une rue à double sens
Fougère, C. et M.C. Weiss. 1978. Exclusion phénotypique dans les cellules hybrides de mélanome de souris et d'hépatome de rat : la production de pigment et d'albumine ne sont pas réexprimées simultanément

L'extinction des gènes spécifiques du foie peut se produire via un niveau élevé d'activité catalytique de la protéine kinase A
Jones KW, Shapero MH, Chevrette M, Fournier RE. Cellule 1991 septembre 666(5):861-872. Clonage par hybridation soustractive d'un extincteur tissu-spécifique : TSE1 code pour une sous-unité régulatrice de la protéine kinase A.
et
Boshart M, Weih F, Nichols M, Schutz G. Cell 1991 Sep 666 (5) : 849-859 Le locus extincteur spécifique au tissu TSE1 code pour une sous-unité régulatrice de la protéine kinase dépendante de l'AMPc.

L'extinction affecte de nombreux facteurs de transcription.
Nitsch, D., M. Boshart et G. Schutz. 1993. L'extinction de l'activité du gène de la tyrosine aminotransférase dans les hybrides de cellules somatiques implique la modification et la perte de plusieurs activateurs transcriptionnels essentiels. Gènes & Devel. 7 : 308-319

Extinction des facteurs de transcription spécifiques du foie
Bulla GA. Nucleic Acids Res 1997 juin 1525(12):2501-2508. Le facteur nucléaire 4 des hépatocytes empêche le silence de l'expression du facteur nucléaire 1 des hépatocytes dans les hybrides de cellules hépatome x fibroblaste.

Extinction de gènes spécifiques du foie étudiée avec un transgène sélectionnable
Keherly MJ, Hsieh CC, McCombs JL, Merryman LS, Papaconstantinou, J., Somat Cell Mol Genet 1996. 22(2):119-134. Caractérisation d'hybrides de cellules somatiques présentant une extinction de l'AFP, de l'albumine et d'un transgène AFP-HPRT.

Biologie G4054y Semaine 5 17 février 2000

Sujet de cours : Transfection et transfert de gènes

CaPO4, électroporation, lipofection
Doit traverser le cytoplasme. Beaucoup englouti dans les lysosomes. L'inhibition de la fonction lysosomale aide souvent (chloroquine)
Péchélosome
2000 Ko de co-intégration (Robins)
Transfections séparées -> emplacements séparés
Sites d'intégration aléatoires ou semi-aléatoires (nombreux) (sauf si ciblé)
Faible recombinaison homologue (prélude à la lecture de la semaine prochaine)
Cf. levure : 50% homologue rec'n, 1/100ème de l'ADN. Donc si recombinaison illégitime proportionnelle aux faux sites, attendez 50%/100 = 0,5% homologue dans les cellules de mammifères (

ce que vous obtenez).
Transfection transitoire vs permanente : gènes clonés -> 10 à 50 % transitoire (coloration)
Les permanents ressemblent plus à 0,001 (par g d'ADN par cellule). c'est-à-dire 106 -> 1000 colonies
L'une des premières applications les plus spectaculaires de la transfection de gènes à partir d'ADN total : Transfert du phénotype de croissance transformée : capacité à croître en multicouches ou en suspension dans une gélose molle : (Weinberg, Wigler)
ADN de tumeur transfecté dans des cellules de souris 3T3 à croissance contrôlée. Recherchez des foyers (focus).
Créez une bibliothèque à partir d'un transfectant transformé par croissance.
Écran pour la répétition Alu humaine.
Vérifiez que l'ADN cloné produit une fréquence élevée de transfectants formant des foyers.
Isoler l'ADNc par hybridation.
Séquence.
Identifier le gène : = un oncogène dominant. Ras, une protéine de signalisation (dans la voie de transduction pour détecter les facteurs de croissance).

Et maintenant : ajoutez des gènes, créez une cellule. Faire une souris.

La lecture sera discutée la prochaine fois :

1. Premier transfert d'ADN d'un seul gène défini
Wigler, M., Silverstein, S., Lee, L.-S., Pellicer, A., Cheng, Y.-C. et Axel, R. 1977. Cell 11:223-232. Transfert du gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès purifié à des cellules de souris en culture.

2. Premier transfert bien caractérisé d'un seul gène défini à partir de l'ADN génomique total
Wigler M. Pellicer A. Silverstein S. Axel R. 1978. Transfert biochimique de gènes eucaryotes à copie unique utilisant l'ADN cellulaire total comme donneur. Cellule. 14 : 725-31.

3. Rétrovirus comme vecteurs de transfert de gènes vers des cellules de mammifères.
Whitehead I, Kirk H, Kay R. Mol Cell Biol 1995 15 février (2) : 704-710. Clonage d'expression d'oncogènes par transfert rétroviral de banques d'ADNc.

