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F7. Liens et références - Biologie

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F7. Liens et références

La réduction du SMN spécifique au muscle révèle une maladie indépendante des motoneurones dans les modèles d'amyotrophie spinale

2 Center for Motor Neuron Biology and Disease, Columbia University Medical Center, New York, New York, États-Unis.

3 Département des sciences biologiques, Université de Californie du Sud, Los Angeles, Californie, États-Unis.

4 Département de neurologie et

5 Département de pédiatrie, Columbia University Medical Center, New York, New York, États-Unis.

6 Département de pharmacologie et de physiologie, Centre médical de l'Université de Rochester, Rochester, New York, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Umrao R. Monani, P&S, Room 5-422, 630 W. 168th Street, New York, New York 10032, USA. Téléphone : 212.342.5132 Courriel : [email protected]

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1 Département de pathologie et biologie cellulaire et

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Publié le 10 février 2020 - Plus d'infos

La rareté de la protéine du motoneurone de survie (SMN) déclenche le trouble du motoneurone infantile souvent fatal, l'amyotrophie spinale (SMA). L'augmentation de la protéine est un moyen de traiter la SMA et a récemment conduit à l'approbation de la FDA d'un oligonucléotide améliorant le SMN administré par voie intrathécale actuellement utilisé. Nonobstant l'avènement de cette thérapie et d'autres pour la SMA, il n'est pas clair si la paralysie associée à la maladie dérive uniquement de motoneurones dysfonctionnels qui peuvent être efficacement ciblés par l'administration restreinte d'agents améliorant le SMN au système nerveux, ou découle de défauts plus larges. de l'unité motrice, plaidant pour une réplétion systémique du SMN. Nous avons étudié les effets contribuant à la maladie d'un faible SMN dans un organe périphérique pertinent - le muscle squelettique - en épuisant sélectivement la protéine dans ce seul tissu. Nous avons constaté que le muscle privé de SMN était profondément endommagé. Bien qu'un phénotype de la maladie ne soit pas immédiatement évident, de faibles niveaux persistants de la protéine ont finalement entraîné des défauts des fibres musculaires, des anomalies de la jonction neuromusculaire, des performances motrices compromises et une mort prématurée. Il est important de noter que la restauration du SMN après l'apparition d'une pathologie musculaire a inversé la maladie. Nos résultats fournissent la preuve la plus convaincante à ce jour d'un rôle contributif direct du muscle dans la SMA et soutiennent qu'une thérapie optimale pour la maladie doit être conçue pour traiter cet aspect de l'unité motrice dysfonctionnelle.

Mutations homozygotes dans la survie du motoneurone 1 (SMN1) entraînent une réduction des niveaux de la protéine SMN et déclenchent la maladie neuromusculaire infantile, l'amyotrophie spinale (SMA) ( 1 – 3 ). La perte complète de SMN est mortelle pour l'embryon (4). En effet, les patients atteints de SMA expriment invariablement la protéine résiduelle d'un SMN1 paralogue appelé SMN2. L'incapacité de SMN2 pour compenser SMN1 provient d'une transition silencieuse C→T dans l'exon 7 du paralogue. Le changement de base unique modifie l'efficacité avec laquelle l'exon 7 est épissé dans les transcrits SMN de telle sorte que SMN2 exprime principalement une isoforme SMNΔ7 (5, 6). L'ARNm de SMNΔ7 est abondamment exprimé. Cependant, la protéine tronquée correspondante est instable et dégradée (2, 3, 7). Pourtant, l'expression de faibles niveaux de la protéine FL-SMN de SMN2 est suffisant pour assurer le développement embryonnaire et les naissances vivantes. En revanche, le développement postnatal précoce, en particulier celui du système neuromusculaire, est profondément affecté en l'absence de SMN1. En conséquence, la plupart des patients atteints de SMA développent rapidement un phénotype paralytique dont les caractéristiques comprennent la perte de motoneurones spinaux et l'atrophie musculaire proximale (8). Compte tenu de la fonction de ménage de la protéine SMN dans l'orchestration de la cascade d'épissage (9), la perte sélective de motoneurones dans la SMA reste largement inexpliquée.

Bien que la plupart des patients atteints de SMA soient gravement touchés, il existe un éventail de phénotypes qui s'étend à une maladie vraiment bénigne. L'AMS légère est généralement associée à un plus grand nombre de SMN2 exemplaires (10, 11). En effet, dans un cas, un patient avec 8 SMN2 copies aurait été asymptomatique (12). L'effet modificateur de la maladie d'une augmentation SMN2 copies, et donc la protéine SMN, a par la suite été démontrée directement chez des souris modèles nulles pour le murin Smn mais abritant 8 exemplaires du SMN2 gène (13). Le phénotype WT de ces souris a fourni la première véritable justification du ciblage SMN2 augmenter la protéine SMN comme moyen de traitement. Les efforts pour mettre en œuvre cette stratégie ont été encore renforcés lorsqu'il a été démontré qu'un élément de régulation, l'ISS-N1, en aval de SMN2 l'exon 7 pourrait être efficacement ciblé pour augmenter les niveaux de FL-SMN (14, 15). Le résultat du traitement des souris modèles SMA gravement affectées avec des oligonucléotides à commutation d'épissage (SSO) qui ciblaient l'élément régulateur était remarquable. L'administration en temps opportun des niveaux thérapeutiques de SMN oligo-améliorés a restauré la fonction neuromusculaire et a considérablement prolongé la survie (16, 17). Le SSO utilisé pour cibler l'ISS-N1 et moduler SMN2 l'expression génique a finalement été développée dans le médicament thérapeutique SMA, Spinraza (18).

Malgré la promesse clinique de Spinraza, les questions sur son efficacité à long terme abondent (19, 20). Une préoccupation majeure découle des exigences spatiales pour la protéine SMN et de la manière dont le médicament est actuellement administré - par voie intrathécale. Une telle manière de traitement devrait entraîner une restauration robuste de la protéine SMN dans le tissu du SNC. Cependant, les organes périphériques, y compris les muscles, resteraient privés des effets salutaires potentiels des concentrations normales de protéines. Il est de plus en plus évident que les faibles niveaux de SMN ont des effets perturbateurs au-delà des motoneurones (21, 22). D'un intérêt particulier, en raison du phénotype SMA résolument neuromusculaire, est le potentiel de tels effets dans le muscle et leur contribution à la maladie globale. Des études visant à évaluer le rôle contributif du muscle dans l'AMS sont arrivées à des conclusions disparates (23 – 30). Ici, nous avons entrepris de résoudre l'incertitude de la manière la plus directe encore en caractérisant les conséquences de la maladie de priver sélectivement le muscle de SMN. En utilisant des souris modèles qui ont été sélectivement appauvries en protéine dans le muscle squelettique, mais néanmoins modifiées pour exprimer 1 ou 2 copies de la SMN2 gène — un génotype typique et sévère de la SMA — nous avons montré qu'un faible SMN dans ce tissu était profondément dommageable. Chez les animaux avec un seul SMN2 copie, l'apparition de la maladie était rapide, avec une survie médiane d'environ P21. En revanche, la maladie chez les animaux porteurs de 2 copies de la SMN2 Le gène est apparu tardivement, mais a néanmoins entraîné un large éventail de phénotypes musculaires, y compris des dommages morphologiques aux fibres musculaires et aux jonctions neuromusculaires (JNM), de mauvaises performances motrices et une incapacité à générer de manière optimale une force musculaire. Similaire à la maladie chez les mutants avec 1 copie de SMN2, ces défauts ont finalement raccourci la durée de vie à environ 13 mois. Malgré ces défauts, la restauration du SMN dans le muscle squelettique des souris symptomatiques s'est avérée bénéfique. Nous concluons que le muscle est un site cellulaire critique d'action de la protéine SMN et qu'il exprime la protéine à partir de 1 ou 2 copies de la SMN2 gène est insuffisant pour empêcher l'apparition d'un phénotype musculaire sévère et autonome de la cellule. Nos résultats impliquent que les régimes de traitement d'amélioration du SMN les plus optimaux pour la SMA seront ceux qui restaurent la protéine dans le muscle squelettique.

MyoD-iCre effectue une inactivation robuste et spécifique du muscle de l'allèle Smn F7. Pour étudier les effets sur l'autonomie cellulaire de l'épuisement du SMN dans le muscle squelettique, nous avons commencé par tester lequel des 2 moteurs de Cre musculaire, MyoD-iCre et Myf5-Cre (31, 32), était le mieux adapté à nos études. Chacun entraîne l'expression dans les cellules progénitrices musculaires dès E8 (33 – 35) et a été utilisé pour épuiser ou restaurer sélectivement les protéines liées à la maladie dans le muscle squelettique (27, 36). Pour déterminer la spécificité tissulaire des 2 lignées Cre, nous avons croisé séparément les souris transgéniques avec des animaux hébergeant une Smn allèle de délétion (Smn F7 ) portant des sites loxP de part et d'autre de l'exon 7 (37, 38). Nous avons ensuite utilisé la PCR pour examiner lequel des tissus des doubles transgéniques présentait des preuves de recombinaison médiée par Cre. Comme prévu, nous avons détecté la présence de l'allèle supprimé (Δ7) dans les muscles proximaux et distaux de chacun des doubles transgéniques. MyoD-iCre Smn F7 et Myf5-Cre Smn F7 animaux (figure 1A). Cependant, et conformément à d'autres rapports ( 27 , 39 ), alors que la recombinaison du Smn F7 allèle était limité au muscle squelettique du MyoD-iCre Smn F7 souris, il a également été détecté dans les tissus du SNC des Myf5-Cre Smn F7 animaux, cette dernière découverte a exclu la lignée Myf5-Cre pour cette étude. Nous avons néanmoins procédé à la quantification de l'efficacité relative avec laquelle chacun des moteurs de Cre effectuait Smn F7 inactivation dans le muscle squelettique. Pour mesurer directement avec quelle robustesse chacun des pilotes a converti le Smn F7 allèle au supprimé Smn Δ7 forme, nous avons utilisé la Q-PCR sur l'ADN génomique du muscle squelettique de P7 MyoD-iCre Smn F7/+ et Myf5-Cre Smn F7/+ animaux et les niveaux relatifs estimés de résidus Smn F7 allèle dans chaque ensemble de mutants. L'ADN du tissu musculaire du MyoD-iCre Smn F7/+ les souris contenaient des niveaux inférieurs de Smn F7 allèle que l'ADN du muscle de Myf5-Cre Smn F7/+ souris (figure 1B), suggérant que MyoD-iCre est plus robuste pour inactiver l'allèle floxé.

Inactivation robuste et spécifique du muscle de la Smn F7 allèle avec MyoD-iCre. (UNE) Analyse par PCR de l'ADN génomique de tissus de souris hébergeant le Smn F7 allèle et soit MyoD-iCre ou Myf5-Cre. Les inactivés Smn Δ7 L'allèle n'est détecté que dans le muscle des souris MyoD-iCre, alors qu'il est observé dans les localisations ectopiques des transgéniques Myf5-Cre. (B) Les données Q-PCR comparant l'efficacité de Smn F7 inactivation dans le muscle de souris avec le pilote MyoD-iCre ou Myf5-Cre. **P < 0.01, t test, m ≥ 4 souris de chaque cohorte. (C) Courbes de survie de Kaplan-Meier de Myf5-Cre Smn F7/– et MyoD-iCre Smn F7/– souris. P < 0.01 entre les groupes, test du log-rank.

Comme deuxième moyen indirect de déterminer l'efficacité de la recombinaison, nous avons établi des croisements pour générer MyoD-iCre Smn F7/– et Myf5-Cre Smn F7/– mutants. Chez ces mutants, la protéine SMN devrait être complètement supprimée dans les cellules musculaires si Smn F7 est converti en Smn Δ7 . Comme une telle ablation est incompatible avec la survie de la cellule et donc de l'organisme (4), l'incidence relative de la Cre Smn F7/– mutants et la sévérité de la maladie chez les animaux résultants - telle qu'évaluée par la durée de vie - est une mesure indirecte mais sensible de l'efficacité de la recombinaison au niveau Smn F7 allèle. Étant donné la conversion moins que complète de Smn F7 à Smn Δ7 , comme détecté dans nos expériences PCR, nous n'avons pas été surpris d'obtenir des vivants et/ou des mort-nés Smn Δ7/– mutants portant chacun des pilotes Cre. Cependant, conformément à nos résultats Q-PCR suggérant que MyoD-iCre a un effet supérieur sur la recombinaison, l'analyse χ 2 a indiqué significativement moins que prévu MyoD-iCre Smn F7/– mutants à la naissance. En revanche, Myf5-Cre Smn F7/– les mutants et leurs congénères sont nés à des fréquences prédites (tableau supplémentaire 1 matériel supplémentaire disponible en ligne avec cet article https://doi.org/10.1172/JCI131989DS1). De plus, alors que la prépondérance (

90%) de MyoD-iCre Smn F7/– mutants étaient soit mort-nés, soit ont péri à P0, environ 75 % des Myf5-Cre Smn F7/– les souris ont non seulement vécu jusqu'à l'âge adulte, mais se sont également reproduites vigoureusement seulement 2 MyoD-iCre Smn F7/– les mutants vivaient au-delà de P1 et aucun n'a survécu au-delà de P30 (figure 1C). Collectivement, les données suggèrent que la lignée transgénique MyoD-iCre constitue un moteur plus robuste que son homologue Myf5-Cre et constitue donc un choix plus prudent de réactif avec lequel évaluer les effets sur l'autonomie cellulaire d'une faible expression de SMN dans le muscle. Dans une confirmation finale de notre choix du pilote MyoD-iCre avec lequel épuiser le SMN dans le muscle, nous avons généré des souris ROSA-YFP (40) avec ou sans le transgène Cre. Comme prévu, nous avons détecté un fort signal YFP dans la majorité des fibres musculaires de MyoD-iCre ROSA-YFP, mais non ROSA-YFP animaux (Figure supplémentaire 1A). La fluorescence YFP n'a pas été détectée dans la moelle épinière, le cerveau ou le tissu hépatique des souris MyoD-iCre ROSA-YFP (Figure supplémentaire 1B). Par conséquent, les autres études ont été menées en utilisant le MyoD-iCre ligne.

