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Une question sur l'induction IPTG

Une question sur l'induction IPTG


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J'ai trouvé l'information : « En l'absence de lactose, le répresseur lac se lie à la séquence opérateur sur l'ADN et plie l'ADN de 40 degrés. Cela bloque l'accès de l'ARN polymérase T7 au site du promoteur et empêche ainsi les fuites de transcription de votre gène avant l'induction.' Je suis confus au sujet d'un fait.

Lorsque j'ajoute de l'IPTG, la protéine répresseur lac (provenant du chromosome d'E.coli) ne peut plus se lier à l'opérateur et l'ARN polymérase native d'E. coli commence à transcrire, le gène de l'ARN polymérase T7 conçu dans son chromosome.

Donc, s'il y a de l'IPTG et que la protéine répresseur lac (du chromosome E. coli) ne peut plus se lier à l'opérateur se trouvant devant le gène de l'ARN polymérase T7, pourquoi la protéine répresseur lac peut toujours se lier à l'opérateur se trouvant devant le gène cible du plasmide ?


Qu'est-ce qui vous fait penser que le répresseur lac sera toujours lié au gène cible ?

Dans les souches avec ce type de configuration régulatrice (généralement avec DE3 dans le génotype), l'idée est que l'induction de l'IPTG active l'expression de la polymérase T7 à partir d'un promoteur lac sur le chromosome, puis cette polymérase T7 transcrit ensuite le gène cible sur le plasmide. La présence d'IPTG garantit que le répresseur ne se liera à aucun site.

Supplémentaire:

Je pense que je comprends pourquoi vous êtes confus maintenant. Votre image de la façon dont cela fonctionne est basée sur l'idée que le répresseur est verrouillé sur l'opérateur jusqu'à ce qu'un inducteur tel que l'IPTG arrive. En fait, il existe un équilibre entre lié et non lié :

répresseur/opérateur <=> répresseur + opérateur

et, dans les brèves périodes où le répresseur n'est pas lié, l'ARN polymérase d'E. coli peut se lier et transcrire l'opéron. C'est ce qu'on appelle la "synthèse d'échappement" et il est généralement supposé qu'elle est fonctionnellement pertinente pour garantir qu'il existe de faibles niveaux d'expression de la lac perméase à tout moment afin que le lactose puisse être absorbé. Si ce n'était pas le cas, comment l'inducteur naturel (un dérivé du lactose) pourrait-il jamais induire l'opéron lac ?

Dans les systèmes d'expression de protéines, il est généralement considéré comme souhaitable de maintenir la synthèse d'échappement de la protéine étrangère à un minimum de sorte qu'il n'y ait pas de sélection agissant sur le gène pour annuler tout effet délétère de son expression. L'utilisation de la polymérase T7 comme niveau intermédiaire de régulation permet d'y parvenir. Même s'il y a un faible niveau de synthèse d'échappement de la T7 polymérase, la concentration de T7 polymérase sera si faible à l'état non induit (par rapport à l'ARN polymérase endogène) que la quantité de synthèse d'échappement de la protéine cible due à la T7 polymérase gagne l'accès productif au promoteur T7 sur le plasmide sera négligeable.

Lire la suite ici.


Groupe Écologie des Bactériophages

L'induction est souvent stimulée par des dommages à l'ADN bactérien et dans le cas des prophages qui sont intégrés dans le chromosome bactérien, l'induction implique également l'excision du prophage du chromosome. Notez que l'induction est l'abréviation de « induction de prophage » et que l'induction de prophage peut également être décrite comme un commutateur génétique (comme dans le passage d'un état génétique d'un cycle lysogène à un cycle lytique ou, plus généralement, une infection productive).

Dans le bactériophage lambda (&lambda), l'induction est associée au clivage du répresseur CI. Le résultat est la production de la protéine Cro, qui inhibe la production ultérieure de CI. L'induction dans &lambda ainsi qu'avec de nombreux autres lysogènes, et donc le clivage de Cro, est typiquement en réponse à des dommages à l'ADN dans la bactérie hôte. L'induction qui se produit en l'absence d'agents inducteurs spécifiques peut être décrite comme spontanée, comme dans "l'induction spontanée" ou la "commutation spontanée".

Les cycles de vie des phages tempérés impliquent plusieurs étapes, souvent conflictuelles, l'étape d'induction étant celle qui fait passer le phage d'un état dans lequel son succès est intimement lié à celui de son hôte bactérien, sur des périodes plus longues, à un état dans lequel il fonctionne à la place. explicitement comme antagonistes antibactériens.

Pour une discussion et des références supplémentaires, voir Little (2005), Ptashne (2004), etc.

Pour en savoir plus sur ce sujet, voir Wikipedia, Google et PubMed. Contactez le webmestre. Retour aux termes.


PROCÉDURES

« Introduction au génie génétique » est un cours au choix de 90 h dispensé aux étudiants de premier cycle en biologie qui ont déjà suivi des cours sur la biochimie, la microbiologie et la génétique moléculaire. L'équipe était composée du professeur de la discipline (Coordonnateur), d'un professeur assistant, de deux assistants diplômés, dont l'un impliqué dans un programme spécifique en enseignement (PESCD/CAPES), soutenu par une institution brésilienne de financement de la recherche (Bureau de coordination pour l'amélioration des étudiants de premier cycle et de troisième cycle [CAPES]) pour fournir aux étudiants diplômés une formation d'enseignant. et six étudiants de premier cycle. Ces derniers ont été divisés en deux groupes dans la partie expérimentale du cours.