4. Une sélection plus complexe pour cloner un gène par sélection pour la fonction
Evans, C.J., D.E. Keith, Jr., H. Morrison, K. Mogandzo et R.H. Edwards. 1992. Clonage d'un récepteur delta opioïde par expression fonctionnelle. Sciences 258 : 1952-1955.

Suggestions supplémentaires :

Raffinement et caractérisation du transfert stable d'un gène défini dans des cellules de mammifères
Pellicer A. Wigler M. Axel R. Silverstein S. 1978. Le transfert et l'intégration stable du gène de la thymidine kinase du HSV dans des cellules de souris Cell. 14:133-41.

L'un des premiers gènes cellulaires clonés par sélection pour la fonction
Lowy, I., A. Pellicer, J.F. Jackson, G-K. Sim, S. Silverstein et R. Axel. 1980. Isolement de l'ADN transformant : clonage du gène aprt du hamster. Cellule 22 : 817-823.

Adénovirus comme vecteur de transfert de gènes : Zhao H, Ivic L, Otaki JM, Hashimoto M, Mikoshiba K, Firestein S. Science 1998 Jan 9279(5348):237-24.Expression fonctionnelle d'un récepteur odorant de mammifère.

Biologie G4054y Semaine 6 24 février 2000

Ciblage génique par recombinaison
Recombinaison non homologue et homologue
Recombinaison mitotique entre chromosomes homologues
Relation avec le cancer par la perte de gènes suppresseurs de tumeurs
(démasqué par recombinaison conduisant à une perte d'hétérozygotie (LOH) (Cavanee)).
Recombinaison de gènes transfectés : recombinaison homologue vs. non homologue.
Conversion génique vs recombinaison réciproque.
Exemple : Recombinaison entre inserts tandem (Liskay)
knockouts de gènes par recombinaison homologue.
Cellules ES et souris transgéniques.
Sélection de recombinants homologues via la perte du gène viral TK (article Capecchi à discuter la prochaine fois)
Remplacements d'allèles dans des lignées cellulaires cultivées. Exemple : Remplacement du gène APRT (Adair)
Effets de position. Éléments de frontière. SAR/MAR.

Lecture à discuter la prochaine fois :
1. Sélection contre des recombinants non homologues et donc pour le ciblage génique.
Mansour SL, Thomas KR et Capecchi MR.1988. Perturbation du proto-oncogène int2 dans les cellules souches dérivées d'embryons de souris : une stratégie générale pour cibler des mutations sur des gènes non sélectionnables. Nature 336:348-52

2. KO d'un gène d'épissage dans une lignée cellulaire de poulet présentant des niveaux élevés de recombinaison homologue
Wang J, Takagaki Y, Manley JL Genes Dev 1996 Oct 1510(20):2588-2599 Perturbation ciblée d'un gène de vertébré essentiel : ASF/SF2 est requis pour la viabilité cellulaire.

3. Trouver de nouveaux gènes par mutagenèse insertionnelle
Friedrich G, Soriano P. Genes Dev. 5 septembre 1991 (9) : 1513-23. Pièges à promoteurs dans les cellules souches embryonnaires : un criblage génétique pour identifier et faire muter les gènes du développement chez la souris.

4. Intégration spécifique au site.
Fukushige S, Sauer B. Proc Natl Acad Sci U S A 1992 Sep 189 (17): 7905-9 Le ciblage génomique avec un vecteur d'intégration lox à sélection positive permet une expression génique hautement reproductible dans les cellules de mammifères.

Influence de la structure locale de la chromatine sur les gènes transfectés et vice versa
Pikaart, M., Feng, J.A.U. et Villeponteau, B. 1992. L'activateur de polyomavirus active l'accessibilité de la chromatine lors de l'intégration dans le gène HPRT. Biologie moléculaire et cellulaire 12:5785-92

Effet de la position du gène sur la mutation dans un transgène intégré
Lichtenauer-Kaligis, E.G., van der Velde-van Dijke, I.,den Dulk, H., van de Putte, P., Giphart-Gassler, M.,Tasseron-de Jong, J.G. 1993. La position génomique influence la mutagenèse spontanée d'un vecteur rétroviral intégré contenant l'ADNc de hprt comme cible pour la mutagenèse. Génétique moléculaire humaine 2:173-82

Lichtenauer-Kaligis EG, Thijssen J, den Dulk H, van de Putte P, Tasseron-de Jong JG, Giphart-Gassler M. Comparison of spontané hprt mutation spectra at the nucleotide sequence level in the endgenous hprt gene and cinq autres positions génomiques. Mutat Res 1996 351:147-155.