Une maladie grave et rapide est observée chez des mutants SMN2 à copie unique dépourvus de SMN dans le muscle. L'ablation complète des tissus de SMN perturbe la biogenèse de snRNP et est donc mortelle (4). De plus, une ablation complète de SMN ne parvient pas à modéliser fidèlement la SMA humaine, dans laquelle les niveaux résiduels de la protéine dérivent de 1 ou plusieurs SMN2 copies.En conséquence, pour générer des mutants exprimant le SMN résiduel uniquement dans le muscle squelettique, nous avons élevé des souris porteuses de SMA homozygotes pour le SMN2 transgène (13) et hétérozygote pour le pilote MyoD-iCre (MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn +/– ) avec Smn F7/F7 animaux. MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7/– les mutants ont été obtenus avec la fréquence attendue de 12,5 %, mais ont présenté un phénotype manifeste, tel qu'évalué par le poids corporel, dans les 24 heures suivant la naissance (Figure 2, A et B). Les mutants ont également présenté un mouvement réduit, ont échoué à un test de performance motrice (figure 2C et vidéo supplémentaire 1) et étaient moribonds d'environ P14. Ils ont souvent été trouvés émaciés, échevelés et présentant des signes de détresse respiratoire (Vidéo supplémentaire 2). La survie médiane a été raccourcie à environ P21 (Figure 2D). Comme prévu, les niveaux de la protéine SMN dans le tissu musculaire squelettique des mutants P7 étaient significativement inférieurs et inférieurs à la moitié des niveaux de protéine chez les souris porteuses SMA d'une lignée couramment employée (41) de mutants sévères (type 1) (Figure 2, E et F). Nous concluons que les mutants ont exprimé environ 25 % de la protéine WT SMN et que le phénotype de la maladie manifeste observé était en effet une conséquence de la réduction sélective des protéines dans le tissu musculaire des animaux.

Maladie grave et précoce chez les MyoD-iCre Smn F7/– mutants portant 1 SMN2 copie. (UNE) Le graphique illustre la réduction du poids des mutants t test, m ≥ 10 souris de chaque série. (B) Un mutant typique et un compagnon de portée témoin reflétant la plus petite taille du premier. (C) Les mutants ont de mauvais résultats dans un test de réflexe de redressement t test, m ≥ 10 souris de chaque cohorte. () Les courbes de survie de Kaplan-Meier représentent une durée de vie réduite des mutants. P < 0,0001 entre les groupes, test du log-rank, m = 25 souris de chaque groupe. (E) Western blot a montré une réduction de la protéine SMN dans le muscle squelettique d'un MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7/– mutant. (F) Niveaux relatifs de SMN dans le muscle squelettique des mutants et contrôles pertinents ANOVA à 1 facteur, m ≥ 3 souris de chaque cohorte. (g) Les fibres musculaires des membres et des muscles respiratoires sont nettement réduites en taille chez les mutants P15 t test, m ≥ 600 fibres de m = 3 souris de chaque cohorte. (H) Coupes transversales colorées au H&E de muscles intercostaux d'un mutant P15 et témoin montrant une perte de tissu et des fibres avec des noyaux centraux (flèches) dans le premier. Barre d'échelle : 20 m. Quantification de (je) noyaux centraux et (J) nombre de fibres dans le muscle intercostal des mutants P15 et des témoins. t test, m = 3 à 5 souris de chaque groupe. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001 pour toutes les analyses.

Compte tenu du phénotype manifeste sévère et rapide et des effets bien connus de l'épuisement systémique de la protéine SMN sur l'unité motrice, nous avons ensuite examiné le MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7/– mutants pour mettre en évidence une pathologie neuromusculaire. Nous avons d'abord évalué la morphologie des fibres musculaires dans les muscles représentatifs distaux (gastrocnémien), proximaux (triceps) et respiratoires (intercostaux). Les zones de myofibres chez les mutants ont été réduites dans les 3 muscles à l'âge de 2 à 3 semaines (figure 2G et figure supplémentaire 2, A–C). Une analyse plus détaillée des muscles intercostaux à P15 a démontré que cette anomalie s'accompagnait d'une pathologie dégénérative distincte caractérisée par des zones dépourvues de fibres musculaires et abritant souvent des infiltrats de monocytes ou de macrophages, et un nombre important de myofibres contenant des noyaux centraux anormalement localisés (Figure 2, H et moi). La quantification des fibres musculaires a indiqué qu'environ un tiers des cellules de ce muscle respiratoire avaient été perdues (figure 2J), une origine probable d'un dysfonctionnement sévère du muscle, d'une respiration laborieuse (voir également la vidéo supplémentaire 2) et de la mort éventuelle du mutant. animaux. Fait intéressant, ces défauts étaient moins significatifs à P7, mais suggéraient néanmoins une dégénérescence postnatale du muscle dans le MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7/– mutants (Figure supplémentaire 2, D–F). De plus, les anomalies étaient limitées au muscle squelettique car un examen du muscle cardiaque, dans lequel MyoD-iCre n'est pas exprimé, n'apparaissait pas différent chez les mutants et les témoins tel que déterminé par la zone de myofibre et l'épaisseur de la paroi du ventricule gauche (Figure supplémentaire 2, G-I).

La SMA est définie par la perte de motoneurones. L'épuisement sélectif du SMN dans ces cellules est suffisant pour déclencher leur perte (42), mais le rôle du muscle malade dans le processus neurodégénératif n'a pas été examiné. Nous avons donc quantifié et caractérisé les somas des motoneurones dans notre MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7/– mutants. Le décompte des corps cellulaires a indiqué que malgré un faible SMN dans le muscle, il n'y avait pas de perte des motoneurones spinaux (Figure 3, A et B). De plus, nous n'avons trouvé ni preuve d'une réduction de la coloration SMN dans le soma des motoneurones ni d'une diminution du nombre de gemmes, foyers sous-nucléaires dans lesquels la protéine se localise (Figure 3, C-E et réf. 43).

défauts NMJ dans MyoD-iCre Smn F7/– mutants avec 1 copie du SMN2 gène. (UNE) Coupes transversales de la moelle épinière lombaire (L1-L3) d'un mutant P21 et contrôle. Barre d'échelle : 25 m. Résultats quantifiés de (B) nombre de neurones moteurs spinaux (L1-L3, T7-T10, C5-C6) (C) Intensité du signal SMN dans les motoneurones () le nombre de gemmes nucléaires dans les motoneurones des souris. N.-É. : P > 0.05, t test, m > 150 cellules et m = 4 souris de chaque groupe. (E) Un motoneurone lombaire d'un mutant montrant un signal SMN robuste et la présence de gemmes nucléaires (flèches). Barre d'échelle : 8 m. (F) NMJ dans les muscles intercostaux de souris mutantes et témoins. Des images à fort grossissement de plaques d'extrémité typiques de chaque animal sont incluses, illustrant une complexité réduite et la présence de varices terminales engorgées de NF (flèches) chez le mutant. Barres d'échelle : 50 m et 15 m, respectivement. Graphiques de (g) complexité NMJ, (H) la taille de la plaque d'extrémité, et (je) Morphologie NMJ chez les mutants P21 et les témoins. **P < 0.01 ***P < 0,001, t test, m ≥ 100 NMJ de m ≥ 3 souris de chaque groupe. (J) L'expression des protéines atrogènes chez les mutants et les témoins a montré peu de changement dans ces marqueurs de dénervation. N.-É. : P > 0.05, t test, m = 3 souris.

Bien que la maladie d'origine musculaire puisse ne pas affecter le motoneurone proximal, la myopathie chronique perturbe le compartiment postsynaptique et finit par compromettre la morphologie et la fonction de la synapse neuromusculaire (44). De plus, il n'est pas clair si un faible SMN dans le muscle contribue ou exacerbe les défauts du NMJ observés dans l'AMS. En conséquence, nous avons effectué une analyse morphologique minutieuse des NMJ dans nos mutants. Nous avons constaté que les groupes de récepteurs de l'acétylcholine (AChR) dans les 3 muscles des mutants P17-P21 avaient acquis la structure typique de type bretzel des NMJ matures (Figure 3F). Cependant, une évaluation minutieuse de leurs complexités relatives sur la base du nombre de perforations dans les grappes a indiqué que bien que les plateaux vertébraux des gastrocnémiens et des triceps ne soient pas différents entre les mutants et les témoins, ceux de l'intercostal étaient moins élaborés chez les mutants (Figure 3G). De plus, conformément à la plus petite taille du muscle mutant, les grappes dans les 3 muscles se sont avérées relativement petites (Figure 3, F et H). Un examen des terminaisons nerveuses musculaires chez les souris mutantes a révélé une augmentation des varices gonflées par la protéine neurofilament (NF), une caractéristique qui rappelle les défauts observés chez les souris modèles exprimant une protéine SMN systémiquement faible (réf. 45 - 48 et figure 3I). Cependant, aucune preuve de dénervation n'a été détectée dans les études immunohistochimiques du NMJ ou en quantifiant les atrogènes, atrogin-1 et MuRF1, qui sont régulièrement régulés à la hausse dans le muscle dénervé (figure 3J). Pourtant, les défauts observés en combinaison avec la pathologie musculaire et le phénotype manifeste de la MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7/– les mutants nous amènent à 2 conclusions. Premièrement, les résultats suggèrent qu'un faible SMN dans le muscle squelettique est suffisant pour provoquer la maladie. Deuxièmement, ils démontrent qu'une pathologie d'origine musculaire est capable de déclencher, très probablement de manière rétrograde, des anomalies des nerfs. En conséquence, la pénurie de SMN dans le muscle agit à la fois de manière autonome et non autonome sur la cellule pour contribuer aux défauts cellulaires et au phénotype global de l'AMS.

La myopathie est démasquée après une lésion musculaire chez de jeunes mutants phénotypiquement normaux portant 2 copies SMN2. SMA chez les patients et les souris modèles hébergeant un seul SMN2 La copie constitue la forme la plus sévère (type 0) de la maladie possible et entraîne souvent la mort in utero (49 – 51). Ainsi, la prévalence de cette forme de la maladie est faible (52), et la sévérité du phénotype chez MyoD-iCre Smn F7/– mutants hémizygotes pour le SMN2 transgène n'est peut-être pas inattendu. Pour déterminer les effets de l'expression du SMN dans le muscle des mutants à partir de 2 copies du gène, une situation plus fréquente chez les patients SMA humains, nous avons généré des souris homozygotes pour SMN2 (MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– ).

Contrairement au phénotype indubitable et rapide discerné chez les mutants MyoD-iCre hébergeant un seul SMN2 copie, nous n'avons détecté que des anomalies subtiles chez de jeunes souris adultes exprimant 2 copies du gène. Ainsi, par exemple, bien que ces derniers mutants aient présenté un poids corporel légèrement réduit au cours de la deuxième semaine de vie postnatale par rapport aux témoins dépourvus du pilote Cre (Figure 4A), les courbes de croissance agrégées entre P0 et P21 ont montré une trajectoire ascendante claire (Figure supplémentaire 3A). De plus, les mutants n'ont montré aucune faiblesse dans la capacité de redressement en tant que nouveau-nés (Figure supplémentaire 3B) ou sur la tige rotative à l'âge de 6 semaines (Figure supplémentaire 3C), et n'ont présenté aucune réduction de la durée de vie entre la naissance et P60 (16 des 16 mutants vivants 18 de 18 témoins vivants). Les concentrations de SMN dans le muscle squelettique de mutants âgés d'un mois sont restées faibles, à environ 21 % des niveaux de WT (figure 4, B et C), les niveaux de protéine dans d'autres tissus n'ont pas été réduits.

