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Améliorer l'efficacité de la transformation - induire un superenroulement ?

Améliorer l'efficacité de la transformation - induire un superenroulement ?


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D'après ma connaissance limitée de la science, je sais que la transformation peut être l'une des étapes les plus difficiles du clonage, et qu'une grande quantité de recherches/d'essais et d'erreurs a été effectuée pour améliorer cette étape. J'ai entendu dire que l'électroporation est la technique la plus efficace, bien que je n'aie aucune référence, et bien sûr, la cellule, le support et la durée ont tous des rôles essentiels à jouer dans le processus.

Cependant, je n'ai jamais entendu parler du superenroulement comme facteur important. La taille du plasmide joue un grand rôle dans la transformation, donc intuitivement, cela me fait penser que le super-enroulement du plasmide avant la transformation améliorerait l'efficacité. Je pensais que la transformation était simplement de l'ADN diffusant à travers des trous, mais des parties du plasmide sont-elles nécessaires pour se lier/interagir avec l'hôte ?

Pourquoi ne suggérons-nous pas de superenrouler avant la transformation ? J'ai plusieurs idées mais je suppose :

  • Est-ce parce que la gyrase peut perturber l'intégrité de l'ADN ?
  • Ou est-ce que c'est juste une enzyme chère et que le gain n'en vaut pas la peine ?
  • Ou peut-être que le superenroulement réduit l'efficacité des préparations / transcriptions de plasmides ultérieures (bien que les enzymes naturelles de l'hôte ne se superposent pas de toute façon?)

Voici un rapport qui montre une augmentation significative de l'efficacité de la transformation pour les grands plasmides (la transformation s'est faite par électroporation. Cependant, l'article a été cité moins de dix fois, si clairement que la technique n'a pas fait son chemin.

Zhixing, Y et Nahon, J-L (1995) L'ADN gyrase améliore la transformation de l'ADN des cellules E. coli avec de grands plasmides recombinants. Acides nucléiques Res. 23:3353-3354


Super enroulement d'ADN

Résumé

Le superenroulement de l'ADN décrit une structure d'ADN d'ordre supérieur. La structure en double hélice de l'ADN implique l'enroulement de deux brins complémentaires l'un autour de l'autre et autour d'un axe hélicoïdal commun. La torsion de cet axe hélicoïdal dans l'espace définit la structure superhélicoïdale de l'ADN (structure tertiaire de l'ADN). Pour un ADN circulaire ou un ADN linéaire avec ses extrémités ancrées pour créer une boucle, il existe un couplage topologique étroit entre la structure superhélicoïdale de l'ADN et la structure en double hélice (structure secondaire de l'ADN). Par conséquent, la superhélicité de l'ADN peut influencer l'enroulement/le déroulement de l'ADN, affectant ainsi les fonctions biologiques de l'ADN. Dans la nature, il existe une classe omniprésente d'enzymes, les ADN topoisomérases, qui peuvent intervenir dans la transformation topologique des molécules d'ADN.


Résumé

Vigne (Vitis spp.) est l'une des cultures fruitières les plus importantes sur le plan économique au monde, et il existe un intérêt considérable pour l'amélioration de ses principales caractéristiques agronomiques et œnologiques en réponse aux environnements agricoles en constante évolution et aux demandes des consommateurs. Les techniques de génétique moléculaire en particulier, associées à des avancées technologiques rapides, offrent une alternative intéressante aux approches de sélection conventionnelles pour développer de nouvelles variétés de vigne avec des performances de rendement, une qualité, une tolérance au stress et une résistance aux maladies améliorées. A ce jour, plusieurs cépages ont été transformés avec des gènes associés à diverses fonctions par bombardement biolistique et/ou Agrobactérie-transformation médiée, et des lignées de raisins transgéniques ont été obtenues en utilisant des systèmes de régénération établis. Néanmoins, il a été démontré qu'un large éventail de facteurs, notamment le génotype, la source d'explant et le milieu de culture, affectent l'efficacité de la régénération des plantes. De plus, la sélection et l'utilisation de matériaux accepteurs, la souche bactérienne et la densité cellulaire, les marqueurs sélectionnables et les méthodes de sélection influencent également l'efficacité de la transformation. Cet article donne un aperçu des avancées récentes en matière de régénération et de transformation génétique de la vigne et une discussion approfondie des principaux facteurs limitants, et discute des stratégies futures prometteuses pour développer une régénération végétale robuste et une transformation génétique de la vigne.


