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1.5 : Microscopie - Biologie

1.5 : Microscopie - Biologie


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Objectifs d'apprentissage

Buts:

  • Utiliser et entretenir correctement un instrument scientifique sensible.
  • Apprenez les techniques nécessaires pour préparer les cellules à l'observation au microscope.
  • Avoir une idée de la taille des cellules.

Résultats d'apprentissage des élèves :

À la fin de ce laboratoire, les étudiants seront capables de :

  • Identifier les parties d'un microscope et leurs fonctions.
  • Transportez, utilisez et rangez correctement un microscope.
  • Préparez une diapositive à montage humide.
  • Visualiser et mettre au point des spécimens au microscope.
  • Déterminer le grossissement total d'un échantillon.
  • Localisez un spécimen si on lui donne une lame.

Introduction

En biologie, le microscope optique composé est un outil utile pour étudier de petits spécimens qui ne sont pas visibles à l'œil nu. Le microscope utilise une lumière vive pour éclairer l'échantillon et fournit une image inversée à un grossissement et une résolution élevés. Il y a deux lentilles qui agrandissent l'image de l'échantillon - la lentille de l'objectif sur le nez et le Lentille oculaire (ou oculaire). Pour déterminer le grossissement total de l'échantillon, vous devez multiplier le grossissement de la lentille de l'objectif par le grossissement de la lentille oculaire.

Les scientifiques et les techniciens utilisent souvent des microscopes optiques pour étudier les cellules. Des cellules procaryotes sont très simples et manquent noyau ou lié à la membrane organites et sont de petite taille. D'autre part, des cellules eucaryotes sont plus compliquées en ce qu'elles contiennent un noyau et de nombreux organites spécialisés. La structure d'une cellule dicte sa fonction ; ainsi, chaque cellule eucaryote est très différente de la suivante. C'est pourquoi une cellule cardiaque est complètement différente d'une neurone (neurone).

Il est très important d'apprendre à manipuler et à utiliser correctement un microscope. Passez en revue les règles et conseils suivants pour l'utilisation et la manipulation de votre microscope.

Règles générales

  • COMMENCEZ et FINISSEZ toujours avec l'objectif à faible puissance lorsque vous mettez ou retirez une lame.
  • Ne tournez jamais le nez par la lentille de l'objectif.
  • Ne mouillez aucune partie du microscope - en particulier la platine et les lentilles de l'objectif.
  • Utiliser seulement papier pour lentilles pour nettoyer les lentilles de microscope.

Nettoyage du microscope

Si nécessaire, procurez-vous un petit carré de papier pour lentilles (et UNIQUEMENT du papier pour lentilles) et essuyez délicatement les lentilles du microscope directement en travers, dans cet ordre :

  1. la surface inférieure de tous les objectifs
  2. la lentille oculaire
  3. la lentille du condenseur et le boîtier de la lumière

Partie I : Trouver la lettre

Matériaux

  • Microscope
  • Papier pour lentilles
  • Diapositive de la lettre « E »
  • Glissière de micromètre d'étape

Procédure

  1. Utilisez toujours une main autour du bras du microscope et une main sous la base du microscope.
  2. Transportez-le en position verticale sans balancer, basculer, faire tomber ou heurter le microscope.
  3. Placez le microscope doucement sur la paillasse du laboratoire avec le bras vers vous. Ne placez jamais le microscope près du bord et ne le faites jamais glisser sur la table.

Identifiez les pièces de microscope suivantes avec un partenaire. Cochez chaque partie au fur et à mesure. Si vous n'êtes pas sûr d'un composant, consultez votre instructeur.

  • Oculaire (lentille oculaire)
  • Anneau de nez (tourelle)
  • Objectifs (faible, moyenne, haute puissance)
  • Organiser
  • Commandes de scène
  • Lentille de condenseur à diaphragme à iris
  • Source de lumière
  • Bouton d'intensité lumineuse (rhéostat)
  • Bouton de réglage de la mise au point grossière
  • Bouton de réglage de la mise au point fine
  1. Branchez et positionnez soigneusement le cordon électrique pour éviter de trébucher ou de faire retirer le microscope de la table.
  2. Allumez le microscope et tournez le anneau de tourelle (tourelle) pour casser le objectif 10x lentille en place. N'utilisez pas l'objectif pour faire pivoter !
  3. Tourne le contrôle de la lumière (rhéostat) à mi-chemin pour régler la quantité de lumière.
  4. Le grossissement total que vous observez en regardant à travers un microscope est le grossissement de la lentille oculaire multiplié par le grossissement de la lentille de l'objectif. Remplissez le tableau 5.1 pour indiquer le grossissement total obtenu par chaque lentille.
Tableau 1. Grossissement total obtenu à l'aide de diverses lentilles d'objectif d'un microscope optique composé

Nom de l'objectif

Objectif

Lentille oculaire

Grossissement total

  1. Sur le côté du microscope se trouvent deux boutons, l'un au-dessus de l'autre. Le plus gros des deux boutons est le bouton de réglage de la mise au point grossière. Tournez le bouton pour que la scène descende le plus loin possible.
  2. Nettoyez toutes les lentilles avec du papier pour lentilles. N'utilisez jamais d'essuie-tout, de lingettes ou de chemise !
  3. Obtenez une diapositive de lettre « e » de votre instructeur. Dessinez le « e » dans le tableau 5.2 comme vous le voyez avec vos yeux (pas à travers le microscope).
Tableau 2. La lettre « e » vue à différents grossissements à l'aide d'un microscope optique

