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D'où viennent les unités phosphate lorsque les unités EGF se dimérisent ?

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Lors de la liaison à l'EGF, les unités EGFR se dimérisent et se phosphorylent. Les groupes phosphate sont transférés vers des régions intracellulaires riches en tyrosine c-terminale. D'où viennent les unités phosphate dans cette réaction croisée ? Est-ce à partir d'unités GTP liées ?


Dans la phosphorylation des protéines, le groupe phosphate transféré de la kinase au substrat provient presque universellement de l'ATP. Cependant, il existe des preuves que certaines protéines kinases utilisent le GTP comme source de phosphate, bien qu'elles soient rares.


Facteur d'échange de nucléotide guanine

Facteurs d'échange de nucléotides de guanine (FEM) sont des protéines ou des domaines protéiques qui activent les GTPases monomères en stimulant la libération de guanosine diphosphate (GDP) pour permettre la liaison de la guanosine triphosphate (GTP). [1] Il a été démontré qu'une variété de domaines structuraux non apparentés présentent une activité d'échange de nucléotides de guanine. Certains GEF peuvent activer plusieurs GTPases tandis que d'autres sont spécifiques à une seule GTPase.


Contenu

Initialement, la transcription de variants d'épissage alternatifs dérivés du gène INSR est traduite pour former l'un des deux isomères monomères IR-A dans lequel l'exon 11 est exclu, et IR-B dans lequel l'exon 11 est inclus. L'inclusion de l'exon 11 entraîne l'ajout de 12 acides aminés en amont du site de clivage protéolytique de la furine intrinsèque.

Lors de la dimérisation du récepteur, après clivage protéolytique en chaînes et , les 12 acides aminés supplémentaires restent présents à l'extrémité C-terminale de la chaîne (désigné αCT) où ils devraient influencer l'interaction récepteur-ligand. [9]

Chaque monomère isométrique est structurellement organisé en 8 domaines distincts constitués d'un domaine répété riche en leucine (L1, résidus 1-157), d'une région riche en cystéine (CR, résidus 158-310), d'un domaine répété riche en leucine supplémentaire (L2, résidus 311-470), trois domaines de fibronectine de type III FnIII-1 (résidus 471-595), FnIII-2 (résidus 596-808) et FnIII-3 (résidus 809-906). De plus, un domaine d'insertion (ID, résidus 638-756) réside dans FnIII-2, contenant le site de clivage de la furine /β, à partir duquel la protéolyse résulte à la fois des domaines IDα et IDβ. Au sein de la chaîne β, en aval du domaine FnIII-3 se trouve une région d'hélice transmembranaire (TH) et de juxtamembrane intracellulaire (JM), juste en amont du domaine catalytique de la tyrosine kinase (TK) intracellulaire, responsable des voies de signalisation intracellulaires ultérieures. [dix]

Lors du clivage du monomère en ses chaînes α et respectives, l'hétéro ou l'homo-dimérisation du récepteur est maintenue de manière covalente entre les chaînes par une seule liaison disulfure et entre les monomères dans le dimère par deux liaisons disulfure s'étendant à partir de chaque chaîne . La structure globale de l'ectodomaine 3D, possédant quatre sites de liaison de ligand, ressemble à un « V » inversé, chaque monomère étant tourné d'environ 2 fois autour d'un axe parallèle aux domaines « V » inversé et L2 et FnIII-1 de chaque monomère formant le sommet du 'V' inversé. [10] [11]

Les ligands endogènes du récepteur de l'insuline comprennent l'insuline, l'IGF-I et l'IGF-II. À l'aide d'un cryo-EM, un aperçu structurel des changements de conformation lors de la liaison à l'insuline a été fourni. La liaison du ligand aux chaînes de l'ectodomaine dimère IR le fait passer d'une forme en V inversé à une conformation en forme de T, et ce changement se propage structurellement aux domaines transmembranaires, qui se rapprochent, conduisant finalement à l'autophosphorylation de diverses tyrosines résidus dans le domaine TK intracellulaire de la chaîne . [12] Ces changements facilitent le recrutement de protéines adaptatrices spécifiques telles que les protéines substrats du récepteur de l'insuline (IRS) en plus de SH2-B (Src Homology 2 - B ), de l'APS et des protéines phosphatases, telles que PTP1B, favorisant éventuellement les processus en aval impliquant homéostasie glycémique. [14]

Strictement parlant, la relation entre l'IR et le ligand montre des propriétés allostériques complexes. Cela a été indiqué par l'utilisation d'un diagramme de Scatchard qui a identifié que la mesure du rapport entre le ligand lié à l'IR et le ligand non lié ne suit pas une relation linéaire en ce qui concerne les changements dans la concentration du ligand lié à l'IR, ce qui suggère que l'IR et son ligand partagent une relation de liaison coopérative. [15] En outre, l'observation selon laquelle le taux de dissociation IR-ligand est accéléré lors de l'ajout d'un ligand non lié implique que la nature de cette coopération est négative, autrement dit, que la liaison initiale du ligand à l'IR inhibe davantage la liaison à son deuxième actif. site - exposition d'inhibition allostérique. [15]

Ces modèles indiquent que chaque monomère IR possède 2 sites de liaison à l'insuline, le site 1, qui se lie à la surface de liaison « classique » de l'insuline : constitué des domaines L1 plus αCT et du site 2, constitué de boucles à la jonction de FnIII-1 et FnIII- 2 prédit se lier au «nouveau» site de liaison faciale de l'hexamère de l'insuline. [5] Comme chaque monomère contribuant à l'ectodomaine IR présente une complémentarité « en miroir » 3D, le site N-terminal 1 d'un monomère fait finalement face au site C-terminal 2 du deuxième monomère, où cela est également vrai pour chaque complément en miroir de chaque monomère (le côté opposé de la structure de l'ectodomaine). La littérature actuelle distingue les sites de liaison du complément en désignant la nomenclature du site 1 et du site 2 du second monomère soit comme site 3 et site 4, soit comme site 1' et site 2' respectivement. [5] [14] En tant que tels, ces modèles indiquent que chaque IR peut se lier à une molécule d'insuline (qui a deux surfaces de liaison) via 4 emplacements, étant le site 1, 2, (3/1') ou (4/2' ). Comme chaque site 1 fait face de manière proximale au site 2, lors de la liaison de l'insuline à un site spécifique, une "réticulation" via un ligand entre les monomères est prévue (c'est-à-dire comme [monomère 1 Site 1 - Insuline - monomère 2 Site (4/2')] ou comme [monomère 1 Site 2 - Insuline - monomère 2 site (3/1')]). Conformément à la modélisation mathématique actuelle de la cinétique de l'insuline IR, il y a deux conséquences importantes pour les événements de réticulation de l'insuline 1. que par l'observation susmentionnée de la coopération négative entre l'IR et son ligand que la liaison ultérieure du ligand à l'IR est réduite et 2 que l'action physique de la réticulation amène l'ectodomaine dans une telle conformation qui est requise pour que les événements de phosphorylation de la tyrosine intracellulaire s'ensuivent (c'est-à-dire que ces événements servent de conditions pour l'activation des récepteurs et le maintien éventuel de l'homéostasie glycémique). [14]

En appliquant des simulations cryo-EM et de dynamique moléculaire du récepteur reconstitué dans des nanodisques, la structure de l'ectodomaine du récepteur d'insuline dimère entier avec quatre molécules d'insuline liées a été visualisée, confirmant ainsi et montrant directement 4 emplacements de liaison biochimiquement prédits. [13]

Agonistes Modifier

Le récepteur d'insuline est un type de récepteur de tyrosine kinase, dans lequel la liaison d'un ligand agoniste déclenche l'autophosphorylation des résidus de tyrosine, chaque sous-unité phosphorylant son partenaire. L'ajout des groupes phosphate génère un site de liaison pour le substrat du récepteur de l'insuline (IRS-1), qui est ensuite activé par phosphorylation. L'IRS-1 activé initie la voie de transduction du signal et se lie à la phosphoinositide 3-kinase (PI3K), provoquant à son tour son activation. Cela catalyse ensuite la conversion du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate en phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3). PÉPIN3 agit comme un messager secondaire et induit l'activation de la protéine kinase dépendante du phosphatidylinositol, qui active ensuite plusieurs autres kinases, notamment la protéine kinase B (PKB, également connue sous le nom d'Akt). La PKB déclenche la translocation du transporteur de glucose (GLUT4) contenant des vésicules vers la membrane cellulaire, via l'activation des protéines SNARE, pour faciliter la diffusion du glucose dans la cellule. La PKB phosphoryle et inhibe également la glycogène synthase kinase, une enzyme qui inhibe la glycogène synthase. Par conséquent, PKB agit pour démarrer le processus de glycogenèse, ce qui réduit finalement la concentration de glucose dans le sang. [16]

Effet de l'insuline sur l'absorption et le métabolisme du glucose. L'insuline se lie à son récepteur (1), qui, à son tour, déclenche de nombreuses cascades d'activation de protéines (2). Ceux-ci comprennent : la translocation du transporteur Glut-4 vers la membrane plasmique et l'afflux de glucose (3), la synthèse du glycogène (4), la glycolyse (5) et la synthèse des acides gras (6).

