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Ensemble de données d'images microscopiques avant et après coloration ?

Ensemble de données d'images microscopiques avant et après coloration ?


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Je suis à la recherche d'un ensemble de données librement distribué d'images microscopiques. J'espère trouver un ensemble de données qui contiendrait des images histologiques avant et après coloration (par exemple H&E ou un autre standard, de préférence). J'ai cherché dans diverses bases de données, mais je ne trouve pas le bon ensemble. J'espère que la taille de l'échantillon sera d'au moins 100. Suggestions ?


Virtual fly brain (http://www.virtualflybrain.org/site/stacks/index.htm) est une excellente base de données de fly (Drosophile) des sections du cerveau, qui peuvent être traitées électroniquement/annotées/surlignées à la volée pour montrer différentes zones du cerveau de la mouche en superposition sur les images originales.

Alternativement, vous pouvez utiliser BrainTrap (http://fruitfly.inf.ed.ac.uk/braintrap/) pour l'expression de protéines chez la mouche (Drosophile) cerveau en utilisant des sections de cerveau. Une autre base de données qui a des taches d'argent de Drosophile sections du cerveau est la base de données flybrain (http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/). Cette base de données contient également des modèles 3D de différentes structures cérébrales de mouches et bien plus encore !

Je suis sûr qu'il existe de nombreuses bases de données similaires, mais ce sont celles que je connaissais, qui sont largement utilisées dans le Drosophile communauté.


Coloration d'échantillons microscopiques

À l'état naturel, la plupart des cellules et des micro-organismes que nous observons au microscope manquent de couleur et de contraste. Cela rend difficile, voire impossible, de détecter des structures cellulaires importantes et leurs caractéristiques distinctives sans traiter artificiellement les spécimens. Nous avons déjà fait allusion à certaines techniques impliquant des taches et des colorants fluorescents, et dans cette section, nous discuterons plus en détail des techniques spécifiques pour la préparation des échantillons. En effet, de nombreuses méthodes ont été développées pour identifier des microbes spécifiques, des structures cellulaires, des séquences d'ADN ou des indicateurs d'infection dans des échantillons de tissus, au microscope. Ici, nous nous concentrerons sur les techniques les plus pertinentes sur le plan clinique.


Définition bleu coton lactophénol

La solution de bleu de lactophénol ou bleu de coton lactophénol est un milieu de montage humide et un agent de coloration qui est utilisé pour la préparation de lames microscopiques de champignons pour examen. Les éléments fongiques sont colorés en bleu intense.

Vous pensez peut-être, pourquoi devrions-nous apprendre cette technique ou quel est le but de cette technique.

Bien, c'est assez simple.

Les champignons sont un type d'organisme eucaryote et se divisent en deux groupes principaux qui sont les levures et les moisissures. Ils contiennent de la chitine sur leur paroi cellulaire. Ils ont une structure microscopique et c'est pourquoi nous ne pouvons pas les voir à l'œil nu. On peut les voir au microscope en les colorant avec des colorants appropriés.

Ces cellules fongiques sont utiles ainsi que nocives pour les êtres humains car elles produisent de nombreux antibiotiques, produits naturels ainsi qu'utilisés dans le processus de fermentation industrielle. Les cellules fongiques sont nocives dans le sens où elles provoquent des maladies humaines, produisent des substances toxiques et nuisent à des cultures importantes.

Il est très important d'examiner les espèces fongiques afin de pouvoir les contrôler ou de produire des médicaments contre les infections fongiques. Avant d'examiner les cellules fongiques au microscope, nous devons les colorer, ce qui est une étape importante.

La coloration des cellules fongiques peut être réalisée par ce Lactophénol Coton Bleu. Voici quelques exemples de champignons Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Candida, Mucor etc. Ici, nous allons colorer les cellules fongiques à l'aide de la méthode au bleu de coton Lactophénol. Cette technique de coloration est également appelée montage de champignon.

Bien qu'il existe de nombreux critères pour identifier les moisissures tels que les caractéristiques culturelles, la tolérance à la température, les profils nutritionnels et divers tests biochimiques, les schémas de classification modernes mettent l'accent sur les caractéristiques morphologiques microscopiques qui sont stables et présentent une variation minimale. L'identification définitive des moisissures est basée sur la forme, le mode de production et la disposition des spores (ontogenèse des conidies).


Solutions de microscopie pour l'histologie et l'histopathologie

La pathologie, l'histopathologie ou l'histologie vise à étudier la manifestation de la maladie par l'examen microscopique de la morphologie des tissus. En pathologie, l'échantillon à examiner au microscope est généralement le résultat d'une intervention chirurgicale, d'une biopsie ou d'une autopsie après fixation, nettoyage/enrobage et sectionnement de l'échantillon de tissu. Alternativement, le traitement des coupes congelées avec un cryostat est effectué lorsque des résultats rapides sont requis (par exemple pendant une intervention chirurgicale) ou que la fixation serait préjudiciable aux structures cibles telles que les lipides ou certains antigènes. Les coupes de tissus après fixation et enrobage de cire sont généralement découpées en tranches minces de deux à cinq microns avec un microtome avant coloration et transférées sur une lame de verre pour examen au microscope optique. Les spécimens typiques en pathologie sont le côlon, le rein, le pancréas, le col de l'utérus, le poumon, le sein, la prostate ou le tissu conjonctif.

