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Existe-t-il un moyen standard de mesurer les niveaux de nutriments de la culture en temps réel ?

Existe-t-il un moyen standard de mesurer les niveaux de nutriments de la culture en temps réel ?


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Je travaille sur l'optimisation des taux de croissance pour une culture, et une chose que j'essaie de surveiller est les taux de consommation de nutriments pour identifier les goulots d'étranglement, c'est-à-dire que la culture passe par tout le calcium en quelques heures, puis arrête de croître.

À moins de prélever manuellement des échantillons toutes les quelques minutes et d'effectuer des tests individuels pour un large éventail de nutriments (minéraux, acides aminés, composés azotés, etc.), existe-t-il un moyen standard de surveiller automatiquement les niveaux de nutriments en temps réel ? Il s'agit d'un projet de recherche personnel, donc malheureusement je n'ai pas accès aux bioréacteurs industriels et autres.


Des capteurs à base d'enzymes pour prendre des mesures en temps réel des substrats de croissance existent. En bref : une enzyme dégrade le substrat et modifie ainsi l'état redox local qui est détecté électroniquement (exemple capteur de glucose). Il n'y a aucune garantie que les substrats que vous souhaitez mesurer puissent être mesurés à l'aide de tels capteurs. De plus, je pense que ces capteurs sont assez chers et sont adaptés à des conditions spécifiques (c'est-à-dire que ce n'est pas aussi simple que de plonger le capteur dans votre milieu de culture). En pratique, je pense que les systèmes utilisant ces capteurs se limitent à surveiller un petit nombre de substrats.

LCMS ou GCMS est la méthode standard pour mesurer les concentrations de substrats. La LC ou la GC (sans la MS) peuvent être possibles, mais probablement pas car il y a de nombreux composants dans les milieux de culture et donc beaucoup de pics qui se chevauchent. L'utilisation de cette méthode demande beaucoup de travail (beaucoup d'échantillons), une faible résolution (temporairement) et l'équipement est assez cher, mais si vous avez accès à un LCMS et êtes prêt à consacrer du temps pour devenir un expert LCMS, alors c'est une bonne option.

Les méthodes basées sur la culture utilisant un milieu minimal complété par des substrats sont une option, ces expériences peuvent atteindre la même chose que la surveillance en temps réel des concentrations de substrat. Si vous avez accès à un lecteur de plaque, ce sera tellement plus facile. La vitesse à laquelle les différents substrats sont consommés et l'ordre dans lequel ils sont consommés peuvent être déduits en mesurant le taux de croissance des bactéries et la taille de la population finale/poids sec de la culture.

Je mentionne cette méthode basée sur la culture parce que, bien que ce ne soit pas exactement le sujet de votre question, elle est beaucoup moins chère que les autres options et beaucoup plus établie (et à mon avis plus amusante : vous avez une bonne idée de la façon dont les bactéries se développent et de ce médias qu'ils aiment et les graphiques sont superbes).


Surveillance des ruisseaux et des rivières

Sans eau, aucune vie ne pourrait exister, et de nombreuses activités humaines essentielles et non essentielles ne seraient pas possibles sans l'utilisation de bassins versants sains. Ces mêmes activités peuvent avoir un impact sur les bassins hydrographiques, de façon à la fois grande et petite. Les bassins versants traversent souvent des frontières politiques et culturelles tandis que les voisins séparés par des frontières urbaines, étatiques ou nationales peuvent ne pas vivre sous les mêmes directives juridiques et culturelles les uns que les autres, les deux pourraient être citoyens du même bassin versant. Par cette mesure, assurer la santé d'un bassin versant - ou des lacs, ruisseaux et rivières qui s'y trouvent - est autant une responsabilité envers vos semblables qu'elle l'est envers votre organisme de réglementation local, étatique ou fédéral. Pour cette même raison, les réglementations sur la qualité de l'eau sont de plus en plus axées sur le niveau du bassin versant plutôt qu'établies par des frontières politiques.

Les ruisseaux et les rivières offrent un aperçu au-dessus du sol de la santé et de l'hydrologie d'un bassin versant et fonctionnent comme une ressource vitale pour l'activité humaine, ainsi qu'un habitat pour une multitude d'animaux et de plantes non humains. Aux États-Unis seulement, il y a plus de 3,5 millions de miles de ruisseaux et de rivières qui traversent de nombreux paysages différents. Malgré cette dépendance généralisée aux voies navigables, l'Environmental Protection Agency des États-Unis a découvert que plus de la moitié des ruisseaux et des rivières aux États-Unis sont en mauvais état biologique. Si un cours d'eau ou une rivière peut être impacté par votre projet, il est essentiel d'établir un système de surveillance approprié pour s'assurer que l'hydrologie et la qualité de l'eau de la voie navigable soient affectées le moins possible, et afin que tout impact puisse être atténué s'il est détecté.


Fond

L'adénosine triphosphate (ATP) est la principale source d'énergie pour tous les organismes vivants, essentielle aux processus fondamentaux de toutes les cellules, du métabolisme à la réplication de l'ADN et à la synthèse des protéines [1]. Chez l'homme, les niveaux anormaux d'ATP cellulaire et la consommation d'énergie (taux de consommation d'ATP), tels qu'ils peuvent être déterminés en mesurant et en modélisant l'ATP, sont liés à de nombreuses maladies, telles que le cancer, le vieillissement, l'obésité, le diabète, les troubles neuronaux, les infections virales et le système immunitaire. dysfonctionnements [1,2,3,4,5,6]. Chez les bactéries, la dynamique de l'ATP est directement liée à l'activité métabolique, à la physiologie et aux comportements des bactéries dans des conditions et des stress variables [7,8,9]. Par exemple, de faibles niveaux d'ATP contribuent à la résistance/persistance bactérienne en réponse aux traitements antibiotiques [9,10,11,12]. Malgré l'importance de l'ATP, notre compréhension actuelle de la dynamique de l'ATP et de l'homéostasie dans les cellules a été limitée par le manque de biocapteurs d'ATP continus facilement disponibles et faciles à utiliser ainsi que par le manque de modèles dynamiques précis pour déterminer les flux d'ATP.