Transduction du signal de l'insuline : A la fin du processus de transduction, la protéine activée se lie à la PÉPIN2 protéines incrustées dans la membrane.

Régulation de l'expression des gènes Modifier

L'IRS-1 activé agit comme un messager secondaire dans la cellule pour stimuler la transcription des gènes régulés par l'insuline. Premièrement, la protéine Grb2 se lie au résidu P-Tyr d'IRS-1 dans son domaine SH2. Grb2 est alors capable de se lier au SOS, qui à son tour catalyse le remplacement du GDP lié par le GTP sur Ras, une protéine G. Cette protéine commence alors une cascade de phosphorylation, culminant dans l'activation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK), qui pénètre dans le noyau et phosphoryle divers facteurs de transcription nucléaires (tels que Elk1).

Stimulation de la synthèse du glycogène Modifier

La synthèse du glycogène est également stimulée par le récepteur de l'insuline via IRS-1. Dans ce cas, c'est le domaine SH2 de la PI-3 kinase (PI-3K) qui lie le P-Tyr de l'IRS-1. Maintenant activé, PI-3K peut convertir le lipide membranaire phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) en phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate (PIP3). Cela active indirectement une protéine kinase, PKB (Akt), via la phosphorylation. La PKB phosphoryle ensuite plusieurs protéines cibles, dont la glycogène synthase kinase 3 (GSK-3). La GSK-3 est responsable de la phosphorylation (et donc de la désactivation) de la glycogène synthase. Lorsque la GSK-3 est phosphorylée, elle est désactivée et empêchée de désactiver la glycogène synthase. De cette manière détournée, l'insuline augmente la synthèse du glycogène.

Dégradation de l'insuline Modifier

Une fois qu'une molécule d'insuline s'est amarrée au récepteur et a effectué son action, elle peut être libérée dans l'environnement extracellulaire ou elle peut être dégradée par la cellule. La dégradation implique normalement une endocytose du complexe insuline-récepteur suivie de l'action d'une enzyme dégradant l'insuline. La plupart des molécules d'insuline sont dégradées par les cellules hépatiques. Il a été estimé qu'une molécule d'insuline typique est finalement dégradée environ 71 minutes après sa libération initiale dans la circulation. [17]

Système immunitaire Modifier

Outre la fonction métabolique, les récepteurs de l'insuline sont également exprimés sur les cellules immunitaires, telles que les macrophages, les cellules B et les cellules T. Sur les cellules T, l'expression des récepteurs de l'insuline est indétectable pendant l'état de repos mais régulée à la hausse lors de l'activation des récepteurs des cellules T (TCR). En effet, il a été démontré que l'insuline, lorsqu'elle est fournie de manière exogène, favorise in vitro Prolifération des lymphocytes T dans les modèles animaux. La signalisation des récepteurs de l'insuline est importante pour maximiser l'effet potentiel des cellules T lors d'une infection et d'une inflammation aiguës. [18] [19]

L'activité principale d'activation du récepteur de l'insuline est l'induction de l'absorption du glucose. Pour cette raison, "l'insensibilité à l'insuline", ou une diminution de la signalisation des récepteurs de l'insuline, conduit au diabète sucré de type 2 - les cellules sont incapables d'absorber le glucose, et le résultat est une hyperglycémie (une augmentation du glucose circulant), et toutes les séquelles qui résulter du diabète.

Quelques patients porteurs de mutations homozygotes dans le INSR gène ont été décrits, ce qui provoque le syndrome de Donohue ou le Leprechaunisme. Cette maladie autosomique récessive se traduit par un récepteur de l'insuline totalement non fonctionnel. Ces patients ont des oreilles basses, souvent protubérantes, des narines évasées, des lèvres épaissies et un retard de croissance sévère. Dans la plupart des cas, les perspectives pour ces patients sont extrêmement mauvaises, le décès survenant au cours de la première année de vie. D'autres mutations du même gène provoquent le syndrome de Rabson-Mendenhall moins sévère, dans lequel les patients ont des dents anormales caractéristiques, une gencive hypertrophique (gencives) et une hypertrophie de la glande pinéale. Les deux maladies présentent des fluctuations du taux de glucose : après un repas, le glucose est initialement très élevé, puis chute rapidement à des niveaux anormalement bas. [20] D'autres mutations génétiques du gène du récepteur de l'insuline peuvent provoquer une résistance sévère à l'insuline. [21]


Contenu

HER2 est ainsi nommé parce qu'il a une structure similaire au récepteur du facteur de croissance épidermique humain, ou HER1. Neu est ainsi nommé parce qu'il est dérivé d'une lignée cellulaire de glioblastome de rongeur, un type de tumeur neurale. ErbB-2 a été nommé pour sa similitude avec ErbB (oncogène B de l'érythroblastose aviaire), l'oncogène trouvé plus tard pour coder pour l'EGFR. Le clonage moléculaire du gène a montré que HER2, Neu et ErbB-2 sont tous codés par les mêmes orthologues. [9]

ERBB2, un proto-oncogène connu, est localisé au bras long du chromosome humain 17 (17q12).

La famille ErbB se compose de quatre récepteurs tyrosine kinases liés à la membrane plasmique. L'un d'eux est erbB-2, et les autres membres étant le récepteur du facteur de croissance épidermique, erbB-3 (la liaison à la neuréguline manque de domaine kinase) et erbB-4. Tous les quatre contiennent un domaine de liaison de ligand extracellulaire, un domaine transmembranaire et un domaine intracellulaire qui peut interagir avec une multitude de molécules de signalisation et présenter une activité à la fois dépendante et indépendante du ligand. Notamment, aucun ligand pour HER2 n'a encore été identifié. [10] [11] HER2 peut s'hétérodimériser avec n'importe lequel des trois autres récepteurs et est considéré comme le partenaire de dimérisation préféré des autres récepteurs ErbB. [12]

La dimérisation entraîne l'autophosphorylation des résidus tyrosine dans le domaine cytoplasmique des récepteurs et initie diverses voies de signalisation.

Transduction du signal Modifier

Les voies de signalisation activées par HER2 comprennent : [13]

En résumé, la signalisation via la famille de récepteurs ErbB favorise la prolifération cellulaire et s'oppose à l'apoptose, et doit donc être étroitement régulée pour empêcher la croissance cellulaire incontrôlée de se produire.

Cancer Modifier

L'amplification, également connue sous le nom de surexpression de la ERBB2 gène, se produit dans environ 15 à 30 % des cancers du sein. [8] [14] Il est fortement associé à une récurrence accrue de la maladie et à un mauvais pronostic, cependant, les agents médicamenteux ciblant HER2 dans le cancer du sein ont altéré de manière significative et positive l'histoire naturelle par ailleurs de mauvais pronostic du cancer du sein HER2-positif. [15] La surexpression est également connue pour se produire dans l'ovaire, [16] l'estomac, l'adénocarcinome du poumon [17] et les formes agressives de cancer de l'utérus, telles que le carcinome séreux de l'endomètre, [18] [19] par ex. HER2 est surexprimé chez environ 7 à 34 % des patients atteints de cancer gastrique [20] [21] et dans 30 % des carcinomes des canaux salivaires. [22]

HER2 est colocalisé et la plupart du temps co-amplifié avec le gène GRB7, qui est un proto-oncogène associé aux tumeurs du sein, des cellules germinales testiculaires, gastriques et œsophagiennes.

Il a été démontré que les protéines HER2 forment des amas dans les membranes cellulaires qui peuvent jouer un rôle dans la tumorigenèse. [23] [24]

Des preuves ont également impliqué la signalisation HER2 dans la résistance au cetuximab, un médicament anticancéreux ciblé sur l'EGFR. [25]

Mutations Modifier

De plus, diverses altérations structurelles ont été identifiées qui provoquent un déclenchement indépendant du ligand de ce récepteur, en l'absence de surexpression du récepteur. HER2 se trouve dans une variété de tumeurs et certaines de ces tumeurs portent des mutations ponctuelles dans la séquence spécifiant le domaine transmembranaire de HER2. La substitution d'une valine à un acide glutamique dans le domaine transmembranaire peut conduire à la dimérisation constitutive de cette protéine en l'absence de ligand. [26]

Des mutations HER2 ont été trouvées dans les cancers du poumon non à petites cellules (NSCLC) et peuvent orienter le traitement. [27]

HER2 est la cible de l'anticorps monoclonal trastuzumab (commercialisé sous le nom d'Herceptin). Le trastuzumab n'est efficace que dans les cancers où HER2 est surexprimé. Un an de traitement par trastuzumab est recommandé pour toutes les patientes atteintes d'un cancer du sein HER2-positif qui reçoivent également une chimiothérapie. [28] Douze mois de traitement par trastuzumab sont optimaux. Des essais randomisés n'ont démontré aucun bénéfice supplémentaire au-delà de 12 mois, alors que 6 mois se sont avérés inférieurs à 12. Le trastuzumab est administré par voie intraveineuse toutes les semaines ou toutes les 3 semaines. [29]

Un effet important en aval de la liaison du trastuzumab à HER2 est une augmentation de p27, une protéine qui arrête la prolifération cellulaire. [30] Un autre anticorps monoclonal, le pertuzumab, qui inhibe la dimérisation des récepteurs HER2 et HER3, a été approuvé par la FDA pour une utilisation en association avec le trastuzumab en juin 2012.