Éléments cis-agissant qui favorisent l'indépendance de position
Talbot, D., Descombes, P., Schibler, U. 1994. La région flanquante 5' du gène LAP de rat (C/EBP bêta) peut diriger une expression de haut niveau, indépendante de la position et dépendante du nombre de copies dans plusieurs tissus chez les souris transgéniques. Recherche sur les acides nucléiques 22:756-66

K.O. d'Oct2 permet toujours l'expression du gène Ig, mais diminue l'action des activateurs artificiels. Feldhaus AL, Klug CA, Arvin KL, Singh H. EMBO J 1993 7:2763-72. La perturbation ciblée du locus Oct-2 dans une cellule B fournit des preuves génétiques de deux voies distinctes spécifiques au type de cellule de l'activation du gène médiée par l'élément octamère.

Biologie G4054y Semaine 7 2 mars 2000

Génétique des cellules cancéreuses
Oncogènes et proto-oncogènes
Oncogènes dominants vs. gènes suppresseurs de tumeurs
Rétinoblastome (Knudson)
Contrôle du cycle cellulaire
Instabilité génétique et susceptibilité au cancer

Lecture à discuter la prochaine fois

1. Canalyse génétique moléculaire originale lassique de suppresseurs de tumeurs
Cavenee, W.K. Dryja, T.P., Phillips, R.A., Benedict, W.F., Godbout, R., Gallie, B.L., Murphree, A.L., Strong, L.C. et White, R.L. 1983. Expression des allèles récessifs par les mécanismes chromosomiques dans le rétinoblastome. La nature. 305 : 779-84

2. Les mutations affectant la réparation de l'ADN contribuent à la susceptibilité au cancer
Leach et al., 1993. Mutations d'un homologue mutS dans le cancer colorectal héréditaire sans polypose. Cellule 75 : 1215-1225.

3. Instabilité génomique globale dans les tumeurs
Stoler DL, Chen N, Basik M, Kahlenberg MS, Rodriguez-Bigas MA, Petrelli NJ, Anderson GR Le début et l'étendue de l'instabilité génomique dans la progression tumorale colorectale sporadique. Proc Natl Acad Sci U S A (1999) 96:15121-6

4. Mutations tumorales et évolution tumorale
Cahill DP, Kinzler KW, Vogelstein B, Lengauer C . Trends Cell Biol 1999 Dec9(12):M57-60. Instabilité génétique et sélection darwinienne dans les tumeurs.

Sélection de mutants résistants à l'inhibition de la croissance médiée par p53.
Jennifer A. Pietenpol, Christoph Lengauer, Jan Jordan, Kenneth W. Kinzler, Bert Vogelstein. Actes de l'Académie nationale des sciences. Tome 93 : 8390-8394. Cellules de mammifères résistantes aux gènes suppresseurs de tumeurs.

Base biochimique du déficit de réparation associé au cancer du côlon
Parsons, R., Li, G.-M., Longely, MJ, Fang, W., Papadopoulos, N., Jen, J., de la Chapelle, A., Kinzler, KW, Vogelstein, B. et Modrich , P. 1993. Hypermutabilité et déficit de réparation des mésappariements dans les cellules tumorales RER +. Cellule 75 : 1227-1236.

Aucune instabilité génétique n'est associée aux tumeurs induites par le polyome chez la souris (contre la tendance).
Jakubczak JL, Merlino G, French JE, Muller WJ, Paul B, Adhya S, Garges S. Proc Natl Acad Sci U S A 1996. 93(17): 9073-9078. Analyse de l'instabilité génétique au cours de la progression tumorale mammaire à l'aide d'un nouveau test basé sur la sélection pour les mutations in vivo dans une cible transgénique du bactériophage lambda.

Disséquer un gène de susceptibilité au cancer et de réparation de l'ADN associé à une maladie humaine
Morgan SE, Lovly C, Pandita TK, Shiloh Y, Kastan. Mol Cell Biol 1997 Apr17:2020-2029 Fragments d'ATM (le gène de l'ataxie-télangiectasie) qui ont une activité dominante négative ou complémentaire.

Biologie G4054y Semaine 8 9 mars 2000

Pas de devoir de lecture, article proposant une expérience en raison de la prochaine réunion (23 mars).

Vous voudrez peut-être consulter les articles qui seront présentés la prochaine fois :

David Champs
La télomérase revisitée
Hahn WC, Counter CM, Lundberg AS, Beijersbergen RL, Brooks MW, Weinberg
RA. Nature 1999 juillet 29400(6743):464-8. Création de cellules tumorales humaines avec des éléments génétiques définis.