La mesure quantitative et continue de l'ATP cellulaire s'est avérée difficile. Les méthodes conventionnelles, telles que les dosages de la luciférase, nécessitent une lyse efficace des cellules et empêchent ainsi les mesures d'ATP intracellulaire en temps réel et en continu [13]. À cette fin, plusieurs biocapteurs ATP génétiquement codés ont été développés, tels que le biocapteur ATeam basé sur FRET de transfert d'énergie par résonance de fluorescence [14], le biocapteur BTeam basé sur BRET de transfert d'énergie par résonance de bioluminescence [13] et le nouveau biocapteur ATeam3.10 [15]. Ces biocapteurs ratiométriques mesurent l'ATP, quels que soient leurs niveaux d'expression dans la cellule, et fonctionnent bien dans les lignées cellulaires de mammifères à croissance lente. Pour surveiller l'ATP cellulaire dans les bactéries à croissance rapide, Yaginuma et al. a développé un capteur QUEEN ATP mais des applications plus larges de ce capteur chez les bactéries n'ont pas été rapportées, peut-être en raison de son signal relativement faible et de sa sensibilité à la température [16]. De plus, ces biocapteurs nécessitent des microscopes à fluorescence coûteux et des procédures chronophages pour la préparation des échantillons et l'analyse des images. Ces limitations rendent difficile la surveillance continue de l'ATP intracellulaire, par exemple dans les applications biologiques synthétiques dans le corps qui nécessitent une détection rapide, bon marché et continue de l'ATP dans des cellules microbiennes ou autres vivantes. La surveillance de cette dynamique de l'ATP peut prédire les nutriments, les stress cellulaires, les états pathologiques ou l'efficacité des traitements médicamenteux [2,3,4,5,6,7, 9, 11] et pourrait être utilisée pour moduler ou activer la libération moléculaire thérapeutique en réponse à énergétique cellulaire.

Étant donné que la synthèse des protéines est le principal processus énergivore dans la cellule, la synthèse des ribosomes doit être étroitement contrôlée par la disponibilité de l'ATP/GTP afin de maintenir l'homéostasie de l'ATP [17,18,19,20]. L'activité d'un promoteur d'ARN ribosomique (ARNr), rrnB Il a été démontré que P1 dépend du niveau d'ATP cellulaire dans E. coli [17, 18]. Lors de la liaison, une holoenzyme ARN polymérase (RNAP) et le rrnB Le promoteur P1 forme un complexe ouvert de très courte durée, ce complexe ouvert instable nécessite une concentration inhabituellement élevée d'ATP (Kd dans la gamme mM) pour initier la transcription de l'ARNr [17, 18, 21, 22]. La sensibilité de la rrnB Le promoteur P1 de l'ATP est attribué à ses caractéristiques spécifiques, notamment des hexamères -35 non consensuels, un espacement non optimal entre -35 et -10 hexamères et un discriminateur riche en GC [23, 24]. L'exigence d'une concentration élevée d'ATP pour l'initiation de la transcription est l'étape limitante et permet la régulation de la production d'ARNr en modifiant les niveaux d'ATP tant qu'ils ne saturent pas [23, 24]. Par conséquent, l'activité de la rrnB Le promoteur P1 a été proposé comme indicateur sensible de l'ATP dans E. coli [10, 17, 18]. Cependant, des analyses systématiques et quantitatives de rrnB Les rapporteurs ATP basés sur P1 qui permettent des mesures dynamiques de la consommation d'énergie et d'énergie ont jusqu'à présent fait défaut. L'utilisation combinatoire d'un tel rapporteur ATP et de modèles dynamiques pourrait permettre une détermination efficace de l'énergétique cellulaire à travers diverses phases de croissance.

Dans ce travail, nous avons conçu et criblé une série de rapporteurs ATP synthétiques dans E. coli. Les reporters ATP ont été créés en fusionnant le capteur ATP rrnB Promoteur P1 avec le gène d'une GFP à repliement rapide (GFP-mut2) qui se replie en quelques minutes [25]. Une étiquette de dégradation de la protéase SsrA [26, 27] fusionnée à l'extrémité C-terminale de la GFP a également permis sa dégradation rapide. Ainsi, la GFP produite à partir de la rrnB Le promoteur P1 en réponse à l'ATP cellulaire a permis un suivi relativement rapide de l'ATP dans E. coli. Nous avons testé les performances du reporter dans les médias minimaux et riches. Même si l'activité du rrnB Le promoteur P1 est également affecté par des niveaux élevés de guanosine tétraphosphate (ppGpp) dans des conditions de famine [18, 20], nous avons constaté que notre journaliste ATP peut suivre fidèlement les niveaux d'ATP cellulaire dans différentes conditions expérimentales indépendamment de la présence potentielle de ppGpp. Après avoir vérifié les performances du rrnB Reporter ATP basé sur P1 dans divers médias et E. coli souches, nous l'avons utilisé pour étudier comment la dynamique bactérienne de l'ATP change en réponse à divers nutriments, y compris le glucose et le phosphate. Pour démontrer la précision du rapporteur ATP dans les mesures de consommation d'énergie pendant la croissance bactérienne, nous avons développé un modèle cinétique et un modèle de circuit électrique pour la croissance bactérienne dans un milieu minimal. Nos mesures et notre modèle de rapporteur ATP nous permettent d'estimer quantitativement la consommation d'énergie ATP intracellulaire (flux ATP) dans les cellules vivantes, ce qui est difficile à estimer par des capteurs ATP à base de luciférase ou d'autres. Nous montrons que notre travail peut aider à quantifier des changements frappants dans la dynamique de l'ATP et la consommation d'énergie au cours des phases de croissance bactérienne.


Azote et eau

Les nutriments, tels que l'azote et le phosphore, sont essentiels à la croissance et à l'alimentation des plantes et des animaux, mais la surabondance de certains nutriments dans l'eau peut avoir plusieurs effets néfastes sur la santé et l'environnement.

Azote et eau

Sugar Creek, Indiana, est un ruisseau qui traverse des terres agricoles fertilisées.