En novembre 2015, il y avait un certain nombre d'essais cliniques en cours et récemment terminés de nouveaux agents ciblés pour le cancer du sein métastatique HER2+, par ex. margetuximab. [31]

De plus, NeuVax (Galena Biopharma) est une immunothérapie à base de peptides qui dirige les cellules T « tueuses » pour cibler et détruire les cellules cancéreuses qui expriment HER2. Il est entré dans les essais cliniques de phase 3.

Il a été constaté que les patientes atteintes de cancers du sein ER+ (récepteurs d'œstrogènes positifs)/HER2+ par rapport aux cancers du sein ER-/HER2+ peuvent en fait bénéficier davantage des médicaments qui inhibent la voie moléculaire PI3K/AKT. [32]

La surexpression de HER2 peut également être supprimée par l'amplification d'autres gènes. Des recherches sont actuellement menées pour découvrir quels gènes peuvent avoir cet effet souhaité.

L'expression de HER2 est régulée par la signalisation via les récepteurs des œstrogènes. Normalement, l'œstradiol et le tamoxifène agissant par l'intermédiaire du récepteur des œstrogènes régulent à la baisse l'expression de HER2. Cependant, lorsque le rapport du coactivateur AIB-3 dépasse celui du corépresseur PAX2, l'expression de HER2 est régulée positivement en présence de tamoxifène, conduisant à un cancer du sein résistant au tamoxifène. [33] [34]

Biopsie du cancer Modifier

Le test HER2 est effectué chez des patientes atteintes d'un cancer du sein pour évaluer le pronostic et déterminer l'adéquation au traitement par trastuzumab. Il est important que le trastuzumab soit limité aux individus HER2-positifs car il est coûteux et a été associé à une toxicité cardiaque. [35] Pour les tumeurs HER2-positives, les risques du trastuzumab l'emportent clairement sur les bénéfices.

Les tests sont généralement effectués sur des échantillons de biopsie mammaire obtenus par aspiration à l'aiguille fine, biopsie au trocart, biopsie mammaire assistée par aspiration ou excision chirurgicale. L'immunohistochimie est utilisée pour mesurer la quantité de protéine HER2 présente dans l'échantillon. Des exemples de ce test comprennent HercepTest, Dako, Glostrup et Danemark. L'échantillon reçoit un score basé sur le motif de coloration de la membrane cellulaire.

  • Coloration complète de la membrane qui est soit non uniforme, soit de faible intensité, mais présente une distribution circonférentielle dans au moins 10 % des cellules. [37][38]

Les échantillons avec des résultats IHC équivoques doivent ensuite être validés par hybridation in situ en fluorescence (FISH). FISH peut être utilisé pour mesurer le nombre de copies du gène qui sont présentes et est considéré comme plus fiable que l'IHC. [39]

Sérum Modifier

Le domaine extracellulaire de HER2 peut être éliminé de la surface des cellules tumorales et entrer dans la circulation. La mesure du sérum HER2 par dosage immunoenzymatique (ELISA) offre une méthode beaucoup moins invasive de détermination du statut HER2 qu'une biopsie et a donc été largement étudiée. Les résultats jusqu'à présent ont suggéré que les changements dans les concentrations sériques de HER2 peuvent être utiles pour prédire la réponse au traitement par trastuzumab. [40] Cependant, sa capacité à déterminer l'éligibilité au traitement par trastuzumab est moins claire. [41]


Contenu

Les premiers RTK à découvrir étaient EGF et NGF dans les années 1960, mais la classification des récepteurs tyrosine kinases n'a été développée que dans les années 1970. [5]

Environ 20 classes RTK différentes ont été identifiées. [6]

  1. RTK classe I (famille des récepteurs EGF) (famille ErbB)
  2. RTK classe II (famille des récepteurs de l'insuline) (famille des récepteurs PDGF)
  3. RTK classe IV (famille des récepteurs VEGF)
  4. RTK classe V (famille des récepteurs FGF)
  5. RTK classe VI (famille des récepteurs CCK)
  6. RTK classe VII (famille des récepteurs NGF)
  7. RTK classe VIII (famille des récepteurs HGF)
  8. RTK classe IX (famille des récepteurs Eph)
  9. RTK classe X (famille de récepteurs AXL)
  10. RTK classe XI (famille de récepteurs TIE)
  11. RTK classe XII (famille des récepteurs RYK)
  12. RTK classe XIII (famille des récepteurs DDR)
  13. RTK classe XIV (famille des récepteurs RET)
  14. RTK classe XV (famille de récepteurs ROS)
  15. RTK classe XVI (famille de récepteurs LTK)
  16. RTK classe XVII (famille de récepteurs ROR)
  17. Classe RTK XVIII (famille des récepteurs MuSK)
  18. RTK classe XIX (récepteur LMR)
  19. RTK classe XX (Indéterminé)

La plupart des RTK sont des récepteurs à sous-unité unique, mais certains existent sous forme de complexes multimères, par exemple le récepteur de l'insuline qui forme des dimères à liaison disulfure en présence d'hormone (insuline). De plus, la liaison du ligand au domaine extracellulaire induit la formation de dimères de récepteur. [7] Chaque monomère a un seul domaine transmembranaire hydrophobe composé de 25 à 38 acides aminés, une région terminale N extracellulaire et une région terminale C intracellulaire. [8] La région N-terminale extracellulaire présente une variété d'éléments conservés, notamment des domaines de type immunoglobuline (Ig) ou facteur de croissance épidermique (EGF), des répétitions de fibronectine de type III ou des régions riches en cystéine qui sont caractéristiques de chaque sous-famille de RTK. ces domaines contiennent principalement un site de liaison de ligand, qui lie des ligands extracellulaires, par exemple, un facteur de croissance ou une hormone particulière. [2] La région terminale C intracellulaire présente le plus haut niveau de conservation et comprend des domaines catalytiques responsables de l'activité kinase de ces récepteurs, qui catalyse l'autophosphorylation des récepteurs et la phosphorylation de la tyrosine des substrats RTK. [2]

En biochimie, un kinase est un type d'enzyme qui transfère des groupes phosphate (voir ci-dessous) de molécules donneuses à haute énergie, telles que l'ATP (voir ci-dessous) à des molécules cibles spécifiques (substrats) le processus est appelé phosphorylation. Le contraire, une enzyme qui élimine les groupes phosphate des cibles, est connue sous le nom de phosphatase. Les enzymes kinases qui phosphorylent spécifiquement les acides aminés tyrosine sont appelées tyrosine kinases.

Lorsqu'un facteur de croissance se lie au domaine extracellulaire d'un RTK, sa dimérisation est déclenchée avec d'autres RTK adjacents. La dimérisation conduit à une activation rapide des domaines kinases cytoplasmiques de la protéine, le premier substrat de ces domaines étant le récepteur lui-même. Le récepteur activé devient alors autophosphorylé sur plusieurs résidus tyrosine intracellulaires spécifiques.

Par divers moyens, la liaison de ligand extracellulaire provoquera ou stabilisera typiquement la dimérisation du récepteur. Cela permet à une tyrosine dans la partie cytoplasmique de chaque récepteur monomère d'être trans-phosphorylé par son récepteur partenaire, propageant un signal à travers la membrane plasmique. [9] La phosphorylation de résidus de tyrosine spécifiques au sein du récepteur activé crée des sites de liaison pour les protéines contenant le domaine d'homologie Src 2 (SH2) et de liaison de la phosphotyrosine (PTB). [10] [11] Les protéines spécifiques contenant ces domaines incluent Src et phospholipase Cγ. La phosphorylation et l'activation de ces deux protéines lors de la liaison au récepteur conduisent à l'initiation de voies de transduction du signal. D'autres protéines qui interagissent avec le récepteur activé agissent comme des protéines adaptatrices et n'ont pas d'activité enzymatique intrinsèque qui leur est propre. Ces protéines adaptatrices relient l'activation de RTK aux voies de transduction du signal en aval, telles que la cascade de signalisation de la MAP kinase. [2] Un exemple de voie vitale de transduction du signal implique le récepteur de la tyrosine kinase, c-met, qui est nécessaire à la survie et à la prolifération des myoblastes en migration pendant la myogenèse. Un manque de c-met perturbe la myogenèse secondaire et, comme dans LBX1, empêche la formation de la musculature des membres. Cette action locale des FGF (Fibroblast Growth Factors) avec leurs récepteurs RTK est qualifiée de signalisation paracrine. Comme les récepteurs RTK phosphorylent plusieurs résidus tyrosine, ils peuvent activer plusieurs voies de transduction du signal.

Famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique Modifier

La famille des protéines ErbB ou la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une famille de quatre récepteurs tyrosine kinases structurellement apparentés. Une signalisation ErbB insuffisante chez l'homme est associée au développement de maladies neurodégénératives, telles que la sclérose en plaques et la maladie d'Alzheimer. [12] Chez la souris, la perte de signalisation par n'importe quel membre de la famille ErbB entraîne une létalité embryonnaire avec des défauts dans les organes, y compris les poumons, la peau, le cœur et le cerveau. Une signalisation ErbB excessive est associée au développement d'une grande variété de types de tumeurs solides. ErbB-1 et ErbB-2 se retrouvent dans de nombreux cancers humains et leur signalisation excessive peut être des facteurs critiques dans le développement et la malignité de ces tumeurs. [13]

Famille des récepteurs du facteur de croissance des fibroblastes (FGFR) Modifier

Les facteurs de croissance des fibroblastes constituent la plus grande famille de ligands de facteurs de croissance avec 23 membres. [14] L'épissage alternatif naturel de quatre gènes du récepteur du facteur de croissance des fibroblastes (FGFR) entraîne la production de plus de 48 isoformes différentes de FGFR. [15] Ces isoformes varient dans leurs propriétés de liaison au ligand et leurs domaines de kinase, cependant, elles partagent toutes une région extracellulaire commune composée de trois domaines de type immunoglobuline (Ig) (D1-D3), et appartiennent donc à la superfamille des immunoglobulines. [16] Les interactions avec les FGF se produisent via les domaines FGFR D2 et D3. Chaque récepteur peut être activé par plusieurs FGF. Dans de nombreux cas, les FGF eux-mêmes peuvent également activer plus d'un récepteur. Ce n'est cependant pas le cas du FGF-7 qui ne peut activer que le FGFR2b. [15] Un gène pour une cinquième protéine FGFR, FGFR5, a également été identifié. Contrairement aux FGFR 1-4, il manque un domaine cytoplasmique de tyrosine kinase, et une isoforme, FGFR5γ, ne contient que les domaines extracellulaires D1 et D2. [17]

Famille des récepteurs du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFR) Modifier

Le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) est l'un des principaux inducteurs de la prolifération des cellules endothéliales et de la perméabilité des vaisseaux sanguins. Deux RTK se lient au VEGF à la surface cellulaire, VEGFR-1 (Flt-1) et VEGFR-2 (KDR/Flk-1). [18]

Les récepteurs du VEGF ont une partie extracellulaire constituée de sept domaines de type Ig et, comme les FGFR, appartiennent donc à la superfamille des immunoglobulines. Ils possèdent également une seule région transmembranaire et une partie intracellulaire contenant un domaine tyrosine-kinase divisé. Le VEGF-A se lie au VEGFR-1 (Flt-1) et au VEGFR-2 (KDR/Flk-1). VEGFR-2 semble médier presque toutes les réponses cellulaires connues au VEGF. La fonction de VEGFR-1 est moins bien définie, bien qu'on pense qu'elle module la signalisation de VEGFR-2. Une autre fonction du VEGFR-1 peut être d'agir comme un récepteur factice/leurre, séquestrant le VEGF de la liaison au VEGFR-2 (cela semble être particulièrement important pendant la vasculogenèse dans l'embryon). Un troisième récepteur a été découvert (VEGFR-3) cependant, le VEGF-A n'est pas un ligand pour ce récepteur. VEGFR-3 médie la lymphangiogenèse en réponse à VEGF-C et VEGF-D.

Famille de récepteurs RET Modifier

L'épissage alternatif naturel du RET gène entraîne la production de 3 isoformes différentes de la protéine RET. RET51, RET43 et RET9 contiennent respectivement 51, 43 et 9 acides aminés dans leur queue C-terminale. [19] Les rôles biologiques des isoformes RET51 et RET9 sont les plus étudiés in vivo, car ce sont les isoformes les plus courantes dans lesquelles RET se produit.

RET est le récepteur des membres de la famille du facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF) des molécules ou ligands de signalisation extracellulaires (GFL). [20]

Afin d'activer RET, les premières GFL doivent former un complexe avec un co-récepteur ancré au glycosylphosphatidylinositol (GPI). Les co-récepteurs eux-mêmes sont classés comme membres de la famille des protéines du récepteur GDNF-α (GFRα). Différents membres de la famille GFRα (GFRα1-GFRα4) présentent une activité de liaison spécifique pour une GFL spécifique. [21] Lors de la formation du complexe GFL-GFRα, le complexe rassemble alors deux molécules de RET, déclenchant la trans-autophosphorylation de résidus de tyrosine spécifiques dans le domaine de tyrosine kinase de chaque molécule de RET. La phosphorylation de ces tyrosines initie alors des processus de transduction du signal intracellulaire. [22]

Famille de récepteurs Eph Modifier

Les récepteurs Ephrin et Eph sont la plus grande sous-famille de RTK.

Famille des récepteurs de domaine discoïdine (DDR) Modifier

Les DDR sont des RTK uniques en ce qu'ils se lient aux collagènes plutôt qu'aux facteurs de croissance solubles. [23]

La voie du récepteur tyrosine kinase (RTK) est soigneusement régulée par une variété de boucles de rétroaction positives et négatives. [24] Étant donné que les RTK coordonnent une grande variété de fonctions cellulaires telles que la prolifération et la différenciation cellulaires, elles doivent être régulées pour prévenir de graves anomalies du fonctionnement cellulaire telles que le cancer et la fibrose. [25]

Protéines tyrosine phosphatases Modifier

La protéine tyrosine phosphatase (PTP) est un groupe d'enzymes qui possèdent un domaine catalytique avec une activité phosphohydrolase spécifique de la phosphotyrosine. Les PTP sont capables de modifier l'activité des récepteurs tyrosine kinases de manière à la fois positive et négative. [26] Les PTP peuvent déphosphoryler les résidus de tyrosine phosphorylés activés sur les RTK [27], ce qui conduit pratiquement à la terminaison du signal. Des études impliquant PTP1B, une PTP largement connue impliquée dans la régulation du cycle cellulaire et la signalisation des récepteurs de cytokines, ont montré qu'elle déphosphorylait le récepteur du facteur de croissance épidermique [28] et le récepteur de l'insuline. [29] Certains PTP, en revanche, sont des récepteurs de surface cellulaire qui jouent un rôle positif dans la prolifération de la signalisation cellulaire. Cd45, une glycoprotéine de surface cellulaire, joue un rôle essentiel dans la déphosphorylation stimulée par l'antigène de phosphotyrosines spécifiques qui inhibent la voie Src. [30]

Herstatine Modifier

L'herstatine est un auto-inhibiteur de la famille ErbB, [31] qui se lie aux RTK et bloque la dimérisation des récepteurs et la phosphorylation de la tyrosine. [27] Les cellules CHO transfectées avec de l'herstatine ont entraîné une réduction de l'oligomérisation des récepteurs, de la croissance clonale et de la phosphorylation de la tyrosine des récepteurs en réponse à l'EGF. [32]

Endocytose des récepteurs Modifier

Les RTK activés peuvent subir une endocytose entraînant une régulation négative du récepteur et éventuellement de la cascade de signalisation. [3] Le mécanisme moléculaire implique l'engloutissement du RTK par une endocytose médiée par la clathrine, conduisant à une dégradation intracellulaire. [3]

Les RTK sont devenus une cible attrayante pour la thérapie médicamenteuse en raison de leur implication dans une variété d'anomalies cellulaires telles que le cancer, les maladies dégénératives et les maladies cardiovasculaires. La Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a approuvé plusieurs médicaments anticancéreux causés par les RTK activés. Des médicaments ont été développés pour cibler le domaine extracellulaire ou le domaine catalytique, inhibant ainsi la liaison du ligand, l'oligomérisation des récepteurs. [33] Herceptin, un anticorps monoclonal capable de se lier au domaine extracellulaire des RTK, a été utilisé pour traiter la surexpression de HER2 dans le cancer du sein. [34]

Inhibiteurs de petites molécules et anticorps monoclonaux (approuvés par la Food and Drug Administration des États-Unis) contre les RTK pour le traitement du cancer [3]
Petite Molécule Cible Maladie Année d'approbation
Imatinib (Gleevec) PDGFR, KIT, Abl, Arg LMC, GIST 2001
Géfitinib (Iressa) EGFR Cancer de l'œsophage, Gliome 2003
Erlotinib (Tarceva) EGFR Cancer de l'œsophage, Gliome 2004
Sorafénib (Nexavar) Raf, VEGFR, PDGFR, Flt3, KIT Carcinome à cellules rénales 2005
Sunitinib (Sutent) KIT, VEGFR, PDGFR, Flt3 Carcinome à cellules rénales, GIST, Cancer du pancréas endocrinien 2006
Dasatinib (Sprycel) Abl, Arg, KIT, PDGFR, Src LMC résistante à l'imatinib 2007
Nilotinib (Tasigna) Abl, Arg, KIT, PDGFR Imatinib-resistant CML 2007
Lapatinib (Tykerb) EGFR, ErbB2 Mammary carcinoma 2007
Trastuzumab (Herceptin) ErbB2 Mammary carcinoma 1998
Cetuximab (Erbitux) EGFR Colorectal cancer, Head and neck cancer 2004
Bevacizumab (Avastin) VEGF Lung cancer, Colorectal cancer 2004
Panitumumab (Vectibix) EGFR Cancer colorectal 2006

+ Table adapted from "Cell signalling by receptor-tyrosine kinases," by Lemmon and Schlessinger's, 2010. Cellule, 141, p. 1117–1134.