Dan Crossman
Hypermutation du gène des immunoglobulines
Storb U, Klotz EL, Hackett J Jr, Kage K, Bozek G, Martin TE Un insert hypermutable dans un transgène d'immunoglobuline contient des points chauds de mutation somatique et des séquences prédisant des structures très stables dans le transcrit d'ARN. J Exp Med 1998 août 17188(4):689-98

Amplification génique (aucune lecture attribuée sur ce sujet) (voir des notes plus détaillées sur le Web)
Historiquement : Résistance au méthotrexate (Littlefield) : Activité enzymatique élevée de la dihydrofolate réductase (DHFR), protéine, taux de synthèse des protéines, ARNm traduisible. (Schimke) : niveau d'ARNm, niveau d'ADN.
Coloration homogène, régions chromosomiques étendues (HSR) : Biedler
Nunberg : = gènes dhfr.
Chromosomes double minute.
Amplicons.
Modèles : sur-réplication, échange inégal de chromatides sœurs. Ce dernier est pris en charge.
Amplification des gènes et instabilité génétique.
Tltsy : les cellules normales n'amplifient pas les cellules p53.
Dans la nature : ADNr dans les ovocytes, gènes du chorion de Drosophila.
En médecine : cancer résistant à la chimiothérapie : N-src dans le neuroblastome.
En biotechnologie : production de protéines recombinantes de haut niveau dans des cellules de mammifères.

Lectures sur l'amplification génique :

Étude cytogénétique des changements accompagnant les événements précoces d'amplification génique
Trask, B.J., et Hamlin, J.L. 1989. Les événements précoces d'amplification du gène de la dihydrofolate réductase dans les cellules CHO se produisent généralement sur le même bras chromosomique que le locus d'origine. Développement de gènes et d'amp. 3 : 1913-25 (arrière-plan pour #2).
et
Ma, C., Martin, S., Trask, B., Hamlin, J.L. 1993. La fusion de chromatides sœurs initie l'amplification du gène de la dihydrofolate réductase dans les cellules de hamster chinois. Gènes et développement 7 : 605-20.

L'amplification génique ne se produit que dans les cellules tumorales génétiquement instables
Tlsty, T.D. 1990. Les cellules diploïdes normales d'humains et de rongeurs n'ont pas une fréquence détectable d'amplification génique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 3132-6, 1990 (arrière-plan pour le n°4).

L'amplification génique est réprimée par p53
Livingstone, L.R., White, A., Sprouse, J., Livanos, E., Jacks, T. et Tlsty, T.D.1992. L'arrêt du cycle cellulaire altéré et le potentiel d'amplification génique accompagnent la perte de p53 de type sauvage. Cellule 70 : 923-35.

Un article classique démontrant que la résistance aux médicaments pourrait être causée par l'amplification génique
Alt FW, Kellems RE, Bertino JR, Schimke RT J Biol Chem 1978 : 253 : 1357-1370 Multiplication sélective de gènes de dihydrofolate réductase dans des variants résistants au méthotrexate de cellules murines en culture.

Démonstration classique de co-amplification de gènes transfectés
Wigler, M., Perucho, M., Kurtz, D., Dana, S., Pellicer, A., Axel, R, Silverstein, S. Proc Natl Acad Sci USA 1980.77:3567-3570 Transformation de cellules de mammifères avec un gène dominant.

Co-amplification de gènes transfectés pour la production de protéines recombinantes de haut niveau
Page MJ, Sydenham MA. Biotechnology (1991) 9:64-68 Expression de haut niveau de l'anticorps monoclonal humanisé Campath-1H dans des cellules d'ovaire de hamster chinois.

Biologie G4054y Semaine 9 23 mars 2000. Isolement de cellules mutantes : exemples de phénotypes intéressants

David Champs
La télomérase revisitée
Hahn WC, Counter CM, Lundberg AS, Beijersbergen RL, Brooks MW, Weinberg
RA. Nature 1999 juillet 29400(6743):464-8. Création de cellules tumorales humaines avec des éléments génétiques définis.