Le cours a commencé par le coordinateur donnant aux étudiants un cours théorique sur les cystatines et leur activité inhibitrice des protéases à cystéine. Les étudiants devaient également lire de la littérature spécifique sur le sujet de cette classe [ 2 , 4 ]. Des cours théoriques supplémentaires ont été donnés pendant le cours pour élucider davantage les expériences et discuter des principes impliqués dans les techniques de biologie moléculaire. Les étudiants ont réalisé des expériences essentiellement pratiques, depuis la recherche du gène cible dans les bases de données NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) jusqu'à son clonage, l'expression de la protéine dans Escherichia coli, et la purification des protéines. Les exigences du gène à choisir doivent être de codifier pour un gène exprimé à des niveaux élevés dans une plante accessible, avoir une séquence d'ADNc complète connue et avoir un cadre de lecture ouvert (ORF) 2 2 Les abréviations utilisées sont : ORF , cadre de lecture ouvert IPTG, isopropylthiogalactoside. ne contenant pas plus de 700 pb pour faciliter la synthèse d'ADNc. Enfin, un "in vivo” test a été effectué pour étudier une activité biologique encore non signalée de la cystatine choisie.

Des protocoles de base ont été fournis aux étudiants, qui ont dû les adapter au cours des expérimentations. Les étudiants ont rédigé des comptes rendus de chaque étape expérimentale. Le tableau I montre les étapes du cours et les techniques expérimentales impliquées dans chaque phase, y compris la chronologie.


RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les colonies bactériennes transformées avec pET28a-GFP présentaient une fluorescence verte 2 jours après avoir été étalées sur du milieu solide LB. Un examen des plaques sous lumière UV a permis une démonstration simple d'un faible niveau basal d'expression de la lac promoteur en l'absence d'IPTG.

La figure 1 montre une analyse en SDS-PAGE de l'induction de GFP recombinante dans E. coli cellules. Une augmentation progressive d'une bande protéique, d'environ 29 kDa, a été observée sous induction à l'IPTG mais n'a pas été détectée dans la culture non induite (sans IPTG). Cette protéine a la taille attendue pour la GFP (∼26,3 kDa), plus le peptide de fusion contenant His6 tag, et le site de la thrombine (∼ 3 kDa). La preuve de l'augmentation de l'expression de la GFP a également été montrée par une augmentation de la fluorescence de la culture induite (en comparaison avec la culture non induite) lorsqu'elle est examinée sous lumière UV.

La protéine recombinante a été détectée dans les fractions solubles et insolubles des cellules induites (Fig. 1). Sa présence dans la fraction insoluble peut avoir résulté d'une perturbation cellulaire inefficace pendant la sonication.

La figure 2 montre une analyse des fractions récupérées pendant la purification des protéines par chromatographie d'affinité. De nombreuses protéines non spécifiques qui ne se liaient pas à la résine ont été libérées dans la solution d'écoulement et avec le tampon de lavage. Les protéines ayant une faible affinité pour les ions nickel ou cobalt ont été éluées avec de faibles concentrations d'imidazole (par exemple. 25 mM). La GFP recombinante a commencé à être éluée dans une gamme de concentrations d'imidazole, à partir de 50 m M (Fig. 2UNE) ou 75 m M (Fig. 2B). A ces concentrations, certaines protéines contaminantes ont également été éluées avec la protéine d'intérêt. A des concentrations plus élevées d'imidazole, la protéine recombinante a été presque exclusivement éluée. Un niveau de récupération élevé a eu lieu à 100 m M (Fig. 2UNE) ou 250 m M d'imidazole (Fig. 2B), en fonction de l'affinité de la GFP recombinante pour les matrices de différents fournisseurs. Au moins 12 mg de GFP ont été purifiés pour 250 ml de culture bactérienne (c'est à dire. 48 mg par litre). L'élution avec les solutions de gradient d'imidazole a permis une récupération plus sélective de la protéine marquée His, car les protéines de faible affinité ont été éluées plus tôt à partir de la protéine recombinante. Comme le montre la figure 2C, les fractions éluées contenant de la GFP purifiée ont pu être identifiées directement en raison de la fluorescence naturelle de la protéine.

Autres sujets abordés

Après les cours, les sujets suivants ont été discutés en détail avec les étudiants.

Pliage des protéines et modification chimique—

La chaîne polypeptidique naissante synthétisée sur le ribosome subit un repliement et toutes les molécules d'une protéine acquièrent une seule conformation appelée état natif, plutôt que de nombreuses autres conformations possibles. La plupart des protéines présentes dans les cellules sont dans leur conformation native soluble, ce qui est nécessaire pour une activité biologique appropriée.

Certains mécanismes cellulaires peuvent empêcher la formation de protéines mal repliées. Les chaperons sont une famille de protéines présentes dans tous les organismes, des bactéries aux humains. Ils sont situés dans chaque compartiment cellulaire, liant différents types de protéines et participant probablement à un mécanisme général de repliement des protéines. Les chaperons moléculaires, qui lient et stabilisent les protéines dépliées ou partiellement repliées, peuvent empêcher la dégradation de ces protéines, tandis que les chaperonines facilitent directement le repliement [ 9 ].

Un problème courant d'expression hétérologue dans E. coli est un repliement inapproprié des protéines, qui conduit à la formation d'agrégats insolubles appelés corps d'inclusion. Ces agrégats peuvent se former en raison de l'interaction de groupes hydrophobes avec des régions similaires d'autres molécules dépliées ou de la formation de liaisons disulfure entre des molécules distinctes.

Les conditions intracellulaires des cellules bactériennes peuvent affecter le repliement correct de certaines protéines eucaryotes. L'état redox distinct du cytoplasme bactérien par rapport aux cellules de mammifères peut affecter la formation de liaisons disulfure de différentes manières et, par conséquent, le repliement et la solubilité des protéines.

La protéine à purifier est typiquement la plus souhaitable si elle est aussi proche que possible de la conformation native. Cependant, certaines modifications post-traductionnelles importantes pour la fonction et la solubilité des protéines dans les cellules eucaryotes (par exemple. glycosylation) sont absents E. coli. Néanmoins, la glycosylation joue rarement un rôle clé dans in vitro études avec une protéine recombinante. De plus, la structure peut ne pas être essentielle si la protéine doit être utilisée comme antigène pour la production d'anticorps [ 10 ].

Autres facteurs impliqués dans l'expression des protéines—

Plusieurs facteurs qui empêchent ou perturbent l'expression des protéines dans E. coli ainsi que certaines stratégies pour les surmonter ont été discutées dans les classes.