Lettre « e » vue…

Dessin

à l'oeil nu

Grossissement total 100X

Grossissement total 400X

Grossissement total de 1000X
Grossissement total de 1000X
Dans quelle direction se déplace le « e » (lorsque vous regardez dans le microscope), lorsque vous déplacez la platine vers la droite ?
  1. Placez la glissière sur la scène et fixez-la avec le extrait de scène.
  2. Utilisez le bouton de mise au point grossière pour déplacer la scène aussi haut que possible.
  3. Utilisation boutons de réglage de la scène centrer le « e » pour que la lumière du Source de lumière peut le traverser.
  4. En regardant à travers les lentilles oculaires, abaissez la platine avec le bouton de réglage grossier de la mise au point jusqu'à ce que le « e » apparaisse.
  5. Utilisez le bouton de réglage de la mise au point fine pour rendre l'image aussi claire que possible.
  6. À ce stade, vous pouvez effectuer différents réglages pour améliorer la qualité de l'image :
  7. Les rhéostat sur le côté du microscope contrôle l'intensité de la lumière. S'il est trop lumineux ou faible à tout moment, utilisez ce bouton pour régler la lumière.
  8. Les condenseur réglera également l'intensité lumineuse. Le condenseur rassemble et focalise la lumière pour éclairer l'échantillon. N'utilisez ceci que si le rhéostat n'a pas réussi à améliorer votre image. Déplacez le condenseur avec le bouton de réglage du condenseur de manière à ce qu'il touche la scène. Abaissez-le lentement pour améliorer l'éclairage de votre échantillon. Habituellement, il devrait être à environ ½ pouce en dessous de la scène.
  9. Les diaphragme à iris ajuste l'ouverture de l'ouverture et contrôle la quantité de lumière qui sort du condenseur (ou illumine l'échantillon). Vous pouvez ouvrir et fermer cette ouverture, dans la plupart des cas, elle doit être complètement ouverte, mais parfois la fermer partiellement augmentera le contraste de l'image.
  10. Dessinez la lettre « e » telle qu'elle apparaît au microscope dans le tableau 4-2. Notez le changement d'orientation. Notez que l'oculaire GAUCHE peut être tourné, mais l'échelle oculaire (appelée réticule) reste au milieu de la lentille oculaire. Notez que l'oculaire DROIT peut être tourné pour déplacer la position du pointeur.
  11. Déplacez la scène lentement vers la droite. Notez dans quelle direction le « e » se déplace lorsque vous regardez à travers le microscope et notez dans le tableau 4-2.
  12. Déplacez le curseur vers la gauche pour recentrer le « e ».
  13. Une fois que le « e » est recentré et mis au point, tournez la tourelle vers l'objectif 40x et enclenchez-la en place. Utilisez la mise au point fine pour rendre l'image claire. Seulement si nécessaire, effectuez de légers ajustements avec le rhéostat, le condenseur ou le diaphragme. Dessinez tout ce que vous voyez au microscope dans le tableau 4-2.
  14. Une fois que le « e » est recentré et mis au point, tournez la tourelle vers l'objectif 40x et enclenchez-la en place. Utilisez la mise au point fine pour rendre l'image claire (JAMAIS utilisez la mise au point grossière à ce grossissement ou à tout grossissement supérieur ou vous risquez de casser la diapositive ou pire, de casser l'objectif !!!) Seulement si nécessaire, effectuez des ajustements légers avec le rhéostat, le condenseur ou le diaphragme. Dessinez tout ce que vous voyez au microscope dans le tableau 4-2. Répondre aux questions ci-dessous.
  15. Pour utiliser la lentille à immersion d'huile, faites pivoter l'embout nasal ENTRE les lentilles 40x et 100x afin que la baguette contenant l'huile puisse atteindre la glissière. Placez une généreuse goutte d'huile sur la lame et enclenchez l'objectif 100x en place. La lentille glissera dans la goutte d'huile.
  16. Utilisez la mise au point fine pour rendre l'image claire. Dessinez ce que vous voyez dans le tableau 4-2.
  17. Ne revenez JAMAIS à l'objectif 40X après qu'il y ait de l'huile sur la lame. Si vous rencontrez des problèmes de mise au point à l'aide de l'objectif à immersion dans l'huile, vous devez revenir en arrière et utiliser l'objectif 10x pour recentrer (tournez le nez de sorte que l'objectif 40x ne soit PAS traîné à travers l'huile sur la lame). Revenez ensuite directement à l'objectif 100x. Si cela ne fonctionne pas, la diapositive doit être nettoyée et vous devez recommencer.

Lorsque vous avez terminé avec la diapositive, abaissez la scène et retirez la diapositive. (N'abaissez pas la scène si vous allez voir une autre diapositive). Nettoyez l'huile de la glissière et rapportez-la à votre instructeur.