Dan Crossman
Hypermutation du gène des immunoglobulines
Storb U, Klotz EL, Hackett J Jr, Kage K, Bozek G, Martin TE Un insert hypermutable dans un transgène d'immunoglobuline contient des points chauds de mutation somatique et des séquences prédisant des structures très stables dans le transcrit d'ARN. J Exp Med 1998 août 17188(4):689-98

Conférence : exemples de quelques mutants intéressants

Récepteurs : LDL, aryl hydrocarbon hydroxylase (résistant aux hydrocarbures aromatiques polycycliques)
Transduction du signal : AMP cyclique (résistant : sous-unité régulatrice Km, sous-unité catalytique négative)
interféron (à discuter la prochaine fois)
Régulation de la biosynthèse : cholestérol (à discuter la prochaine fois)
Régulation transcriptionnelle : récepteur des glucocorticoïdes (cellules lymphoïdes résistantes à la dexaméthasone)
Biogenèse des organites : peroxysomes (pyrène-alcool résistants), mitochondries (Attardi)
Mutations d'épissage pré-ARNm à action cis (dépistage du transgène naturel négatif avec exon tueur)

Lecture à discuter la prochaine fois : 1. Une double sélection push-pull intelligente pour les mutants dans la voie de transduction du signal interféron-réponse
Pellegrini, S. et al. 1989. Utilisation d'un marqueur sélectionnable régulé par l'interféron pour obtenir des mutations dans la voie de signalisation Mol. Cellule. Biol. 9 : 4605-4612. ( Wayne Devonish)

2. Les mutants de la voie métabolique comprennent ceux affectés par les gènes régulateurs
Rawson RB, Cheng D, Brown MS, Goldstein JL J Biol Chem 1998 273 : 28261-9. Isolement de cellules ovariennes mutantes de hamster chinois nécessitant du cholestérol présentant des défauts de clivage des protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols au site 1.( Jinshi Shen)

3. La sélection de mutants négatifs pour l'enzyme dihydrofolate réductase donne de nombreux mutants d'épissage
Carothers, A.M., G. Urlaub, D. Grunberger et L.A. Chasin. 1993. Mutants d'épissage et leurs suppresseurs de second site au locus de la dihydrofolate réductase dans les cellules ovariennes de hamster chinois. Mol. Cellule. Biol. 13 : 5085-5098.

4. Mise en place d'un gène modifié pour révéler des mutations d'épissage agissant en cis
Chen, I-T. et L.A. Chasin. 1993. Sélection directe pour les mutations affectant des sites d'épissage spécifiques dans un minigène de dihydrofolate réductase de hamster. Mol. Cellule. Biol. 13 : 289-300. Suggestion supplémentaire :

Caractérisation de mutants sélectionnés dans la voie de transduction du signal interféron-réponse
Leung, S.A., Qureshi, S.A., Kerr, I.M., Darnell, J.E. Jr., Stark, G.R. 1995. Rôle de STAT2 dans la voie de signalisation de l'interféron alpha. Biologie moléculaire et cellulaire 15:1312-7

La sélection de mutants négatifs pour l'enzyme hprt produit de nombreux mutants d'épissage
Steinrimsdottir, H., G. Rowley, G. Dorado, J. Cole et A.R. Lehmann. 1992. Mutations qui modifient l'épissage dans le gène humain de l'hypoxanthine guanine phosphoribosyltransférase. Acides nucléiques Res. 20 : 1201-1208.

Isolement et caractérisation de mutants défectueux dans la formation de peroxysomes
Tateishi K, Okumoto K, Shimozawa N, Tsukamoto T, Osumi T, Suzuki Y, Kondo, N, Okano I, Fujiki. Des mutants de cellules ovariennes de hamster chinois nouvellement identifiés, défectueux dans la biogenèse des peroxysomes, représentent deux nouveaux groupes de complémentation chez les mammifères. Eur J Cell Biol 1997 août 73:4 352-9

Isolement et caractérisation des mutants du métabolisme du cholestérol : un parmi plusieurs types
Jacobs NL, Andemariam B, Underwood KW, Panchalingam K, Sternberg D, Kielian M, Liscum L. J Lipid Res 1997 Oct38 (10):1973-1987 Analyse d'un mutant de cellules ovariennes de hamster chinois avec une mobilisation défectueuse du cholestérol de la membrane plasmique au réticulum endoplasmique.

Mutants de la voie du TGF-bêta isolés d'une manière similaire aux mutants de la voie de l'interféron ci-dessus.
Hocevar BA, Howe PH. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 juillet 2393 (15) : 7655-7660. Isolement et caractérisation de lignées cellulaires mutantes défectueuses dans la signalisation bêta du facteur de croissance transformant.

Examen de la voie JAK/STAT sondée par les mutants de réponse à l'interféron ci-dessus.
Briscoe J, Guschin D, Rogers NC, Watling D, Muller M, Horn F, Heinrich P, Stark GR, Kerr I. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1996 février 29351 (1336) : 167-171. JAKs, STATs et transduction de signaux en réponse aux interférons et autres cytokines.

Biologie G4054y. Semaine 10. 30 mars 2000

Isolement de mutants cellulaires intéressants affectés dans la régulation transcriptionnelle ou la transduction du signal :

Wayne Devonish
10A. Pellegrini S, John J, Shearer M, Kerr IM, Stark GR, Mol Cell Biol 1989. 9 : 4605-4612. Utilisation d'un marqueur sélectionnable régulé par l'interféron alpha pour obtenir des mutations dans la voie de signalisation.