Les éléments nutritifs, tels que l'azote et phosphore, sont essentiels à la croissance et à l'alimentation des plantes et des animaux, mais la surabondance de certains nutriments dans l'eau peut entraîner un certain nombre d'effets néfastes sur la santé et l'environnement. L'azote, sous forme de nitrate, de nitrite ou d'ammonium, est un nutriment nécessaire à la croissance des plantes. Environ 78 % de l'air que nous respirons est composé d'azote gazeux, et dans certaines régions des États-Unis, en particulier le nord-est, certaines formes d'azote sont couramment déposées dans pluie acide.

Bien sûr, l'azote est utilisé dans l'agriculture pour faire pousser des cultures, et dans de nombreuses fermes, le paysage a été considérablement modifié pour maximiser la production agricole. Les champs ont été nivelés et modifiés pour évacuer efficacement l'excès d'eau qui peut tomber au fur et à mesure précipitation ou de pratiques d'irrigation.

Cette image montre Sugar Creek dans l'Indiana, car il a été largement modifié pour un usage humain. Comme on le trouve couramment dans les petits ruisseaux agricoles, le ruisseau Sugar a été redressé, approfondi et des drains en tuiles ont été installés pour favoriser l'élimination rapide de l'eau des terres agricoles. Si un excès d'azote se trouve dans les champs cultivés, l'eau de drainage peut l'introduire dans des cours d'eau comme ceux-ci, qui s'écouleront dans d'autres rivières plus grandes et pourraient se retrouver dans le golfe du Mexique, où un excès d'azote peut entraîner des conditions hypoxiques (manque d'oxygène ).

Sources d'azote

Des engrais et autres produits chimiques sont appliqués dans les champs cultivés dans le monde entier. En raison du ruissellement, des produits chimiques en excès peuvent se retrouver dans les plans d'eau et nuire à la qualité de l'eau.

Crédits : Pixabay - Creative Commons

Bien que l'azote soit abondant naturellement dans l'environnement, il est également introduit par les eaux usées et les engrais. Les engrais chimiques ou le fumier animal sont couramment appliqués aux cultures pour ajouter des éléments nutritifs. Il peut être difficile ou coûteux de conserver sur place tout l'azote apporté aux exploitations pour l'alimentation ou l'engrais et généré par le fumier animal. À moins que des structures spécialisées n'aient été construites dans les fermes, de lourdes des pluies peut générer un ruissellement contenant ces matériaux dans les environs ruisseaux et lacs. Installations de traitement des eaux usées qui n'éliminent pas spécifiquement l'azote peut également conduire à des niveaux excessifs d'azote dans surface ou eaux souterraines.

Les nitrates peuvent entrer dans l'eau directement à la suite de ruissellement d'engrais contenant du nitrate. Certains nitrates pénètrent dans l'eau de l'atmosphère, qui transporte des composés azotés dérivés des automobiles et d'autres sources. Plus de 3 millions de tonnes d'azote se déposent chaque année aux États-Unis à partir de l'atmosphère, provenant soit naturellement de réactions chimiques, soit de la combustion de combustibles fossiles, comme le charbon et l'essence. Le nitrate peut également se former dans les plans d'eau par oxydation d'autres formes d'azote, notamment le nitrite, l'ammoniac et les composés organiques azotés tels que les acides aminés. L'ammoniac et l'azote organique peuvent pénétrer dans l'eau par les effluents d'eaux usées et le ruissellement des terres où du fumier a été épandu ou stocké.

Sources d'azote dans le golfe du Mexique

L'identification des sources de nutriments est une tâche compliquée car, avec plus de 1,2 million de miles carrés, le bassin du fleuve Mississippi est le quatrième plus grand bassin au monde. Il couvre près de 40 pour cent des 48 États inférieurs. Il y a 31 États qui se déversent, via le bassin du fleuve Mississippi, dans le golfe du Mexique, et des sources de nutriments se trouvent dans tout le bassin.

Les engrais utilisés sur les cultures, la pollution de l'air et le fumier sont quelques-unes des principales sources d'azote transporté du bassin du fleuve Mississippi au golfe du Mexique.

Problèmes avec les niveaux excessifs d'azote dans l'environnement

L'excès d'azote peut endommager les plans d'eau

Un excès d'azote peut provoquer une stimulation excessive de la croissance des plantes aquatiques et des algues. La croissance excessive de ces organismes, à son tour, peut obstruer les prises d'eau, épuiser oxygène dissous à mesure qu'ils se décomposent et bloquent la lumière vers les eaux plus profondes. Lac et réservoir l'eutrophisation peut se produire, qui produit des écumes disgracieuses d'algues à la surface de l'eau, peut parfois entraîner la mort de poissons, et peut même "tuer" un lac en le privant d'oxygène. L'efficacité de la respiration des poissons et des invertébrés aquatiques peut se produire, entraînant une diminution de la diversité animale et végétale, et affecte notre utilisation de l'eau pour la pêche, la baignade et la navigation de plaisance.

L'excès d'azote dans l'eau peut nuire aux gens

Une prolifération d'algues sur le lac Le-Auqa-Na, Illinois.

Trop d'azote, sous forme de nitrate, dans l'eau potable peut être nocif pour les jeunes nourrissons ou les jeunes animaux. Un excès de nitrate peut entraîner une restriction du transport de l'oxygène dans le sang. Les nourrissons de moins de 4 mois manquent de l'enzyme nécessaire pour corriger cette condition ("syndrome du bébé bleu").

Variation du nitrate à travers les États-Unis

La concentration de nitrate (une forme d'azote) des plans d'eau varie considérablement à travers les États-Unis. Les processus naturels et humains déterminent la concentration de nitrate dans l'eau. Le National Atmospheric Deposition Program a développé des cartes montrant les patrons de nitrate, comme celle ci-dessous montrant le patron spatial des nitrates sur des sites d'échantillonnage sélectionnés pour 2002. Vous devez savoir que cette carte de contour a été développée en utilisant les mesures de nitrate aux emplacements d'échantillonnage spécifiques ainsi , les contours et les isolignes ont été créés par interpolation entre les points de données. Vous ne devez pas nécessairement utiliser la carte pour documenter les nitrates d'un plan d'eau à un emplacement particulier de la carte, mais plutôt utiliser la carte comme indicateur général des nitrates dans tout le pays.

Source : National Atmospheric Deposition Program (NRSP-3)/National Trends Network. (2004). Bureau du programme NADP, Illinois State Water Survey, 2204 Griffith Dr., Champaign, IL 61820.