Petite pathologie cellulaire chez l'adulte jeune MyoD-iCre Smn F7/– mutants portant 2 SMN2 copies. (UNE) Comparaisons des poids corporels des témoins et des mutants hébergeant 1 ou 2 SMN2 copie l'ANOVA à 1 facteur, m ≥ 10 souris de chaque cohorte. (B) Résultats de Western blot montrant une déplétion sélective de la protéine SMN dans le muscle squelettique d'un P30 MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutant. (C) Niveaux quantifiés de protéine SMN chez les souris mutantes P30 et témoins t test, m ≥ 3 souris de chaque groupe. () Des coupes transversales de muscles gastrocnémiens colorés au H&E d'un mutant P30 et d'un témoin n'ont pas révélé de différences morphologiques majeures entre les deux. Barre d'échelle : 25 m. Graphiques de (E) zones de myofibres, (F) fibres contenant des noyaux centraux, et (g) taux sériques de créatine kinase (CK) chez les jeunes mutants et les témoins. N.-É. : P > 0.05, t test, m > 150 fibres de m = 3 souris de chaque groupe pour des résultats en E et F N.-É. : P > 0.05, t test, m = 10 souris pour les valeurs CK. (H) NMJs du triceps d'un mutant P30 et d'un contrôle montrant une morphologie similaire des compartiments pré- et postsynaptiques chez les 2 souris. Barre d'échelle : 30 m. (je) Graphique de l'étendue de l'innervation NMJ chez les mutants P30 et les contrôles. (J) Graphique illustrant la complexité de la plaque terminale chez les mutants P30 et les congénères de contrôle. N.-É. : P > 0,05, test exact de Fisher, m ≥ 300 NMJ de m = 3 souris de chaque groupe de souris pour les analyses en je et J. **P < 0.01 ***P < 0,001.

Compte tenu des preuves d'une pathologie neuromusculaire dans la copie unique SMN2 Mutants MyoD-iCre, nous avons procédé à l'examen du muscle et de l'unité motrice distale de jeunes mutants adultes hébergeant 2 copies du transgène humain. Aucune anomalie musculaire n'a été notée. Malgré le poids un peu plus petit des mutants, les fibres musculaires examinées étaient en grande partie de taille équivalente à celles des témoins (Figure 4, D et E), semblaient morphologiquement normales et ne présentaient pas de pathologie sous la forme de myonoyaux anormalement localisés dans le muscles gastrocnémiens et intercostaux. Le muscle triceps plus vulnérable chez les mutants abritait un plus grand nombre de noyaux centraux que les témoins, mais cela représentait moins de 1% du total des myofibres examinées (figure 4F et figure supplémentaire 4, A-E). Conformément à l'absence de pathologie musculaire majeure, nous n'avons trouvé aucune élévation de la créatine kinase musculaire (CK) dans le sérum des animaux mutants (Figure 4G) ou des dommages au sarcolemme évalués en examinant si les IgG sériques circulantes avaient pénétré les myofibres (Figure supplémentaire 4F). Les analyses des niveaux d'expression des gènes des chaînes lourdes de la myosine et des facteurs myogéniques Pax7, MyoD, Myf6 et myogénine, marqueurs connus de l'état de maturité des myofibres chez les mutants P7, n'ont révélé aucun changement significatif chez les animaux hébergeant 1 ou 2 SMN2 copies (Figure supplémentaire 5, A–L), bien que l'expression de MyoD ait tendance à être plus élevée, en particulier chez les mutants SMA 7 les plus sévères, qui ont servi de 1 ensemble de contrôles. Les changements d'expression étaient également indétectables chez les mutants P14 (Figure supplémentaire 5, M-Q), suggérant que l'épuisement sélectif de SMN dans le muscle squelettique de l'organisme intact tel qu'il est effectué ici ne perturbe pas la myogenèse ou la différenciation musculaire.

Nous avons ensuite étudié la morphologie du NMJ. Contrairement aux défauts frappants observés chez les mutants hémizygotes pour le SMN2 transgène, les NMJ dans les muscles triceps des mutants de 1 mois homozygotes pour SMN2 semblait relativement normal (Figure 4H). Plus précisément, aucune différence dans la taille des plateaux vertébraux (surface en m 2 — témoins : 218,1 ± 3,9, mutants : 225,3 ± 3,7, m ≥ 150 NMJ de m = 3 souris de chaque cohorte, P = 0.183, t test), l'innervation (Figure 4I), la complexité des plateaux vertébraux (Figure 4J) ou l'incidence de varicosités NF ont été observées (nombre de plateaux vertébraux avec gonflements axonaux - témoins : 7,87 ± 0,69, mutants : 5,25 ± 1,56, m ≥ 150 NMJ de m = 3 souris de chaque cohorte, P = 0.2, t test). En tant que moyen plus sensible de détecter les défauts synaptiques potentiels, nous avons également examiné l'état fonctionnel des NMJ. La fréquence du potentiel de plaque terminale miniature (MEPP), l'amplitude du MEPP, les potentiels évoqués de plaque terminale (EPP) et le contenu quantique étaient tous normaux chez les enfants de 4 à 5 semaines MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants (Figure supplémentaire 6, A–D). Conformément à ces résultats, la section transversale et le nombre moyen de fibres quantifiés dans les muscles long extenseur des orteils (EDL) mutants étaient équivalents à ceux des témoins (Figure supplémentaire 6, E et F). Collectivement, ces résultats ont démontré que le jeune adulte MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– les mutants étaient phénotypiquement normaux et ne présentaient pas de signes majeurs de pathologie musculaire ou NMJ.

Considérant l'absence de défauts majeurs chez les jeunes MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants, nous avons demandé si une lésion musculaire aiguë pouvait révéler une pathologie sous-jacente. En conséquence, nous avons injecté dans les gastrocnémiens des mutants P21 et des témoins un agent myonécrotique, la cardiotoxine (CTX), et avons examiné la capacité du muscle à se régénérer. Six jours après l'exposition au CTX, les myofibres des mutants et des témoins présentaient une dégénérescence uniforme caractérisée par un muscle nécrotique et un grand nombre de myofibres en régénération minute avec des noyaux centraux (figure 5A). Deux semaines après la blessure, la régénération musculaire était encore plus évidente. Cependant, la quantification des noyaux situés au centre par rapport aux noyaux situés en périphérie dans les nouvelles myofibres a révélé que le muscle mutant n'était pas seulement caractérisé par un plus grand nombre de fibres qui abritaient toujours des noyaux situés au centre, mais également par des cellules contenant plusieurs noyaux de ce type (Figure 5, A et B). L'examen des animaux 26 jours après l'injection a montré que le muscle exprimant des niveaux normaux de SMN s'était complètement rétabli, avec moins de 2 % des fibres abritant encore des noyaux centraux. En revanche, le muscle appauvri en protéine a continué à montrer des signes de régénération, environ la moitié des fibres de ce muscle étaient encore immatures, contenant un ou plusieurs noyaux situés au centre, présentant une variation considérable de taille et, dans quelques cas, toujours en dégénérescence (Figure 5, A et C). Ces résultats suggèrent que malgré l'absence d'une myopathie évidente chez les jeunes MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants, une pathologie sous-jacente a fait surface dans des conditions de lésion musculaire, compromettant gravement la capacité des animaux à réparer les muscles endommagés.

Une blessure aiguë révèle une pathologie musculaire chez un jeune adulte MyoD-iCre Smn F7/– mutants portant 2 copies du SMN2 gène. (UNE) Des coupes transversales de muscle colorées au H&E de souris mutantes et témoins ont été examinées 6, 14 et 26 jours après la blessure avec le CTX. Noter la persistance d'une pathologie musculaire caractérisée par des fibres hypotrophiques (têtes de flèches pleines), de nombreux noyaux centraux (flèches) et des fibres dégénératives (têtes de flèches ouvertes) au jour 26 chez le mutant. Barres d'échelle : 25 m (panneaux supérieurs), 15 m (panneaux du milieu) et 30 m (panneaux inférieurs). Les graphiques illustrent la proportion de fibres avec des noyaux situés au centre ou à la périphérie chez les mutants et les témoins (B) 14 jours et (C) 26 jours après la blessure. ***P < 0,001, t test, m ≥ 400 fibres de m ≥ 4 souris de chaque génotype.

Un dysfonctionnement moteur d'apparition tardive et une mortalité précoce sont observés chez des mutants SMN2 à 2 copies sélectivement appauvris en SMN dans le tissu musculaire squelettique. Bien que nous n'ayons pas réussi à détecter des anomalies musculaires majeures ou une maladie manifeste chez les jeunes MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants, le résultat de nos expériences impliquant le CTX et la révélation que des dommages aigus démasquent une pathologie sous-jacente prédisaient qu'un tel dysfonctionnement finirait par faire surface sous la forme d'une maladie à apparition tardive. En conséquence, nous avons continué à surveiller les 2 copies SMN2 mutants, en effectuant un deuxième large ensemble d'analyses entre 6 et 7 mois. Dans les tests de rotarod, nous n'avons pas réussi à détecter de changements marqués chez les mutants à 8, 10 et 16 semaines d'âge, même s'il y avait une tendance pour les mutants à sous-performer les témoins. Cependant, à l'âge de 18 semaines, l'écart est devenu significatif et le restait lorsque les animaux ont été testés à 20 et 28 semaines, respectivement (figure 6A). Ces différences étaient encore plus importantes lorsque les résultats étaient stratifiés selon le sexe et suggéraient que, bien que les mutants fonctionnent généralement moins bien que les témoins, les animaux femelles sont davantage affectés que les mâles sur la tige rotative (Figure supplémentaire 7, A et B).

Maladie d'apparition tardive chez MyoD-iCre Smn F7/– mutants portant 2 SMN2 copies. Resultats de (UNE) tige rotative et (B) des tests de force de préhension ont démontré les effets d'apparition tardive et pathogènes de l'épuisement sélectif du SMN dans le muscle squelettique t test, m ≥ 25 souris de chaque génotype. (C) Les courbes de survie de Kaplan-Meier représentent une durée de vie réduite des mutants. P < 0,0001 entre les mutants et les 2 jeux de contrôles P > 0,05 entre les 2 séries de contrôles, test du log-rank. () Des coupes transversales de muscles mutants âgés de 6 à 7 mois et de muscles gastrocnémiens témoins illustrent la présence d'une pathologie chez les mutants. Les fibres hypotrophes (flèches pleines), les fibres en régénération avec basophilie cytoplasmique (tête de flèche ouverte), les fibres fendues (têtes de flèches pleines) ou les fibres en dégénérescence (flèches ouvertes) sont représentées. Barre d'échelle : 25 m. Les graphiques représentent (E) tailles de fibres et (F) nombre de fibres dans les muscles de mutants et de témoins âgés de 7 mois t test, m ≥ 500 fibres de m ≥ 3 souris de chaque génotype. (g) Estimations des noyaux centraux dans les muscles de mutants ou témoins âgés de 7 mois t test, m ≥ 1000 fibres de m ≥ 3 souris de chaque génotype. (H) Coupes transversales de muscles gastrocnémiens de souris mutantes et témoins âgées de 7 mois représentant des myofibres IgG-positives endommagées (flèches). Barre d'échelle : 50 m. (je) Quantification des fibres endommagées de l'expérience précédente t test, m ≥ 300 fibres de m ≥ 3 souris de chaque génotype. (J) Résultats quantifiés des valeurs sériques de CK de souris mutantes et témoins de 7 mois t test, m ≥ 8 souris de chaque cohorte. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001.

Dans un test de force de préhension, le dysfonctionnement est devenu apparent encore plus tôt. Les mutants ont sous-performé à tous les moments examinés (figure 6B). De plus, les deux sexes semblaient également touchés (Figure supplémentaire 7, C et D). Enfin, une évaluation de la durée de vie a démontré qu'un faible SMN dans le muscle squelettique provoquait également une mortalité précoce en 2 copies. SMN2 mutants. Alors qu'environ 95 % des témoins (SMN2 +/+ Smn F7/– ) les animaux sont restés vivants à environ 18 mois, seuls 14 % des mutants étaient encore viables à cet âge (figure 6C). Comme prévu, nous n'avons trouvé aucune différence entre les SMN2 +/+ Smn F7/– contrôles et un deuxième ensemble de contrôles qui hébergeaient le pilote MyoD-iCre, mais portaient également 1 allèle WT SMN (MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/+ ), assurant ainsi des niveaux hétérozygotes de la protéine dans le muscle (figure 6C). Combinés à l'analyse comportementale de jeunes mutants adultes, ces résultats suggèrent qu'une faible expression persistante de SMN dans le muscle squelettique de 2 SMN2 copies étaient suffisantes pour déclencher un phénotype manifeste de la maladie, bien que sous la forme d'un dysfonctionnement d'apparition tardive.