Jinshi Shen
10B. Rawson RB, Cheng D, Brown MS, Goldstein JL J Biol Chem 1998 273 : 28261-9. Isolement de cellules ovariennes mutantes de hamster chinois nécessitant du cholestérol présentant des défauts de clivage des protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols au site 1.

Lecture à discuter la prochaine fois :

Identification des gènes par transfection : déclencheurs de la différenciation des cellules musculaires

1. Identification du gène myoD par changement phénotypique induit par la transfection
Davis RL. Weintraub H. Lassar AB. 1987. L'expression d'un seul ADNc transfecté convertit les fibroblastes en myoblastes. Cellule 51 : 987-1000.

2. Caractérisation génétique des cellules de mammifères de la dérégulation de la différenciation dans les cellules tumorales musculaires
Fiddler TA, Smith L, Tapscott SJ, Thayer MJ. 1996. L'amplification de MDM2 inhibe la myogenèse induite par MyoD. Mol Cell Biol 16:5048-57

3. La sélection de facteurs pouvant déclencher une différenciation myogénique chez les transfectants donne une surprise
Rastinejad, F. et H.M. Blau. 1993. La complémentation génétique révèle un nouveau rôle régulateur pour les régions 3' non traduites dans la croissance et la différenciation. Cellule. 72 : 903-917.

Suggestions supplémentaires :
Suivi de l'article sur l'ARN réglementaire 3' UTR ci-dessus par le même premier auteur
Rastinejad F, Conboy MJ, Rando TA, Blau HM. 1993. Suppression tumorale par l'ARN de la région 3' non traduite de l'alpha-tropomyosine. Cellule 75:1107-1117

Explorer l'extinction de l'action myoD
Thayer MJ. Weintraub H. 1990. Activation et répression de la myogenèse dans les hybrides de cellules somatiques : preuve de la régulation trans-négative de MyoD dans les fibroblastes primaires. Cellule 63:23-32

Biologie G4054y. Semaine 11. 6 avril 2000

Identification des gènes par transfection

Présentations et débats :

1. Identification du gène myoD par changement phénotypique induit par la transfection
Davis RL. Weintraub H. Lassar AB. 1987. L'expression d'un seul ADNc transfecté convertit les fibroblastes en myoblastes. Cellule 51 : 987-1000.

2. Caractérisation génétique des cellules de mammifères de la dérégulation de la différenciation dans les cellules tumorales musculaires
Fiddler TA, Smith L, Tapscott SJ, Thayer MJ. 1996. L'amplification de MDM2 inhibe la myogenèse induite par MyoD. Mol Cell Biol 16:5048-57

3. La sélection de facteurs pouvant déclencher une différenciation myogénique chez les transfectants donne une surprise
Rastinejad, F. et H.M. Blau. 1993. La complémentation génétique révèle un nouveau rôle régulateur pour les régions 3' non traduites dans la croissance et la différenciation. Cellule. 72 : 903-917.

Blocage phénotypique médié par la transfection (sélection d'éléments suppresseurs génétiques)

ADNc antisens + sélection pour l'inhibition d'une voie biologique (Roninson)
Les ADNc sens tronqués sont utilisés de la même manière.
Aussi : Kimchi : résistance à l'interféron Plage : levure

Lecture pour discussion la prochaine fois : 1. Démonstration très satisfaisante de la faisabilité du système utilisant les gènes lambda et E. coli.
Holzmayer, T.A., Pestov, D.G., Roninson, I.B. 1992. Isolement de mutants négatifs dominants et de séquences d'ARN antisens inhibitrices par sélection d'expression de fragments d'ADN aléatoires. Recherche sur les acides nucléiques 20:711-7

2. Stratégie générale de suppression génétique avec des exemples de levure.
Hannon GJ, Sun P, Carnero A, Xie LY, Maestro R, Conklin DS, Beach D. 1999. MaRX : une approche de la génétique dans les cellules de mammifères. Science. 1999 février 19283(5405):1129-30.