Alors que diverses procédures de coloration pour les tissus humains/animaux et végétaux ont été développées dès le 17ème siècle, c'est le médecin allemand Rudolf Virchow qui est considéré comme le père de l'histopathologie moderne. Virchow a réalisé le potentiel des nouvelles techniques de microscope émergentes du XIXe siècle pour ses recherches révolutionnaires, a publié une grande quantité d'écrits scientifiques et a créé une impressionnante collection de milliers de lames d'échantillons histopathologiques, jetant ainsi les bases de l'histologie moderne et de la recherche sur le cancer.

La préparation des lames histologiques commence par la fixation de l'échantillon de tissu. Il s'agit d'une étape cruciale dans la préparation des tissus, et son but est d'empêcher l'autolyse et la putréfaction des tissus. Pour de meilleurs résultats, les échantillons de tissus biologiques doivent être transférés dans un fixateur immédiatement après le prélèvement, généralement dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 24 à 48 heures. Après la fixation, les échantillons sont coupés à l'aide d'un scalpel pour leur permettre de s'insérer dans une cassette de tissus étiquetée de manière appropriée qui est stockée dans du formol jusqu'au début du traitement.

La première étape du traitement est la déshydratation, qui consiste à immerger votre échantillon dans des concentrations croissantes d'alcool pour éliminer l'eau et le formol des tissus. La compensation est l'étape suivante, dans laquelle un solvant organique tel que le xylène est utilisé pour éliminer l'alcool et permettre l'infiltration avec de la cire de paraffine. L'enrobage est l'étape finale, où les échantillons sont infiltrés avec l'agent d'enrobage - généralement de la cire de paraffine qui fournit une matrice de support qui permet une coupe très fine. Un microtome est utilisé pour découper des sections de tissu extrêmement fines du bloc sous la forme d'un ruban, après coloration histochimique (généralement à l'hématoxyline et à l'éosine - « coloration HE ») pour fournir un contraste aux sections de tissu, rendant les structures tissulaires plus visibles et plus faciles à évaluer . Dans certains cas, des colorations immunohistochimiques (IHC), telles que HER2 ou Ki-67, sont nécessaires pour une analyse plus approfondie.


3. Préparation de la grille

Une fois que l'échantillon est prêt, il doit être préparé pour l'imagerie par EM. Pour imager avec des électrons, un microscope est maintenu sous un vide poussé, dans lequel les spécimens biologiques hydratés se déshydrateraient rapidement. Ainsi, pour imager un spécimen biologique, il doit être fixé, de préférence dans un état natif (ou natif). Une autre considération est l'épaisseur de l'échantillon. Dans certains cas, l'échantillon peut être trop épais pour que les électrons soient transmis, une condition préalable à la transmission EM, et il peut donc être nécessaire de traiter l'échantillon pour le rendre plus fin. Le choix de la technique de préparation est finalement déterminé par la nature de l'échantillon et la résolution requise pour l'aperçu biologique visé, mais les méthodes courantes incluent la coloration négative, l'inclusion/le découpage en plastique et la vitrification.

Les grilles EM mesurent traditionnellement 3,05 mm de diamètre et sont constituées d'un maillage de métal tel que le cuivre, l'or, le nickel, le molybdène ou le rhodium. Les grilles en cuivre sont les plus couramment utilisées, mais les supports en or sont de plus en plus courants, en particulier lorsque les cellules doivent être cultivées directement sur la grille, car elles ne sont pas toxiques pour les cellules. Le treillis métallique soutient le film sur le dessus. La taille du maillage, ou le nombre de carrés sur la grille, est défini comme le nombre de carrés dans un pouce. Par exemple, une grille de 200 mailles a 20 carrés dans chaque direction et une maille de 300 30 carrés. Les grilles de maille 200� sont les plus couramment utilisées pour la cryo-EM. Sur le support métallique, un film de support est déposé, différents films de support sont utilisés à des fins différentes (Section 3.3). Des mailles plus fines offrent un meilleur support pour le film, mais lorsque la grille est inclinée, les barres peuvent bloquer le faisceau. Par conséquent, les grilles de 200 mailles sont le plus souvent utilisées pour la collecte de données de séries d'inclinaison.