La myopathie est une conséquence tardive et autonome des cellules d'un faible SMN dans le muscle squelettique. Considérant les signes de maladie manifeste chez les personnes âgées MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants, nous avons considéré une réévaluation de la pathologie neuromusculaire potentielle chez les animaux comme particulièrement importante. En conséquence, nous avons de nouveau commencé notre analyse en examinant la morphologie musculaire. Contrairement aux observations chez les jeunes mutants adultes, les résultats des analyses des souris plus âgées (âgées de 6 à 7 mois) étaient frappants. Dans les 3 muscles examinés, nous avons trouvé des signes évidents de pathologie caractérisée par des fibres nécrotiques infiltrées par des cellules inflammatoires, des fibres en régénération présentant une basophilie cytoplasmique, des fibres angulaires qui semblaient provenir de la division d'une fibre plus grosse et la présence occasionnelle de groupes de muscles hypotrophiques. fibres au sein de ce qui semblait avoir été autrefois un endomysium individuel (figure 6D et figure supplémentaire 7, E et F). La preuve d'une pathologie dans le muscle mutant a également été démontrée sous la forme d'une augmentation des points lacrymaux qui s'est révélée positive pour le marqueur microglial/macrophage, Iba-1 (Figure supplémentaire 7G). Deuxièmement, nous avons constaté que les myofibres mutantes étaient non seulement généralement plus petites (figure 6E et figure supplémentaire 8, A-C), mais également de taille incohérente. Troisièmement, nous avons constaté que les muscles mutants avaient significativement moins de fibres (figure 6F), beaucoup avec un ou plusieurs noyaux situés au centre (figure 6G). La perte de fibres musculaires est clairement un événement tardif, car nous avons trouvé des nombres équivalents de fibres dans les muscles mutants et témoins à l'âge de 1 mois (figure 6F). Enfin, une évaluation de la taille brute des gastrocnémiens a montré que le muscle mutant pesait significativement moins que le muscle témoin (poids en mg : témoins — 126 ± 7,3, mutants — 93,08 ± 4,5, P < 0.01, m ≥ 7 souris, t test). La pathologie du muscle court fléchisseur des orteils (FDB) plus vulnérable était encore plus grave. Chez les mutants, seuls des restes du muscle ont été trouvés, suggérant une perte ou une dégénérescence presque complète (Figure supplémentaire 8D).

Étant donné le processus de dégénérescence musculaire en cours chez les personnes âgées MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants et comme deuxième moyen de confirmer la pathologie, nous avons évalué l'intégrité individuelle des myofibres en quantifiant la pénétration par les taux sériques d'IgG et de CK sériques. Conformément à la pathologie observée, et contrairement à celle observée chez les jeunes animaux, un nombre significativement plus élevé de fibres mutantes contenait des IgG (Figure 6, H et I), semblable à ce qui est observé dans la dystrophie musculaire, quoique dans une moindre mesure (Supplément Figure 4F). Les niveaux de CK mutante étaient également élevés (figure 6J). Sans surprise, une pathologie musculaire caractérisée par une CK sérique élevée et des myofibres plus petites avec des noyaux centraux accrus a également été observée chez des mutants plus âgés sélectivement appauvris en SMN dans des myotubes fusionnés - au moyen d'un pilote HSA-Cre (24) - au lieu de progéniteurs musculaires (Figure supplémentaire 9, A–D). Pour vérifier la pertinence de ces résultats chez nos souris modèles pour une pathologie musculaire potentielle dans la SMA humaine, nous avons examiné les valeurs sériques de CK dans un échantillon de convenance de 6 patients, qui avaient tous été traités pendant au moins un an avec Spinraza. Dans chaque cas, les valeurs de CK étaient élevées et dépassaient les valeurs normales maximales de 15 % à 500 % (tableau 1). Collectivement, ces résultats renforcent les observations de maladie manifeste chez les personnes âgées. MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants, fournissent une base cellulaire pour le dysfonctionnement moteur et la mortalité précoce, et renforcent l'idée que le muscle squelettique est un site cellulaire critique d'action de la protéine SMN. Carence en protéine, même en présence de 2 SMN2 copies, est préjudiciable au muscle à mesure que l'organisme vieillit.

Augmentation des valeurs sériques de créatine kinase musculaire (CK-MM) chez les patients SMA traités

Les défauts fonctionnels et structurels des NMJ sont des conséquences cellulaires autonomes d'un faible SMN dans le muscle squelettique. Nous avons ensuite examiné les NMJ chez l'enfant de 7 mois MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– souris. Le résultat le plus frappant de nos analyses morphologiques était la mesure dans laquelle les clusters AChR mutants ont été désassemblés et fragmentés (Figure 7, A et B). Des défauts similaires ont été observés chez un enfant de 6 mois HSA-Cre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants (Figure supplémentaire 9, E et F). De plus, contrairement aux jeunes MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants dans lesquels les plaques d'extrémité n'étaient pas différentes en taille et en structure de celles des témoins, les plaques d'extrémité chez les souris plus âgées étaient non seulement significativement plus petites (figure 7C), mais aussi moins élaborées - comme évalué en quantifiant la proportion de grappes AChR dans le gastrocnémien possédant la structure typique en forme de bretzel avec 4 perforations ou plus (témoins — 86,33 % ± 3,1 %, mutants — 3,33 % ± 1,85 %, P < 0,001, m ≥ 100 NMJ dans m = 3 souris de chaque cohorte, t test).

Pathologie NMJ et dysfonctionnement neuromusculaire chez MyoD-iCre Smn F7/– mutants portant 2 SMN2 copies. (UNE) Les NMJ des muscles EDL de souris âgées de 7 mois montrent une profonde fragmentation des plateaux vertébraux chez les mutants. Barre d'échelle : 10 m. (B) Représentation quantifiée des NMJ fragmentés chez des souris mutantes et témoins de 7 mois t test, m ≥ 500 plaques d'extrémité de m ≥ 3 souris de chaque génotype. (C) Le graphique illustre la taille du NMJ dans les muscles gastrocnémiens de mutants et de témoins âgés de 7 mois t test, m ≥ 420 plaques d'extrémité de m = 3 souris de chaque génotype. Représentations quantifiées de () Amplitude MEPP, (E) Fréquence du RRI, (F) amplitude EPP, et (g) contenu quantique dans les muscles EDL de souris mutantes et témoins de 7 mois. N.-É. : P > 0.05, t test, m ≥ 10 plateaux vertébraux par animal à partir de m ≥ 4 souris de chaque génotype. Les graphiques représentent (H) nombres de myofibres et (je) la proportion de fibres à noyau central dans les muscles EDL des souris analysées t test, m ≥ 4 souris de chaque génotype. Représentations quantifiées de (J) force spécifique maximale, (K) chute de force relative, et (L) taux de production de force maximale dans les muscles soléaires de souris âgées de 5 à 7 mois ANOVA à 2 voies pour des résultats en J et t tests de résultats dans K et L, m ≥ 5 souris de chaque cohorte. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001.

Pour déterminer si les anomalies morphologiques étaient corrélées avec une altération de la neurotransmission, nous avons également évalué la fonction NMJ par des moyens électrophysiologiques. Bien qu'il n'y ait pas eu de différences dans les amplitudes EPP et les fréquences MEPP dans les muscles EDL des mutants et des contrôles, les amplitudes MEPP étaient significativement plus faibles dans le MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– souris, ce qui correspond à une pénurie d'AChR postsynaptiques (Figure 7, D-F). Cela a conduit à une augmentation marquée du contenu quantique moyen au niveau des plaques d'extrémité mutantes (figure 7G), suggérant une augmentation compensatoire de la libération de neurotransmetteurs présynaptiques en réponse à des concentrations d'AChR postsynaptiques plus faibles. Le muscle EDL mutant était, en outre, réduit en taille (section musculaire en m 2 : témoins — 584 300 ± 33 470, mutants — 406 900 ± 36 780, P < 0.05, t test de m ≥ 4 animaux de chaque cohorte) et se composait de moins de fibres, beaucoup avec des noyaux situés au centre plutôt qu'à la périphérie (Figure 7, H et I). Les défauts musculaires notés ci-dessus n'ont pas affecté le nombre de motoneurones spinaux chez les mutants (nombre moyen par section : mutants — 14,5 ± 0,25, témoins — 12,8 ± 1,08, P > 0.05, m = 3 souris, t test). Ces résultats renforcent l'observation selon laquelle les dysfonctionnements morphologiques et moteurs résultent d'un faible SMN dans le muscle squelettique, et suggèrent en outre que les défauts provenant du compartiment postsynaptique peuvent avoir un effet rétrograde sur la fonction des motoneurones.

Dans une série d'expériences fonctionnelles conclusives, nous avons effectué des mesures de contractilité ex vivo dans les muscles soléaires de 5 à 7 mois. MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants. Nous avons constaté que la force spécifique maximale générée lors des stimulations à simple secousse et à basse fréquence (10-20 Hz) ne différait pas entre les échantillons mutants et témoins. Cependant, une réduction significative de la force spécifique maximale a été détectée lorsque les muscles mutants ont été stimulés avec des fréquences qui ont entraîné une contraction sommative (40-200 Hz) (Figure 7J). Aucun changement dans la relation force-fréquence n'a été observé entre les muscles témoins et mutants. Nous avons également soumis les muscles à une stimulation répétitive à fréquence modérée pour évaluer la sensibilité à la fatigue. Fait intéressant, le muscle mutant a présenté une diminution modeste, mais significative, de la fatigabilité au cours des 25 derniers trains de stimulus (figure 7K). Pour étudier la base cellulaire de cette observation, les myofibrilles extraites du muscle soléaire entier ont été analysées pour les niveaux relatifs des isoformes de la chaîne lourde de la myosine. En cohérence avec une résistance accrue à la fatigue, nous avons constaté que les muscles soléaires de MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– les souris ont exprimé considérablement plus de myosine de type I (MyHc7) que l'on trouve de manière caractéristique dans les fibres musculaires à contraction lente et résistantes à la fatigue (Figures supplémentaires 10, A et B). Enfin, compte tenu de ces changements observés dans la force tétanique spécifique maximale et la teneur lente en myosine de type I, nous avons analysé la cinétique de développement de la force (dF/dt) dans les muscles soléaires de souris témoins et mutantes. Congruent avec l'augmentation observée de la teneur en MyHc7, et malgré leur taille normale (poids en mg : témoins — 6,15 ± 0,22, mutants — 6,15 ± 0,38 P = 1, m 4 souris, t test), le dF/dt maximal a été réduit dans le muscle soléaire exprimant un faible SMN (Figure 7L). Collectivement, ces résultats fournissent des preuves solides d'importants déficits morphologiques et fonctionnels du muscle résultant d'un effet d'autonomie cellulaire de la pénurie de SMN dans ce tissu.

L'atténuation de la pathologie neuromusculaire est observée après réplétion postsymptomatique de la protéine SMN. La réplétion postnatale précoce du SMN empêche efficacement l'apparition de l'AMS (53, 54). Pour déterminer si la restauration du SMN profite également aux souris post-symptomatiques appauvries sélectivement en protéine dans le muscle, nous avons administré systématiquement soit un SMN2 morpholino à commutation d'épissure (MO) ou un avec une séquence brouillée à 7 mois MyoD-iCre SMN2 +/+ Smn F7/– mutants. Neuf semaines plus tard, les niveaux de SMN musculaire ont été évalués. Conformément aux rapports antérieurs, nous avons constaté que les transcrits FL-SMN et les niveaux totaux de protéine SMN étaient significativement plus élevés chez les mutants traités par SMN MO que dans la cohorte traitée avec la molécule brouillée (Figure 8, A-C). Pour déterminer si l'augmentation du SMN musculaire avait atténué la pathologie musculaire typiquement observée chez les mutants, nous avons disséqué les gastrocnémiens des différentes cohortes, en même temps que les niveaux de SMN étaient examinés, pour évaluer les muscles. Les mesures du poids humide du muscle ont démontré que, alors que les muscles des mutants traités au MO brouillés restaient significativement plus petits que ceux des témoins, les muscles des mutants restaurés pour le SMN étaient plus gros et ne différaient pas en poids du muscle témoin (Figure 8D). Cela s'accompagnait de moins de défauts cellulaires chez les mutants SMN MO traités. De plus, moins de myofibres traitées par MO SMN contenaient des noyaux centralisés par rapport à celles des mutants traités par MO brouillés (Figure 8, E–G). Enfin, les mesures de la taille et de la complexité des plaques d'extrémité dans les 3 cohortes de souris ont démontré que ces deux paramètres étaient partiellement normalisés chez les mutants traités par SMN MO (Figure 8, H-J). Plus précisément, les NMJ chez les mutants restaurés pour SMN étaient non seulement plus grandes (figure 8I), mais également moins fragmentées (figure 8, H et J). De plus, les plaques d'extrémité intactes chez les mutants restaurés pour SMN étaient plus élaborées, comme évalué par une quantification des structures de type bretzel avec 3 perforations distinctes ou plus (figure 8J). Nous concluons que la restauration du SMN, même après une pathologie musculaire, arrête et/ou inverse la myopathie attribuée à une faible teneur en protéines dans le tissu. En conséquence, on s'attend à ce que la réplétion de SMN dans le muscle des sujets SMA ait un effet atténuant important sur le phénotype global de la maladie.