Partie II : Diamètre du champ

Les microscopes sont destinés à un grossissement d'images trop petites pour être vues à l'œil nu. Cependant, ils peuvent être utilisés comme un outil pour estimer la taille de l'objet visualisé. Pour ce faire, vous devez connaître le diamètre de chaque champ de vision avec chaque objectif. Vous pouvez ensuite estimer la quantité de champ que prend votre objet sur le terrain et la comparer au diamètre mesuré. Par exemple, disons que le diamètre du champ utilisant l'objectif 40x est de 0,10 mm. Vous visualisez ensuite un objet à l'aide de cet objectif qui occupe ¼ du champ de vision. Vous pouvez alors estimer que l'objet mesure ¼ (0,10 mm) de long ou 0,025 mm. Pour déterminer le diamètre du champ, vous utiliserez une lame micrométrique, qui est essentiellement une règle très fine (généralement 2 mm) qui est gravée sur une lame de microscope.

Procédure

  1. Procurez-vous une lame micrométrique de scène. SOYEZ TRÈS PRUDENT. Une lame micrométrique de scène est coûteuse, alors s'il vous plaît, traitez-la avec respect ! Placez la lame micrométrique de la scène sur la scène et concentrez-vous sur les marques millimétriques à l'aide de l'objectif 10x. Enregistrez le diamètre du champ en mm lorsque vous utilisez cet objectif dans le tableau 3.
  2. Passez à l'objectif 40x et faites la mise au point. Déterminer le diamètre du champ en mm avec le micromètre et noter dans le tableau 3. Répéter les mêmes étapes pour les autres lentilles d'objectif.
  3. Convertissez les diamètres en micromètres (μM). Toutes les mesures des cellules et des organites seront effectuées en M. Nettoyez soigneusement la lame et replacez-la dans son plateau sur la table de démonstration.
Tableau 3. Détermination du champ de vision à l'aide d'un micromètre à platine

Objectif utilisé

Grossissement total

Diamètre du champ (mm)

Diamètre du champ en (µm)

Partie III : Faire des montages humides

Matériaux

  • Diapositives (en pot d'alcool)
  • Lamelle (dans un pot d'alcool)
  • Serviettes en papier
  • Plateau ou Bécher pour laver les lames
  • Forceps
  • Pipettes de transfert
  • Couteau et planche à découperCure-dents
  • Oignon
  • Iode (flacon compte-gouttes)
  • Bleu de méthylène (flacon compte-gouttes)
  • Feuille d'Elodea (dans un bécher d'eau)
  • Eau de bassin (dans un bécher)
  • 20% d'eau salée (flacon compte-gouttes)
  • Eau déminéralisée (flacon compte-gouttes)

Diapositives préparées :

  • Paramécie
  • Spirogyre
  • Frottis de sang humain
  • Sang drépanocytaire humain
  • Frottis de sang d'amphibiens

Procédure

Cellules de la joue humaine

La joue humaine est bordée de cellules épithéliales. Elles vous serviront aujourd'hui à observer des cellules animales eucaryotes et son noyau. Vous allez gratter et colorer un échantillon de vos cellules de joue avec le colorant bleu de méthylène. Le colorant vous permettra de colorer clairement les noyaux des cellules. Soyez prudent avec les teintures utilisées pour les montures humides car elles tacheront votre peau et vos vêtements. De plus, les lames et les lamelles que vous utiliserez sont conservées dans de l'alcool. Assurez-vous de sécher les diapositives et les lamelles avec des serviettes en papier (pas le papier pour objectif coûteux) avant de préparer vos diapositives à montage humide.

  1. Obtenez une lame de microscope sèche et une lamelle.
  2. Mettez une goutte de bleu de méthylène sur la lame.
  3. Grattez doucement l'intérieur de votre joue avec un cure-dent et faites-le tourbillonner dans le colorant sur la lame.
  4. Placez une lamelle sur la suspension et visualisez à un grossissement total de 1000X
  5. Dessinez 1 à 3 cellules suffisamment grandes pour montrer les détails que vous voyez dans votre manuel de laboratoire. Étiqueter son membrane cellulaire, cytoplasme et noyau. N'oubliez pas d'indiquer le grossissement utilisé et le nom de l'échantillon. Indiquez également la taille estimée de la cellule en micromètres sous votre dessin. Voir l'exemple (il manque les étiquettes).

Elodea Leaf Wet Mount

La membrane cellulaire n'est pas visible sur le Élodée feuille en raison de sa proximité avec la paroi cellulaire beaucoup plus épaisse. Afin de visualiser la membrane, vous ajouterez du sel à la Élodée. L'eau s'écoulera des cellules d'Elodea par osmose, rétrécissant la membrane cellulaire de la paroi cellulaire rigide (plasmolyse).

  1. Obtenez une lame de microscope. Placer 2 gouttes d'eau délayée à gauche et 2 gouttes de sel à 20 % à droite.
  2. Obtenez une feuille d'une tige d'Elodea et coupez la feuille en deux. Placer une demi-feuille dans chaque solution.
  3. Attendez 3 à 5 minutes puis placez une lamelle sur chaque feuille (enlevez l'excès d'eau).
  4. Vue à un grossissement total compris entre 400X.
  5. Recherchez les cellules qui ont subi une plasmolyse. Si aucun n'est trouvé, préparez à nouveau la lame.
  6. Dessinez 2-3 cellules connectées assez grandes pour montrer les détails que vous voyez. Étiqueter le paroi cellulaire, membrane cellulaire, cytoplasme et chloroplastes dans votre manuel de laboratoire. N'oubliez pas d'indiquer le grossissement utilisé et le nom de l'échantillon. Indiquez également la taille estimée de la cellule en micromètres sous votre dessin.