3. Différents éléments suppresseurs génétiques basés sur p53 bloquent différentes fonctions de p53.
Valeria S. Ossovskaya, Ilya A. Mazo, Michail V. Chernov, Olga B. Chernova, Zaklina Strezoska, Roman Kondratov, George R. Stark, Peter M. Chumakov, Andrei V. Gudkov. Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis 93:10309-10314. Utilisation d'éléments suppresseurs génétiques pour disséquer les effets biologiques distincts de domaines p53 distincts. (Kristi McKinney)

4. L'amplification génique est réprimée par p53
Livingstone, L.R., White, A., Sprouse, J., Livanos, E., Jacks, T. et Tlsty, T.D.1992. L'arrêt du cycle cellulaire altéré et le potentiel d'amplification génique accompagnent la perte de p53 de type sauvage. Cellule 70 : 923-35.
( Wayne Devonish)

Application aux cellules de mammifères
Gudkov, A.V., Kazarov, A.R., Thimmapaya, R., Axenovich, S.A., Mazo, I.A., et Roninson, I.B. 1994. Clonage de gènes de mammifères par sélection d'expression d'éléments suppresseurs génétiques : association de la kinésine avec la résistance aux médicaments et l'immortalisation cellulaire. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 91:3744-8

Blocage de p53 par des éléments suppresseurs génétiques couplé à une sélection pour la résistance aux médicaments
Gallagher WM, Cairney M, Schott B, Roninson IB, Brown R. Oncogene 1997 janvier 1614 (2):185-193. Identification d'éléments suppresseurs génétiques p53 qui confèrent une résistance au cisplatine

Sélection de fragments d'ADNc antisens qui confèrent une résistance à l'inhibition de la croissance médiée par l'interféron
Deiss LP, Kimchi A. Science 1991 avril 5252 (5002):117-120. Un outil génétique utilisé pour identifier la thiorédoxine en tant que médiateur d'un signal inhibiteur de croissance.
Suivi de ce qui précède
Cohen O, Feinstein E, Kimchi A. EMBO J 1997 mars 316 (5) : 998-1008. La DAP-kinase est une protéine kinase Ca2+/calmoduline-dépendante, associée au cytosquelette, avec des fonctions induisant la mort cellulaire qui dépendent de son activité catalytique

Une autre application aux cellules de mammifères par le laboratoire Roninson
Gudkov, A.V., Zelnick, C.R., Kazarov, A.R., Thimmapaya, R., Suttle, D.P., Beck, W.T. et Roninson, I.B. 1993. Isolement d'éléments suppresseurs génétiques, induisant une résistance aux médicaments cytotoxiques interactifs avec la topoisomérase II, à partir de l'ADNc de la topoisomérase II humaine. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 90:3231-5

Biologie G4054y. Semaine 12. 13 avril 2000

Blocage phénotypique induit par la transfection

Présentations et débats :

1. Démonstration très satisfaisante de la faisabilité du système utilisant les gènes lambda et E. coli.
Holzmayer, T.A., Pestov, D.G., Roninson, I.B. 1992. Isolement de mutants négatifs dominants et de séquences d'ARN antisens inhibitrices par sélection d'expression de fragments d'ADN aléatoires. Recherche sur les acides nucléiques 20:711-7

2. Stratégie générale de suppression génétique avec des exemples de levure.
Hannon GJ, Sun P, Carnero A, Xie LY, Maestro R, Conklin DS, Beach D. 1999. MaRX : une approche de la génétique dans les cellules de mammifères. Science. 1999 février 19283(5405):1129-30.

3. Différents éléments suppresseurs génétiques basés sur p53 bloquent différentes fonctions de p53.
Valeria S. Ossovskaya, Ilya A. Mazo, Michail V. Chernov, Olga B. Chernova, Zaklina Strezoska, Roman Kondratov, George R. Stark, Peter M. Chumakov, Andrei V. Gudkov. Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis 93:10309-10314. Utilisation d'éléments suppresseurs génétiques pour disséquer les effets biologiques distincts de domaines p53 distincts. (Kristi McKinney)

4. L'amplification génique est réprimée par p53
Livingstone, L.R., White, A., Sprouse, J., Livanos, E., Jacks, T. et Tlsty, T.D.1992. L'arrêt du cycle cellulaire altéré et le potentiel d'amplification génique accompagnent la perte de p53 de type sauvage. Cellule 70 : 923-35. (
Wayne Devonish)

SELEX : sélection de cibles de séquences d'acides nucléiques

Espace de séquence
Sélection de ligands protéiques
Sélection pour les petites molécules ligands
Sélection pour les ribozymes
SELEX in vivo
SELEX génomique

A lire pour la discussion la prochaine fois :

1. Sélection des séquences d'ARN qui se lient le mieux à la protéine Rev du VIH
Bartel DP, Zapp ML, Green MR, Szostak Cell 1991 novembre 167 (3) : 529-536. La régulation de HIV-1 Rev implique la reconnaissance de paires de bases non Watson-Crick dans l'ARN viral. (Igor Shuryak)

2. Sélection de séquences pouvant catalyser la ligature d'ARN
Ekland EH, Szostak JW, Bartel DP. Science 1995 Jul 21269(5222):364-370 ARN ligases structurellement complexes et hautement actives dérivées de séquences d'ARN aléatoires

3. SELEX in vivo pour l'épissage de séquences amplificatrices
Coulter LR, Landrée MA, Cooper TA. Mol Cell Biol 1997 Apr 17:4 2143-50 Identification d'une nouvelle classe d'amplificateurs d'épissage exonique par sélection in vivo.