3.1. Coloration négative

Utilisation typique : Le contraste élevé et la vitesse de préparation de la grille des échantillons colorés négatifs le rendent idéal pour évaluer la pureté, la concentration, l'hétérogénéité et la flexibilité conformationnelle des échantillons. Les reconstructions 3D basse résolution à partir de données colorées peuvent également fournir des modèles de départ pour des études cryo-EM à plus haute résolution.

Avantages : Grande vitesse de préparation des échantillons et bon contraste des échantillons. De plus, il est possible de marquer avec des anticorps ou de l'or pour faciliter les études fonctionnelles et déterminer la stoechiométrie. La grille peut être facilement conservée pendant de nombreuses années et réimagée.

Inconvénients : Structures limitées à une résolution modeste (∼㸠 Å), topologie de surface uniquement, possibilité de colorer des artefacts, incompatible avec certains tampons et/ou réactifs.

La coloration négative est une méthode courante pour examiner un échantillon, en particulier des complexes macromoléculaires, à température ambiante. De nombreuses variantes de la technique de coloration négative ont été documentées depuis la fin des années 1950, en utilisant plusieurs colorations différentes aux métaux lourds [18]. En règle générale, les échantillons sont adsorbés sur un film de support de carbone continu mince (� nm) qui a été rendu hydrophile (Section 3.3). Il est ensuite coloré avec une solution de sel de métal lourd, généralement 1𠄲% (w/v) d'acétate d'uranyle ou de formiate d'uranyle et tamponné pour assurer une fine couche de tache, sans qu'aucune tache ne migre vers l'arrière de la grille. Certains composants tampons courants (tableau 1) sont connus pour affecter négativement la qualité de la coloration. Cependant, une grande dilution d'un échantillon concentré avec un tampon compatible immédiatement avant l'application sur la grille est le moyen le plus simple d'améliorer cela. Si cela n'est pas possible, le lavage de la grille avant la coloration est également une option. Le processus de coloration déshydrate rapidement l'échantillon et l'enveloppe de colorant (lorsque l'échantillon est visualisé par l'absence de tache, une coloration négative se produit lorsque l'échantillon lui-même se colore, une coloration positive se produit) (Fig. 2). La couche résultante d'atomes de métaux lourds génère un contraste d'amplitude et un rapport signal sur bruit (SNR) relativement élevé (la formation d'images en MET a été examinée dans [12]). La profondeur de tache correcte doit être atteinte pour une imagerie optimale, les informations étant perdues lorsque la tache est trop profonde ou trop peu profonde. La déshydratation de l'échantillon et sa déformation lors de l'adsorption sont des inconvénients de la préparation d'échantillons de coloration négative. De plus, la résolution des images colorées est limitée par la taille des grains de la tache, qui détermine dans quelle mesure l'enveloppe de la tache reflète la structure de l'objet [19]. L'utilisation d'un film de support de carbone continu peut entraîner des échantillons adoptant une orientation préférée sur la grille, ce qui complique la détermination de la structure 3D en raison d'un manque de vues. Malgré ces problèmes, les échantillons colorés négatifs peuvent générer des données 3D et fournir des informations biologiques inestimables [20], [21]. Par exemple, la coloration négative peut être utilisée pour élucider la liaison des inhibiteurs de petites molécules en quelques semaines [22], évaluer les changements conformationnels [23], [24], la stabilité complexe [25] et la stoechiométrie/position des sous-unités [26], [27]. Le processus de coloration négative a été examiné en détail dans [28].

Coloration positive et négative à l'aide de sels de métaux lourds. En coloration négative (A), la coloration enveloppe entièrement le complexe macromoléculaire sur la micrographie, le complexe apparaît en blanc sur un fond sombre. La coloration positive (B) entraîne une petite quantité de tache formant une fine enveloppe autour de la molécule, ce qui signifie que l'échantillon apparaît sombre sur un fond clair.

La coloration négative peut également être combinée à la vitrification (section 3.2), dans une technique de préparation d'échantillons connue sous le nom de coloration cryo-négative. Cette méthode combine le contraste élevé de l'utilisation d'un colorant de métal lourd avec les effets protecteurs de la conservation cryogénique (Examiné dans [29]).

3.2. Vitrification

Les techniques de préparation d'échantillons telles que la coloration et l'enrobage plastique impliquent la déshydratation des échantillons biologiques, ce qui les élimine fondamentalement de leur environnement aqueux natif. La cryo-immobilisation préserve cet environnement aqueux, tout en améliorant les dommages dus aux radiations [30]. L'imagerie d'échantillons cryogéniquement immobilisés par EM est connue sous le nom de cryo-EM. L'échantillon doit être congelé extrêmement rapidement, à une vitesse de � 6  ଌ/s, de sorte que l'eau dans et autour de l'échantillon soit fixée dans un état vitreux [31]. Si la congélation se produit trop lentement ou si l'échantillon est ensuite réchauffé au-dessus de � ଌ, la température à laquelle l'eau se dévitrifie [31], de la glace cristalline se forme. D'après notre expérience, chauffer l'échantillon plus que ∼� ଌ peut donner une glace de mauvaise qualité. La contamination par la glace compromet l'intégrité structurelle de l'échantillon, car les cristaux retirent les molécules d'eau des coquilles d'hydratation de l'échantillon ou de l'échantillon lui-même (Fig. 3). La formation de glace cristalline dégrade également la qualité de l'image en diffractant les électrons. Une contamination peut également se produire pendant le processus de congélation, telle que la glace hexagonale, qui peut être réduite en travaillant dans des environnements à humidité contrôlée et en minimisant la contamination de la glace dans l'azote liquide.