Montage humide sur membrane d'oignon

Les bulbes d'oignons sont en fait des feuilles gonflées qui forment une structure souterraine. Bien qu'ils ne constituent pas une bonne source pour visualiser les chloroplastes, ils constituent une excellente source pour visualiser les noyaux de plantes eucaryotes.

  1. Obtenez une lame de microscope sèche et une lamelle.
  2. Coupez un petit carré d'une couche d'oignon. Utilisez une pince pour peler la fine membrane blanche et transparente du côté concave intérieur d'une section d'oignon (vous n'avez besoin que d'un petit morceau, de la taille d'une gomme à crayon) et placez-la sur la lame. Essayez de lisser la membrane transparente de l'oignon aussi plate que possible.
  3. Ajouter une goutte d'iode sur la membrane et attendre 30 secondes. Couvrir la membrane avec une lamelle. Placez la lame dans une serviette en papier pliée et tapotez doucement pendant 1 seconde pour éliminer l'excès de colorant.
  4. Vue à un grossissement total de 100X ou 400X, de sorte que vous puissiez voir 2-3 cellules.
  5. Dessinez 2-3 cellules connectées assez grandes pour montrer les détails que vous voyez. Étiqueter le paroi cellulaire, noyau et cytoplasme. Indiquez également la taille estimée de la cellule en micromètres sous votre dessin.

Étang eau humide Mount

Vous préparerez une monture humide de l'un des protistes suivants que l'on peut trouver dans l'eau de l'étang : Euglena, Spirogyra, Paramécie, et/ou Amibe.

  1. Prenez une lame à dépression et séchez-la. Le toboggan à dépression a un renfoncement incurvé au milieu du toboggan, ce qui permet aux créatures vivantes de se déplacer et de ne pas se faire écraser.
  2. Mettez une goutte de méthylcellulose et une goutte de l'eau du bassin ou des cultures.
  3. Mettez soigneusement une lamelle. Si vous avez trop de liquide sur la lame, utilisez délicatement un coin d'une serviette en papier pour absorber l'excès de liquide.
  4. Vue à un grossissement total de 100X ou 400X.
  1. Dessinez les organismes que vous voyez. Indiquez également la taille estimée de la cellule en micromètres sous votre dessin.

Diapositives préparées

Vous regarderez diverses diapositives préparées, y compris Paramécie, Spirogyre, des frottis sanguins humains, des frottis sanguins drépanocytaires humains, des frottis sanguins de grenouille et peut-être d'autres. Regardez au microscope en utilisant le grossissement le plus élevé pour obtenir les meilleurs détails cellulaires et dessinez ce que vous voyez. Indiquez également la taille estimée de la cellule en micromètres sous votre dessin.

Partie IV : Vérification du laboratoire

Cochez chaque tâche une fois terminée. L'instructeur doit signer avant de ranger votre microscope.

Microscope composé de retour

  • Faites pivoter l'objectif de faible puissance en position
  • Utilisez une mise au point grossière pour élever le nez vers le haut
  • Supprimer la diapositive de la scène
  • Assurez-vous que la barre des clips de scène ne dépasse pas
  • Tournez le rhéostat au plus bas avant d'éteindre la lumière
  • Débranchez et enroulez le cordon d'alimentation conformément aux instructions de l'instructeur
  • Transportez correctement le microscope dans l'armoire et remettez-le sur la bonne étagère

Nettoyage des supports humides

  • Rincez la lame dans un bécher d'eau, retirez et retournez la lamelle et glissez-la dans les pots appropriés
  • Remettez les lames préparées sur le bon plateau sur la table de démonstration
  • Serrez tous les bouchons des flacons de réactifs.
  • Nettoyer la table de démonstration
  • Essuyez toutes les tables avec une éponge humide

Signature de l'instructeur

Questions d'étude

  1. Sur la page suivante, étiquetez les pièces du microscope et énumérez leur fonction.
  2. Comment transporter correctement un microscope ?
  3. Comment ranger correctement le microscope ?
  4. Quelle est la puissance de grossissement de :
    • Objectif haute puissance ?
    • Objectif de moyenne puissance ?
    • Objectif de faible puissance ?
    • Lentille oculaire?
  5. Comment le grossissement total d'un spécimen est-il déterminé?
  6. Lorsque le grossissement augmente, comment la taille du champ de vision change-t-elle ?
  7. Pourquoi est-il important de placer le milieu sur une lame avant de sélectionner l'échantillon à monter ?
  8. Nommez une façon d'être sûr que l'échantillon sera trouvé dans le champ de vision lorsque vous changez le grossissement.
  9. Quelles sont les caractéristiques distinctives d'une cellule végétale par rapport à une cellule animale?
  10. Connaissant la taille du champ de vision à l'aide de l'un des trois grossissements, être capable de déterminer la taille d'un spécimen observé.