Améliorer l'efficacité de l'électro-transformation de Corynebacterium glutamicum en affaiblissant sa paroi cellulaire et en augmentant la fluidité de la membrane cytoplasmique

Pour améliorer l'efficacité de transformation de Corynebacterium glutamicum cellules avec un ADN plasmidique hétérogène et un ADN simple brin (ADNsb) en utilisant une méthodologie basée sur l'électro-transformation.

Résultats

Un milieu hypertonique semi-complexe a été sélectionné avec addition de glycine et de dl-thréonine pour affaiblir les parois cellulaires et addition de Tween 80 et d'hydrazide d'acide isonicotinique pour augmenter la fluidité de la membrane cytoplasmique. Leur contenu a été optimisé par la méthodologie de surface de réponse. La croissance cellulaire, le tampon d'électro-transformation et le protocole de transformation ont également été optimisés. L'inactivation temporaire par chauffage de l'enzyme de restriction hôte a montré un effet significatif. Enfin, une efficacité de transformation élevée de 3,57 ± 0,13 × 10 7 cfu/μg d'ADN de plasmide et 1,05 × 10 6 Str R cfu pour 109 cellules viables avec un ADNsb a été obtenu.

Conclusion

Les résultats mettent en lumière l'application en génomique fonctionnelle et en édition du génome de C. glutamicum.


Discussion

Nous avons développé un test basé sur le PNA qui nous a permis d'attacher des plasmides superenroulés entre des lames de couverture et des billes. Nous avons étudié la dynamique interne des attaches d'ADN individuelles, à la fois des plasmides superenroulés, des plasmides détendus et des attaches linéaires, ainsi que la boucle d'ADN à médiation protéique dans un système superenroulé.

Les RMSD de l'ADN superenroulé, relaxé et linéaire ont été comparés, et il a été constaté que le RMSD du plasmide superenroulé enchevêtré était significativement plus petit que ceux du plasmide relaxé et de l'attache linéaire, qui étaient comparables. En outre, nous avons constaté que le plasmide superenroulé présentait un temps de relaxation beaucoup plus rapide que le plasmide détendu et l'attache linéaire, ce qui est analogue à la juxtaposition de sites améliorée dans l'état superenroulé. Ces résultats appuient les simulations de dynamique moléculaire précédemment publiées (19) et les tests de transcription in vitro (18).

Les paramètres thermodynamiques du bouclage de l'ADN ont déjà été étudiés in vivo (21, 22) et par des expériences de molécule unique utilisant de l'ADN linéaire (14). Dans cette dernière étude utilisant de l'ADN linéaire, les résultats ont montré que le bouclage de l'ADN impliquant six opérateurs et six dimères CI était relativement stable, tandis que le bouclage impliquant seulement quatre dimères (sans que OR3 et OL3 soient occupés) était moins stable. Il apparaît que le surenroulement de l'ADN améliore la stabilité de la boucle par rapport à la mise en boucle d'une attache d'ADN linéaire. Le résultat expérimental est soutenu par le fait que le modèle thermodynamique a fourni un excellent ajustement aux données expérimentales d'ADN superenroulé in vitro, produisant des paramètres cohérents avec les observations in vivo (21, 22). Une étude in vitro plus récente utilisant des matrices superenroulées dans un test de transcription a confirmé l'amélioration de l'activation de pRM par la boucle médiée par l'octamère et le rôle coopératif d'OL3 et OR3 dans la répression de pRM (12). Ces résultats indiquent que le superenroulement augmente la stabilité de la boucle comme on l'observe directement ici.