Risques de contamination par les nitrates dans les eaux souterraines peu profondes

Une grande partie de la nation utilise les eaux souterraines à sa principale source d'eau pour de nombreux besoins, de l'eau potable et d'autres usages domestiques à l'irrigation aux usages publics, tels que l'approvisionnement en eau des parcs. Bien sûr, la géologie et les facteurs qui affectent la disponibilité des eaux souterraines varient considérablement géographiquement, mais de nombreux endroits, comme le sud de la Géorgie, ont des aquifères qui peuvent fournir beaucoup d'eau douce très près de la surface terrestre. Étant donné que la contamination par l'azote est plus un problème dans les eaux peu profondes aquifères, il vaut la peine de savoir quels aquifères aux États-Unis seraient plus à risque pour l'azote contamination.

Développée pour une étude de l'USGS, la carte ci-dessous montre les zones présentant le risque le plus élevé de contamination des eaux souterraines peu profondes par les nitrates. En général, la vulnérabilité des aquifères est représentée par les caractéristiques de drainage du sol, c'est-à-dire la facilité avec laquelle l'eau et les produits chimiques peuvent s'infiltrer dans les eaux souterraines— et la mesure dans laquelle les forêts sont entrecoupées de terres cultivées. L'utilisation de la carte des risques pour identifier et hiérarchiser la contamination à un niveau plus détaillé que celui présenté ici n'est pas conseillée car les variations locales d'utilisation des sols, pratiques d'irrigation, le type d'aquifère et les précipitations peuvent entraîner des concentrations de nitrates qui ne sont pas conformes aux schémas de risque indiqués à l'échelle nationale.


Ce chapitre est une introduction aux méthodes de dosage les plus couramment utilisées pour estimer le nombre de cellules viables dans des plaques multipuits. Ce chapitre décrit les dosages où les données sont enregistrées à l'aide d'un lecteur de plaques, il ne couvre pas les méthodes de dosage conçues pour la cytométrie en flux ou l'imagerie à haut contenu. Les méthodes de dosage couvertes comprennent l'utilisation de différentes classes de réactifs colorimétriques au tétrazolium, la réduction de la résazurine et des substrats de protéase générant un signal fluorescent, le dosage de l'ATP luminogène et un nouveau dosage en temps réel pour surveiller les cellules vivantes pendant des jours en culture. Les dosages décrits sont basés sur la mesure d'une activité de marqueur associée au nombre de cellules viables. Ces tests sont utilisés pour mesurer les résultats de la prolifération cellulaire, tester les effets cytotoxiques des composés et pour le multiplexage en tant que contrôle interne afin de déterminer le nombre de cellules viables au cours d'autres tests cellulaires.

Les analyses cellulaires sont souvent utilisées pour cribler des collections de composés afin de déterminer si les molécules d'essai ont des effets sur la prolifération cellulaire ou présentent des effets cytotoxiques directs qui conduisent finalement à la mort cellulaire. Les tests cellulaires sont également largement utilisés pour mesurer la liaison au récepteur et divers événements de transduction de signaux pouvant impliquer l'expression de rapporteurs génétiques, le trafic de composants cellulaires ou la surveillance de la fonction des organites. Quel que soit le type de test cellulaire utilisé, il est important de savoir combien de cellules viables restent à la fin de l'expérience. Il existe une variété de méthodes de dosage qui peuvent être utilisées pour estimer le nombre de cellules eucaryotes viables. Ce chapitre donnera un aperçu de certaines des principales méthodes utilisées dans les formats multi-puits où les données sont enregistrées à l'aide d'un lecteur de plaques. Les méthodes décrites comprennent : la réduction du tétrazolium, la réduction de la résazurine, les marqueurs de protéase et la détection de l'ATP. Les méthodes de cytométrie en flux et d'imagerie à haut contenu pourraient être couvertes dans différents chapitres à l'avenir.

Les tests de réduction de tétrazolium, de réduction de résazurine et d'activité de protéase mesurent certains aspects du métabolisme général ou une activité enzymatique en tant que marqueur de cellules viables. Tous ces tests nécessitent l'incubation d'un réactif avec une population de cellules viables pour convertir un substrat en un produit coloré ou fluorescent qui peut être détecté avec un lecteur de plaques. Dans la plupart des conditions de culture standard, l'incubation du substrat avec des cellules viables entraînera la génération d'un signal proportionnel au nombre de cellules viables présentes. Lorsque les cellules meurent, elles perdent rapidement la capacité de convertir le substrat en produit. Cette différence constitue la base de nombreux tests de viabilité cellulaire couramment utilisés. Le dosage de l'ATP est quelque peu différent en ce que l'ajout de réactif de dosage rompt immédiatement les cellules, il n'y a donc pas de période d'incubation du réactif avec une population de cellules viables.

Essais de réduction du tétrazolium

Divers composés de tétrazolium ont été utilisés pour détecter des cellules viables. Les composés les plus couramment utilisés sont : MTT, MTS, XTT et WST-1. Ces composés se répartissent en deux catégories de base : 1) le MTT qui est chargé positivement et pénètre facilement dans les cellules eucaryotes viables et 2) ceux tels que MTS, XTT et WST-1 qui sont chargés négativement et ne pénètrent pas facilement dans les cellules. Cette dernière classe (MTS, XTT, WST-1) est généralement utilisée avec un accepteur d'électrons intermédiaire qui peut transférer des électrons du cytoplasme ou de la membrane plasmique pour faciliter la réduction du tétrazolium en produit formazan coloré.

Concept de dosage du tétrazolium MTT

Le test de réduction du tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) a été le premier test de viabilité cellulaire homogène développé pour un format à 96 puits qui convenait au criblage à haut débit (HTS ) (1). La technologie de dosage du tétrazolium MTT a été largement adoptée et reste populaire dans les laboratoires universitaires, comme en témoignent des milliers d'articles publiés. Le substrat MTT est préparé dans une solution physiologiquement équilibrée, ajouté aux cellules en culture, généralement à une concentration finale de 0,2 à 0,5 mg/ml, et incubé pendant 1 à 4 heures. La quantité de formazan (probablement directement proportionnelle au nombre de cellules viables) est mesurée en enregistrant les changements d'absorbance à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre à lecture de plaque. Une longueur d'onde de référence de 630 nm est parfois utilisée, mais pas nécessaire pour la plupart des conditions de dosage.