Certaines protéines, en particulier celles qui sont inférieures à 10 kDa, ne sont pas stables dans E. coli et peut être dégradé rapidement par les protéases [ 11 ]. La fusion avec une protéine plus grosse telle que la glutathion S-transférase peut surmonter ce problème. De plus, de nombreuses protéines insolubles deviennent solubles dans E. coli lorsqu'il est exprimé en fusion avec la glutathion S-transférase et peut être facilement purifié par chromatographie d'affinité, en utilisant une colonne contenant du glutathion immobilisé. En variante, les protéines insolubles peuvent être solubilisées en utilisant des agents chaotrophes tels que le SDS ou l'urée suivis d'un repliement dans la forme native par retrait progressif de ces agents.

Ralentir le taux d'expression peut également améliorer la solubilité des protéines, et cela peut être réalisé en abaissant la concentration de l'agent inducteur (par exemple. IPTG) ou en abaissant la température d'induction. Ces approches peuvent également être adoptées lorsque la protéine hétérologue exprimée dans E. coli est toxique pour la cellule.

La présence de codons abondants et inhabituels dans le gène à exprimer dans E. coli peut entraîner une mauvaise traduction en raison d'une pause ribosomique [ 12 ]. Parce que la transcription et la traduction sont étroitement liées dans E. coli, une interruption prématurée de la transcription peut survenir. Les in vitro remplacement de tels codons par mutation par les codons les plus couramment utilisés pour E. coli peut surmonter ce problème. La traduction des protéines peut également être affectée par la présence de structures secondaires dans l'ARN messager, qui empêchent la liaison du ribosome au site de liaison du ribosome.


Manque d'expression dans le clone pQE30 - (17 juil. 2008 )

J'ai finalement cloné ma séquence d'ADN optimisée en codons dans les sites de restriction SphI et HindIII dans le vecteur d'expression pQE30 par Qiagen. La séquence est dans le cadre lors du séquençage et j'ai transformé en M15 et JM109 E.coli à des fins d'expression.

J'ai également posté une question à laquelle un Andriy a répondu concernant mon clone sur le forum de clonage moléculaire. Il a mentionné une question sur l'utilisation de SphI dans laquelle mon superviseur a dit que cela ne poserait pas de problème.

Mais lors de l'expression préliminaire dans JM109 et M15, il n'y avait pas de bande exprimée intense car les profils protéiques étaient similaires à ceux des témoins utilisés qui étaient les souches qui ont été transformées en vecteur pQE30 en it0. J'ai utilisé 1 mM et induit une expression à OD600nm 0,6.
J'ai ensuite répété l'expression dans les deux souches en abaissant la concentration d'IPTG à 0,5 mM et le profil semble être le même.
Dois-je augmenter ma concentration d'IPTG à 5 mM comme certains l'ont suggéré ou peut-être encore plus bas à 0,005 mM ? Mon aîné m'a également dit de diminuer la température de croissance à 25 degrés Celsius. Mais je pensais que c'était uniquement à des fins de solubilité ?
Je pensais détecter avec Western blot mais pas d'anticorps 6xHis.

J'ai finalement cloné ma séquence d'ADN optimisée en codons dans les sites de restriction SphI et HindIII dans le vecteur d'expression pQE30 par Qiagen. La séquence est dans le cadre lors du séquençage et j'ai transformé en M15 et JM109 E.coli à des fins d'expression.

J'ai également posté une question à laquelle un Andriy a répondu concernant mon clone sur le forum de clonage moléculaire. Il a mentionné une question sur l'utilisation de SphI dans laquelle mon superviseur a dit que cela ne poserait pas de problème.

Mais lors de l'expression préliminaire dans JM109 et M15, il n'y avait pas de bande exprimée intense car les profils protéiques étaient similaires à ceux des témoins utilisés qui étaient les souches qui ont été transformées en vecteur pQE30 en it0. J'ai utilisé 1 mM et induit une expression à OD600nm 0,6.
J'ai ensuite répété l'expression dans les deux souches en abaissant la concentration d'IPTG à 0,5 mM et le profil semble être le même.
Dois-je augmenter ma concentration d'IPTG à 5 mM comme certains l'ont suggéré ou peut-être encore plus bas à 0,005 mM ? Mon aîné m'a également dit de diminuer la température de croissance à 25 degrés Celsius. Mais je pensais que c'était uniquement à des fins de solubilité ?
Je pensais détecter avec Western blot mais pas d'anticorps 6xHis.

C'est le profil d'expression du lysat cellulaire total

Comme surlignés en vert sont p11, surlignés en rouge sont p14 et jaunes ou c(0) ou c(3) sont des contrôles.
Ceux avec des crochets [] sont des fractions de 1 ml.
Autre que le [], les cellules ont été normalisées à T = 0 h.

Toutes les cultures ont été induites à une DO600nm = 0,7.
Les cultures ont été cultivées à 250 tr/min, 37 degrés Celsius.
J'ai d'abord essayé avec 1 mM d'IPTG, puis je l'ai répété en abaissant le niveau d'IPTG à 0,5 mM en pensant qu'il y aurait des changements mais les profils semblent similaires.

Je peux vous dire que toutes les protéines ne peuvent pas être vues dans la commasie comme induites par rapport à celles non induites.

Comme vous l'avez dit, si vous n'êtes pas sûr, la meilleure chose à faire est d'utiliser W.B avec anti His tag Ab.

Le profil d'induction UR semble correct (ne modifiez pas la conc. IPTG). U devrait également prolonger le temps d'induction de 6h ou pendant la nuit.

Merci pour votre réponse.
Je suis assez nouveau dans ce domaine.
Toutes les protéines ne sont pas visibles dans Coomasie ? Me proposeriez-vous de faire de l'argent ?

Puis-je poser des questions sur IPTG ? Si je l'augmente, cela fera-t-il une différence ? J'ai essayé de l'augmenter mais le profil est exactement le même & #33 L'IPTG n'est pas quantitatif, n'est-ce pas ?