1.5 : Microscopie - Biologie

La micromanipulation de micropipettes pour la mesure de force est une nouveauté technique

  • La dernière configuration expérimentale de mesure de force de micropipettes a été conçue et construite en 1998 par le professeur Mike Poirier pour isoler et mesurer la réponse de force des chromosomes mitotiques à partir de cellules vivantes de Newt.
  • En tant que postdoctorant, j'ai adapté cette technique pour isoler un seul noyau d'une cellule vivante et mesurer la réponse à la force via l'extension du noyau entier à des vitesses physiologiques.
  • Je suis fier de vous présenter notre "preuve de concept" Microscope de Micromanipulation 1.5. Avec l'aide et le dévouement de Vis, un chercheur de premier cycle, nous avons construit le premier microscope de mesure de force de micromanipulation en deux décennies (1998 à 2018). Cet instrument a été construit à partir d'une ancienne base IX-81 dans une unité entièrement fonctionnelle. Nous construirons un microscope de micromanipulation version 2.0 à UMass Amherst avec des capacités d'imagerie microscopique avancées au-delà des versions actuelles qui sont équipées d'une imagerie de phase et d'une fluorescence à large champ. Si vous êtes intéressé, veuillez consulter nos liens à venir vers MM 2.0 et People (NOUS RECRUTONS !)
  • Remerciements : Nous tenons à remercier la bourse postdoctorale NIH NRSA et le prix NIH K99 Pathway to Independence pour avoir financé la construction de ce microscope. Mon mentor, le professeur Marko, était une ressource inestimable et a fourni de nombreuses pièces de rechange coûteuses nécessaires à la construction de cet instrument. Merci à Vis pour avoir effectué la mise à niveau du logiciel, le codage, l'intégration du matériel et des logiciels et l'ingénierie générale qui étaient essentielles à la fonctionnalité de cet instrument.

Vous trouverez ci-dessous des images de la construction de l'instrument et des vidéos montrant toutes ses fonctionnalités

Pré-étalonnage de la force de la micropipette - Une micropipette avec une rigidité en flexion connue (en bas) est poussée contre une micropipette avec une rigidité en flexion inconnue pour déterminer la rigidité en flexion. La taille de l'ouverture de la micropipette et la force sont maintenues dans une fenêtre étroite et corrélées, l'ouverture est

Constante de flexion de 3 um et 2 nN/um.

(Nous nous excusons que cette vidéo ait été perdue lors du transfert du site Web. Nous l'aurons bientôt. Veuillez voir les autres vidéos ci-dessous)

Isolement d'un seul noyau à partir d'une cellule vivante en quelques minutes - La micropipette supérieure pulvérise du détergent dilué sur une cellule vivante MEF V-/- en culture pour ouvrir la cellule. L'autre micropipette saisit le noyau et le sépare de la cellule. Ce processus est rapide (1 à 2 minutes) et ne soumet pas le noyau à des détergents agressifs continus et à des abus mécaniques qui se produisent normalement pendant l'isolement du noyau en vrac.

Mesure d'extension de force par micromanipulation d'un seul noyau isolé - La micropipette "pull" (à droite) prolonge le noyau tandis que la micropipette "force" mesure la force via la déviation multipliée par la constante de flexion prémesurée.


donne accès à des microscopes optiques et électroniques avancés ainsi qu'à l'expertise de scientifiques spécialisés en imagerie. Nous fournissons une analyse d'image personnalisée, une préparation complète des échantillons pour la microscopie électronique, ainsi qu'un nettoyage et une expansion pour la microscopie optique.

Veuillez également profiter de nos ressources d'apprentissage liées à l'imagerie.

"Pour de meilleurs résultats, laissez-nous vous aider à chaque étape du processus d'imagerie, de la préparation des échantillons à l'analyse quantitative de l'image."

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L'expert en épigénétique Dana C. Dolinoy de l'École de santé publique de l'Université du Michigan et directeur de la faculté du BRCF Epigenomics Core explique comment notre compréhension naissante de l'épigénome conduit à des avancées dans la compréhension des causes et du traitement potentiel de certains …

La direction de Michigan Medicine a récemment publié la déclaration selon laquelle «nous reconnaissons sans équivoque le racisme comme un problème de santé publique et nous nous mobilisons contre les préjugés et les inégalités». Ici, au Bureau de la recherche de la faculté de médecine, nous approuvons de tout cœur ce message et le …


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Immunohistochimie Modifier

L'immunohistochimie ou la coloration IHC des coupes de tissus (ou l'immunocytochimie, qui est la coloration des cellules), est peut-être la technique d'immunocoloration la plus couramment appliquée. [2] Alors que les premiers cas de coloration IHC utilisaient des colorants fluorescents (voir immunofluorescence), d'autres méthodes non fluorescentes utilisant des enzymes telles que la peroxydase (voir coloration à l'immunoperoxydase) et la phosphatase alcaline sont désormais utilisées. Ces enzymes sont capables de catalyser des réactions qui donnent un produit coloré facilement détectable par microscopie optique. Alternativement, des éléments radioactifs peuvent être utilisés comme marqueurs, et l'immunoréaction peut être visualisée par autoradiographie. [3]

Préparation des tissus ou fixation est essentiel pour la préservation de la morphologie cellulaire et de l'architecture tissulaire. Une fixation inappropriée ou prolongée peut diminuer considérablement la capacité de liaison de l'anticorps. De nombreux antigènes peuvent être mis en évidence avec succès dans des coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine. Cependant, certains antigènes ne survivront même pas à des quantités modérées de fixation d'aldéhyde. Dans ces conditions, les tissus doivent être rapidement frais congelés dans de l'azote liquide et coupés avec un cryostat. Les inconvénients des coupes congelées comprennent une mauvaise morphologie, une mauvaise résolution à des grossissements plus élevés, des difficultés à couper sur des coupes en paraffine et la nécessité d'un stockage congelé. Alternativement, les sections de vibratome ne nécessitent pas que le tissu soit traité par des solvants organiques ou une chaleur élevée, ce qui peut détruire l'antigénicité ou être perturbé par la congélation et la décongélation. L'inconvénient des sections vibratome est que le processus de sectionnement est lent et difficile avec des tissus mous et mal fixés, et que des marques de bavardage ou des lignes vibratome sont souvent apparentes dans les sections.