Les cellules viables à métabolisme actif convertissent le MTT en un produit de formazan de couleur pourpre avec un maximum d'absorbance proche de 570 nm (Figure 1). Lorsque les cellules meurent, elles perdent la capacité de convertir le MTT en formazan, ainsi la formation de couleur sert de marqueur utile et pratique des seules cellules viables. Le mécanisme cellulaire exact de la réduction du MTT en formazan n'est pas bien compris, mais implique probablement une réaction avec le NADH ou des molécules réductrices similaires qui transfèrent des électrons au MTT (2). La spéculation dans la littérature ancienne impliquant des enzymes mitochondriales spécifiques a conduit à l'hypothèse mentionnée dans de nombreuses publications que le MTT mesure l'activité mitochondriale (3, 4).

Figure 1:

Structures de produit MTT et formazan coloré.

Le produit formazan du tétrazolium MTT s'accumule sous forme de précipité insoluble à l'intérieur des cellules et se dépose près de la surface cellulaire et dans le milieu de culture. Le formazan doit être solubilisé avant d'enregistrer les lectures d'absorbance. Diverses méthodes ont été utilisées pour solubiliser le produit formazan, stabiliser la couleur, éviter l'évaporation et réduire les interférences du rouge de phénol et d'autres composants du milieu de culture (5-7). Diverses méthodes de solubilisation comprennent l'utilisation de : isopropanol acidifié, DMSO, diméthylformamide, SDS et des combinaisons de détergent et de solvant organique (1, 5-7). L'acidification de la solution solubilisante a l'avantage de changer la couleur du rouge de phénol en une couleur jaune qui peut avoir moins d'interférences avec les lectures d'absorbance. Le pH de la solution de solubilisation peut être ajusté pour fournir une absorbance maximale si la sensibilité est un problème (8) cependant, d'autres technologies de dosage offrent une sensibilité beaucoup plus grande que le MTT.

La quantité de signal généré dépend de plusieurs paramètres dont : la concentration de MTT, la durée de la période d'incubation, le nombre de cellules viables et leur activité métabolique. Tous ces paramètres doivent être pris en compte lors de l'optimisation des conditions de dosage pour générer une quantité suffisante de produit pouvant être détectée au-dessus du bruit de fond.

La conversion du MTT en formazan par les cellules en culture dépend du temps (figure 2).

Figure 2:

Corrélation directe de l'absorbance du formazan avec le nombre de cellules de l'hybridome B9 et augmentation de l'absorbance en fonction du temps. Remarque : il y a peu de changement d'absorbance entre 2 et 4 heures. Adapté du test de prolifération cellulaire non radioactive CellTiter 96 ® (plus.)

Un temps d'incubation plus long entraînera une accumulation de couleur et une sensibilité accrue jusqu'à un certain point, cependant, le temps d'incubation est limité en raison de la nature cytotoxique des réactifs de détection qui utilisent l'énergie (réduction des équivalents tels que le NADH) de la cellule pour générer un signal. Pour les populations cellulaires en phase de croissance logarithmique, la quantité de produit formazan est généralement proportionnelle au nombre de cellules viables métaboliquement actives, comme le montre la linéarité de la réponse à la figure 2. Les conditions de culture qui modifient le métabolisme des cellules affecteront probablement le taux de Réduction du MTT en formazan. Par exemple, lorsque les cellules adhérentes en culture approchent de la confluence et que la croissance devient inhibée par contact, le métabolisme peut ralentir et la quantité de réduction de MTT par cellule sera plus faible. Cette situation entraînera une perte de linéarité entre l'absorbance et le nombre de cellules. D'autres conditions de culture défavorables telles qu'un pH modifié ou un épuisement des nutriments essentiels tels que le glucose peuvent entraîner une modification de la capacité des cellules à réduire le MTT.

Le test MTT a été développé comme une alternative non radioactive à l'incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN pour mesurer la prolifération cellulaire (1). Dans de nombreuses situations expérimentales, le test MTT peut se substituer directement au test d'incorporation de thymidine tritiée (figure 3).

Figure 3:

Une comparaison de l'utilisation des tests d'incorporation de MTT et de 3 [H] thymidine de cellules TF-1 traitées par hGM-CSF. Une valeur d'absorbance à blanc de 0,065 (provenant de puits sans cellules mais traités avec du MTT) a été soustraite de toutes les valeurs d'absorbance. Adapté de CellTiter 96 (plus. )

Cependant, il convient de noter que la réduction du MTT est un marqueur reflétant le métabolisme cellulaire viable et non spécifiquement la prolifération cellulaire. Les essais de réduction du tétrazolium sont souvent décrits à tort comme mesurant la prolifération cellulaire sans l'utilisation de contrôles appropriés pour confirmer les effets sur le métabolisme (10).

Peu de temps après l'ajout de MTT, la morphologie de certains types de cellules peut être observée pour changer considérablement suggérant une physiologie altérée (11 et Figure 4).

Figure 4 :

Modification de la morphologie des cellules NIH3T3 après exposition au MTT (0,5 mg/ml). Le panneau A montre un champ de cellules photographié immédiatement après l'ajout de la solution de MTT. Le panneau B montre le même champ de cellules photographiées après 4 heures d'exposition au MTT. Panneau (plus. )

La toxicité du composé MTT est probablement liée à la concentration ajoutée aux cellules. L'optimisation de la concentration peut entraîner une diminution de la toxicité. Compte tenu de la nature cytotoxique du MTT, la méthode de dosage doit être considérée comme un dosage à point final. Un rapport récent a émis l'hypothèse que les cristaux de formazan contribuent à endommager les cellules en perforant les membranes pendant l'exocytose (12). L'observation de cristaux de formazan extracellulaires de plusieurs fois le diamètre des cellules qui s'allongent au fil du temps fait qu'il semble peu probable que l'exocytose de ces grandes structures ait été impliquée (Figure 4 et 5).