Je vais essayer dans la nuit aujourd'hui et voir si j'obtiens quelque chose.
Merci beaucoup =)

Ce que je voulais dire quand je dis que "Toutes les protéines ne peuvent pas être vues dans Coomasie", c'est qu'il est parfois difficile de voir et d'identifier

bande claire de protéine induite lorsque vous la comparez à la fraction non induite (en raison de protéines contaminantes ou simplement

frottis protéique). Comme je l'ai dit, le meilleur moyen d'être sûr, c'est de faire du western blot (n'oubliez pas le contrôle positif), je ne sais pas comment

Concernant la concentration d'IPTG, 1 mM est acceptable comme "concentration suffisante" pour l'induction. je ne pense pas que

augmenter l'IPTG vous aiderait.

Ce que vous pouvez changer, c'est : 1) Induction OD- 0,8-1 au lieu de 0,6 2) quel tampon utilisez-vous pour tester vos échantillons-fractions 3) faites-vous

charger suffisamment de culture (protéines totales) sur du gel d'agarose ? 4) prenez-vous de la DO en fin d'induction (vérifiez que les cellules sont

en passant, les JM109 ne sont pas des cellules d'expression (pour autant que je sache) qu'elles utilisent comme cellules de réplication pour les plasmides.

Ce que je voulais dire quand je dis que "Toutes les protéines ne peuvent pas être vues dans Coomasie", c'est qu'il est parfois difficile de voir et d'identifier

bande claire de protéine induite lorsque vous la comparez à la fraction non induite (en raison de protéines contaminantes ou simplement

frottis protéique). Comme je l'ai dit, le meilleur moyen d'être sûr, c'est de faire du western blot (n'oubliez pas le contrôle positif), je ne sais pas comment

Concernant la concentration d'IPTG, 1 mM est acceptable comme "concentration suffisante" pour l'induction. je ne pense pas que

augmenter l'IPTG vous aiderait.

Ce que vous pouvez changer, c'est : 1) Induction OD- 0,8-1 au lieu de 0,6 2) quel tampon utilisez-vous pour tester vos échantillons-fractions 3) faites-vous

charger suffisamment de culture (protéines totales) sur gel d'agarose ? 4) prenez-vous de la DO en fin d'induction (vérifiez que les cellules sont

en passant, les JM109 ne sont pas des cellules d'expression (pour autant que je sache) qu'elles utilisent comme cellules de réplication pour les plasmides.

Je voudrais aussi faire Western pour vérifier. Mon problème est que je ne peux pas identifier la protéine induite.
Merci d'avoir clarifié la concentration en IPTG. J'apprécie vraiment votre contribution jusqu'à présent. Vous avez vraiment été très utile =)

1) J'ai changé l'induction aujourd'hui et il n'y a toujours pas de différence.
2) J'utilise le tampon de dissociation SDS-PAGE 1x sur le culot cellulaire lavé et charge 14 uL dans chaque puits.
3) Comme ci-dessus. Je normalise les cellules à celle de T = o h d'induction parce que mes aînés ont eu des problèmes pour répondre à la requête de teneur en protéines dans leurs Viva's. Ergo, mon superviseur m'a suggéré de le faire en référence à la production de « single cellule ».
4) Je prends OD toutes les heures afin de normaliser les cellules. Atteint la phase stationnaire sans croissance instable.

J'utilise JM109 pour comparer l'expression et le profil protéique à écrire dans ma thèse, la différence entre utiliser une cellule hôte de clonage et une cellule hôte d'expression pour approfondir ma discussion.

En ce qui concerne votre suggestion précédente, j'ai prélevé une DO et un échantillon à T=6 heures et demain matin à T=20 heures car le laboratoire est fermé entre les deux. Étant donné que l'ampicilline est instable, mon profil protéique serait-il correct ? Je me demande également, étant donné que l'insert est un codon optimisé pour l'expression, mon clone est plutôt inutile étant donné qu'il s'exprime à peine et s'il le fait après de si longues heures, n'est-ce pas ?

Ce que je voulais dire quand je dis que "Toutes les protéines ne peuvent pas être vues dans Coomasie", c'est qu'il est parfois difficile de voir et d'identifier

bande claire de protéine induite lorsque vous la comparez à la fraction non induite (en raison de protéines contaminantes ou simplement

frottis protéique). Comme je l'ai dit, le meilleur moyen d'être sûr, c'est de faire du western blot (n'oubliez pas le contrôle positif), je ne sais pas comment

Concernant la concentration d'IPTG, 1 mM est acceptable comme "concentration suffisante" pour l'induction. je ne pense pas que

augmenter l'IPTG vous aiderait.

Ce que vous pouvez changer, c'est : 1) Induction OD- 0,8-1 au lieu de 0,6 2) quel tampon utilisez-vous pour tester vos échantillons-fractions 3) faites-vous

charger suffisamment de culture (protéines totales) sur gel d'agarose ? 4) prenez-vous de la DO en fin d'induction (vérifiez que les cellules sont

en passant, les JM109 ne sont pas des cellules d'expression (pour autant que je sache) qu'elles utilisent comme cellules de réplication pour les plasmides.

Je voudrais aussi faire Western pour vérifier. Mon problème est que je ne peux pas identifier la protéine induite.
Merci pour la précision sur la concentration en IPTG. J'apprécie vraiment votre contribution jusqu'à présent. Vous avez vraiment été très utile =)

1) J'ai changé l'induction aujourd'hui et il n'y a toujours pas de différence.
2) J'utilise le tampon de dissociation SDS-PAGE 1x sur le culot cellulaire lavé et charge 14 uL dans chaque puits.
3) Comme ci-dessus. Je normalise les cellules à celle de T = o h d'induction parce que mes aînés ont eu des problèmes pour répondre à la requête de teneur en protéines dans leurs Viva's. Ergo, mon superviseur m'a suggéré de le faire en référence à la production de « single cellule ».
4) Je prends OD toutes les heures afin de normaliser les cellules. Atteint la phase stationnaire sans croissance instable.