En résumé, nous avons développé un test à molécule unique utilisant de l'ADN surenroulé nativement. Nous avons étudié les probabilités de bouclage en fonction de la concentration de CI et avons trouvé une transition plus nette entre les états bouclés et non bouclés que celle observée avec l'ADN linéaire (14). Cette transition plus nette est attendue pour le réseau de régulation décidant entre les états lytique et lysogène. En adaptant un modèle thermodynamique à nos données, nous avons obtenu des valeurs pour les énergies libres associées à la formation de boucles qui étaient cohérentes avec les valeurs rapportées pour l'ADN surenroulé nativement in vivo. Notre travail fournit des informations cruciales sur la façon dont le superenroulement modifie la dynamique du commutateur lambda, le premier commutateur épigénétique à être déchiffré et le commutateur qui est devenu un paradigme pour la régulation transcriptionnelle.


Refroidissement à base de torsion par pliage de fibres NR

Pour démontrer l'évolutivité, le refroidissement a été mesuré tout en dépliant de manière isométrique plusieurs fibres NR. Le dépliage des fibres NR à sept plis de 2,2 mm de diamètre (Fig. 2, D et E) a produit un refroidissement de surface maximal (−19,1 °C) et moyen (–14,4 °C) plus élevé que pour un étirement de 600 % d'une fibre non torsadée ( −12,2°C) (Fig. 1B) ou pour la détorsion isométrique d'une fibre simple étirée à 100 % (−15,5°C maximum et −12,4°C en moyenne) (Fig. 1C et fig. S15). Le décrochage des souches isométriques autour de 100 % a produit le refroidissement twistocalorique le plus élevé (fig. S23 et S24).

Guidés par la correspondance entre le refroidissement twistocalorique pour des fibres simples ayant le même étirement, et un produit similaire de la densité de torsion et du diamètre de la fibre étirée (fig. S17), nous avons constaté que le refroidissement twistocalorique associé au pliage isométrique des fibres dépend approximativement du produit de la densité de torsion du pli et diamètre effectif du faisceau (eff = m 0.5 × s, où m est le nombre de fibres et s est le diamètre de la fibre étirée) (Fig. 2E).


Améliorer l'efficacité de la transformation - induire un superenroulement ? - La biologie

Bien qu'il soit connu que le superenroulement de la matrice d'ADN peut être induit par transcription, le mécanisme et l'efficacité de ce processus in vivo ne sont pas entièrement compris. Nous rapportons ici que la transcription de gènes codant pour l'ARNr 16 S, une espèce d'ARN stable ou des polypeptides cytoplasmiques conduit à très peu ou pas de superenroulement d'ADN détectable, même dans les conditions optimales chez Escherichia coli. Cela indique que la traînée hydrodynamique sur le complexe de transcription (y compris l'ARN polymérase, l'ARN naissant, les ribosomes et les polypeptides naissants) n'est pas suffisante pour ancrer l'ARN polymérase pendant la transcription-traduction couplée. D'autre part, la transcription de gènes associés à la membrane codant pour la membrane interne intégrale ou des polypeptides périplasmiques exportés conduit à un surenroulement apparent de l'ADN. La transcription de gènes codant pour des polypeptides de membrane interne intégrale conduit à un ancrage significativement plus important de l'ARN polymérase que ne le fait la transcription de gènes codant pour des polypeptides périplasmiques. Cela peut refléter des différences dans le couplage de la transcription-traduction avec l'association membranaire au cours de l'expression de ces deux classes de polypeptides. Des preuves sont en outre présentées pour suggérer que l'ancrage de l'ARN polymérase est probablement obtenu par l'interaction de polypeptides naissants avec la surface cytoplasmique de la membrane interne pendant la transcription-traduction couplée. De plus, les transcriptions d'un gène associé à la membrane peuvent, dans certaines circonstances, induire l'ancrage topologique d'une ARN polymérase transcrivant un gène voisin qui n'est habituellement pas associé à la membrane. Enfin, les conséquences biologiques potentielles de nos découvertes sont discutées.