La détection de nombreux antigènes peut être considérablement améliorée en récupération d'antigène méthodes qui agissent en brisant certaines des liaisons croisées protéiques formées par fixation pour découvrir des sites antigéniques cachés. Ceci peut être accompli en chauffant pendant des durées variables (extraction d'épitope induite par la chaleur ou HIER) ou en utilisant une digestion enzymatique (extraction d'épitope induite par protéolyse ou PIER). [4]

L'une des principales difficultés de la coloration IHC est de surmonter le bruit de fond spécifique ou non spécifique. L'optimisation des méthodes et des temps de fixation, le prétraitement avec des agents bloquants, l'incubation d'anticorps à haute teneur en sel et l'optimisation des tampons de lavage post-anticorps et des temps de lavage sont tous importants pour obtenir une immunocoloration de haute qualité. De plus, la présence de contrôles positifs et négatifs pour la coloration est essentielle pour déterminer la spécificité.

Cytométrie en flux Modifier

Un cytomètre en flux peut être utilisé pour l'analyse directe de cellules exprimant une ou plusieurs protéines spécifiques. Les cellules sont immunocolorées en solution en utilisant des méthodes similaires à celles utilisées pour l'immunofluorescence, puis analysées par cytométrie en flux.

La cytométrie en flux présente plusieurs avantages par rapport à l'IHC, notamment : la capacité de définir des populations cellulaires distinctes par leur taille et leur granularité la capacité d'éliminer les cellules mortes une sensibilité améliorée et une analyse multicolore pour mesurer plusieurs antigènes simultanément. Cependant, la cytométrie en flux peut être moins efficace pour détecter des populations cellulaires extrêmement rares, et il y a une perte de relations architecturales en l'absence d'une section de tissu. [5] La cytométrie en flux a également un coût d'investissement élevé associé à l'achat d'un cytomètre en flux.

Western blot Modifier

Le Western blot permet la détection de protéines spécifiques à partir d'extraits de cellules ou de tissus, avant ou après toute étape de purification. Les protéines sont généralement séparées par taille en utilisant une électrophorèse sur gel avant d'être transférées sur une membrane synthétique via des méthodes de transfert sec, semi-sec ou humide. La membrane peut ensuite être sondée à l'aide d'anticorps en utilisant des méthodes similaires à l'immunohistochimie, mais sans besoin de fixation. La détection est typiquement effectuée en utilisant des anticorps liés à la peroxydase pour catalyser une réaction chimioluminescente.

Le Western blot est une méthode de biologie moléculaire de routine qui peut être utilisée pour comparer semi-quantitativement les niveaux de protéines entre les extraits. La séparation des tailles avant le transfert permet d'évaluer le poids moléculaire de la protéine par rapport aux marqueurs de poids moléculaire connus.

Test immuno-enzymatique Modifier

Le dosage immuno-enzymatique ou ELISA est une méthode de diagnostic permettant de déterminer quantitativement ou semi-quantitativement les concentrations de protéines à partir d'extraits de plasma sanguin, de sérum ou de cellules/tissus dans un format de plaque multipuits (généralement 96 puits par plaque). En gros, les protéines en solution sont adsorbées sur des plaques ELISA. Des anticorps spécifiques de la protéine d'intérêt sont utilisés pour sonder la plaque. Le bruit de fond est minimisé en optimisant les méthodes de blocage et de lavage (comme pour l'IHC), et la spécificité est assurée par la présence de contrôles positifs et négatifs. Les méthodes de détection sont généralement basées sur la colorimétrie ou la chimiluminescence.

Immuno-microscopie électronique Modifier

La microscopie électronique ou EM peut être utilisée pour étudier la microarchitecture détaillée des tissus ou des cellules. Immuno-EM permet la détection de protéines spécifiques dans des coupes de tissus ultrafines. Les anticorps marqués avec des particules de métaux lourds (par exemple l'or) peuvent être directement visualisés en utilisant la microscopie électronique à transmission. Bien que puissant pour détecter la localisation sous-cellulaire d'une protéine, l'immuno-EM peut être techniquement difficile, coûteux et nécessiter une optimisation rigoureuse des méthodes de fixation et de traitement des tissus. Biotinylation des protéines in vivo a été proposé pour atténuer les problèmes causés par l'incompatibilité fréquente de la coloration des anticorps avec des protocoles de fixation qui préservent mieux la morphologie cellulaire. [6]

Dans les méthodes d'immunocoloration, un anticorps est utilisé pour détecter un épitope protéique spécifique. Ces anticorps peuvent être monoclonal ou polyclonal. La détection de ce premier ou anticorps primaire peut être accompli de plusieurs manières.