J'utilise JM109 pour comparer l'expression et le profil protéique à écrire dans ma thèse, la différence entre utiliser une cellule hôte de clonage et une cellule hôte d'expression pour approfondir ma discussion.

En ce qui concerne votre suggestion précédente, j'ai prélevé une DO et un échantillon à T=6 heures et demain matin à T=20 heures car le laboratoire est fermé entre les deux. Étant donné que l'ampicilline est instable, mon profil protéique serait-il correct ? Je me demande également, étant donné que l'insert est un codon optimisé pour l'expression, mon clone est plutôt inutile étant donné qu'il s'exprime à peine et s'il le fait après de si longues heures, n'est-ce pas ?

MAIS, pourquoi la protéine est-elle plus grosse que ma bande attendue. Elle est d'environ 20 kDa alors que ma protéine devrait être de 18 kDa et que la protéine tag 6x His est de 0,84 kDa.
Est-ce que quelqu'un a une idée ?

Si vous demandez à quelqu'un, il vous dira que vous obtenez "toujours" votre protéine qui n'a pas la taille attendue (généralement elle est plus grande de quelques kDa)

vous pouvez exécuter simultanément deux échelles de protéines et vous voyez une différence dans leur fonctionnement

Félicitations pour votre expression, n'oubliez pas de chérir ce moment.

Si vous demandez à quelqu'un, il vous dira que vous obtenez "toujours" votre protéine qui n'a pas la taille attendue (généralement elle est plus grande de quelques kDa)

vous pouvez exécuter simultanément deux échelles de protéines et vous voyez une différence dans leur fonctionnement

Félicitations pour votre expression, n'oubliez pas de chérir ce moment.

D'accord. Heehee Merci encore beaucoup, Amtash.
Y a-t-il une raison particulière pour laquelle il exprime un peu plus grand ? E.coli a peu de modifications post-traductionnelles, sinon presque aucune, n'est-ce pas ?

C'est exactement ce que j'ai fait, j'ai utilisé un marqueur précoloré de 7 à 175 kDa avec mon marqueur de 2 à 212 kDa aujourd'hui. je vais vérifier et revoir..

Merci. Cela en vaut vraiment la peine car j'essaie depuis 8 mois de cloner et un mois d'exprimer et ce n'est que mon projet de recherche de premier cycle =s

J'ai joint la photo du gel ici où M est le marqueur de protéine NEB 2 - 212 kDa et la seconde à partir de la bande du bas est la bande de 20 kDa. les pistes 1 à 3 sont le lysat cellulaire des cellules M15 tandis que les restes sont les cellules JM109. Tous sont de l'heure 6 à 7 lors de l'induction


Comment fonctionnent X gal et IPTG ?

Cliquez pour lire la réponse détaillée. À cet égard, que fait X gal ?

X-Fille est un substrat chromogène largement utilisé pour la &beta-galactosidase. Il donne un précipité bleu foncé au site de l'activité enzymatique. X-Fille est utile pour de nombreuses applications histochimiques et de biologie moléculaire, y compris la détection de l'activité lacZ dans les cellules et les tissus.

On peut également se demander comment obtenir des plaques Iptg X gal ? (ou 2 µl X-Fille Solution (100 mg/ml) pour 1 ml de milieu). Ajouter 10 µl IPTG (100 mM) pour 1 ml de média pour une concentration finale de 1 mM. Ajouter l'antibiotique de dépistage de choix (ampicilline, kanamycine, carbénicilline, etc.). Verser assiettes et laisser refroidir à température ambiante (généralement au moins 30 minutes) avant utilisation.

A savoir aussi, quels sont les rôles de l'IPTG et du X gal lorsqu'une sélection bleu blanc est réalisée ?

Pour dépistage les clones contenant de l'ADN recombinant, un substrat chromogène connu sous le nom de X-fille est ajouté à la plaque de gélose. Isopropyl &beta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) est utilisé avec X-fille pour bleu-écran blanc. IPTG est un analogue non métabolisable du galactose qui induit l'expression du gène lacZ.

Combien ajoutent les plaques IPTG ?

Ajouter 40 µl 100mM IPTG et 120 µl X-Gal (20 mg/ml) à la surface de chaque assiette et répartis sur toute la surface.


RÉSULTATS ET DISCUSSION

Génération de Tn5P, un Tn5 transposon avec un promoteur tourné vers l'extérieur. Un outil génétique qui restait à développer pour V. fischeri était une méthode d'insertion aléatoire d'un promoteur inductible dans le génome. Pour développer cet outil, nous avons choisi d'utiliser le promoteur LacI-répressible A1/34 [1]. Ce promoteur contient deux sites de liaison LacI, un entre les sites -35 et -10 et un autre qui chevauche le site de démarrage de la transcription (Fig. ​ 1 1 ), et il a déjà été démontré qu'il fonctionnait comme un puissant promoteur dans V. fischeri lorsqu'il était inséré directement en amont d'un opéron [1]. Nous avons ensuite conçu le mini-Tn5 vecteur de livraison pEVS170 [31] pour contenir ce promoteur dans l'élément transposable dans une position tournée vers l'extérieur, l'insertion du promoteur a été confirmée par séquençage. Ce transposon sera appelé Tn5P, pour Tn5 plus Promoteur.

Construction du transposon Tn5P. A) Le Tn5 de pEVS170 contient un gène de résistance à l'érythromycine et une origine de réplication (flèche bleue et boîte) dans les extrémités Tn5 (rectangles rouges). pEVS170 a été modifié pour contenir un promoteur orienté vers l'extérieur, LacI-répressible/IPTG-inductible, PA1/34 (flèche verte) [1]. (B) La région du promoteur PA1/34 (italique) contient deux sites de liaison LacI (gras). La liaison de LacI à ces sites empêche l'accès aux sites -35 et -10 (vert), réprimant ainsi la transcription. L'extrémité Tn5 (rouge) contient un codon d'initiation (souligné).