Nuclear localization of EGF receptor and its potential new role as a transcription factor

Epidermal growth factor receptor (EGFR) has been detected in the nucleus in many tissues and cell lines. However, the potential functions of nuclear EGFR have largely been overlooked. Here we demonstrate that nuclear EGFR is strongly correlated with highly proliferating activities of tissues. When EGFR was fused to the GAL4 DNA-binding domain, we found that the carboxy terminus of EGFR contained a strong transactivation domain. Moreover, the receptor complex bound and activated AT-rich consensus-sequence-dependent transcription, including the consensus site in cyclin D1 promoter. By using chromatin immunoprecipitation assays, we further demonstrated that nuclear EGFR associated with promoter region of cyclin D1 in vivo. EGFR might therefore function as a transcription factor to activate genes required for highly proliferating activities.


Résultats

ßTCP binding peptides identified by phage display

Three rounds of panning yielded plaques for three of the six conditions: ßTCP blocked with BSA ßTCP blocked with OBB buffer (non-mammalian blocking buffer) and ßTCP-PLGA composite blocked with OBB buffer. Mock conditions (tubes only) and ßTCP-PLGA blocked with albumin (BSA) did not yield plaques at the 2 nd and 3 rd round respectively. The sequence Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr was identified in a total of 28% (8/29) of the clones: 5 from ßTCP blocked with BSA 2 from ßTCP blocked with OBB protein buffer and 1 from composite ßTCP-PLGA blocked with OBB buffer, ( Fig 2A ). The remaining 21 clones showed only modest sequence similarity based on the BLOSUM62 scores ( Fig 2A ).

The 12-amino acid consensus sequence (Mw = 1448 Da) includes one negatively charged residue (Asp), one positively-charged residue (Arg), and has a predicted pI of 6.92. Interestingly, the sequence includes two histidines (nominal pK of 6.1), which may become protonated in the low-pH environment of post-surgical inflammation or abstract protons from the calcium phosphate surface. The peptide is predicted to be relatively soluble based on a grand average of hydropathicity (GRAVY) score in the moderately negative range (-0.800). The extinction coefficient (water) at 280 nm was determined to be 5500 M -1 cm -1 .

Binding affinities of EGF fusion proteins with single and concatameric ßTCP binding peptides

Based on the biophysics of interactions between the EGFR and tethered EGF, it is desirable to present the EGF moiety using a spacer to enhance accessibility of the ligand [31,50,51]. We therefore fused the binding peptide sequences to the N-terminus of human EGF (53 amino acids MW = 6.2KDa) with an intervening 106 amino acid sequence comprising a coiled-coil sequence (46 amino acids, MW = 5.4 KDa) flanked on both ends by a flexible, protease-resistant spacer (25 amino acids MW = 1.9KDa) along with several restriction enzyme sites for cloning (See S1 Table for protein sequence). In previous work, we used paired high-affinity heterospecific coiled-coil sequences with the same protease-resistant spacer in order to dimerize EGF and other EGFR family ligands, and had determined that the fusion proteins and their dimers were active when constructed as either N-terminal or C-terminal fusions [48].

Further, we reasoned that the binding affinity of the peptide to ßTCP might be further enhanced by concatamerization of the binding sequence. We used mutagenesis (see Methods) to concatamerize the 12-mer ßTCP binding peptide, yielding protein fusions with 3, 5, and 10 repeats of the 12 amino acid ßTCP binding unit (LLADTTHHRPWT) flanked by other relevant protein domains as depicted in Fig 1 (see Methods). We first examined the relative binding affinities of the fusion proteins as a function of the number of repeats of the binding domain in the fusion protein using a semi-quantitative approach based on eluting proteins followed by western blot analysis ( Fig 2B and 2C ). We titrated the adsorption concentrations across a range of 0� μM and found that binding exhibited a profound dependence on the number of 12-mer repeats (3, 5 or 10) in the binding domain ( Fig 2B and 2C ). Based on these results, we selected the fusion protein with the 10x linear concatamer, referred to as BP10-T-EGF (See Fig 1 ), to perform all subsequent cell interaction experiments.

PA10-T-EGF in solution exhibits wild-type soluble EGF activity

After selecting BP10-T-EGF as the best binder, we confirmed the purity and activity of each recombinantly-produced 10-mer protein batch prior to use in cell phenotypic assays. Western blots of samples subjected to SDS-PAGE showed that the EGF is co-localized with the 73 kDa band ( Fig 3A ), as expected for intact BP10-T-EGF. Biological activity of BP10-T-EGF compared to control wild type EGF was assessed by analyzing activation of Erk-1 and Erk-2 (Erk1/2), a signaling pathway that shows maximal phosphorylation 7� min after stimulation of EGFR in MSC [20,30,31,50�]. Compared to unstimulated controls, a 2.5 to 3-fold increase in ERK1/2 phosphorylation was observed 10 min after stimulation of MSC by either wild type EGF or BP10-T-EGF ( Fig 3B ). Results were normalized to the loading control GAPDH (N = 3 per condition one-way ANOVA pπ.0001 *pairwise comparisons with control were p𢙀.001 using Tukey’s multiple comparisons test all data was log-transformed before analysis). There was no statistical difference between the pairwise comparisons of wild type EGF and soluble BP10-T-EGF (pϠ.05 Tukey’s test). Thus, the EGF domain in BP10-T-EGF appears to be fully competent to activate the EGFR.

Binding and release of BP10-T-EGF tethered to ßTCP scaffolds

Comparable binding isotherms for BP10-T-EGF were observed for crosses of 3 mm and 5 mm using concentrations of 0.2𠄹 μM soluble protein ( Fig 4A ). The resulting range of tEGF surface densities was estimated as 4,000�,000 EGF/μm 2 (see Methods), well within and above the value of 500𠄵,000 EGF/μm 2 found to provide maximal stimulation to epithelial and mesenchymal cells in previous studies employing EGF tethered to polymer substrates [31,50,51]. However, because these previous studies employed tethering schemes that fostered local clustering of tethered EGF, and the binding peptide approach would not necessarily lead to such localized clustering, a tethering concentration of 2 μM (

10,000 EGF/μm 2 ) was chosen for further studies. After a 7-day long incubation of treated (2 μM) scaffolds in 1xPBS at 37C, a

25% release of tethered BP10-T-EGF protein was observed (N = 4 per condition, Fig 4B ). Another stability experiment performed at lower temperatures (4C) using the same buffer revealed there was no statistically significant release of BP10-T-EGF protein from 3mm ßTCP scaffolds (Normalized protein amounts were 1.02 +- 0.09 (day 0) and 1.02 +- 0.11 (day 5) both were normalized to t = 0 N = 3 per condition).

Tethered EGF stimulates an increase in hBMSC number on scaffolds following 7-day culture

After establishing that the EGF domain of the BP10-T-EGF fusion protein induced bioactivity when it was used in soluble form for MSC stimulation (activation of signaling pathways downstream of activated EGFR), we investigated phenotypic responses of low passage primary hBMSC cultured on ßTCP scaffolds modified with BP10-T-EGF fusion protein for three different densities of adsorbed BP10-T-EGF fusion protein. We have previously shown that EGF tethered to polymer substrates via polyethylene oxide (PEO) tethers can enhance proliferation of hBMSC maintained in both expansion and osteogenic media [34] We used day 7 as a metric for comparison in order to allow for several MSC population doublings [54].