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TRANSFORMATION DES PLANTES : Problèmes et stratégies pour une application pratique

RésuméLa transformation des plantes est désormais un outil de recherche central en biologie végétale et un outil pratique pour l'amélioration des cultivars. Il existe des méthodes vérifiées pour l'introduction stable de nouveaux gènes dans les génomes nucléaires de plus de 120 espèces végétales diverses. Cette revue examine les critères pour vérifier la transformation des plantes les exigences biologiques et pratiques pour les systèmes de transformation l'intégration de la culture tissulaire, le transfert de gènes, la sélection et les stratégies d'expression transgénique pour réaliser la transformation chez les espèces récalcitrantes et d'autres contraintes à la transformation des plantes, y compris l'environnement réglementaire, les perceptions du public , la propriété intellectuelle et l'économie. Étant donné que les coûts du dépistage des populations présentant divers changements génétiques peuvent dépasser de loin les coûts de transformation, il est important de distinguer les efficacités de transformation absolues et utiles. Le principal défi technique auquel est confrontée la biologie de la transformation des plantes est le développement de méthodes et de constructions pour produire une proportion élevée de plantes présentant une expression transgénique prévisible sans dommages génétiques collatéraux. Cela nécessitera des réponses à une série de questions biologiques et techniques, dont certaines sont définies.


Conseils et FAQ

Si vous n'êtes pas concerné par l'efficacité de la transformation (par exemple, lorsque vous avez un tube d'ADN plasmidique et que vous avez juste besoin de transformer des bactéries pour pouvoir faire pousser plus de plasmide), vous pouvez gagner beaucoup de temps en raccourcissant ou en sautant de nombreuses étapes et aura encore assez de colonies pour votre prochaine étape. N'oubliez pas que chacun de ces raccourcis réduira l'efficacité de la transformation. Par conséquent, lorsqu'une efficacité plus élevée est nécessaire, suivez le protocole complet.

  • Décongelez les cellules compétentes dans votre main plutôt que sur de la glace
  • Réduire l'étape 4 de 20 - 30 minutes à 2 minutes sur glace avant le choc thermique

Raccourcir ou sauter l'excroissance (pour la résistance à l'ampicilline, il est acceptable de sauter complètement l'excroissance, pour les autres antibiotiques, c'est une bonne idée de dépasser pendant au moins 20-30 minutes)

Les cellules chimiquement compétentes sont rapides et faciles à utiliser, mais sont moins efficaces pour absorber des plasmides plus gros. Si vous devez transformer de gros plasmides, c'est une bonne idée d'utiliser des cellules électro-compétentes. Au lieu de compter sur le choc thermique pour amener les cellules à absorber l'ADN, un champ électromagnétique est appliqué au mélange cellule/ADN pour induire la perméabilité de la membrane. Pour ce faire, vous aurez besoin d'avoir accès à un électroporateur et aux cuvettes appropriées. Suivez les instructions du fabricant pour chacun.

Vérifiez que vous déposez sur une plaque de gélose LB contenant le bon antibiotique. Le gène de résistance sur votre plasmide doit correspondre à l'antibiotique sur la plaque. Vous devez également ajouter un contrôle positif (de nombreuses entreprises incluent un plasmide de contrôle positif avec leurs cellules compétentes) pour vous assurer que votre procédure de transformation fonctionne.

Bien que cela puisse être contre-intuitif, vous obtiendrez souvent des efficacités de transformation plus élevées avec moins d'ADN, en particulier lorsque vous utilisez des cellules hautement compétentes. Si vous avez utilisé 100-1000 ng d'ADN total dans une ligature, vous obtiendrez souvent plus de colonies si vous utilisez 1 l d'une dilution 1:5 ou 1:10 plutôt que 1 l directement.


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