Insertion du lacI gène dans V. fischeri et évaluation phénotypique. V. fischeri ne contient pas le lac opéron ou le lacI gène répresseur. Par conséquent, pour contrôler l'expression du promoteur dans Tn5P, il fallait introduire le lacI gène dans V. fischeri. Un emplacement traditionnellement utilisé pour insérer des gènes dans le V. fischeri le génome est le Tn7 site, qui se situe entre oui et glmS (Figure. ​ 2 2 ) [15, 33]. Cependant, étant donné que ce site est fortement utilisé pour la complémentation en une seule copie (par exemple., [34]), nous avons choisi de laisser ce site intact pour de futures manipulations. Au lieu de cela, nous avons ciblé l'insertion de lacI q , un allèle plus hautement transcrit de la lacI gène, à une région immédiatement adjacente au Tn7 site (entre oui et le Tn7 site) (fig. ​ 2 2 ). Le résultat était une souche, KV6576, qui contient lacI q , conserve un Tn intact7 site, et reste non marqué, permettant l'utilisation d'un marqueur de résistance aux antibiotiques dans les manipulations futures.

Avec la génération du lacI q -contenant V. fischeri, deux questions se sont posées : (i) Est-ce que le lacI q allèle fonctionnel (par exemple., contrôle-t-il l'expression des gènes dans V. fischeri?) et (ii) est le Tn7 site adjacent au site d'insertion du lacI q gène, toujours permissif pour les événements d'insertion ? Pour évaluer si le lacI q allèle dans KV6576 était fonctionnel, nous avons étudié la capacité de cette souche à influer sur l'expression d'un lac gène contrôlé par le promoteur. Plus précisément, nous avons introduit dans KV6576 un plasmide, pCLD46, qui contient le rscS gène entraîné par le lac promoteur, ou pVSV105, le vecteur vide à partir duquel pCLD46 a été dérivé. Lorsque pCLD46 est introduit dans le type sauvage V. fischeri, la protéine RscS est fabriquée et induit la formation de biofilm [13]. Un phénotype de biofilm qui peut être facilement évalué est la formation de colonies ridées. Nous avions prévu que, si le lacI q allèle dans KV6576 étaient fonctionnels, alors LacI réprimerait l'expression de rscS, ce qui entraîne une souche qui ne parvient pas à former des colonies ridées ou le fait après un certain délai. En effet, nous avons constaté que cette souche ne se plissait pas après 24 heures de croissance en l'absence d'IPTG (Fig. ​ 3 3 ). De plus, lorsque nous avons cultivé la souche en présence d'IPTG, qui devrait inactiver LacI, des colonies ridées se sont développées avec un timing impossible à distinguer du témoin (Fig. ​ 3 3 et données non présentées). Ces données indiquent que le LacI fonctionnel a été produit et était sensible à l'IPTG. Notons cependant que la répression des rscS l'expression de pCLD46 n'était pas complète : à des moments ultérieurs, la souche présentait un phénotype de rides modeste en l'absence d'IPTG (Fig. ​ 3 3 ). Nous attribuons ce résultat à l'incapacité de LacI exprimé à partir du chromosome de réprimer complètement un promoteur présent sur un plasmide multicopie.

lac formation de biofilm induite par le promoteur par WT et lacI exprimant des tensions. Cultures de type sauvage (ES114) et lacI q (KV6576) contenant soit le vecteur vide pVSV105 soit le plasmide d'expression RscS pCLD46 ont été cultivés dans du LBS contenant Cm. Les aliquotes ont été diluées à une DO600 de 0,2, déposé sur du milieu LBS-Cm contenant ou manquant 1,75 mM d'IPTG, et incubé à température ambiante. La formation de colonies ridées a été évaluée 20 et 50 h après l'inoculation.

Pour vérifier que le Tn7 site à proximité du site de lacI q l'insertion dans KV6576 restait manipulable, nous avons utilisé pEVS107, un Tn7 vecteur de livraison qui cible le Tn7 site [15], pour introduire une cassette de résistance Erm à cet endroit. pEVS107 contient une cassette de résistance Erm dans le Tn7 extrémités et une cassette de résistance à la kanamycine à l'extérieur. Les souches résistantes à l'érythromycine ont été facilement isolées et ont montré une sensibilité à la kanamycine, comme prévu lorsque le Tn7 cassettes insérées à la Tn7 site (données non présentées).

Identification de mutants de motilité. Nos données ci-dessus indiquent que le lacI gène inséré dans le chromosome est fonctionnel pour réprimer la transcription d'un lac gène contrôlé par le promoteur. Cependant, la question demeurait, est-ce que le lacI q transcription de contrôle d'allèle à partir du PA1/34 promoteur contenu dans Tn5P? Plus précisément, nous nous sommes demandé si nous pouvions induire ou réprimer V. fischeri gènes dans KV6576 contenant des insertions de Tn5P. Pour répondre à cette question, nous avons choisi d'évaluer un phénotype facilement évaluable, la motilité. V. fischeri contient un certain nombre de gènes connus [35-38] ou prédits [39] pour avoir un impact sur la motilité. Nous avons émis l'hypothèse que Tn5Les insertions de P en amont de ces gènes pourraient entraîner des souches à motilité inductible ou répressible. Nous avons donc introduit Tn5P dans KV6576 et évalué la motilité des mutants sur des plaques de gélose molle qui contenaient ou manquaient d'IPTG. À partir d'un criblage d'environ 2000 mutants, nous avons identifié environ 20 souches présentant des phénotypes de motilité potentiels dépendants de l'IPTG et confirmé les phénotypes d'un sous-ensemble de ces mutants. Parmi celles-ci, notre attention s'est portée sur deux souches aux phénotypes opposés (Fig. ​ 4 4 ). Une souche, KV7432, avait une motilité répressible par IPTG : elle présentait une motilité proche du type sauvage en l'absence d'IPTG mais une motilité considérablement diminuée en présence d'IPTG (Fig. ​ 4B 4B ). En revanche, l'IPTG n'a pas eu d'impact sur la motilité de la souche témoin (Fig. ​ 4A 4A ). La deuxième souche d'intérêt, KV7433, avait une motilité inductible par IPTG : elle était immobile en l'absence d'IPTG mais a retrouvé un phénotype de motilité de type sauvage en présence d'IPTG (Fig. ​ 4C 4C ). En raison de leurs phénotypes forts mais opposés, nous avons choisi ces deux souches pour une caractérisation supplémentaire.