Suggestions supplémentaires
Idées SELEX génomiques
Singer BS, Shtatland T, Brown D, Gold L. Nucleic Acids Res 1997 février 1525(4):781-786. Bibliothèques pour SELEX génomique.
et
Gold L, Brown D, He Y, Shtatland T, Singer BS, Wu Y. Proc Natl Acad Sci U S A 1997 Jan 794 (1) : 59-64. Des formes oligonucléotidiques au SELEX génomique : de nouvelles boucles de régulation biologique.

Biologie G4054y. Semaine 13. 20 avril 2000

Discussion des articles lus la semaine dernière :

1. Sélection des séquences d'ARN qui se lient le mieux à la protéine Rev du VIH
Bartel DP, Zapp ML, Green MR, Szostak Cell 1991 novembre 167 (3) : 529-536. La régulation de HIV-1 Rev implique la reconnaissance de paires de bases non Watson-Crick dans l'ARN viral. (Igor Shuryak)

2. Sélection de séquences pouvant catalyser la ligature d'ARN
Ekland EH, Szostak JW, Bartel DP. Science 1995 Jul 21269(5222):364-370 ARN ligases structurellement complexes et hautement actives dérivées de séquences d'ARN aléatoires

3. SELEX in vivo pour l'épissage de séquences amplificatrices
Coulter LR, Landree MA, Cooper TA. Mol Cell Biol 1997 Apr 17:4 2143-50 Identification d'une nouvelle classe d'amplificateurs d'épissage exonique par sélection in vivo.

4. Non affecté à la lecture :
Rawson et al. : Clonage de l'enzyme de clivage du site 1 de la protéine régulatrice des stérols. (Jingshi Shen)

Nouvelles directions en mutagenèse et analyse de mutants

A lire pour la discussion la prochaine fois :

1. Mélange d'ADN
Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP Nature 1998 39:288-91 Le remaniement de l'ADN d'une famille de gènes de diverses espèces accélère l'évolution dirigée. (Adam Meshel)

2. Caractérisation des phénotypes mutants par analyse de puces à ADN
Sudarsanam P, Iyer VR, Brown PO, Winston F. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 mars 2897 (7) : 3364-3369. Analyse de l'expression du génome entier de mutants snf/swi de Saccharomyces
cerevisiae. (David Champs)

3. Empreinte génétique.
Laurent LC, Olsen MN, Crowley RA, Savilahti H, Brown PO. Caractérisation fonctionnelle du génome du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 par empreinte génétique. J Virol. 2000 mars74(6):2760-9.

Documents connexes supplémentaires :
Cartographie fonctionnelle haute résolution d'un gène cloné par empreinte génétique.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 février 1894(4):1304-9.

Smith V, Chou KN, Lashkari D, Botstein D, Brown PO. Analyse fonctionnelle des gènes du chromosome V de levure par empreinte génétique.Science. 1996 déc. 20274 (5295) : 2069-74.

Smith V, Botstein D, Brown PO. Empreinte génétique : une stratégie génomique pour déterminer la fonction d'un gène compte tenu de sa séquence. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 juillet 392 (14) : 6479-83.

Goryshin IY, Miller JA, Kil YV, Lanzov VA, Reznikoff WS. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 95(18): 10716-21. Reconnaissance de cible Tn5/IS50.

Biologie G4054y. Semaine 14. 27 avril 2000

Dernier cours, pas de devoir.

Discussion des papiers assignés la dernière fois.

1. Mélange d'ADN
Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP Nature 1998 39: 288-91 Le remaniement de l'ADN d'une famille de gènes de diverses espèces accélère l'évolution dirigée.- (Adam Meshel)

2. Caractérisation des phénotypes mutants par analyse de puces à ADN
Sudarsanam P, Iyer VR, Brown PO, Winston F. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 mars 2897 (7) : 3364-3369. Analyse de l'expression du génome entier de mutants snf/swi de Saccharomyces cerevisiae.

3. Empreinte génétique.
Laurent LC, Olsen MN, Crowley RA, Savilahti H, Brown PO. Caractérisation fonctionnelle du génome du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 par empreinte génétique. J Virol. 2000 mars74(6):2760-9.


Voir la vidéo: Cours Biotechnologies Microbiologie Partie 1: Analyse microbiologique dun produit polymicrobien (Décembre 2022).