Exemples de glace vitreuse et non vitreuse. A) Glace vitreuse vide (barre d'échelle 50 nm). B) Glace hexagonale (barre d'échelle 400 nm). C) Grand cristal de glace (flèche blanche) (barre d'échelle 400 nm). D) Contamination probable par l'éthane (barre d'échelle 200 nm).

Bien que la cryo-EM soit en développement depuis les années 1970, le grand nombre de structures à haute résolution déposées au cours des deux dernières années a suscité un intérêt accru pour la technique [32], [33], [34], [35], [ 36]. Ici, les méthodes de cryo-immobilisation sont discutées.

3.2.1. Congélation plongeante

Utilisation typique : une large gamme d'échantillons, des petites macromolécules (� kDa) aux cellules eucaryotes entières, peuvent être vitrifiés et imagés par cryo-EM.

Avantages : L'échantillon est visualisé dans un état natif. Le traitement des données peut générer des informations structurelles 3D haute résolution.

Inconvénients : Les échantillons biologiques doivent être imagés avec de faibles doses d'électrons pour éviter les dommages causés par le rayonnement entraînant un faible contraste. Il est parfois non trivial d'optimiser la distribution de l'échantillon et l'épaisseur de la glace.

Pour les échantillons minces tels que les suspensions de macromolécules, les cristaux 2D ou très petits 3D, les petites cellules et le bord mince des cellules plus grandes, la cryo-immobilisation peut être réalisée par transfert pour générer un mince film de liquide contenant l'échantillon, puis congélation rapide en le plongeant dans un cryogène ( Fig. 4 ). Les cryogènes les plus utilisés sont l'éthane liquide ou le propane, refroidis par de l'azote liquide [37]. Les échantillons minces de congélation en plongée sont utilisés pour une large gamme d'échantillons. Pour chacun, la couche de glace doit être aussi mince que possible sans déformer l'échantillon et tout en incorporant complètement la particule, afin de maximiser le contraste de l'échantillon. L'absence d'enrobage complet de l'échantillon peut entraîner des dommages préférentiels par rayonnement de l'échantillon à l'extérieur de la couche de glace. Le buvardage et la plongée peuvent être réalisés avec des dispositifs simples, souvent construits en interne [38]. Cependant, ces appareils ont souvent du mal à fournir des résultats cohérents au sein et entre les lots de grilles préparés. Plusieurs instruments commerciaux sont disponibles qui permettent d'obtenir des résultats plus reproductibles, y compris les modèles de FEI, Leica et Gatan (tableau 2). Les appareils de congélation disponibles dans le commerce offrent différentes caractéristiques qui peuvent être avantageuses lorsque l'on travaille avec certains échantillons. Par exemple, le buvardage simple face peut être avantageux lors de la préparation de grilles de cellules adhérentes. Le buvardage double face peut entraîner le retrait de certaines cellules de la grille et sur le papier buvard. Le buvardage simple face peut être effectué à partir du côté arrière de la grille, où les cellules n'adhèrent pas, en contournant les problèmes causés par le buvardage double face. De plus, certains complexes macromoléculaires peuvent bénéficier d'un contrôle de température et/ou d'humidité faible (υ ଌ) dans la chambre de congélation. Ces considérations peuvent influencer le choix de l'appareil de congélation, lorsqu'un choix est disponible.

Imagerie multi-échelle par cryo-EM. A) Cellules eucaryotes (barre d'échelle 6 μm). B) Cellules procaryotes (barre d'échelle 0.5 μm). C) Organites isolés, dans ce cas des microsomes (barre d'échelle 200 nm). D) Liposomes synthétiques (barre d'échelle 100 nm) E) Virus (barre d'échelle 50 nm). F) Complexes macromoléculaires (barre d'échelle 25 nm).

Tableau 2

Comparaison des dispositifs de surgélation en plongée disponibles dans le commerce.

ModèleContrôle de l'humidité dans la chambreContrôle de la température dans la chambreContrôle automatique de la température de l'éthaneModalité de buvardageInformation additionnelle
Leica EM GPSimple faceStéréomicroscope en option pour surveiller le buvardage
Gatan Cryo-plongée 3
(Chambre fixée à 98%)

(Fonctionne à température ambiante)
Simple et double faceChambre d'humidité amovible
FEI VirobotDouble faceActuellement, le dispositif de congélation par plongée le plus courant.