Migration de souches mutantes sur gélose molle. KV6576 (UNE), KV7432 (B) et KV7433 (C) ont été cultivés pendant une nuit dans du LBS. Les cultures ont été diluées à une DO600 de 0,4 avant l'inoculation sur un milieu de motilité TB-SW contenant ou manquant de 1,75 mM d'IPTG. Les images illustrent la migration après 5,5 h d'incubation à 28ଌ.

We first identified the sites of insertion of Tn5P as described in Materials and Methods. The mutant with IPTG-repressible motility, KV7432, contained an insert within the intergenic region between VF_A0340 et VF_A0341, with the promoter of Tn5P oriented toward VF_A0341 (Figure. ​ 5A 5A ). In this orientation, the promoter appears positioned to drive expression of the nearby three-gene operon consisting of VF_A0342, VF_A0343, et VF_A0344. These three genes are predicted to encode proteins with GGDEF or EAL domains. These domains are found in diguanylate cyclase and phosphodiesterase proteins, which synthesize and degrade, respectively, the second messenger cyclic-di-GMP (c-di-GMP) [40]. High levels of cellular c-di-GMP inhibit motility in a variety of bacteria [41]. Therefore, we hypothesize that IPTG-mediated expression from the transposon promoter increases the levels of c-di-GMP in the cell and thus, inhibits motility. It also remains possible that expression from the Tn5P promoter decreases the expression of VF_A0341, which encodes a hypothetical protein with no conserved domains.

The location and orientation of the Tn5P insertions in two motility mutants. The insertion in KV7432 is located in the intergenic region between VF_A0340 et VF_A0341 with the A1/34 promoter oriented toward VF_A0341 (UNE). The insertion in KV7433 is located within the 5’ end of cheZ with the A1/34 promoter oriented toward cheA (B).

The mutant with IPTG-inducible motility, KV7433, carried the Tn5P insertion within the cheZ gene, with the transposon’s promoter oriented with the che operon (Fig. ​ 5B 5B ). In the absence of IPTG, the transposon insertion should interrupt transcription of cheZ as well as the downstream che genes which coordinate chemotaxis and are required for motility in V. fischeri [38]. Thus, it was not surprising that, in the absence of IPTG, this mutant exhibited a motility defect. Given that the Tn insertion was within the cheZ gene, however, it was unexpected that the addition of IPTG would restore near wild-type motility (Fig. ​ 4 4 ). Upon closer investigation of the insertion site, we noted that (1) the Tn is inserted near the beginning of cheZ, and (2) an ATG start codon within the Tn5P transposon end is in frame with the cheZ open reading frame (Fig. ​ 1B 1B and data not shown). Based on these observations, we hypothesize that expression from the transposon’s promoter and translation from the ATG within the transposon end results in the production of a hybrid CheZ protein with an altered N-terminus that is functional to promote motility.

Assessment of IPTG Induction. Our previous experiments used a single concentration of IPTG, 1.75 mM, to induce transcription from the Tn5P promoter. However, it was unclear whether this high amount of IPTG was necessary to obtain full repression/induction of motility by our strains. Thus, to determine the sensitivity of the Tn5P promoter to IPTG, we assessed the mutants’ motility phenotypes in the presence of a range of IPTG concentrations. KV7433 exhibited a dose-dependent increase in motility within a wide range of IPTG concentrations between 3.5 µM and 175 µM IPTG that was not further increased with additional IPTG (Fig. ​ 6 6 ). The other mutant, KV7432, similarly exhibited a dose-dependent change. In this case, the impact on motility required higher IPTG concentrations, above 35 µM at the highest amount tested, 1.75 mM, motility was not fully repressed (Fig. ​ 6 6 ). These data further support our conclusion that expression from the Tn5P promoter is induced by the addition of IPTG. Additionally, because we obtained different ranges of IPTG addition required for a transition from the motile to non-motile phenotype in the two strains, we conclude that it may be necessary to experimentally determine the optimal expression of a particular gene obtained using this experimental set-up (lacI q /Tn5P) by titrating the concentration of IPTG in the medium against the phenotype being tested.

Dependence of mutant motility phenotypes on IPTG. Motility mutants KV7432 and KV7433 were grown at 28ଌ in TB-SW motility medium containing the indicated concentrations of IPTG. The average diameter of migration of triplicate samples after 5 hours is shown. Standard deviation is indicated by error bars. Error bars smaller than the plotted points are occluded by the points and not visible.


IPTG (dioxane free)

IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) induces the transcription of genes from the lac et tac operons in bacteria, notably the hydrolase enzyme beta-galactosidase (ß-Gal). Once expressed, ß-Gal hydrolyzes beta-galactoside and lactose sugars into monosaccharides. IPTG is commonly used in the beta-galactosidase assay, wherein cells transfected with vector carrying the E. coli-derived lacZ gene, which encodes ß-Gal, are lysed and analyzed via the reaction substrate O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG). The ONPG substrate used in the beta-galactosidase assay turns yellow upon cleavage by ß-Gal, allowing quantitation of the transfected ß-Gal in cells and its use as a transfection control.

IPTG (isopropyl beta- D -1-thiogalactopyranoside) induces the transcription of genes from the lac et tac operons in bacteria, notably the hydrolase enzyme beta-galactosidase (ß-Gal). Once expressed, ß-Gal hydrolyzes beta-galactoside and lactose sugars into monosaccharides. IPTG is commonly used in the beta-galactosidase assay, wherein cells transfected with vector carrying the E. coli-derived lacZ gene, which encodes ß-Gal, are lysed and analyzed via the reaction substrate O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG). The ONPG substrate used in the beta-galactosidase assay turns yellow upon cleavage by ß-Gal, allowing quantitation of the transfected ß-Gal in cells and its use as a transfection control.