Scaffolds (ßTCP crosses, see Methods) were pre-incubated with BP10-T-EGF solutions at concentrations of 0.4 μM, 2 μM, and 9 μM in order to achieve a range of surface densities (estimated as 4,000�,000 BP10-T-EGF per μm 2 ) and to determine dose response. Human BMSCs were seeded onto the treated and control scaffolds and cultured for 7 days in expansion medium. After 7 days, the relative cell numbers were quantified using the Alamar Blue reagent, using cells seeded on standard plates at different densities as a calibration to ensure the assay was in the linear range. All scaffolds treated with BP10-T-EGF had a 2𠄲.3 fold greater number of hBMSC number compared to surfaces without BP10-T-EGF ( Fig 5A N = 3 per condition one-way ANOVA p-valueπ.05 (p-value = 0.02) all pairwise p-values of BP10-T-EGF vs control were π.05 using Tukey’s multiple comparison test). No statistical differences were observed between the different BP10-T-EGF surface densities (All pairwise p-valuesϠ.05 using Tukey’s test). These results indicate that EGF-tethered onto ßTCP scaffolds does not impair expansion of hBMSCs, as the final cell number was greater than the initial number (data not shown), but these data are not sufficient to conclude that tethered EGF enhances proliferation, as differences in initial plating efficiencies together with comparable expansion rates may account for the observed differences at day 7. To parse these mechanisms, we next examined plating efficiencies.

Tethered EGF does not alter plating efficiency of hBMSCs seeded on ßTCP scaffolds

The Alamar Blue assay and other similar kinds of proliferation assays do not have sufficient sensitivity to detect the relatively small number of cells present on scaffolds immediately after seeding. Hence, we developed an approach to directly count cells seeded on scaffolds by embedding scaffolds in agarose, demineralizing to reveal an optically-clear mold, then staining cells and observing them with confocal microscopy. Using this method, we found no statistical differences between the direct count of P3 hBMSCs in the control or BP10-T-EGF conditions for both the 12hr and 24hr time point ( Fig 5B ). This suggests that the increase in hBMSC number observed after a 7-day culture under BP10-T-EGF conditions was most likely due to induction of proliferation and not due to differential plating efficiency.


Where do the phosphate units come from when EGF units dimerize? - La biologie

C2006/F2402 '10 Outline for Lecture 24 -- (c) 2010 D. Mowshowitz -- Lecture updated 04/26/10

Handouts From last time: 23C -- Stress Response & TK receptors

New this time: 24A -- Basic Processes in Kidney Tubule
24B -- Kidney Structure

Recent NPR story on oxytocin: When the 'Trust Hormone' is out of balance. http://www.npr.org/templates/story/story.php?storyId=126141922

A. Lactation -- done last time see handout 23A.

B. Stress response (Handout 23C.)

1. Phase one -- Nerve (Sympathetic) activity stimulates target organs (that are not glands) → Direct response of heart, liver, lungs, etc.

2. Phase two -- Nerve (Sympathetic activity) → activation of glands

une. Stimulate pancreas → glucagon release stimulated insulin release inhibited → secretion of glucagon → additional stimulation of some of same target organs

b. Stimulate adrenal medulla → release of epinephrine → stimulation of same targets as sympathetic nerve activity & some additional targets -- hormones can reach where nerves can't go.

3. Phase three -- stimulate HT/AP axis to produce cortisol

HT in brain → releases CRH → AP → releases ACTH → adrenal cortex → produces cortisol → target organs → stimulation of breakdown of fats & protein for energy (sparing glucose for brain) inhibition of immune system.

Note that each additional phase is slower but involves additional degrees of amplification due to second messengers, transcription, etc.

II. Signaling with RTK's. How do RTK's Work?

A. Importance of Catalytic Receptors

  • Many growth factors (such as EGF) and other paracrines, autocrines and juxtacrines act through TK receptors.
  • Insulin, PL, and GH, but not most other endocrines, act through TK receptors. (See Sadava 15.6)

B. Important Properties of Receptor TKs -- See handout 23C & chart below.

1. Receptor is usually a single pass protein

2. Ligand binding usually leads to dimerization of receptors (Sadava fig. 15.6 or Becker 14-17). Why does it matter that TK receptor monomers (or any protein) must dimerize in order to act?

une. Function: If 1/2 the receptors (1/2 the monomers) are abnormal, most of the dimers that form are abnormal.

b. Inheritance: "lack of function" mutations in TK receptors are often dominant. (For an example see Becker figs. 14-20 & 14-21 (14-19 & 14-20). Dimers form, but they are inactive. See below for more details.

  • Example? PLC. Ligand binding to TK-linked receptor can activate a type of PLC → IP3 & DAG → etc.
  • This means that the IP3 pathway can be activated by both types of receptors -- GPCRs and TKs.
  • The cAMP pathway (as far as we know) can only be activated by GPCRs.

c. SH2 domains. Proteins that bind directly to TK have certain types of domains -- usually called SH2 binding domains.

ré. Recruitment. Note that the initial target protein(s) to be activated come to or are "recruited by" the TK this is the opposite of the situation with most 2nd messengers where the messenger diffuses throughout the cytoplasm and "seeks out" the target protein to be activated. The recruitment method may be important in localizing the response to a particular part of the cell.

C. A human example of TK receptor signaling: FGF (Fibroblast growth factor) and FGF Receptor. Significance of dimerization. See Becker figs.14-20 & 14-21 (14-19 & 14-20).

1. FGFR is a TK receptor

2. FGF & FGFR needed for proper development as described in Becker chap.14. Failure of signal transmission (or premature transmission) causes developmental abnormalities. Voir Becker fig. 14-20 (10-20).

3. Achondroplasia (a type of dwarfism), is due to a defective FGF receptor.

4. Achondroplasia is dominant. In a heterozygote for achondroplasia, 1/2 the FGF receptor (monomers) are defective, therefore dimers that form are defective.

une. Example #1: In the example shown in Becker & on handout, the cytoplasmic domain of the defective receptors is missing. Dimers form, but most dimers are never activated -- the two monomers can not phosphorylate each other. (Fig. 14-19) Therefore the signaling is badly disrupted. (In the example shown in Fig. 14-20, the FGF is needed to allumerformation of certain embryonic tissues, so the mutant fails to form these tissues. This type of mutation is called a 'dominant negative' as explained below.)

b. (FYI) Example #2: In most cases of human achondroplasia, the molecular explanation is different. In these cases, the mutation is in the transmembrane domain of FGF3 Receptor and dimers form, but act abnormally. (In these cases, the FGF signal is needed to turn on bone differentiation and éteindre cell growth. Mutant dimers signal prematurely, so differentiation starts -- and cell growth stops -- before bones are long enough. This type of mutation is called a 'gain of function' mutation, because it works when it shouldn't.)

5 . Significance of a 'Dominant Negative'

une. Recessive (ordinary) negative mutations. 'Negative' mutations (those that produce inactive protein) are usually NOT dominant. Most negative or "lack of function" alleles (or mutations) are recessive. If there is a mixture of normal and abnormal protein in the heterozygote, the normal, active, protein usually works (in spite of the presence of abnormal, inactive, protein). So usually, overall, there is NO lack of function in the heterozygote.

b. 'Dominant negative' mutations. Sometimes negative mutations are dominant. How does this occur? There is a mixture of normal and abnormal protein present, as usual. What's unusual is that the abnormal, inactive, protein 'gets in the way' and interferes with the working of the normal, active, protein. So overall, there is a lack of function in the heterozygote.

c. Definition: An abnormal allele like the one that produces the FGF receptor without a cytoplasmic domain is called a "dominant negative mutation." A dominant negative allele (or mutation) makes an inactive protein that disrupts function even in the presence of a normal allele (and normal protein). 'Dominant negative' means that the heterozygote is negative for function, not that it doesn't produce any protein.

ré. Implications: What does the existence of a dominant negative mutation imply? It indicates that the gene involved probably codes for a protein that must polymerize in order to act.

RÉ. How do GPLR's and RTK's Compare? -- See table below for reference for comparison of basic features of TK or TK linked receptors and G protein linked receptors. For TK's, see Sadava figs. 15.6 & 15. 10 (15.9) or Becker fig. 14-17 for structure and Becker 14-18 for signaling pathway.

# See Becker Fig. 14-4.
## See Becker fig. 14-17 or Sadava 15.6 & 15.3.
*Either part, alpha or beta + gamma may be activator/inhibitor G proteins can also be inhibitory
**SH2 = sarc homology 2 domain

Review problems 6-1 & 6-3

E. Signaling Pathways all interrelate

1. Different 2nd messengers can influence the same enzyme/pathway. See problem 6-20.

2. Each signaling system can affect the others -- For example, Ca ++ levels can affect kinases/phosphatases and phosphorylations can affect Ca ++ transport proteins (& therefore Ca ++ levels). See an advanced text if you are interested in the details.

3. The same signal (same activated TK receptor) may trigger more than one signaling pathway . For example, EGF can trigger both the IP3 pathway and the ras pathway. (Becker fig. 14-18).


IV. Intro to Kidney Function (Handout 24A). See also Sadava Sect. 51.4. & 51.5.

Here's an article from the LA Times on a recent artificial kidney.

A. Overall Function -- what does the kidney do?

  • Filtration

  • tubular secretion (addition of substances to the filtrate) = secretion dans the tubule

  • tubular reabsorption (removal of substances from filtrate) = reabsorption de the tubule

  • control of volume of urine

B. Details of Basic Processes

1 . Basic set up

une. Capillaries: Artery (from heart) → afferent arteriole → glomerular capillaries → efferent arteriole → peritubular capillaries → venule → vein (back to heart)

b. Filtration: Material moves from glomerular capillaries into tubule.

c. Secretion & Reabsorption: Materials moves between inside of tubule and inside of peritubular capillaries (surrounding kidney tubule).