Dans de nombreuses installations, de larges gammes d'échantillons sont préparées à l'aide du même instrument de plongée-congélation. Des précautions doivent être prises pour décontaminer l'appareil de manière appropriée après utilisation, par exemple avec de l'éthanol à 70 % (v/v). Pour les échantillons qui représentent un risque biologique, les congélateurs plongeants peuvent être placés dans une armoire de sécurité biologique. Cela protège l'utilisateur contre les aérosols et permet la fumigation de l'appareil, améliorant ainsi la biosécurité.

3.2.2. Congélation haute pression

Utilisation typique : échantillons épais tels que la région nucléaire des cellules eucaryotes, des coupes de tissus et des organismes entiers tels que Caenorhabditis elegans qui ne peuvent pas être préparés par congélation par plongée.

Avantages : L'échantillon est conservé dans un état de type natif. Peut générer des informations structurelles 3D haute résolution.

Inconvénients : Pour être visualisé par MET, c'est-à-dire devenir transparent aux électrons, l'échantillon doit être sectionné ou aminci par broyage par faisceau d'ions focalisé (FIB) après congélation. Il est possible de générer des artefacts dans ce processus, et cela peut être techniquement difficile.

Alors que les échantillons plus minces que le bord d'une grande cellule peuvent être vitrifiés par congélation par plongée, des échantillons plus épais (ρ μm) tels que les régions nucléaires et périnucléaires des cellules eucaryotes, ou des coupes de tissus sont susceptibles de subir une formation de glace cristalline. pendant la congélation en plongée. Pour ces échantillons, la congélation à haute pression (HPF) est une alternative efficace. HPF consiste à augmenter la pression de l'échantillon à �ꂺr tout en abaissant la température à l'aide d'azote liquide [39]. Pour les échantillons de 𾄀 μm d'épaisseur jusqu'à � μm d'épaisseur, ils peuvent être vitrifiés à l'aide de HPF, mais doivent ensuite être sectionnés pour être suffisamment minces pour la MET. Le sectionnement peut être effectué dans des conditions cryogéniques, ce qui permet la meilleure conservation de l'échantillon. Cette technique, connue sous le nom de cryo-microscopie électronique des coupes vitrées (CEMOVIS), utilise la cryo-ultramicrotomie avec un couteau en diamant pour produire des coupes de 40� nm d'épaisseur [40], [41], [42]. C'est une technique utile, capable d'imager des spécimens épais dans un état de type natif, mais elle est techniquement extrêmement difficile. Une approche alternative courante consiste à effectuer une substitution par congélation sur l'échantillon, ce qui permet une coupe et une imagerie à température ambiante [43], [44]. La substitution par congélation consiste à réchauffer progressivement l'échantillon et à remplacer l'eau par de l'acétone. L'échantillon peut ensuite être coloré, noyé dans de la résine et sectionné. La substitution par congélation introduit moins d'artefacts que l'enrobage plastique traditionnel, mais de petits cristaux de glace se forment, provoquant un réarrangement des structures cellulaires, et la coloration n'est pas uniforme, donc l'interprétation des images peut être difficile.

Une alternative au sectionnement est l'utilisation du fraisage FIB pour réduire l'épaisseur de l'éprouvette [45], [46]. Le broyage FIB est effectué sur des échantillons hydratés congelés dans un instrument à double faisceau EM/FIB [47]. Un faisceau focalisé d'ions est tramé sur la surface de l'échantillon, éliminant les atomes de surface dans un processus connu sous le nom de pulvérisation cathodique. Le microscope électronique à balayage (MEB) permet un contrôle simultané et non destructif du processus de broyage [47]. Les ions gallium sont couramment utilisés en raison de leur volatilité et de leur faible point de fusion [47]. Le faisceau d'ions est généré par une source d'ions de métal liquide et libéré par une électrode d'extraction. Des lentilles et des ouvertures électromagnétiques sont utilisées pour focaliser le faisceau d'ions et des déflecteurs pour contrôler le motif de broyage. Le fraisage FIB peut introduire des artefacts, car le matériau pulvérisé peut se redéposer sur la surface de l'échantillon, bien qu'un dispositif anti-contaminant refroidi et positionné de manière appropriée puisse réduire cela. Des vitesses de broyage différentielles peuvent également produire des stries ou des rideaux sur la surface, et un chauffage/dévitrification local peut également se produire. Cependant, des conditions ont été établies où les températures n'augmentent pas suffisamment pour que cela devienne un problème de routine [48]. Des mesures spécifiques peuvent être prises pour assurer une surface lisse pendant le fraisage, comme l'utilisation d'un système d'injection de gaz pour créer une couche de platine organométallique recouvrant l'échantillon, qui le protège de certains artefacts causés par une pulvérisation irrégulière pendant le fraisage [49]. Le broyage FIB peut être soit utilisé en conjonction avec l'imagerie par SEM, comme dans l'imagerie série face de bloc, soit l'échantillon broyé transféré vers un MET [45], [46]. Depuis la première expérience réussie de cryo-FIB en 2003 [50], des workflows ont été développés pour améliorer et optimiser la technique, notamment in situ préparation cryo-lamelle de cellules cultivées sur des grilles EM. La technologie cryo-FIB est encore en développement. Un développement particulièrement passionnant est la mise en œuvre de la microscopie optique corrélative en combinaison avec le broyage FIB [51].