La réplétion SMN atténue les défauts musculaires chez les mutants symptomatiques. Niveaux du (UNE) SMN2-transcrits FL-SMN dérivés et (B) La protéine SMN dans les muscles gastrocnémiens des témoins et des mutants soit administrée SMN2 MO à commutation d'épissage ou MO non spécifique à l'âge de 7 mois ANOVA à une voie, m = 3 souris de chaque génotype. (C) Western blot sondé pour la protéine SMN dans le muscle squelettique après traitement avec SMN-MO ou MO brouillé. () Poids musculaires chez les souris traitées comme décrit dans les panneaux précédents ANOVA à 1 facteur, m ≥ 3 souris dans chaque groupe. (E) Coupes transversales de muscles gastrocnémiens de mutants et de témoins traités. Moins de pathologies sous forme de noyaux centraux (têtes de flèches), de fibres hypotrophiques (flèches vides) et de fibres dégénératives (flèches pleines) observées dans le muscle traité par SMN-MO. Barre d'échelle : 100 m. Résultats quantifiés de (F) noyaux centraux et (g) zones de myofibres dans les muscles des souris ANOVA à 1 facteur, m ≥ 300 fibres de m ≥ 3 souris de chaque cohorte. (H) Les plaques d'extrémité des 3 ensembles de souris, moins de NMJ fragmentées sont observées chez le mutant traité par SMN-MO que chez son homologue ayant reçu une MO brouillée. Barre d'échelle : 25 m. (je) Mesures de surface NMJ et (J) Analyse de la complexité NMJ dans les muscles gastrocnémiens de mutants traités ou de témoins de portée ANOVA à 1 facteur, m ≥ 400 plateaux de m ≥ 3 souris de chaque génotype pour des résultats en je et J. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001.

La SMA est un trouble paralytique infantile causé par une faible protéine SMN. Non traités, la plupart des patients atteints d'AMS meurent avant l'âge de 2 ans. La restauration du SMN chez les souris modèles prévient et/ou inverse l'apparition de la SMA (54, 55) et a donc été rapidement adoptée comme moyen de traitement viable. Cependant, les études de réplétion ont également montré clairement que le succès de la stratégie dépend de manière critique du moment et des tissus dans lesquels le SMN est restauré. Le fait que les cellules du SNC et, en particulier, les motoneurones spinaux sont particulièrement vulnérables à un faible SMN et doivent donc exprimer des niveaux de SMN adéquats pour contrecarrer l'apparition de la maladie est largement accepté. Ces cellules sont efficacement ciblées par l'administration intrathécale d'agents de restauration de SMN tels que Spinraza. En effet, le résultat initial du traitement des patients de cette manière n'a laissé aucun doute sur l'efficacité clinique du ciblage du SNC. Pourtant, des questions persistantes concernant l'administration intrathécale restreinte du médicament et les effets à long terme de la privation de la périphérie d'un SMN adéquat demeurent. Ici, nous avons utilisé ce que nous pensons être une nouvelle lignée de souris modèles pour démontrer le résultat de la privation d'un organe périphérique important, le muscle squelettique, d'un SMN adéquat. Ce tissu est particulièrement pertinent compte tenu de la vulnérabilité de l'unité motrice dans l'AMS. Quatre conclusions principales sont ressorties de nos études. Le plus important est de révéler à quel point la carence en SMN est préjudiciable pour le muscle squelettique. Nous avons trouvé des défauts dans les myofibres et les NMJ individuels, des anomalies et un dysfonctionnement de muscles entiers, et finalement un phénotype manifeste qui compromettait la survie. Cette pathologie est apparue malgré des niveaux normaux de SMN dans d'autres tissus. Deuxièmement, nous avons démontré que l'étendue de la maladie est en corrélation avec le nombre de SMN2 copies et donc des niveaux absolus de protéine SMN fonctionnelle dans le tissu. Alors que les mutants n'exprimant qu'un seul exemplaire du SMN2 gène développé rapidement la maladie, ceux avec 2 copies présentaient un phénotype beaucoup plus tardif. Néanmoins, la pathologie cellulaire sous-jacente même à une maladie d'apparition tardive pourrait être démasquée à des stades précoces dans des conditions de lésion musculaire aiguë. Troisièmement, nos résultats ont démontré sans équivoque qu'au moins certains aspects du phénotype global de l'AMS découlent d'un effet d'autonomie musculaire. L'épuisement du SMN dans ce tissu est suffisant pour déclencher une pathologie. De plus, bien que les anomalies résultantes aient été les plus apparentes dans le muscle lui-même, des défauts ont également été finalement détectés dans la présynapse sous la forme de varices axonales contenant NF et d'une tentative de neurotransmission compensatoire.Enfin, nous avons montré que la restauration du SMN dans le muscle même après l'apparition d'une pathologie peut avoir un effet atténuant. C'est particulièrement rassurant d'un point de vue clinique. Nous concluons que la protéine SMN est intrinsèquement importante pour la fonction musculaire. Les thérapies de restauration SMN qui privent ce tissu de protéines adéquates sont peu susceptibles d'obtenir un bénéfice maximal. Au contraire, nos résultats ont soulevé la possibilité que les sujets traités par voie intrathécale développent éventuellement des myopathies sévères et potentiellement mortelles au fil du temps. Zolgensma, un agent améliorant le SMN médié par AAV9, qui a été récemment approuvé pour le traitement de la SMA, répond à cette préoccupation car il est administré de manière systémique et cible donc probablement le muscle. Cependant, un tel traitement n'est actuellement approuvé que pour les patients de moins de 2 ans. Les patients plus âgés sont limités à la thérapie intrathécale.

La réplétion SMN pour traiter la SMA doit tenir compte des exigences spatiales et temporelles de la protéine. Dans ce contexte, un effet pathogène potentiel d'autonomie cellulaire d'un faible SMN dans le muscle squelettique a fait l'objet de nombreux débats. L'ambivalence provient en grande partie de la nature de la SMA, qui implique de faibles niveaux omniprésents de la protéine SMN, la principale vulnérabilité des motoneurones spinaux à la pénurie de SMN et la manière dont la dénervation affecte le muscle. Tout effet de l'AMS sur le muscle pourrait donc être interprété comme étant secondaire à la perte de motoneurones. Pourtant, de nombreuses études ont inféré un rôle indépendant pour le muscle dans l'AMS. Ces études allaient d'analyses de cellules en culture démontrant un effet dommageable du muscle SMA sur les cocultures nerf-muscle (23, 56) à des évaluations de muscle intact et de marqueurs de myogenèse dans des tissus d'autopsie et des souris modèles (26, 57, 58). Cependant, étant donné que les expériences reposaient sur des cellules de patients ou des souris épuisées de manière ubiquitaire pour le SMN, il était impossible de vraiment séparer les effets dans les motoneurones de ceux intrinsèques au muscle. Les tentatives les plus directes pour déterminer les effets potentiels sur l'autonomie cellulaire du SMN musculaire faible sur le phénotype SMA ont conclu qu'une faible teneur en protéines dans ce tissu contribue peu à la maladie (25, 28).

Nos résultats contrastent fortement avec ceux de Iyer et al. ( 28 ). Une explication de la différence de résultats provient de notre choix de moteurs Cre. La robustesse et la spécificité de ces moteurs sont essentielles pour permettre de prédire avec précision les résultats dans le contexte d'une maladie. À cet égard, non seulement nous avons trouvé la ligne MyoD-iCre pour épuiser le SMN plus efficacement que le pilote Myf5-Cre, mais aussi pour le faire avec une plus grande spécificité tissulaire. Nos résultats ont été particulièrement révélateurs, démontrant que près de la moitié de tous les Myf5-Cre Smn F7/– les mutants ont non seulement vécu jusqu'à l'âge adulte, mais étaient également assez robustes pour se reproduire. Cela suggère fortement que la ligne Myf5-Cre n'a pas réussi à conduire efficacement la recombinaison au niveau du Smn F7 allèle, et il n'est donc pas étonnant que l'ajout SMN2 à Myf5-Cre Smn F7/– les souris masqueraient davantage tous les symptômes de la maladie - semblable à ce qui a été observé par Iyer et al. Une explication connexe pour les résultats contrastés est le fond allélique adopté dans les 2 études. Alors que les souris modèles utilisées par Iyer et al. hébergeait et exprimait un transgène SMNΔ7 artificiel, le nôtre non. Malgré des données fiables démontrant que la protéine SMNΔ7 est à elle seule non fonctionnelle, elle est néanmoins capable, de concert avec FL-SMN, de conférer une fonction partielle au complexe SMN et ainsi d'atténuer de manière significative la maladie (41, 59). Une dernière explication de l'incapacité à détecter un dysfonctionnement chez les souris générée par Iyer et al. réside probablement dans le fait que la prépondérance des analyses ont été menées dans des sujets relativement jeunes (8 semaines), SMN2 mutants. En effet, nous aussi, nous n'avons pas réussi à détecter des signes de pathologie cellulaire ou de maladie manifeste chez nos jeunes mutants adultes MyoD-iCre hébergeant 2 SMN2 copies. Un phénotype de la maladie n'est apparu qu'à l'âge de 6 à 7 mois. Nous pensons que cela aurait également été le cas si Iyer et ses collègues avaient analysé des mutants plus anciens. La différence entre nos résultats respectifs n'infirme pas l'affirmation de Iyer et al. que le traitement exclusif du tissu musculaire dans la SMA ne produira pas de bénéfice clinique. Cela reste probablement le cas, le bénéfice clinique optimal n'étant obtenu que lorsque la périphérie et le SNC sont restaurés pour la SMN.

Nos résultats ne sont pas tout à fait inattendus compte tenu du phénotype principalement neuromusculaire de l'AMS et des inférences d'un rôle indépendant du muscle dans la contribution à la maladie. Pourtant, à notre connaissance, les nôtres sont les premiers résultats à utiliser un modèle mammifère exprimant SMN2 pour montrer directement qu'un faible SMN dans le muscle squelettique produit une maladie d'une manière cellulaire autonome. Ceci est particulièrement pertinent d'un point de vue clinique, étant donné la promesse thérapeutique des agents de restauration du SMN. Deux d'entre eux, Spinraza et Zolgensma, ont maintenant reçu l'approbation réglementaire pour le traitement de la SMA. Cependant, leur utilisation est sujette aux mises en garde déjà évoquées. À la lumière de nos résultats, cette combinaison de facteurs justifie l'inquiétude pour les centaines de patients actuellement en traitement, en particulier si elles se limitent au SNC. Si, comme nos résultats précliniques le prédisent, la pathologie musculaire est une conséquence tardive d'un faible SMN dans le tissu, il est fort possible que les bénéfices initiaux du traitement intrathécal finissent par céder la place à un trouble musculaire chronique et insidieux d'apparition tardive. Les valeurs de CK sériques généralement élevées chez nos patients SMA traités par Spinraza et les niveaux particulièrement élevés de ce biomarqueur chez les patients ambulatoires par rapport aux patients non ambulatoires échantillonnés ont soutenu cette affirmation. . Le dysfonctionnement peut être arrêté et/ou inversé, comme le montre notre modèle, en augmentant le SMN dans le muscle, mais est encore une fois susceptible de dépendre du moment de l'intervention. Le muscle une fois perdu dans son intégralité sera difficile à remplacer.

Bien que les défauts musculaires de nos souris modèles et les implications thérapeutiques de ces dommages soient évidents, il reste à explorer précisément comment un faible SMN déclenche la pathologie. Certains ont suggéré des perturbations dans le processus de myogenèse (29, 57, 60, 61). Bien que cela puisse être vrai dans la forme la plus sévère de SMA, cela ne semble pas être le cas chez nos mutants, en particulier ceux exprimant 2 SMN2 copies. Chez ces mutants examinés à P7, nous avons trouvé peu de défauts musculaires. Nos données suggèrent plutôt des défauts dans l'entretien musculaire. Les défauts du maintien musculaire dans l'AMS n'ont jusqu'à présent été ni signalés ni soulignés - une conséquence probable de la gravité du phénotype et de la courte durée de vie des souris modèles examinées jusqu'à présent. Néanmoins, les défauts de maintenance restent une possibilité distincte et peuvent provenir de myofibres endommagées et/ou de cellules satellites. Les cellules satellites sont particulièrement actives au début du développement musculaire postnatal lorsqu'elles servent de sources de nouveaux myonoyaux (62). Après la vie prépubère chez les souris (âgées de 4 à 6 semaines), période au cours de laquelle les niveaux de SMN diminuent également considérablement (63), le nombre de ces cellules chute considérablement à mesure que les myofibres atteignent leurs dimensions adultes. Nous supposons que c'est au cours des semaines suivantes que les myofibres exprimant un faible SMN dégénèrent en nombre substantiel. Les cellules satellites peuvent initialement satisfaire la demande de renouvellement des fibres en dégénérescence. Cependant, un processus de dégénérescence accéléré accompagné d'un dysfonctionnement intrinsèque des cellules satellites appauvries en SMN finit par submerger la capacité de ces cellules souches à repeupler le muscle. Le dysfonctionnement des cellules satellites pourrait être déduit de l'écart entre le nombre beaucoup plus important de fibres présentant des noyaux centraux par rapport à ceux en dégénérescence active - comme évalué par l'absorption sérique d'IgG (Figure 6I). Une explication intrigante d'une telle disparité pourrait résider dans la capacité normale des cellules satellites appauvries en SMN à répondre aux dommages des fibres, mais dans un échec ultérieur des cellules à revenir à une quiescence. L'état constitutivement actif de ces cellules qui en résulte pourrait accélérer leur épuisement et donc la perte globale de fibres musculaires. Nos expériences CTX ont en outre suggéré que les niveaux de SMN affectaient gravement la régénération musculaire après une blessure. Si cela est vrai chez l'homme, les patients traités avec des médicaments qui restaurent le SMN exclusivement dans le SNC devront faire preuve de prudence. Une énigme apparente émergeant de nos observations est de savoir pourquoi une pathologie musculaire semblable à ce que nous avons observée n'a pas été largement rapportée dans la SMA classique. Nous pensons que la réponse réside principalement dans les effets masquants de la perte précoce des motoneurones. Une deuxième hypothèse intrigante se concentre sur la diaphonie entre le muscle et le nerf. Dans l'AMS classique, la santé des compartiments pré- et post-synaptiques est probablement compromise. Le sauvetage sélectif du motoneurone, comme on peut s'y attendre chez les patients traités par voie intrathécale, peut avoir pour résultat que le compartiment présynaptique sauvé impose une charge excessive sur le muscle. Les déterminants moléculaires sous-jacents à de telles perturbations de la signalisation au NMJ restent à explorer dans le contexte de la SMA. Nos souris modèles serviront d'outil utile pour étudier cette question et des questions plus larges centrées sur la signalisation requise entre les motoneurones et les muscles pour assurer la santé et la viabilité des deux types de cellules.