2. The 4 Basic Processes

une. Filtration:

(1). Occurs in glomerulus

(2). About 20% of blood liquid (plasma) enters Bowman's capsule = filtrate

(3). Filtrate contains no large proteins or cells

b. Tubular (selective) secretion: Material is ajouté à the filtrate.

  • Secretion = extruded by the cells into extracellular space (into filtrate, lumen, etc.).

  • Excretion = carried out of body in urine or feces.

c. Tubular (selective) reabsorption: Material is removed fromthe filtrate.

(1). Result of reabsorption: Filtrate does NOT carry certain materials (which are selectively reabsorbed) -- conserves valuable materials returns them to circulation.

(2). Aldosterone affects Na + reabsorption (& K + secretion). Details below.

(1). Water loss is adjusted at the end of the tubule using ADH. (See below.)

(2). Urine can be more -- or less -- concentrated than the plasma. Concentration and/or volume can be varied to suit need.

(3). Water loss or conservation in tubule controls volume of body fluids (not just urine volume). Controls volume of plasma, extra cellular fluid, etc. (& blood pressure).

3. How does tubular secretion/reabsorption occur? Structure of cells lining tubules -- see handout 24A bottom or Sadava fig. 51.12 (for a different example).

une. Tubules are lined by layer of polarized epithelial cells (similar to those lining intestine)

b. Materials must cross epithelial cells to enter or exit lumen of tubules.

c. Interstitial fluid separates epithelial cells and peritubular capillaries.

ré. Epithelial cells have different proteins/channels/transporters on their two surfaces -- the apical or luminal surface (facing lumen) and basolateral surface (facing interstitial fluid and capillaries).

e. Cells in different parts of the tubule have different transporters/channels on their luminal surface.

F. All cells in tubule that absorb Na + have the Na + /K + pump on their basolateral surface. Other transporters may vary.

g. What cells transport (& in which direction) depends primarily on which transport proteins are on the luminal surface. Depending on transporters, cells can secrete materials dans lumen or reabsorb material de lumen.

h. Cells lining tubule do actual secretion/reabsorption but peritubular capillaries remove reabsorbed material or provide material to be secreted. Therefore (as shown on handout 24A, top left):

(1). Result of tubular reabsorption = net transfer from filtrate to capillary.

(2). Result of tubular secretion = net transfer from capillary to filtrate.

Try problem 12-3.

3. Example of reabsorption -- see 24A upper right. (Fig. 14-18). How Na + is reabsorbed.

Q: How could K + be secreted? What would you have to add/remove from the diagram?

  • aldosterone affects Na + reabsorption (& K + secretion)

  • ADH affects water reabsorption

b. Role of aldosterone in Na + reabsorption

(1). Promotes reabsorption of Na +

(2). Stimulates virtually all steps of reabsorption -- all steps shown in 24A, upper right.

c. Role/Mech. of action of ADH

  • Are they in the luminal membrane, BL membrane, or both?

  • Are they inserted or removed in response to hormone?

  • Why are cells in only some areas of tubule responsive to ADH (or aldosterone)?

ré. Questions to think about: Where are the receptors for ADH? Aldosterone? Which hormone elicits a faster response?

See problems 12-8 to 12-10.(See below for location of cells affected by each hormone.)

A. Overall structure -- see handout 24B or Sadava fig. 51.9. Alternatively, see Kimball's biology pages.

1. Kidney has medulla (inner part) and cortex (outer)

2. Functional unit = nephron (Sadava 51.7 )

3. Visible unit (in medulla) = Renal Pyramid = bottoms of many nephrons

4. Tops of nephrons in cortex

B. Structure of Nephron -- see handout 24B or Sadava fig. 51.7 & 51.9 . For EM pictures see Sadava 51.8. (We may do the parts as we need them, but all are summarized here.)

1. Nephron itself -- parts in cortex

une. Bowman's capsule
b. proximal (convoluted) tubule
c. distal (convoluted) tubule

une. Loop of Henle
b. Collecting duct (shared by many nephrons)

3. Capillaries (discussed last time)

une. 2 sets in series

(1). Glomérulaire
(une). form glomerulus inside Bowman's capsule
(b). function in filtration

(2). Peritubular
(une). surround tubules
(b). fyi: part in medulla (surrounding loop of Henle) is called the vasa recta
(c). function in sécrétion & réabsorption

b. How capillaries connected. Circulation goes as follows:

Artery (from heart) → afferent arteriole → glomerular capillaries → efferent arteriole → peritubular capillaries → venule → vein (back to heart)


V I. Kidney Function, revisited.

A. Function of Nephron -- Let's follow some liquid through.

2. Reabsorption & secretion (of most substances) occurs in proximal tubule

3. Loop of Henley -- overall picture of state of filtrate

une. Definition: Osmolarity (Osm) = total solute concentration = concentration of dissolved particles = osmol/liter. (One osmol = 1 mole of solute particles.)

Examples: 1M solution of glucose = 1 Osm 1M solution of NaCl = 2 Osm.

(1). Descending: Osmolarity increases as filtrate descends due to loss of water

(2). Ascending: Osmolarity decreases as filtrate ascends due to loss of salt reaches min. value less than that of blood. Therefore can excrete urine that is hypo-osmotic (less concentrated) than blood.

(3). Overall: Net effect of going through countercurrent loop -- less volume, less total salt to excrete (even if filtrate and blood are iso-osmotic when done).

4. Distal Tubule & Collecting Ducts

une. Control of removal from filtrate (reabsorption) of remaining Na + (Role of aldosterone.)

b. Volume Control -- occurs in collecting ducts. (Role of ADH.)

B. Details for Proximal Tubule

1. Many substances removed from lumen by secondary act. transport

une. examples: glucose and amino acids

b. AA etc. cross apical/luminal surface of epithelial cell by Na + co-transport -- therefore a lot of Na + removed from filtrate (along with glucose, AA, etc.)

c. Exit basolateral side of cells into intersit. fluid by facilitated diffusion

c. Process is similar to absorption in cells lining intestine

2. Na+/K+ pump on basolateral side keeps internal Na+ low.

4. Secretion of most materials (except K + ) occurs here -- toxins etc. transported to filtrate

C. Details of Transport Events in Loop of Henley (See Sadava 51.10)

1. Water permeability. Luminal cell membranes in descending loop and lower part of ascending loop are permeable to water.

2. Generating the Na + gradient in the medulla.

une. Luminal cell membranes in rest of ascending are impermeable to water and pump NaCl from lumen to interstitial fluid.

b. NaCl pumped out from Ascendant loop accumulates in medulla, forming a gradient of increasing osmolarity (outside the tubule) as reach bottom of loop = core of medulla.

3. Water loss: Filtrate from proximal tubule loses water as it descends into medulla → NaCl stays in tubule → high concentration NaCl in tubule → to be removed in ascending. (Na + not pumped out of these cells on BL side.)

4. Escalator Effect: If NaCl diffuses into descending loop, it is carried around and pumped out in ascending = escalator effect.

5. Why called countercurrent? Because flow in two sides of loop is in opposite directions -- physically and with respect to osmolarity.

une. First leg (descending) of loop removes water → higher osmolarity in filtrate as it proceeds (on the way down).

b. Second leg (ascending) removes salt → lower osmolarity in filtrate as it proceeds (on the way up).

c. Net effect is higher osmolarity toward the bottom on both legs.

ré. Why doesn't flow in peritubular capillaries (vasa recta) wash out the salt gradient in the medulla? Because capillaries exit out the top of the nephron, carrying a low amount of salt.

See problems 12-1 to 12-3.

. Distal Tubule and Collecting Ducts -- A few more Details

1. Overall

une. Reminder: Filtrate entering distal tubule is at minimum osmolarity

b. This is the only part of the tubule affected by ADH and aldosterone

(1). Events in distal convoluted tubule (& first part of coll. ducts) depend on aldosterone

(2). Events in collecting duct (volume control) depend on ADH

c. Hormones cause water and/or remaining Na + to be removed (reabsorbed from filtrate)

(1). aldosterone affects Na + reabsorption (& K + secretion) -- See handout 24B, top right.

(2). ADH affects water reabsorption

2. Importance of aldosterone (in water/Na+ balance)

une. Promotes reabsorption of Na + water follows (not necessarily in same part of tubule).

b. Amount of Na + reabsorbed due to aldosterone is small % of total, but adds up affects blood pressure.

c. Aldosterone promotes K + secretion -- this may be of major importance, but we are focusing on role of hormone in Na + balance.

3. Importance of ADH. Controls water retention in body. Osmolarity of filtrate will increase (and volume decrease) in collecting duct if ADH (vasopressin) present and water removed. (See above for mechanism.)