Figure 5 :

Cellules U937 incubées avec du tétrazolium MMT pendant 3 heures montrant des cristaux de formazan plus gros que les cellules. L'image a été capturée à l'aide d'un microscope confocal Olympus FV500. Barre d'échelle = 20 µm

La croissance des cristaux peut suggérer que le formazan marginalement soluble s'accumule là où les cristaux germes ont commencé à se déposer.

Les composés réducteurs sont connus pour interférer avec les essais de réduction du tétrazolium. Les produits chimiques tels que l'acide ascorbique ou les composés contenant du sulfhydryle, notamment le glutathion réduit, la coenzyme A et le dithiothréitol, peuvent réduire les sels de tétrazolium de manière non enzymatique et entraîner une augmentation des valeurs d'absorbance dans les puits de dosage (13-17). Un milieu de culture à pH élevé ou une exposition prolongée des réactifs à la lumière directe peut également provoquer une réduction spontanée accélérée des sels de tétrazolium et entraîner une augmentation des valeurs d'absorbance de fond. L'interférence chimique suspectée des composés d'essai peut être confirmée en mesurant les valeurs d'absorbance à partir de puits témoins sans cellules incubées avec un milieu de culture contenant du MTT et diverses concentrations du composé d'essai.

Disponibilité commerciale

Des kits commerciaux contenant des solutions de MTT et un réactif de solubilisation ainsi que de la poudre de réactif MTT sont disponibles auprès de plusieurs fournisseurs. Par exemple:

La concentration de la solution de MTT et la nature du réactif de solubilisation diffèrent selon les différents fournisseurs. La quantité de signal de formazan généré dépendra de divers paramètres, notamment le type de cellule, le nombre de cellules par puits, le milieu de culture, etc. Bien que les kits disponibles dans le commerce soient largement applicables à un grand nombre de types de cellules et de conditions de dosage, la concentration de le MTT et le type de solution de solubilisation peuvent devoir être ajustés pour des performances optimales.

Préparation des réactifs
Solution MTT

Dissoudre le MTT dans Dulbecco&# x02019s solution saline tamponnée au phosphate, pH = 7,4 (DPBS) à 5 mg/ml.

Filtrez-stérilisez la solution MTT à travers un filtre de 0,2 µM dans un récipient stérile et protégé de la lumière.

Stockez la solution MTT, à l'abri de la lumière, à 4ଌ pour un usage fréquent ou à -20ଌ pour un stockage longue durée.

Solution de solubilisation

Choisissez un récipient approprié résistant aux solvants et travaillez sous une hotte ventilée.

Préparer 40 % (vol/vol) de diméthylformamide (DMF) dans 2 % (vol/vol) d'acide acétique glacial.

Ajouter 16 % (p/vol) de dodécyl sulfate de sodium (SDS) et dissoudre.

Conserver à température ambiante pour éviter la précipitation du SDS. Si un précipité se forme, réchauffer à 37ଌ et mélanger pour solubiliser le SDS.

Protocole de dosage MTT

Préparez les cellules et testez les composés dans des plaques à 96 puits contenant un volume final de 100 & # x000a0 & # x000b5l / puits.

Incuber pendant la période d'exposition souhaitée.

Ajouter 10 µl de solution MTT par puits pour obtenir une concentration finale de 0,45 mg/ml.

Incuber 1 à 4 heures à 37ଌ.

Ajouter 100 µl de solution de solubilisation à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan.

Mélanger pour assurer une solubilisation complète.

Enregistrez l'absorbance à 570 nm.

Concept de dosage du tétrazolium MTS

Des réactifs tétrazolium développés plus récemment peuvent être réduits par des cellules viables pour générer des produits de formazan qui sont directement solubles dans le milieu de culture cellulaire. Les composés de tétrazolium correspondant à cette catégorie comprennent les séries MTS, XTT et WST (18-23). Ces réactifs au tétrazolium améliorés éliminent une étape de manipulation de liquide pendant la procédure de dosage car une seconde addition de réactif à la plaque de dosage n'est pas nécessaire pour solubiliser les précipités de formazan, rendant ainsi les protocoles plus pratiques. On pense que la charge négative des produits formazan qui contribuent à la solubilité dans le milieu de culture cellulaire limite la perméabilité cellulaire du tétrazolium (24). Cet ensemble de réactifs au tétrazolium est utilisé en combinaison avec des réactifs accepteurs d'électrons intermédiaires tels que le méthylsulfate de phénazine (PMS) ou l'éthylsulfate de phénazine (PES) qui peuvent pénétrer dans les cellules viables, se réduire dans le cytoplasme ou à la surface cellulaire et sortir des cellules où ils peuvent convertir le tétrazolium en produit formazan soluble (25). Le schéma réactionnel général de cette classe de réactifs au tétrazolium est illustré à la figure 6.

Figure 6 :

L'accepteur d'électrons intermédiaire phéazine éthyl sylfate (PES) transfère l'électron du NADH dans le cytoplasme pour réduire le MTS dans le milieu de culture en un formazan soluble aqueux.

In general, this class of tetrazolium compounds is prepared at 1 to 2mg/ml concentration because they are not as soluble as MTT. The type and concentration of the intermediate electron acceptor used varies among commercially available reagents and in many products the identity of the intermediate electron acceptor is not disclosed. Because of the potential toxic nature of the intermediate electron acceptors, optimization may be advisable for different cell types and individual assay conditions. There may be a narrow range of concentrations of intermediate electron acceptor that result in optimal performance.

Commercial Availability

Commercial kits containing solutions of MTS, XTT, and WST-1 and an intermediate electron acceptor reagent are available from several vendors. Par exemple:


The Issue

Nutrient pollution is one of America's most widespread, costly and challenging environmental problems, and is caused by excess nitrogen and phosphorus in the air and water.

Nitrogen and phosphorus are nutrients that are natural parts of aquatic ecosystems. Nitrogen is also the most abundant element in the air we breathe. Nitrogen and phosphorus support the growth of algae and aquatic plants, which provide food and habitat for fish, shellfish and smaller organisms that live in water.

But when too much nitrogen and phosphorus enter the environment - usually from a wide range of human activities - the air and water can become polluted. Nutrient pollution has impacted many streams, rivers, lakes, bays and coastal waters for the past several decades, resulting in serious environmental and human health issues, and impacting the economy.