3.3. Films de soutien

Une considération clé dans la préparation de la grille est le choix de la grille et du film de support. Pour la cryo-EM, des films de carbone perforés sont généralement utilisés, permettant d'imager l'échantillon dans de la glace suspendue entre les trous du film de support de carbone. Des films de carbone continus sont utilisés pour la coloration négative. Cependant, d'après notre expérience, les échantillons peuvent avoir des affinités très différentes pour les films de carbone. Les propriétés de surface du carbone peuvent être altérées par une variété de processus, y compris l'exposition au rayonnement UV, à la décharge luminescente, à la poly-l-lysine ou au traitement détergent [52], [53]. En cryo-EM, la modification des propriétés de charge du film de carbone peut modifier la partition de l'échantillon dans les trous, mais cela doit être optimisé pour chaque échantillon. Certains échantillons ont une très grande affinité pour le film de carbone, ces échantillons bénéficient parfois d'un film de carbone mince et continu en couche sur le film perforé. Une telle couche de carbone peut améliorer la distribution des particules, mais doit être fine (㰐 nm) pour éviter d'ajouter un bruit excessif aux images. De tels films de carbone minces peuvent également être extrêmement fragiles, il y a donc un compromis entre la stabilité et l'épaisseur du carbone. Les films de carbone amorphe perforés sont disponibles dans le commerce et peuvent consister en des réseaux réguliers de trous de taille égale, comme avec les grilles Quantifoil® et C-Flat®, ou irréguliers, comme dans le carbone lacé. Les grilles de film de carbone perforé avec un film de carbone continu ultramince (3𠄵 nm) peuvent également être achetées dans le commerce ou fabriquées en interne.

Les films de support en carbone amorphe sont largement utilisés, mais ne sont pas sans poser des problèmes. Ils peuvent être incohérents entre les lots, et la qualité du film de carbone amorphe peut se détériorer avec le temps. De plus, l'instabilité des films de carbone amorphe contribue au mouvement des particules induit par le faisceau, brouillant l'image de l'échantillon [54]. De nouveaux matériaux sont en cours de développement pour résoudre ces problèmes, notamment des films de support en or, des films de graphène et de carbure de silicone dopé, qui semblent tous réduire le mouvement des particules induit par le faisceau [55], [56], [57]. Les améliorations apportées aux films de support ont le potentiel d'augmenter considérablement la qualité de la collecte de données cryo-EM inclinées et non inclinées.


Structure de l'amibe

Comme mentionné, les amibes sont des eucaryotes, ce qui signifie simplement qu'elles ont une membrane cellulaire entourant leur cytoplasme et leur ADN qui est correctement emballé dans le noyau central.

Lorsqu'ils sont observés au microscope, ces aspects de l'organisme sont clairement visibles, en particulier lorsque l'échantillon est coloré.

Certains des autres organites visibles au microscope comprennent :

* En ce qui concerne leur structure, les amibes ressemblent beaucoup à des cellules d'animaux supérieurs comme celles des êtres humains.


Mesures et analyse des données

CellProfiler mesure un grand nombre de caractéristiques pour chaque cellule ou compartiment subcellulaire identifié, y compris la surface, la forme, l'intensité et la texture (chaque caractéristique est décrite dans le fichier de données supplémentaires 4). Cela inclut de nombreuses caractéristiques standard [39, 40], mais aussi des mesures complexes comme les caractéristiques de forme Zernike [41] et les caractéristiques de texture Haralick et Gabor [42-44], qui sont décrites en détail dans l'aide en ligne et le manuel. Il existe également des modules pour mesurer diverses caractéristiques (par exemple, l'intensité, la texture, la saturation, le flou, la zone occupée par une tache) d'une image dans son intégralité. Une limitation sévère de la plupart des logiciels commerciaux est l'incapacité de s'adapter à de nouvelles questions biologiques en calculant de nouvelles caractéristiques à partir de cellules identifiées [5]. En revanche, la conception modulaire et le code open source de CellProfiler permettent de mesurer rapidement de nouveaux phénotypes cellulaires selon les besoins.