4. Where do the hormones come from? What triggers their production/release?

une. ADH produced by HT (& released in PP) primarily in response to high osmolarity of blood.

b. Aldosterone produced by adrenal cortex in response to inadequate blood flow through kidney, not primarily in response to ACTH.

See problems 12-8 to 12-13 & 12-15.

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Regulation of Cell Proliferation by Receptor Tyrosine Protein Kinases

Cross-linking of receptors causes activation

Tyrosine kinase -containing receptors come in several different forms but they are unified by the presence of a single membrane-spanning domain and an intracellular kinase catalytic domain. The extracellular chains vary considerably as indicated in Figure 10-3 . A general feature of these receptors is that ligand binding causes dimerization, first discovered for the EGF receptor ( Yarden and Schlessinger, 1987 Sternberg and Gullick, 1990 ). In addition to activation by the natural peptide ligands, some (but not all) of the functions of the EGF receptor can be elicited by crosslinking with antibodies ( Defize et al., 1986 Spaargaren et al., 1991 ). Within the family of the receptor tyrosine kinases, ligand-mediated crosslinking is achieved in a number of ways. Platelet-derived growth factor (PDGF) is itself a disulfide-linked dimeric ligand which cross-links two receptors upon binding. FGF uses a heparin oligosaccharide to bring two receptors together. In the case of the insulin receptors, they are already dimerized through a disulfide bridge but nevertheless require insulin in order to signal into the cell ( Ottensmeyer et al., 2000 Yip and Ottensmeyer, 2003 ). EGF is different, its binding causes the receptor to unfold, exposing a dimerization motif that allows the occupied monomers to recognize each other (or to recognize unliganded unfolded ERBB2) ( Yamanaka et al., 2002 Gerrett et al., 2002 ) ( Figure 10-5 ). Since truncated EGF receptors that lack the extracellular ligand-binding domain are constitutively active ( Thiel and Carpenter, 2007 ), it follows that the unoccupied extracellular domain acts to prevent kinase activation. Indeed, dimerization of the receptor brings about a change in the relative position of the transmembrane domains that, in turn, promotes dimerization and activation of the intracellular protein kinase segment ( Endres et al., 2013 ).

Figure 10-5 . Dimerization of the EGF-receptor extracellular segment. (a) The EGF receptor is composed of four extracellular domains, L1, CR, L2, and GH. L1 and L2 carry leucine-rich repeats that function in ligand binding, CR1 is a furin-like cysteine-rich domain and GH is a growth factor receptor domain IV. The intracellular segment contains a tyrosine kinase domain and a long unstructured C-terminal sequence that harbors numerous phosphorylation sites. The C-terminal tail is the substrate of a neighboring receptor (phosphorylation in trans). Note that in the receptor structure on the left, the extracellular segment folds onto itself the dimerization arm of the CR domain (indicated by a green surface) docks onto the GF domain. The receptor shown is bound to EGF but only to the L1 domain. (b) Binding of EGF to both L1 and L2 causes unfolding and dimerization of the extracellular segment. The dimerization arm of CR now binds to a docking site in the CR domain of the partner (and vice versa). As a consequence, the two transmembrane domains associate with their N-terminal sequences and this, in turn, brings about a change in the position of the kinase domains leading to their activation (not shown, see Figure 10-6 ).

Normally, the kinase domain of the EGFR is inactive because both the activation segment and the αC- helix are wrongly positioned. Moreover, the kinase is tethered to the plasma membrane through both its N-terminal juxtamembrane sequence, which three leucines (motif LLRRL), and through interactions of surface lysines and arginines (positively charged) with negatively charged phospholipids ( Figure 10-6 ) ( Arkhipov et al., 2013 ). Membrane-tethered kinases cannot form dimers. Receptor crosslinking disrupts the membrane binding and allows the two kinases to align asymmetrically, with the C-lobe (activator kinase) binding to the N-lobe (receiver). This causes an outward movement of the activation segment and inward movement of the αC-helix of the receiver kinase ( Figure 10-6 ). The other, activator kinase, remains catalytically incompetent. The EGFR is rendered competent through an allosteric interaction between kinase domains (in other words, an activating “shape change” is caused by protein–protein interaction) ( Jura et al., 2009 Brewer et al., 2009 ). The interaction between the two EGFR-kinase domains is reinforced by the antiparallel association of the helices carrying the –LRRLL motif and by the juxtamembrane region of the receiver kinase which latches onto the activator (juxtamembrane latch). The mode of activation is unique among the tyrosine protein kinases, which otherwise often involves phosphorylation of the activation segment (further discussed in Chapter 15, “Activating the Adaptive Immune System: Role off Non-receptor Tyrosine Kinases” and Chapter 16, “Signaling through the Insulin Receptor” ). However, the mechanism is similar to the one observed with cyclin-dependent protein kinases (CDKs), which are serine/threonine protein kinases. Here allosteric regulation is brought about by a regulatory subunit, named cyclin, that binds the kinase domain.

Figure 10-6 . Allosteric regulation of the EGFR kinase domains through the formation of an asymmetric kinase dimer. In the inactive state (monomer) the kinase domain is tethered to the membrane through an interaction of the LRRLL motif in the juxtamembrane sequence and through binding of lysine residues of the kinase domain to negatively charged lipids. Ligand-mediated dimerization of the extracellular segment leads to dimerization of the transmembrane helix and this disrupts membrane attachment of the kinase domain. Two protein kinase domains now associate head-to-tail (asymmetric dimer) bringing about a conformational change of one kinase only, named the “receiver kinase.” As a consequence, the multiple residues on the adjacent C-terminal tail are phosphorylated. As the kinase domain may change roles, where the activator becomes the receiver kinase, with time both tails will be fully phosphorylated. The phosphate symbol indicates a phosphorylation site (threonine-678) in the juxtamembrane region which inactivates the receptor (part of a negative feedback mechanism).The residues of the human EGFR are numbered according to the sequence information in UniProtKB (with inclusion of the signal peptides, 1–24).

It is likely that the receiver and activator positions can be interchanged, so that the kinases alternate their activity. Indeed EM studies of EGF-treated receptors have revealed that the dimeric extracellular segment is associated with intracellular segments of different conformations, ranging from asymmetric dimers (active), symmetric dimers (inactive) to nonassociated kinase domains ( Mi et al., 2011 ). Importantly, as a consequence of asymmetric dimerization, the C-terminal tails of the two kinases are trans-phosphorylated (one kinase phosphorylates the tail of the other) on multiple tyrosine residues. The phosphorylated dimer then constitutes the active receptor. For more information about protein kinase activation, return to Chapter 2, “An Introduction to Signal Transduction,” Section “Protein kinase activation mechanisms” ( Figures 2-43 and 2-44 Figure 2-43 Figure 2-44 ).

While certain proteins serve as substrates of the activated EGF receptors, what really matters is the recruitment of signaling partners through the phosphotyrosine residues in the C terminal tail. These phosphotyrosines, within a specific context of five amino acids, bind proteins bearing SH2 or PTB domains ( Liu et al., 2010 ). The recruited proteins can be effectors or adaptors, which serve to bind effectors indirectly ( Anderson et al., 1990 Jones et al., 2006 ) (see Figure 10-4 for a list of such effectors and adaptors, and see Figure 10-8 for more detail about the interaction).

Growth factor receptor dimers can further aggregate into oligomers of several hundreds or even thousands of units. This phenomenon, already recorded at the time when receptor dimerization first came to light ( Yarden and Schlessinger, 1987 ), has now been visualized by the use of fluorescent protein tagging ( Carter and Sorkin, 2006 ). Different types of receptors can be recruited, so that PDGF receptors have been found associated with EGF receptors ( Saito et al., 2001 ) and these aggregates give rise to multiprotein signaling platforms that may contain numerous effectors.


Lectins are carbohydrate-binding proteins. Individual lectins show specificity for particular sugar structures.

This is a homology unit of ∼ 110 amino acids. Although there is variation in primary sequence, the structure of this domain is conserved and organized into two β-sheets, one of three and the other of four strands, which are stabilized by disulphide bonds in most of the cases. Ig domains are found in several proteins, including cell-adhesion molecules and signalling receptors, and have been implicated in protein–protein interactions.

Fibronectin type III (FNIII) domain

FNIII motifs, originally described in the extracellular matrix protein fibronectin, comprise ∼ 90 amino acids. Their three-dimensional structure is similar to that of the immunoglobulin domain. In fibronectin itself, a RGD sequence in the loop that connects the β-sheets in FNIII motif 10 has been implicated in promoting adhesion by binding to integrins. This motif is also found in a wide variety of signalling proteins.

The pKα (also known as pKa) is a measure of the uptake/release of protons by amino acids. It is the negative log to the base 10 of the acid-dissociation constant, which reflects the equilibrium between protonation and deprotonation and indicates the extent of proton dissociation. The log scale is used because this constant differs over orders of magnitude between individual acids the smaller the pKα value, the stronger the acid.


Voir la vidéo: LHistoire du système métrique (Janvier 2023).