Too much nitrogen and phosphorus in the water causes algae to grow faster than ecosystems can handle. Significant increases in algae harm water quality, food resources and habitats, and decrease the oxygen that fish and other aquatic life need to survive. Large growths of algae are called algal blooms and they can severely reduce or eliminate oxygen in the water, leading to illnesses in fish and the death of large numbers of fish. Some algal blooms are harmful to humans because they produce elevated toxins and bacterial growth that can make people sick if they come into contact with polluted water, consume tainted fish or shellfish, or drink contaminated water.

Nutrient pollution in ground water - which millions of people in the United States use as their drinking water source - can be harmful, even at low levels. Infants are vulnerable to a nitrogen-based compound called nitrates in drinking water. Excess nitrogen in the atmosphere can produce pollutants such as ammonia and ozone, which can impair our ability to breathe, limit visibility and alter plant growth. When excess nitrogen comes back to earth from the atmosphere, it can harm the health of forests, soils and waterways.


Preserving Bacterial Cultures

Bacteria can be stored for months or years if they are stored at -80C and in a high percentage of glycerol.

Objectifs d'apprentissage

Describe how bacterial cultures can be stored for a long time at -80C in glycerol

Points clés à retenir

Points clés

  • Preserve your selected bacteria so you always have something to go back to if something goes wrong.
  • While it is possible to make a long term stock from cells in stationary phase, ideally your culture should be in logarithmic growth phase.
  • Ensure a pure culture is being preserved by picking a single colony of the bacteria off a plate for cryopreservation.

Mots clés

  • cryogenic: of, relating to, or performed at low temperatures
  • logarithmic growth phase: exponential phase (sometimes called the log phase or the logarithmic phase) is a period characterized by cell doubling.

Bacteria in liquid media: An erlenmeyer containing a bacterial culture. Bacteria that have been preserved in glycerol stocks can be grown overnight in liquid media to promote propagation.

Three species of bacteria, Carnobacterium pleistocenium, Chryseobacterium greenlandensis, and Herminiimonas glaciei, have reportedly been revived after surviving for thousands of years frozen in ice. As a practical matter, as a researcher, you will want to preserve your selected bacteria so you can go back to it if something goes wrong.

Whenever you successfully transform a bacterial culture with a plasmid or whenever you obtain a new bacterial strain, you will want to make a long term stock of that bacteria. Bacteria can be stored for months and years if they are stored at -80C and in a high percentage of glycerol.

In order to ensure a pure culture is being preserved, pick a single colony of the bacteria off a plate, grow it overnight in the appropriate liquid media, and with shaking. Take the overnight culture and and mix an aliquot with 40% glycerol in sterile water and place in a cryogenic vial. It is important to label the vial with all the relevant information (e.g. strain, vector, date, researcher, etc.). Freeze the glycerol stock and store at -80C. At this point you should also record the strain information and record the location.

While it is possible to make a long term stock from cells in the stationary phase, ideally your culture should be in logarithmic growth phase. Certain antibiotics in the medium should be removed first as they are supposedly toxic over time, e.g. Tetracycline. To do this, spin the culture down and resuspend it in the same volume of straight LB medium.


Food Calorimetry: How to Measure Calories in Food

Laura Jennings
Product Developer


People who check nutrition labels to make informed decisions about which foods to eat and which to avoid often base those decisions solely on the number of calories per serving. A calorie, like a joule, is a unit of energy. The International System of Units (SI) unit for energy is the joule Cependant, le calorie is commonly used for a unit of food energy. A calorie is equal to the amount of energy per unit mass required to raise the temperature of 1 g of water by 1° C. One calorie is the equivalent of 4.18 joules. Food calories, as read off a nutrition label, are actually kilocalories (often denoted as �lories” with a capital C). There are 1,000 calories in a kilocalorie, or food Calorie.

A calorimeter is a piece of equipment designed to measure the energy released or absorbed during a chemical reaction or phase change. Food calorimetry allows us to determine the number of calories per gram of food. In this activity, a piece of food is burned and the released energy is used to heat a known quantity of water. The temperature change (∆T) of the water is then used to determine the amount of energy in the food.

Safety measures

Use safety glasses or goggles and be cautious with the matches and burning food samples. Check for food allergies before using food samples. Sensitive individuals should not participate in any activities that may result in exposure. Never eat or drink in lab.

Matériaux

  • Soda Can (empty)
  • Stirring Rod
  • Ring Stand and Ring
  • Thermomètre
  • Graduated Cylinder, 100 mL
  • Large Paper Clip
  • 2 Twist Ties
  • 3 Food Samples with Nutrition Labels (2 to 3 g each of samples such as nuts marshmallows or soft chips, e.g., cheese puffs)
  • L'eau
  • Matches
  • Aluminum Foil (small piece)

At least 1 of the following to be shared

Procédure

  1. Using the graduated cylinder, obtain 50 mL of water and carefully pour it into the soda can.
  2. Determine the mass of water and record your finding in the data table (hint: density of water = 1 g/mL).
  3. Hold the paper clip horizontally and bend the outer end upwards until it is at a 90° angle to the rest of the paper clip.
  4. Obtain a 2- to 3-g food sample.
  5. Place the food sample on the paper clip&aposs upward-extending end. The sample should be freestanding, supported by the bottom of the paper clip (see Fig. 1). Determine the initial mass of the food sample and paper clip, and record your findings in the data table.


Figure 1

  1. Place a small piece of aluminum foil underneath the paper clip in a space that has been cleared of all flammables.
  2. Insert the stirring rod through the soda can tab and position the can in the ring stand so the stirring rod supports it (see Fig. 2).