Les mesures sont accessibles de plusieurs manières : en utilisant les outils de visualisation et de traçage intégrés de CellProfiler (Fichier de données supplémentaires 5) en exportant dans un format de feuille de calcul délimité par des tabulations qui peut être ouvert dans des programmes comme Microsoft Excel ou OpenOffice Calc en exportant dans un format qui peut être importé dans une base de données comme Oracle ou MySQL ou directement dans MATLAB.


Procédure

Pour la cellule de pelure d'oignon

  • Enlevez une petite section de peau d'oignon
  • Placer la pelure d'oignon au centre de la lame
  • Placez les deux gouttes d'eau sur la peau d'oignon. C'est ce qu'on appelle un "montage humide"
  • En commençant par un bord, abaissez doucement une lamelle sur la peau d'oignon
  • Tapotez doucement la lame avec un crayon pour éliminer les bulles d'air
  • Placez une goutte d'iode sur un bord de la lamelle. Touchez le bord opposé de la lamelle avec une serviette en papier pour dessiner la tache sous la lamelle
  • Placez la lame sur la scène à faible puissance. Utilisez le bouton de réglage grossier pour faire la mise au point
  • Tournez le nez à puissance moyenne. Utilisez le bouton de réglage fin pour effectuer la mise au point. Observez ce que vous voyez
  • Répétez l'étape 8, mais cette fois, passez à la puissance élevée et dessinez ce que vous voyez (utilisez un crayon)
  • Après avoir dessiné vos diagrammes, faites pivoter le nez à faible puissance. Retirez la lame et jetez le morceau d'oignon, et lavez la lame et la lamelle

Pour la cellule de la joue

  • Prenez un cure-dent propre et grattez doucement l'intérieur de votre joue
  • Préparez un support humide comme dans les étapes 2 à 6. Utilisez plutôt la solution de bleu de méthylène comme colorant

Mitose et méiose Partie B

Petra Vyplelová Miroslav Ovečka George Komis Jozef Šamaj , dans Méthodes en biologie cellulaire , 2018

4.4 Imagerie de réseaux de microtubules mitotiques végétaux avec le système Airyscan confocal à balayage ponctuel avec une résolution améliorée

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) équipée du système Airyscan représente une nouvelle application d'une approche d'imagerie à balayage ponctuel avec une résolution améliorée. Le système est équipé d'un détecteur 32 GaAsP offrant une sensibilité élevée et une capacité de collecte de lumière supérieure. Les échantillons peuvent être scannés avec le mode rapide permettant une résolution temporelle suffisante lors de l'acquisition spatiale et temporelle 3D. Alternativement, un mode haute résolution pourrait être utilisé permettant une résolution 3D améliorée pour l'acquisition d'un seul Z-piles. Compte tenu de ces améliorations techniques, nous avons utilisé la plate-forme de microscopie LSM880 Airyscan (Carl Zeiss Microscopy) pour la documentation de la progression mitotique dans les cellules du ktn1-2 mutant exprimant de manière stable le marqueur microtubulaire GFP-TUA6 (Komis et al., 2017). Défauts dans l'organisation des réseaux de microtubules mitotiques dans les cellules en division causés par une mutation dans le KATANINE1 gène ont été clairement documentés par comparaison avec le contrôle correspondant (Fig. 3).

3 . Analyse comparative des réseaux de microtubules au cours de la mitose et de la cytokinèse des cellules épidermiques du pétiole des feuilles chez Arabidopsis thaliana plantes transformées de manière stable avec un 35S::GFP:TUA6 construction entre des plantes de type sauvage et un mutant knock-out ktn1-2, déficiente en protéine de coupure des microtubules KATANIN 1 en utilisant la microscopie confocale à balayage laser équipée du système Airyscan. Organisation de réseaux de microtubules typiques pour des stades particuliers de division cellulaire dans les cellules de la plante de type sauvage (A, C et E) et le ktn1-2 mutants (B, D et F). (A et B) Rétrécissement de la bande de préprophase (PPB) à la fin de la phase G2 du cycle cellulaire (stade de préprophase). Notez la disposition unipolaire et désorganisée des microtubules PPB dans le ktn1-2 mutant (B). (C et D) Organisation du fuseau mitotique, ne montrant aucun changement structurel entre le contrôle et ktn1-2 cellules mutantes. (E et F) Organisation des microtubules phragmoplastes au cours de la cytokinèse. Par rapport au témoin (E), le phragmoplaste dans le ktn1-2 le mutant est de forme anormale (F). Barre d'échelle : 5 m.

Les graines de lignées transgéniques exprimant un marqueur microtubulaire approprié (GFP-TUA6) sont stérilisées en surface à l'aide d'éthanol à 70 % (v/v) pendant 2 min suivi d'hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) contenant 0,05 % (v/v) de Tween 20 pendant 8 minutes. Après lavage, les graines stériles sont étalées à la surface de milieu MS demi-force sans vitamines et avec 1% (p/v) de saccharose, pH ajusté à 5,7, solidifié avec du Phytagel à une concentration de 0,6% (p/v). Après stratification des graines à 4°C pendant 2 à 4 jours, elles sont cultivées en chambre de croissance à 22°C, 50% d'humidité et 16/8 h (lumière/obscurité) photopériode en position verticale pour permettre une croissance droite des racines sur la surface du milieu solidifié.