  • L'anticorps primaire peut être directement marqué en utilisant une enzyme ou un fluorophore.
  • L'anticorps primaire peut être marqué en utilisant une petite molécule qui interagit avec un partenaire de liaison de haute affinité qui peut être lié à une enzyme ou à un fluorophore. La biotine-streptavidine est une interaction de haute affinité couramment utilisée.
  • L'anticorps primaire peut être sondé pour l'utilisation d'un plus large spectre spécifique à l'espèce anticorps secondaire qui est marqué à l'aide d'une enzyme ou d'un fluorophore.
  • Dans le cas de la microscopie électronique, les anticorps sont liés à une particule de métal lourd (généralement des nanoparticules d'or d'un diamètre compris entre 5 et 15 nm).

Comme décrit précédemment, des enzymes telles que la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline sont couramment utilisées pour catalyser des réactions qui donnent un produit coloré ou chimiluminescent. Les molécules fluorescentes peuvent être visualisées en utilisant microscopie à fluorescence ou microscopie confocale.

Les applications de l'immunomarquage sont nombreuses, mais sont le plus souvent utilisées dans diagnostic clinique et recherche en laboratoire.

Cliniquement, l'IHC est utilisé en histopathologie pour le diagnostic de types spécifiques de cancers sur la base de marqueurs moléculaires.

En science de laboratoire, l'immunocoloration peut être utilisée pour une variété d'applications basées sur l'étude de la présence ou de l'absence d'une protéine, sa distribution tissulaire, sa localisation sous-cellulaire et des changements dans l'expression ou la dégradation des protéines.


Chapitre 1.4-1.5 Quiz Biologie I M. Cardona ID:A

3. Les études complexes, telles que celles qui étudient la transmission de maladies chez l'homme, utilisent souvent lesquelles des méthodes suivantes ?

A. modélisation informatique
B. plusieurs expériences de garçon
C. tests humains
D. imagerie par résonance magnétique

4. Quelle phrase définit le mieux un gène ?

A. unité de vie de base
B. tranche d'un spécimen
C. trait héréditaire
D. segment d'ADN

A. utiliser des spécimens morts ou vivants
B. utiliser des électrons
C. former des images 3D
D. n'utiliser que des spécimens morts

6. La connaissance de la biologie peut favoriser le progrès en aidant tout le monde à faire

A. valeurs individuelles
B. décisions éclairées
C. des produits rentables
D. opinions bien arrêtées

7. L'utilisation et l'application des êtres vivants et des processus biologiques sont appelées

A. épidémiologie
B. biotechnologie
C. biologie humaine
D. la recherche médicale

8. Parmi les propositions suivantes, laquelle est un exemple d'organisme transgénique ?

A. bactéries qui produisent de l'insuline humaine
B. levure utilisée pour produire du pain
C. les micro-organismes producteurs de fromage
D. des algues qui produisent de l'hydrogène gazeux

9. La biotechnologie soulève des questions éthiques, principalement en ce qui concerne la

A. Meilleure utilisation des fonds pour la recherche biologique
B. manières dont les connaissances devraient être utilisées
C. sagesse de continuer à utiliser la technologie
D. la sécurité de manger des plantes cultivées localement

10. Quelle est la vérité sur les questions sans réponse de la biologie ?

A. peu susceptible de changer quoi que ce soit
B. peu existaient dans le passé
C. dépendent rarement de la technologie
D. beaucoup ne sont pas sollicités

11. Quel type de microscope est illustré dans la figure ci-dessous ?

12. Étiquetez chaque composant du microscope illustré dans la figure ci-dessous.

Briser les frontières

La cryo-EM est une technique vieille de plusieurs décennies qui détermine la forme d'échantillons congelés par flash en leur envoyant des électrons et en enregistrant les images résultantes. Les progrès de la technologie de détection des électrons ricochant et des logiciels d'analyse d'images ont catalysé une « révolution de la résolution » qui a commencé vers 2013. Cela a conduit à des structures protéiques plus nettes que jamais - et presque aussi bonnes que celles obtenues par cristallographie aux rayons X, une technique plus ancienne qui déduit des structures à partir de schémas de diffraction créés par des cristaux de protéines lorsqu'ils sont bombardés de rayons X.

Les avancées matérielles et logicielles ultérieures ont conduit à davantage d'améliorations dans la résolution des structures cryo-EM. Mais les scientifiques ont dû largement compter sur la cristallographie aux rayons X pour obtenir des structures à résolution atomique. Cependant, les chercheurs peuvent passer des mois voire des années à cristalliser une protéine, et de nombreuses protéines médicalement importantes ne formeront pas de cristaux utilisables. La cryo-EM, en revanche, nécessite seulement que la protéine soit dans une solution purifiée.

Les cartes à résolution atomique sont suffisamment précises pour discerner sans ambiguïté la position des atomes individuels dans une protéine, à une résolution d'environ 1,2 ångströms (1,2 × 10 –10 m). Ces structures sont particulièrement utiles pour comprendre le fonctionnement des enzymes et utiliser ces informations pour identifier les médicaments qui peuvent bloquer leur activité.

Pour pousser la cryo-EM à une résolution atomique, les deux équipes ont travaillé sur une protéine stockant le fer appelée apoferritine. En raison de sa stabilité semblable à celle d'une roche, la protéine est devenue un banc d'essai pour la cryo-EM : une structure de la protéine avec une résolution de 1,54 ångströms était le précédent record 3 .