Souris. Des souris ROSA26-flox-STOP-flox-YFP (The Jackson Laboratory, n° de stock 006148) ont été génotypées selon les protocoles de https://www.jax.org/ MyoD-iCre ou Myf5-Cre SMA souris sans SMN2 (MyoD-Cre Smn F7/– ou Myf5-Cre Smn F7/– ) et des contrôles (Smn F7/– ) ont été générés par l'élevage de souris MyoD-iCre (The Jackson Laboratory, n° de stock 014140) ou Myf5-Cre (The Jackson Laboratory, n° de stock 007893) hétérozygotes pour Smn (Smn +/– Le laboratoire Jackson, code commande 006214) avec Smn F7/F7 animaux (Smn F7 , The Jackson Laboratory, code commande. 006138). Mutants MyoD-Cre SMA avec 1 ou 2 copies de SMN2 et contrôles (SMN2 +/– Smn F7/– , SMN2 +/+ Smn F7/– , ou MyoD-Cre SMN2 +/+ Smn F7/+ ) ont été générés en introduisant le SMN2 transgène (The Jackson Laboratory, n° de stock 005024) sur des animaux avec le pilote Cre et l'allèle floxed. Toutes les analyses sur 2 copies SMN2 souris ont été réalisées avec l'investigateur aveugle au phénotype. Un protocole similaire a été suivi pour le 1-copie SMN2 souris, à l'exception des études comportementales où un phénotype manifeste chez les mutants empêchait la mise en aveugle. Voir les méthodes supplémentaires pour plus de détails sur les amorces de génotypage.

Essais de comportement moteur. Les tests de tige rotative et de force de préhension ont été effectués à l'aide de la tige rotative LE8200 (Harvard Apparatus/Panlab Inc.) et du testeur de force de préhension BIOSEB BIO-GS3 (Bioseb Inc.), respectivement, conformément aux instructions du fabricant. Les détails de ces méthodes sont décrits dans les Méthodes supplémentaires.

Dosage de la CK sérique. Les souris ont été euthanasiées au CO2 gaz et 500 L de sang prélevés dans le ventricule droit à l'aide d'une aiguille de calibre 21. Le niveau de CK sérique a été mesuré par l'Institute of Comparative Medicine de l'Université de Columbia à l'aide d'un analyseur de chimie vétérinaire Element DC (Heska).

Neurone moteur, NMJ et histologie musculaire. L'histologie du motoneurone, de la NMJ et du muscle a été essentiellement réalisée comme décrit précédemment (42, 45). Des détails supplémentaires sont présentés dans les méthodes supplémentaires.

PCR, Western blots et analyses sur gel coloré à l'argent. Les tissus ont été lysés à l'aide de TRIzol (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Après la synthèse d'ADNc, une PCR quantitative a été réalisée en triple sur un MasterCycler Real Plex4 (Eppendorf). Les séquences d'amorces utilisées pour la qRT-PCR sont indiquées dans les méthodes supplémentaires. Le transfert de Western a été effectué comme décrit (13). L'analyse des isoformes de la chaîne lourde de la myosine a été effectuée selon un rapport antérieur (64), voir également Méthodes supplémentaires.

Expériences CTX et MO. Les souris ont été anesthésiées avec 1 % à 2 % d'isoflurane et une myonécrose induite avec du CTX. Une aiguille de calibre 30 a été utilisée pour injecter 20 L d'une solution à 10 M de CTX, dans du PBS, dans le ventre du gastrocnémien. La cardiotoxine a été délivrée uniformément dans les muscles du membre postérieur droit. Le membre postérieur gauche a été injecté avec des volumes identiques de PBS. Les souris ont été évaluées au point de référence (aucune injection) et à divers moments après les injections de CTX et de PBS, et les muscles des membres postérieurs ont été retirés, pesés et immédiatement utilisés pour préparer des lysats tissulaires ou des cryosections. Le SMN et les MO brouillés utilisés étaient identiques à ceux d'un rapport précédent (16). Chaque MO a été remis en suspension dans de l'eau stérile et aliquoté à une concentration finale de 0,5 mM. Les souris ont reçu les MO par voie i.p. injection (12,5 mg/kg) à P210.

Electrophysiologie. Électrophysiologie NMJ: L'électrophysiologie NMJ a été essentiellement réalisée comme décrit précédemment (46). Les expériences de contractilité musculaire ex vivo ont été réalisées sur la base de méthodes optimisées et précédemment utilisées (64). Les modifications apportées aux méthodes respectives de cette étude sont détaillées dans les méthodes supplémentaires.

Statistiques. Les courbes de survie de Kaplan-Meier ont été évaluées pour les différences en utilisant le test du log-rank équivalent au test de Mantel-Haenszel. L'étudiant non apparié à deux queues t test ou ANOVA à un facteur suivi de la comparaison post hoc de Tukey, le cas échéant, ont été utilisés pour comparer les moyennes des différences statistiques. Dans les cas où des variables binomiales catégoriques devaient être analysées, le test exact de Fisher a été utilisé. Les données sont représentées en moyenne ± SEM, sauf indication contraire. P les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives. Les analyses statistiques ont été réalisées avec Prism version 6.0 (GraphPad Software).

Approbation de l'étude. Toutes les procédures animales ont adhéré aux protocoles décrits dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press, 2011) et ont été approuvés par l'IACUC de l'Université de Columbia. Les sujets de cette étude étaient des souris mâles et femelles sélectionnées au hasard, issues d'un milieu mixte, hébergées dans un environnement contrôlé sur un cycle de lumière de 12 heures/12 heures d'obscurité avec de la nourriture et de l'eau.

JKK, NNJ et MRF ont réalisé la plupart des expériences décrites ici. ZF a évalué l'état fonctionnel des NMJ tandis que CPK a supervisé ces expériences et a fourni une contribution intellectuelle. CAC a contribué aux données des patients décrites dans cette étude. LWL a réalisé les études de contractilité musculaire ex vivo et RTD a dirigé cet aspect du projet. URM a conceptualisé les expériences, dirigé l'ensemble du projet et analysé et interprété les données. JKK et URM ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Nous remercions P. Faust et les membres du Columbia MNC pour leurs conseils et suggestions. Nous remercions également D.C. De Vivo pour son soutien au cours de cette étude. Ce projet a été financé par des subventions de l'AFM-France, de Cure SMA et du NIH (R21 NS099921, R01 NS057482 et R56 NS104218) à l'URM, NIH R01 AR059646-08 à RTD et la Fondation SMA au CPK.

Conflit d'intérêt: Les auteurs ont déclaré qu'il n'existe aucun conflit d'intérêts.


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RÉSULTATS

Effets de l'ajout de PBO et de MTX au régime alimentaire sur la sécrétion tubulaire de MTX

Nous avons d'abord examiné les effets du PBO ajouté à l'alimentation, seul ou en association avec le méthotrexate. Il n'y avait aucun effet de l'un ou l'autre régime expérimental sur les taux de sécrétion de liquide par les tubules de Malpighi isolés baignés dans une solution saline contenant 400 mol l –1 de MTX par rapport aux tubules isolés de mouches élevées avec le régime témoin (Fig. 1A).

En revanche, la concentration de MTX dans le liquide sécrété par les tubules de mouches élevées avec des régimes contenant du PBO ou à la fois du PBO et du MTX était plus du double de celle des témoins correspondants (Fig. 1B). En conséquence, la sécrétion de MTX par les tubules de mouches élevées avec des régimes contenant du PBO ou à la fois du PBO et du MTX a augmenté de 73 et 136%, respectivement, par rapport aux témoins (Fig. 1C).

Effets de l'exposition alimentaire au phénol pendant plusieurs générations sur la sécrétion tubulaire de MTX

Les activités de TPS augmentent en Drosophile élevé pendant plus de sept générations avec un régime contenant 0,3 % de phénol (Shen et al., 2003). Nous avons donc évalué si les augmentations de l'activité de la GST étaient corrélées avec une augmentation de la sécrétion du méthotrexate, substrat de la MRP.

Les taux de sécrétion liquidienne, la concentration liquide sécrétée de méthotrexate et les taux de sécrétion de méthotrexate des tubules isolés de mouches élevées avec un régime enrichi en phénol étaient similaires à ceux des groupes témoins des générations F0, F1 et F4 (Fig. 2). Cependant, il y avait une augmentation du taux de sécrétion de fluide de 46 et 65% pour les tubules des générations F7 et F10, respectivement, des mouches élevées avec un régime enrichi en phénol par rapport aux témoins (Fig. 2A). Il y avait également une augmentation de 43 et 50 % de la concentration de méthotrexate dans le liquide sécrété par les tubules des mouches des générations F7 et F10, respectivement, sur le régime enrichi en phénol (Fig. 2B). En conséquence de l'augmentation à la fois du taux de sécrétion de fluide et de la concentration de méthotrexate fluide sécrété, les tubules des mouches des générations F7 et F10 sur le régime enrichi en phénol ont sécrété du MTX à plus du double du taux des témoins correspondants (Fig. 2C).

Les effets de l'exposition chronique au butoxyde de pipéronyle alimentaire (PBO 1 mmol l –1 ) seul ou en association avec le méthotrexate (MTX 0,1 mmol l –1 ) sur (A) le taux de sécrétion liquidienne, (B) la concentration de MTX dans le liquide sécrété ([MTX]nf) et (C) flux transépithélial de MTX. Des tubules de Malpighi isolés ont été mis en place dans un essai de Ramsay contenant 400 μmol l –1 [ 3 H]MTX dans la solution saline de bain et les gouttelettes sécrétées ont été recueillies à 60 min. Les différences significatives entre les moyennes des mouches élevées sur un régime standard (barres témoins ouvertes) et sur des régimes expérimentaux (barres pleines) sont indiquées par des astérisques (*P<0.05, test t apparié, N=8-12). Les barres d'erreur sont +s.e.m.

Les effets de l'exposition chronique au butoxyde de pipéronyle alimentaire (PBO 1 mmol l –1 ) seul ou en association avec le méthotrexate (MTX 0,1 mmol l –1 ) sur (A) le taux de sécrétion liquidienne, (B) la concentration de MTX dans le liquide sécrété ([MTX]nf) et (C) flux transépithélial de MTX. Des tubules de Malpighi isolés ont été mis en place dans un essai de Ramsay contenant 400 μmol l –1 [ 3 H]MTX dans la solution saline de bain et les gouttelettes sécrétées ont été recueillies à 60 min. Les différences significatives entre les moyennes des mouches élevées sur un régime standard (barres ouvertes témoins) et sur des régimes expérimentaux (barres pleines) sont indiquées par des astérisques (*P<0.05, test t apparié, N=8-12). Les barres d'erreur sont +s.e.m.

Effets du PBO sur le métabolisme du MTX par les tubules de Malpighi

L'analyse du liquide sécrété par TLC a indiqué qu'il existe un seul métabolite du MTX Rfs pour le MTX et le métabolite étaient de 0,41 et 0,79, respectivement. Les Rf les valeurs pour les échantillons de liquide sécrété par les tubules de mouches élevées sur des régimes témoins et enrichis en PBO étaient les mêmes, ce qui indique que le PBO alimentaire ne modifie pas le nombre de métabolites. Cependant, la densitométrie ponctuelle a indiqué que, alors que 24,5 % du MTX était métabolisé en le composé avec une Rf de 0,79 dans les tubules témoins (tableau 2), 38,2 % de MTX ont été métabolisés en ce composé dans les tubules de mouches élevées avec un régime enrichi en PBO.

Chromatographie sur couche mince d'échantillons de fluide sécrété par les tubules de Malpighi de Drosophile mouches élevées avec différents régimes

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Effets du PBO et du MTX sur l'expression des gènes P450

L'exposition alimentaire au MTX a été associée à une réduction significative de l'expression relative de l'ARNm pour cinq gènes P450 dans les tubules de Malpighi par rapport aux tubules de mouches élevées avec le régime témoin (Fig. 3A). L'exposition alimentaire au PBO était associée à une réduction de l'expression de Cyp4e2 et Cyp4p1, aucun changement significatif dans l'expression de Cyp6a2 et Cyp6a8 et une augmentation de quatre fois de l'expression de Cyp12d1 par rapport aux témoins (Fig. 3B). L'exposition à la fois au MTX et au PBO n'a été associée à aucun changement dans Cyp4e2 et Cyp6a2, une réduction de l'expression de Cyp4p1 et une augmentation de 10 à 18 fois de l'expression de Cyp6a8 et Cyp12d1 (Fig. 3C).