Tout d'abord, il est nécessaire de construire la chambre d'observation à l'aide d'une lame de verre et d'une lamelle espacée de parafilm ou de doubles bandes de ruban adhésif. Une goutte de milieu MS liquide à demi-force est placée au milieu de la lame et une plantule sélectionnée est transférée dans la goutte. L'échantillon est pris en sandwich entre la lame et la lamelle avec une distance stable assurant suffisamment d'espace pour les jeunes A. thaliana plante. La microchambre est scellée sur les côtés et les bords par des bandes de parafilm pour empêcher l'évaporation du milieu MS liquide à demi-force pendant l'imagerie time-lapse pendant plus de 1 h. Noter: Le transfert des plantes sélectionnées du milieu de culture à la lame de microscopie doit être effectué dans des conditions stériles dans la boîte à flux laminaire.

Epidermal petiole cells of young first true leaf are suitable for observation of cell division in the green part of A. thaliana les plantes. The most preferable plants are 6–7 days old for preparation of such sample. The plant must be entirely covered by the coverslip and young first true leaf must be positioned by abaxial (lower) leaf side parallel to the coverslip.

The example given here ( Fig. 3 ) was obtained using LSM880 with Airyscan (Carl Zeiss Microscopy). We used single-photon excitation with the 488 nm laser line and a 32 GaAsP detector for fluorescence detection. The superior light-collecting capacity of the Airyscan and the sensitivity of the GaAsP detector allowed setting laser power to a level not exceeding 2% of the range available. Observation of dividing cells was done with Plan-Apochromat 63 ×/1.4 NA oil immersion objective and data sets were analyzed with Zeiss Zen 2014 software (Blue Version).


Dataset of microscopic images before and after staining? - La biologie


This training process is to train the statistical color detection model based on visual selected color pixels. You can start training by selecting a Region of Interest (ROI) through a rectangular tool in imageJ and pressing Training button on main panel.

The left image is original DAB stained color image and the right image is the result image. Using the sliding bar presented in sub-panel (color Chooser), you can visually determine the reserved color pixels in the result image. Once all the desired color pixels of an image are reserved, you can record them by pressing Collection button in color Chooser panel. The model is then automatically calculated and created. In general, the training phase requires re-selecting the ROI on multiple training samples in order to obtain a wide range of shades of the target color. You can close the collected image and re-open a new one. When a new training image is added, the model is then re-calculated automatically based on the accumulated histograms.

At the end of collecting training samples, the created statistical model can be saved (Using Save Model button in color Chooser panel) and reused for subsequent detection. It is recommended to save the model as the .txt format. Please see those models we created in the Modelfolder. These model files are pre-defined color model for the detection of DAB stained brown color, brown color in elastin contained liver samples and Sirius Read (SR) stained pink color. Users can define their own models throung the Training step and put them in User Model folder.

By selecting those models or changing a new one, you can press the button Read User Model on the main panel to read them one by one. The Read Model button is set to read the default model H-DAB.txt for brown color detection.


Once you have read one color detection model (for example, the H-DAB. txt), simply press the Color button on the main panel. Then the tool will generate the detected result in a created new window.


For the nuclei segmentation and quantification, you can set those parameters before you press Nuclei button. The quantification consists of counting the positive nuclei and oval fitted nuclei segmentation. Instead, the contour is drawn at the edge of the detected positive nuclei. Unless customized parameters are set, this nuclei segmentation and quantification functions are automatically processed. Changing between the processes of Quantification to Segmentation, you can select the order through the drop-down menu.
In order to estimate the parameters for nuclei segmentation, you can use the square tool and ellipse tool in imageJ. The image on the left is fitted by a 44x44 square, and the image on the right is fitted by an ellipse that has 908 pixels inside. For the window size parameter, it is better to set as 25 pixels (half size of the window) which may cover the sizes of all nuclei. And the seed size, corresponding to the minimum size constraint, should be the half of small nucleus. In our dataset, the size of nuclei changes from 300 to 900 pixels, where we set 150 pixels as seed size.



Commentaires:

  1. Gildas

    Tout peut arriver, peut-être que votre blog augmentera dans la note Yandex pour un tel article. Voyons voir.

  2. Cawley

    pas très précis...

  3. Duff

    Aimerait dire à la vapeur des mots.

  4. Palt El

    C'est d'accord, votre idée tout simplement excellente

  5. Meztigor

    Je ne peux pas participer maintenant à la discussion - il n'y a pas de temps libre. Je serai libéré - j'exprimerai nécessairement l'opinion sur cette question.



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