IPTG is also commonly used in blue/white screening experiments to determine the presence or absence of bacterial recombinant vectors following transformation. If the insert of interest is cloned into the vector's lacZ gene, it disrupts ß-Gal and prevents its expression. Bacterial colonies are grown on media containing X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-D-galactopyranoside), a substrate for ß-Gal that turns into an insoluble blue product upon being cleaved by the enzyme. Without ß-Gal, bacterial colonies exposed to X-gal cannot process the substrate and remain white, evidence that they are transformed with recombinant vector and not non-recombinant vector. These white bacterial colonies can be selected for subsequent recombinant vector amplification.

Many regulatory elements of the lac operon are used in inducible recombinant protein systems IPTG is an effective inducer when used in the concentration range of 100 micromolar to 1.5 millimolar. Inducer concentration depends on the required strength of induction as well as the cell or plasmid genotype for example, if the organism genotype includes lacI q , a mutation that results in the overproduction of the lac repressor, then a higher concentration of IPTG may be necessary.


IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside), Dioxane-Free ≥ 99% (HPLC), ≤ 0.1% Dioxane, Crystalline Powder, Non-Ionic, Molecular Biology Grade

IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) is a non-metabolizable analog of galactose that is commonly used as a molecular biology reagent during cloning procedures that require induction of β-galactosidase activity. IPTG mimics the lactose metabolite allolactose, which triggers transcription of the lac operon by inactivation of the tetrameric lacl repressor by allosterically altering its conformation which prompts the synthesis of β-galactosidase, a hydrolase enzyme that catalyzes the hydrolysis of β-galactosides into monosaccharides. It is utilized in sync with X-Gal or Bluo-Gal for the purpose of blue-white screening of recombinant bacterial colonies that induce expression of the lac operon in E. coli and also Magenta-Gal for red-white colony screening of bacterial colonies. Allolactose is hydrolyzable by β-galactosidase, but cannot hydrolyze IPTG due to the chemical bond formed with the sulfur atom and as a result it's concentration remains constant during experimentation.

Uptake by E. coli may be independent of lactose permease depending on the concentration of IPTG as there are other transport pathways. At high concentrations which are typically established for protein induction, IPTG enters the cell independent of lactose permease while at low concentrations IPTG enters the cell via lactose permease. Though different concentrations may be utilized depending on the specific use case, IPTG is commonly used with a final concentration ranging from 100 uM - 3 mM. We recommend preparing a stock solution by dissolving IPTG in water and then utilizing a 0.22 um (micron) sterile filter to prepare a 0.1 M IPTG stock solution. The final concentration of IPTG for use in indicator plates should be 0.2 mM. The required induction strength and cell genotype may serve as a key factors in determining the final concentration. IPTG is commonly utilized for its induction efficacy associated with protein expression where a protein of interest is encoded downstream in association with the IPTG and subsequently induced in cell culture which can then be lysed and the resulting protein purified via His-Tag or FST purification systems for proteins with ligand tags. IPTG also has widespread use in blue-white and red-white screening of bacterial colonies.

Redoxica's IPTG is manufactured with high quality materials, the latest instrumentation and manufacturing best practices to ensure an ultrahigh purity end product with reliability and reproducibility at the center of our quality assurance processes. Redoxica's IPTG is manufactured synthetically, from non-animal origin, dioxane-free.

Caractéristiques

Unit of Measure g
Shelf Life 60 MONTHS
InChI Key BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N
Empirical Formula C9H18O5S
Molecular Weight 238.3
CAS# 367-93-1
Functionality Inducer
Apparence White to off-white, powder
Odor Odorless
Former Solid, fine crystalline powder
Classe Molecular Biology Grade
L'eau ≤ 2.00 %
Melting Point (MP) 121°C
La source Synthetic, Animal-Free
Pureté ≥ 99% (HPLC)
MDL Number MFCD00063273
PubChem CID 656894
Suitability Suitable for recombinant protein expression and analysis of bacterial induction behavior.
EC Number 206-703-0
UNII X73VV2246B
Isomeric SMILES CC(C)S[[email protected]]1[[email protected]@H]([[email protected]]([[email protected]]([[email protected]](O1)CO)O)O)O
Canonical SMILES CC(C)SC1C(C(C(C(O1)CO)O)O)O
Formulation 1S/C9H18O5S/c1-4(2)15-9-8(13)7(12)6(11)5(3-10)14-9/h4-13H,3H2,1-2H3/t5-,6+,7+,8-,9+/m1/s1
Ingrédients (2R,3R,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol
Microbial Sterility Test -1.26
0 Oui
1 115 A2
2 AAADceBwOABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAkAAAAAAAAAAAAAAAAGgQACAAACBSkwAKCAAAABggAAAAAAAAAAAAAABAAAAAAAAABEAIgAAACQAAFAAAjAAHAYAQAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA==
3 L'eau
4 4631
5 Dioxane (≤ 0.1%)
6 Clear, colorless
Synonymes IPTG, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Isopropyl β-D-thiogalactoside, 1-Thio-beta-D-galactopyranoside Isopropyl, Isopropyl 1 Thio beta D galactopyranoside, Isopropyl 1-Thio-beta-D-galactopyranoside, Isopropyl Thiogalactoside, Thiogalactoside Isopropyl,

Q. How much is shipping and handling? A. US customers receive free ground shipping! If you are located outside of the United States, shipping and handling costs will vary based on location and order size. Additional customs/duties/VAT charges may be incurred for international orders.

Q. How do I place an order? A. All Redoxica products are fulfilled by our exclusive global distribution partner, Labscoop. You can place an order via Labscoop.com, submit your PO by email to [email protected], by fax at 1.800.316.3081 or by phone at 1.800.316.3081.

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Voir la vidéo: The Lac operon. Regulation of gene expression (Septembre 2022).


Commentaires:

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