Effets du MTX, du PBO et du phénol sur l'expression des gènes GST

L'exposition chronique au MTX dans l'alimentation était associée à une réduction de l'expression relative de GstD1 et GstE1 (Fig. 4A). L'exposition chronique au PBO ou à la fois au PBO et au MTX dans l'alimentation était associée à une réduction de l'expression de GstD1 et soit à une réduction (PBO) soit à aucun changement (PBO + MTX) pour GstD5 (Fig. 4B, C). L'expression de GstE1 a augmenté de 1,5 fois en réponse au PBO alimentaire (Fig. 4B) et il n'y a eu aucun changement significatif (P>0.1), par rapport aux témoins, dans l'expression de GstE1 en réponse à la fois au PBO et au MTX (Fig. 4C).

Effets de l'exposition alimentaire au phénol (0,3 %) pendant plusieurs générations (F0-F10) sur (A) le taux de sécrétion de liquide, (B) la concentration de MTX dans le liquide sécrété ([MTX]nf) et (C) flux transépithélial de MTX. Des tubules de Malpighi isolés ont été mis en place dans un essai de Ramsay contenant 400 μmol l –1 [ 3 H]MTX dans la solution saline de bain et les gouttelettes sécrétées ont été recueillies à 60 min. Les différences significatives entre les moyennes pour le contrôle (barres vides) et les groupes expérimentaux (barres pleines) sont indiquées par des astérisques (*P<0.05, apparié t-test, N=8-12). Les barres d'erreur sont +s.e.m.

Effets de l'exposition alimentaire au phénol (0,3 %) pendant plusieurs générations (F0-F10) sur (A) le taux de sécrétion de liquide, (B) la concentration de MTX dans le liquide sécrété ([MTX]nf) et (C) flux transépithélial de MTX. Des tubules de Malpighi isolés ont été mis en place dans un essai de Ramsay contenant 400 μmol l –1 [ 3 H]MTX dans la solution saline de bain et les gouttelettes sécrétées ont été recueillies à 60 min. Les différences significatives entre les moyennes pour le contrôle (barres vides) et les groupes expérimentaux (barres pleines) sont indiquées par des astérisques (*P<0.05, apparié t-test, N=8-12). Les barres d'erreur sont +s.e.m.

Lorsqu'il est ajouté au régime seul ou en combinaison avec du MTX pendant 10 générations, le phénol a été associé à des réductions de l'expression de GstD1 dans les tubules de Malpighi (Fig. 5A,B). Le phénol était associé à une réduction de GstD5 et à aucun changement dans l'expression de GstE1 (Fig. 5A). En revanche, l'exposition alimentaire à la fois au MTX et au phénol pendant 10 générations n'a entraîné aucun changement dans l'expression de GstD5 mais une multiplication par quatre de l'expression de GstE1 (Fig. 5B).

Expression de l'ARNm de cinq gènes du cytochrome P450 par rapport à l'expression de GAPDH1 dans des tubules de Malpighi adultes isolés de mouches élevées en régime standard (barres vides) ou en régimes expérimentaux (barres pleines) contenant (A) 0,1 mmol l –1 MTX, (B) 1 mmol l –1 PBO ou (C) à la fois PBO et MTX. Les différences significatives entre les moyennes des groupes témoins et expérimentaux sont indiquées par des astérisques (P<0.05, N=6-12). Les barres d'erreur sont +s.e.m.

Expression de l'ARNm de cinq gènes du cytochrome P450 par rapport à l'expression de GAPDH1 dans des tubules de Malpighi adultes isolés de mouches élevées en régime standard (barres vides) ou en régimes expérimentaux (barres pleines) contenant (A) 0,1 mmol l –1 MTX, (B) 1 mmol l –1 PBO ou (C) à la fois PBO et MTX. Les différences significatives entre les moyennes des groupes témoins et expérimentaux sont indiquées par des astérisques (P<0.05, N=6-12). Les barres d'erreur sont +s.e.m.

Effets du PBO et du MTX sur l'expression des gènes transporteurs

L'exposition chronique au PBO a été associée à une augmentation de 123 fois de l'expression de MET et à une augmentation de 27 fois de l'expression de dMRP, mais aucun changement dans l'expression de l'OATP (Fig. 6A). L'exposition chronique au PBO et au MTX dans l'alimentation a entraîné une augmentation de l'expression des trois gènes dans les tubules de Malpighi : 93 fois pour le MET, 267 fois pour le dMRP et 50 fois pour l'OATP (Fig. 6B).


F7. Liens et références - Biologie

Le gène F7 code pour le facteur de coagulation VII, qui est le zymogène du facteur de protéase sérique VIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K qui participe à la voie extrinsèque de la coagulation sanguine. Lors d'une lésion vasculaire, le facteur VII entre en contact avec le facteur tissulaire, également connu sous le nom de facteur III ou TFA (TF 134390), et est clivé en sa forme active : cette réaction est l'événement principal de la coagulation sanguine. Le complexe de facteur tissulaire et de facteur VII activé sert à activer les facteurs IX (F9 300746), X (F10 613872) et (autocatalytiquement) le facteur VII (résumé par O'Hara et al., 1987 et Millar et al., 2000) .

▼ Clonage et expression

Hagen et al. (1986) ont isolé des clones correspondant au gène F7 à partir d'une banque d'ADNc de foie humain. La protéine est synthétisée avec une séquence leader et la protéine circulante mature est un polypeptide à chaîne unique contenant 406 acides aminés. La conversion du facteur VII en facteur VIIa activé est due au clivage par sérine protéase de la liaison entre arg152 et ile153. La forme activée du facteur VII se compose d'une chaîne légère de 20 kD de 152 résidus avec des résidus d'acide gamma-carboxyglutamique et d'une chaîne lourde de 30 kD de 254 résidus, qui contient le domaine catalytique, les 2 chaînes sont maintenues ensemble par une liaison disulfure . Le facteur VII humain est hautement homologue à d'autres protéines dépendantes de la vitamine K, telles que le facteur IX (F9 300746), le facteur X (F10 613872), le facteur II (F2 176930) et la protéine C (PROC 612283).

O'Hara et al. (1987) ont déterminé la séquence nucléotidique du gène F7. L'ARNm du facteur VII est polyadénylé sur plusieurs sites et peut subir un épissage alternatif.

▼ Structure des gènes

O'Hara et al. (1987) ont déterminé que le gène F7 contient 9 exons et s'étend sur environ 12,8 kb.

▼ Cartographie

Le gène F7 correspond au chromosome 13q34 (Millar et al., 2000).

Par effets de dosage dans 7 cas de chromosome 13 anormal, Gilgenkrantz et al. (1986) ont cartographié les gènes F7 et F10 (613872) sur 13q34. Les facteurs de coagulation étaient augmentés dans la trisomie de ce segment et diminués dans la monosomie.

Tariverdian et al. (1986) ont trouvé un déficit en facteurs VII et X dans un cas de l'anneau 13. Le site de la cassure était cohérent avec la localisation des gènes dans le segment 13q34-qter.

▼ Fonction génique

La synthèse des facteurs VII et X (613872), ainsi que des facteurs II (176930) et IX (264900), a lieu dans le foie et nécessite de la vitamine K. Des homologies structurelles de ces facteurs, précurseurs des protéases à sérine, ont été mises en évidence. (Zur et Nemerson, 1981). Ratnoff et Bennett (1973) ont déclaré : « Bien qu'un argument convaincant puisse être avancé selon lequel (elles) sont dérivées d'une seule molécule, la plupart des preuves suggèrent qu'il s'agit de protéines distinctes.

Dans une discussion sur la biologie moléculaire et cellulaire de la coagulation sanguine, Furie et Furie (1992) ont présenté une figure comparant la structure des gènes de 5 proenzymes, 3 procofacteurs et 2 protéines régulatrices. Des similitudes et des différences intéressantes existaient pour les membres de chaque catégorie. Les 5 proenzymes étaient les facteurs VII, XI (264900), IX et X et la prothrombine les 3 procofacteurs étaient le facteur tissulaire et les facteurs VIII (F8 300841) et V (F5 612309) les protéines régulatrices étaient la protéine C (PROC 612283) et la protéine S (PROS1 176880).

Pike et al. (1999) ont décrit des différences structurelles subtiles qui se produisent dans le complexe facteur VIIa/facteur tissulaire, mettant ainsi en lumière le mécanisme de l'augmentation spectaculaire de l'activité du facteur VIIa induite par le facteur tissulaire.

Di Bitondo et al. (2002) ont utilisé l'analyse du gène rapporteur pour montrer que l'inclusion de régions promotrices (résidus -658 à -1 et -348 à -1) de F7 réduisait l'activité de transcription en présence de facteurs œstrogéniques. L'effet était indépendant de l'haplotype polymorphe du promoteur. Les auteurs ont localisé la séquence à laquelle le récepteur des œstrogènes se liait aux résidus -225 à -212 du promoteur F7. L'élément de réponse aux œstrogènes F7 représente un type alternatif, dans lequel les 2 demi-sites sont séparés par seulement 2 nucléotides espaceurs. Les auteurs ont présenté un mécanisme pour la relation inverse entre les niveaux de F7 et d'estradiol observés pendant le cycle menstruel.

▼ Génétique moléculaire

Girolami et al. (1977) ont observé un facteur VII qualitativement anormal, appelé Verona, associé à un déficit en facteur VII.

Déficit en facteur VII

Chez une femme italienne présentant une diathèse hémorragique due à un déficit sévère en facteur VII (227500), Arbini et al. (1996) ont identifié une hétérozygotie composée pour 2 mutations dans le gène F7 (613878.0005 et 613878.0008).

Cooper et al. (1997) ont passé en revue les études structure-fonction du facteur VII basées sur l'analyse de variants naturels, y compris les polymorphismes et les mutations sous-jacentes au déficit en facteur VII. Ils ont totalisé 30 substitutions différentes de paires de bases uniques et 4 courtes délétions. La plupart des lésions signalées responsables d'un déficit en facteur VII n'avaient été notées qu'une seule fois. Les exceptions notables comprenaient la mutation ala244-à-val (A244V 613878.0006) trouvée chez 23 homozygotes et 10 hétérozygotes d'origine juive marocaine/iranienne par Tamary et al. (1996).

Chez 2 frères et sœurs nourrissons, nés de parents consanguins, présentant un déficit sévère en facteur VII entraînant une mort prématurée due à une hémorragie intracrânienne, McVey et al. (1998) ont identifié une mutation du site d'épissage homozygote dans le gène F7 (613878.0008).

Wulff et Herrmann (2000) ont effectué un criblage de mutations chez 87 proposants non apparentés avec des activités de facteur VII réduites ou faibles. Parmi 101 allèles F7 de 77 proposants, 34 lésions différentes ont été trouvées, dont 22 étaient nouvelles. Les 34 lésions différentes comprenaient 31 mutations ponctuelles et 3 petites délétions. Une transition dans le doublet CpG représentait 12 des 34 mutants différents. Seize mutations ont été notées une seule fois. Les mutations de loin les plus courantes trouvées dans cette étude en Allemagne étaient la mutation faux-sens A294V (613878.0010) et la double mutation A294V/11128delC (613878.0012). Ces mutations sont localisées dans l'exon 8 à l'extrémité carboxy-terminale du gène, où se concentre le plus grand nombre de mutations provoquant un déficit en facteur VII. Les deux mutations sont également prévalentes chez les patients polonais et italiens (Arbini et al., 1994 Bernardi et al., 1994), indiquant qu'elles représentent les mutations F7 les plus fréquentes dans les populations européennes. Des études familiales ont montré le même haplotype pour les deux mutations.

Millar et al. (2000) ont séquencé le gène F7 chez 48 individus non apparentés présentant un déficit en facteur VII, produisant un total de 23 nouvelles lésions, dont 15 mutations faux-sens, 2 microdélétions, 5 mutations de jonction d'épissage et une seule substitution de paire de bases dans la région non traduite 5-prime.

McVey et al. (2001) ont décrit une base de données de mutations dans laquelle sont enregistrées les mutations du gène F7 de 238 individus décrits dans la littérature mondiale. Plusieurs polymorphismes ont été identifiés dans le gène F7 et il a été démontré que certains influencent les taux plasmatiques d'antigène du facteur VII.

En utilisant une combinaison de DGGE et de séquençage direct des 9 exons du gène F7, Giansily-Blaizot et al. (2001) ont étudié 37 patients non apparentés, principalement d'origine française et maghrébine, avec une activité coagulante du facteur VII inférieure à 5 % de la normale. Cette stratégie a permis la détection de 68 des 74 allèles mutés prédits (92 %). Au total, 40 mutations différentes ont été détectées dans le gène, dont 18 n'avaient pas été signalées auparavant. Les génotypes des patients présentant une diathèse hémorragique sévère comprenaient des mutations sur les deux allèles, ce qui a empêché la production d'une molécule de FVII fonctionnelle. Les auteurs ont suggéré que dans les groupes légers et asymptomatiques, une mutation non délétère sur un allèle peut permettre la libération d'une quantité infime de protéine FVII qui peut être suffisante pour déclencher la cascade hémostatique.