Figure 2

  1. Adjust the ring stand until the can is approximately 4 cm above the food sample.
  2. Suspend the thermometer inside the can a few centimeters above the can&aposs bottom. Secure with 2 twist ties.
  3. Determine the initial temperature of the water in the can and record this value in the data table.
  4. Carefully light a match and use it to light the food sample.
  5. Allow the lit sample to heat the water in the can. Gently stir the water periodically with the thermometer (see Fig. 3).
  6. Monitor the temperature change of the water and record the highest observed temperature in the data table.


figure 3


INTRODUCTION

Eukaryotes have two major protein degradation systems within cells. One is the ubiquitin-proteasome system, which accounts for the selective degradation of most short-lived proteins (Hochstrasser, 1996 Hershko and Ciechanover, 1998). The other is the lysosomal system. Proteins from both inside and outside of the cell are delivered to the lytic compartment. Degradation of exogenous materials and plasma membrane proteins is mediated by the process of endocytosis/phagocytosis, whereas degradation of cytoplasmic components is achieved by autophagy (also known as autophagocytosis). Three types of autophagy have been proposed: macroautophagy, microautophagy, and chaperon-mediated autophagy (Seglen and Bohley, 1992 Dunn, 1994 Blommaart et al., 1997). Macroautophagy is thought to be responsible for the majority of the intracellular protein degradation in mammalian cells, particularly during starvation-induced proteolysis (Mortimore and Pösö, 1987).

Macroautophagy (simply referred to as autophagy hereafter) is mediated by a unique organelle termed the autophagosome. A membrane cisterna called the isolation membrane (also known as phagophore) encloses a portion of cytoplasm, resulting in the formation of the autophagosome. The autophagosome is a double-membrane structure containing undigested cytoplasmic materials including organelles. The sequestration step is generally thought to be nonselective. Next, the outer membrane of the autophagosome fuses with the lysosome membrane. Various hydrolytic enzymes are supplied to the autophagosome and the cytoplasm-derived contents are degraded together with the inner membrane of the autophagosome. This degrading structure is termed the autolysosome/autophagolysosome.

Autophagy is thought to be required for normal turnover of cellular components particularly in response to starvation (Mortimore and Pösö, 1987). Autophagy-defective yeast cells die quickly during starvation (Tsukada and Ohsumi, 1993). Autophagy also plays an important role in some types of differentiation/development: ATG genes (described below) are essential for spore formation in yeast (Tsukada and Ohsumi, 1993), and the development of Drosophila melanogaster (Juhasz et al., 2003), Dictyostelium discoideum (Otto et al., 2003), and Caenorhabditis elegans (Melendez et al., 2003). Plants deficient for autophagy genes show acceleration of senescence (Doelling et al., 2002 Hanaoka et al., 2002). In contrast, the precise roles of autophagy in mammals are not known, although a growing number of studies have suggested that autophagy might be important for cell death during embryogenesis (Clarke, 1990) and pathogenesis (Liang et al., 1999 Nishino et al., 2000). In addition, systematic analysis describing where and when autophagy occurs has not been performed. This is largely due to a lack of good diagnostic methods. To date, electron microscopy has been the only method to monitor autophagy. Unfortunately, this is a method requiring many skills and much time, and sometimes it is difficult to distinguish autophagic vacuoles from other structures just by morphology. Although an elegant transgenic mouse model was recently generated to monitor the ubiquitin/proteasome system (Lindsten et al., 2003), we have not had such in vivo assay systems for autophagy.

We have dissected the autophagic pathway at the molecular level using both yeast and mammalian cells. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, at least 16 of APG et AUT genes have been identified to be required for autophagosome formation (Klionsky and Ohsumi, 1999 Ohsumi, 2001 Mizushima et al., 2002a). The nomenclature of these autophagy-related genes were recently unified as ATG (Klionsky et al., 2003). We have found two novel ubiquitylation-like conjugation systems: one mediates conjugation of Atg12 to Atg5 (Mizushima et al., 1998a) and the other mediates a covalent linkage between Atg8 (Aut7/Atg8) and phosphatidylethanolamine (PE Ichimura et al., 2000). The resulting conjugates, Atg12-Atg5 and Atg8-PE, function in autophagosome formation (Suzuki et al., 2001 Noda et al., 2002). These two conjugation systems are highly conserved in mammals (Mizushima et al.,1998b, 2002b Kabeya et al., 2000 Tanida et al.,2001, 2002). Most Atg12-Atg5 conjugate exists in the cytosol as a complex with Atg16L (Mizushima et al.,1999, 2003 Kuma et al., 2002). Only a small fraction of the Atg12-Atg5·Atg16L complex localizes to the autophagic isolation membranes throughout its elongation process, and the complex dissociates from the membrane when autophagosome formation is completed (Mizushima et al., 2001). We have demonstrated that mouse Atg12-Atg5 conjugate is indeed essential for the membrane elongation process by generating ATG5 -/- embryonic stem (ES) cells (Mizushima et al., 2001). LC3, one of the mammalian homologues of Atg8, also targets the isolation membrane in an Atg5-dependent manner. However, LC3 remains on the membrane even after spherical autophagosomes are completely formed (Kabeya et al., 2000 Mizushima et al., 2001). When we label autophagosomes with green fluorescent protein (GFP)-LC3, we are able to see them by fluorescence microscopy as ring-shaped structures (Mizushima et al., 2003), or dots in the case of small autophagosomes (Kabeya et al., 2000). Because autolysosomes have less LC3 on the membrane than autophagosomes, the fluorescent signal of autolysosomes is weaker. On the basis of these observations, we propose that LC3 could serve as a good molecular marker for isolation membranes, autophagosomes, and some autolysosomes (Kabeya et al., 2000).

We have applied this method to in vivo studies to monitor autophagy simply and accurately. We generated GFP-LC3 transgenic mice and examined the occurrence of autophagy in various tissues. Using this novel assay system, we performed comprehensive and quantitative analysis on the autophagic response during starvation.


Résumé

Freshwater and marine algae can balance nutrient demand and availability by regulating uptake, accumulation and exudation. To obtain insight into these processes under nitrogen (N) and phosphorus (P) limitation, we reanalyze published data from continuous cultures of the chlorophyte Selenastrum minutum. Based on mass budgets, we argue that much of the non‐limiting N and P had passed through the organisms and was present as dissolved organic phosphorus or nitrogen (DOP or DON). We construct a model that describes the production of biomass and dissolved organic matter (DOM) as a function of the growth rate. A fit of this model against the chemostat data suggests a high turnover of the non‐limiting N and P: at the highest growth rates, N and P atoms spent on average only about 3 h inside an organism, before they were exuded as DON and DOP, respectively. This DOM exudation can explain the observed trends in the algal stoichiometric ratios as a function of the dilution rate. We discuss independent evidence from isotope experiments for this apparently wasteful behavior and we suggest experiments to quantify and characterize DON and DOP exudation further.