La révolution ne se cristallisera pas : une nouvelle méthode déferle sur la biologie structurale

Les équipes ont ensuite utilisé des améliorations technologiques pour prendre des photos plus nettes de l'apoferritine. L'équipe de Stark a obtenu une structure de 1,25 ångström de la protéine, avec l'aide d'un instrument qui garantit que les électrons se déplacent à des vitesses similaires avant de toucher un échantillon, améliorant ainsi la résolution des images résultantes. Scheres, Aricescu et leur groupe ont utilisé une technologie différente pour tirer des électrons voyageant à des vitesses similaires. Ils ont également bénéficié d'une technologie qui réduit le bruit généré après que certains électrons se soient éloignés de l'échantillon de protéine, ainsi que d'une caméra de détection d'électrons plus sensible. Leur structure de 1,2 ångström était si complète, dit Scheres, qu'ils pouvaient repérer des atomes d'hydrogène individuels, à la fois dans la protéine et dans les molécules d'eau environnantes.

Stark reckons that melding the technologies could push resolutions to around 1 ångström — but not much further. “Below 1 Å is almost impossible to reach for cryo-EM,” he says. Obtaining such a structure with existing state-of-the-art technology would take “several hundred years of data recording and a non-realistic amount of compute power and data-storage capacities”, his team estimates.


Light Microscopes

You will need to know:

how to prepare a slide for a light microscope.

label a light microscope and remember a brief description of what each of the components do.

  1. Using a pipette, place a drop of water in the centre of the slide.
  2. Using a scalpel and tweezers, carefully remove one thin layer of onion, trying to get only one or two layers of cells.
  3. Place the piece of onion in the water droplet using the tweezers.
  4. Using a pipette, place a drop of iodine over the onion slice.
  5. Carefully place a cover slide (a thin square piece of plastic/glass) over the onion and droplets. In order to prevent air bubbles from forming, place the cover slide upright on the larger slide and carefully tilt and lower the cover slide onto the water droplets.
  6. Place the slide onto the microscope stage, making sure the onion is in the centre of the stage.


Drawbacks of Second Harmonic Generation

Despite the effectiveness of SHG microscopy in imaging biological tissue, it still suffers from some limitations. One of these limitations is the restricted penetration depths (100–300 μm with laser excitation in the 800–1000 nm range). Consequently, this might make SHG microscopy inappropriate for some biological applications, mainly when the region of interest is deeply located within the tissue or organ thus, it is unreachable by SHG. The biggest issue in SHG microscopy is that it can image only a few structural proteins or harmonophores such as collagen types I & III, actomyosin complexes, cholesterol crystals (ChC), centrosomes and mitotic spindles. Unfortunately, to date, scientists could not find a method that can discriminate between fibrillar collagen types, which could enhance wound repair and regeneration biology [29]. However, these limitations might be controlled by finding suitable imaging solutions.


Super-resolution microscopy demystified

Super-resolution microscopy (SRM) bypasses the diffraction limit, a physical barrier that restricts the optical resolution to roughly 250 nm and was previously thought to be impenetrable. SRM techniques allow the visualization of subcellular organization with unprecedented detail, but also confront biologists with the challenge of selecting the best-suited approach for their particular research question. Here, we provide guidance on how to use SRM techniques advantageously for investigating cellular structures and dynamics to promote new discoveries.

In their pursuit of understanding cellular function, biologists seek to observe the processes that allow cells to maintain homeostasis and react dynamically to internal and external cues—on both a molecular scale and inside structurally intact, ideally living specimens. A pathway towards this goal was opened with the advent, and widespread application, of super-resolution microscopy (SRM) techniques that manage to surpass the ‘classical’ diffraction limit of optical resolution of about half the wavelength of the emitted light 1 . These fluorescence microscopy techniques are continuously pushing the resolution barrier towards nanometre scales, thereby enabling the imaging of cellular structures with a level of detail that was previously only achievable with electron microscopy (EM). At the same time, SRM techniques retain the advantages of optical microscopy with regard to sample preservation, imaging flexibility and target specificity. SRM allows the extraction of quantitative information on spatial distributions and often also on the absolute numbers of proteins or other macromolecules within subcellular compartments. SRM can also reveal three-dimensional (3D) structural details, and provides direct experimental feedback for modelling complex biological interactions 2 .


4.3 Elodea Leaf Wet Mount

Elodea canadensis (American or Canadian waterweed or pondweed) is a perennial aquatic plant, or submergent macrophyte, native to most of North America. It grows rapidly in favorable conditions and can choke shallow ponds, canals, and the margins of some slow-flowing rivers. It requires summer water temperatures of 10-25 °C and moderate to bright lighting. Young plants initially start with a seedling stem with roots growing in mud at the bottom of the water further adventitious roots are produced at intervals along the stem, which may hang free in the water or anchor into the bottom. It grows indefinitely at the stem tips, and single specimens may reach lengths of 3 m or more. The leaves are bright green, translucent, oblong, 6-17 mm long and 1-4 mm broad, borne in whorls of three (rarely two or four) round the stem. It lives entirely underwater, the only exception being the small white or pale purple flowers which float at the surface and are attached to the plant by delicate stalks. It is dioecious, with male and female flowers on different plants. The flowers have three small white petals male flowers have 4.5-5 mm petals and nine stamens, female flowers have 2-3 mm petals and three fused carpels. The fruit is an ovoid capsule, about 6 mm long containing several seeds that ripen underwater. The seeds are 4-5 mm long, fusiform, glabrous (round), and narrowly cylindrical. It flowers from May to October.


Voir la vidéo: Microscope optique: biologie cellulaire (Décembre 2022).