Diminution de la susceptibilité à l'infarctus du myocarde

Girelli et al. (2000) ont étudié 3 polymorphismes du gène F7 et ont découvert que 2 d'entre eux, le polymorphisme 5-prime F7 (613878.0013) et R353Q (613878.0014), affectent le niveau d'activité du facteur VII et réduisent le risque d'infarctus du myocarde (MI 608446) chez les patients atteints de maladie coronarienne. Ils ont étudié 444 patients, dont 311 avaient une athérosclérose coronarienne sévère documentée par angiographie. Sur ces 311 patients, 175 avaient des antécédents d'IM. Un groupe témoin, 133 patients avec des artériographies coronaires normales, a également été inclus dans l'étude. Le polymorphisme 5-prime F7 implique une insertion de 10 pb à la position -323 dans la région du promoteur 5-prime du gène F7, l'allèle A1 correspond à l'absence du décamère, et l'allèle A2 fait référence à son insertion. Les patients avec le génotype A2A2 avaient une réduction de 66 % de l'activité du facteur VII activé. Le polymorphisme R353Q implique une mutation faux-sens au codon 353 du gène F7, entraînant une substitution arg-à-glu. Les patients homozygotes pour l'allèle Q présentaient une réduction de 72 % de l'activité du facteur VII activé. Les allèles A2 et Q se sont avérés être en déséquilibre de liaison. Il y avait significativement plus d'hétérozygotes que d'homozygotes pour les allèles A2 et Q parmi ceux qui n'avaient pas eu d'IM que parmi ceux qui en avaient eu. L'odds ratio ajusté pour l'IM parmi les patients avec le génotype A1A2 ou RQ était de 0,47.

▼ Histoire

La possibilité d'un gène sur le chromosome 8 régulant le taux de facteur de coagulation VII (F7R, F7E) a été suggérée par l'observation d'un déficit de ce facteur chez 3 sujets trisomiques pour ce chromosome (de Grouchy et al., 1974). Fineman et al. (1975, 1979) pourraient corroborer les conclusions de de Grouchy et al. (1974) mais Stenbjerg et al. (1975) ne pouvait pas. De Grouchy et al. (1984) ont de nouveau conclu qu'un gène régulateur se trouve sur le chromosome 8 et ont également présenté des résultats compatibles avec l'attribution du gène de structure du facteur VII (et celui du facteur X) à 13q34. Dans une note ajoutée en preuve, de Grouchy et al. (1984) ont décrit un facteur VII normal chez un bébé atteint de trisomie 8p due à une duplication en tandem, suggérant que F7R pourrait être sur 8q. Cependant, Fagan et al. (1988), à partir d'études cytogénétiques et de coagulation chez 2 patients présentant différentes anomalies du chromosome 8, ont conclu que la localisation est 8p23.2-p23.1.

▼ Modèle animal

Les expériences d'inactivation du gène chez la souris indiquent que le facteur tissulaire est essentiel au développement embryonnaire au-delà du jour 9, les embryons homozygotes déficients en facteur tissulaire ne parvenant pas à développer une circulation du sac vitellin (Toomey et al., 1996). Comme le facteur VII est le seul ligand connu du facteur tissulaire, il est probable qu'un knock-out du facteur VII serait également mortel.

Le complexe F7a/TF catalyse l'activation des facteurs IX et X, permettant la génération ultérieure de thrombine et, finalement, la formation d'un caillot de thrombine. Alors que plusieurs protéines anticoagulantes existent pour réguler à la baisse différentes réactions du système de coagulation, par exemple la protéine C activée, la protéine S, le cofacteur II de l'héparine et l'antithrombine III, seul l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI 152310) est connu pour inhiber le complexe F7a/TF. Chan et al. (1999) ont généré des souris doublement hétérozygotes pour un allèle TFPI modifié dépourvu de son domaine 1 de type Kunitz et pour une déficience du gène F7. Les expériences d'accouplement ont indiqué que la descendance homozygote pour la modification TFPI mais avec l'allèle F7 de type sauvage et les souris homozygotes pour la déficience en F7 avec l'allèle sauvage TFPI présentaient des phénotypes précédemment détaillés (c. développement avec saignement périnatal sévère, respectivement). Étonnamment, les souris du génotype combiné (doublement homozygote) sont nées à la fréquence mendélienne attendue mais ont subi l'hémorragie périnatale fatale associée au génotype F7 -/-. Les souris porteuses du génotype hétérozygote F7 et homozygote mutant TFPI ont également été sauvées de la létalité associée au génotype sauvage F7 et homozygote mutant TFPI mais ont succombé à une coagulopathie de consommation périnatale. Ainsi, le sauvetage d'embryons mutants homozygotes TFPI, soit par un déficit en F7 homozygote ou hétérozygote, a suggéré que la diminution de l'activité de F7 exclut la nécessité d'une inhibition médiée par TFPI de la voie de coagulation F7a/facteur tissulaire pendant l'embryogenèse. De plus, les phénotypes de ces états de carence combinés suggèrent que F7 embryonnaire est produit chez les souris dès le jour embryonnaire 9,5 et que tout niveau de F7 maternel dans les embryons à un stade précoce est insuffisant pour provoquer une coagulopathie chez les souris mutantes homozygotes TFPI.

Pour déterminer si une perte supplémentaire du gène du facteur VII a influencé la coagulopathie observée chez les embryons et les nouveau-nés déficients en protéine C (PC -/-), Chan et al. (2000) ont croisé des souris doublement hétérozygotes pour les 2 facteurs pour produire une progéniture possédant les 9 combinaisons génotypiques prédites. Les embryons doublement nuls, bien que présents à leur fréquence mendélienne attendue, présentaient un phénotype qui n'avait été observé ni dans les embryons déficients en facteur VII ni en protéine C. À E12,5 jours après le coït, les embryons doublement nuls présentaient une coagulopathie intra- et extravasculaire qui a progressé avec une hémorragie concomitante substantielle et un œdème périphérique au jour E17,5, entraînant une mortalité immédiatement après la naissance. Les embryons FVII(+/-)/PC(-/-) ont montré un phénotype moins sévère, suggérant un effet de dosage génique. L'absence de sauvetage des embryons et des nouveau-nés PC-/- et l'augmentation de la coagulopathie résultant d'un déficit supplémentaire en FVII hétérozygote ou homozygote étaient dues à une augmentation du facteur Xa (613872) et de la génération de thrombine, résultant de la perte de la voie du facteur tissulaire dépendant du FVIIa. fonction inhibitrice et l'absence de contrôle au niveau des facteurs Va et VIIIa. La présence de fibrine dans les embryons en l'absence de facteur VII fœtal a suggéré qu'un potentiel significatif de génération de caillots existe en dehors de la voie dépendante du facteur VII embryonnaire.

▼ VARIANTES ALLÉLIQUES ( 24 exemples sélectionnés) :

.0001 FACTEUR VII PADOUE

Chez un homme de 47 ans sans tendance hémorragique clinique mais avec une activité plasmatique du facteur VII indétectable lors d'un test en une étape utilisant le facteur tissulaire cérébral de lapin, O'Brien et al. (1991) ont identifié une transition hétérozygote G-à-A dans le gène F7, entraînant une substitution arg304-à-gln (R304Q). Le plasma du patient a montré des taux normaux d'antigène du facteur VII. Le résidu arg304 est homologue à arg333 du facteur IX, et une mutation arg333-à-gln dans F9 (300746.0056) a été identifiée chez des patients atteints d'hémophilie B sévère (306900) chez lesquels il y a synthèse et expression de la protéine du facteur IX.

Marchetti et al. (1992) ont identifié une substitution R304Q hétérozygote dans le gène F7 comme base du facteur VII anormal de Padoue, décrit par Girolami et al. (1982) chez des personnes originaires de la vallée de la rivière Piave dans le nord-est de l'Italie. Les individus décrits par Girolami et al. (1982) étaient asymptomatiques, mais présentaient une légère prolongation du temps de Quick. L'activité du facteur VII variait entre 45 % et 61 % de la normale, mais le matériel de réaction croisée avec le facteur VII était normal. Une bonne corrélation négative a été trouvée entre le taux de facteur VII et les temps de prothrombine.

.0002 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez 2 patients de différentes régions d'Italie présentant un déficit en facteur VII (227500), Marchetti et al. (1992) ont trouvé une transversion G-à-T dans le gène F7, entraînant une substitution cys310-à-phe (C310F), qui supprimait une liaison disulfure conservée dans le domaine catalytique de toutes les protéases à sérine.Dans la forme homozygote, la mutation a provoqué une réduction sévère de l'activité de la protéase (4 %).

.0003 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un patient présentant un antigène F7 et une activité F7 au niveau de 30 % et 37 %, respectivement, compatibles avec un déficit partiel en facteur VII (227500), Marchetti et al. (1993) ont identifié une transition hétérozygote G-à-A dans l'exon 7 du gène F7, entraînant une substitution cys178-à-tyr (C178Y) dans le domaine catalytique. L'anomalie a été détectée lors d'un test de dépistage préopératoire. Des dimorphismes neutres ont également été trouvés : un dans le codon 115 pour l'histidine et un autre dans le codon 353 pour l'arginine (R353Q 613878.0014).

.0004 CARENCE EN FACTEUR VII

Ohiwa et al. (1994) ont trouvé un déficit homozygote asymptomatique en facteur VII (227500) dans une famille déterminée par un proposita de 45 ans qui avait un temps de prothrombine prolongé. Le niveau d'antigène facteur VII dans le cas index était de 25,9 % de la normale et le niveau d'activité du facteur VII était de 28 % et 24 %, selon le test utilisé. Presque les mêmes niveaux réduits d'antigène et d'activité du facteur VII ont été trouvés chez 2 de ses sœurs, et ses parents, qui étaient des cousins ​​germains, un fils, une fille et une nièce avaient des niveaux modérément réduits d'activité et d'antigène du facteur VII. Des études moléculaires ont identifié une transition G-à-A dans l'exon 8, entraînant une substitution arg247-à-his (R247H). Des tests d'expression transitoire ont suggéré que la substitution conduit à une déficience en facteur VII en altérant la sécrétion de la protéine mutée. Cette mutation a été désignée facteur VII Mie.

.0005 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez une femme italienne de 36 ans présentant un déficit sévère en facteur VII (227500), Arbini et al. (1996) ont identifié une hétérozygotie composée pour 2 mutations dans le gène F7 : une transition 1994C-T, entraînant une substitution thr359-à-met (T359M), et une transition G-à-A dans l'intron 4 (613878.0008), entraînant un défaut d'épissage et un traitement anormal de l'ARNm. Des études d'expression cellulaire ont montré que la protéine mutante T359M s'accumulait de manière intracellulaire et qu'aucun facteur VII n'était détecté dans le milieu après 3 heures de chasse. Les chaînes latérales glucidiques associées à la protéine mutante T359M étaient sensibles à la digestion par l'endo-bêta-N-acétylglucosaminidase H (endo H), ce qui indiquait que la protéine était retenue dans le réticulum endoplasmique. Arbini et al. (1996) ont conclu que la mutation T359M dans F9 entraîne un grave défaut de sécrétion qui est probablement la conséquence d'un repliement anormal de la molécule. Le patient avait des épistaxis récurrentes, une ecchymose facile, une ménorragie, une hémarthrose du genou droit et une hémorragie importante après extraction dentaire. Un frère du patient est décédé à l'âge de 7 ans d'une épistaxis incontrôlée.

.0006 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez 13 patients israéliens présentant un déficit en facteur VII (225700), Tamary et al. (1996) ont identifié une transition homozygote 10648C-T dans le gène F7, entraînant une substitution ala244-à-val (A244V). La mutation était associée à une diminution de l'activité du facteur VII et des niveaux d'antigène. Dix autres patients étaient hétérozygotes pour la mutation. Sur les 36 allèles A244V, 20 ont été observés chez des patients d'origine marocaine, 10 chez des patients juifs iraniens et 6 chez des patients d'autres origines ethniques. Un modèle informatique du domaine sérine protéase du facteur VII suggéré à Tamary et al. (1996) que la substitution A244V peut provoquer une distorsion de la structure entière de la protéine. Les analyses de sites polymorphes intragéniques (analyse des haplotypes) ont révélé un effet fondateur pour les patients marocains et juifs irano-iraniens. La mutation A244V s'est avérée avoir une fréquence allélique de 1:42,5 chez les Juifs marocains et de 1:40 chez les Juifs iraniens. Comme les Juifs marocains sont séparés des Juifs iraniens depuis plus de 2 000 ans, les données suggèrent que la mutation A244V s'est produite dans les temps anciens.

.0007 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez les membres affectés d'une parenté présentant un déficit en facteur VII (613878), Leonard et al. (1998) ont identifié une transition 5989G-A hétérozygote dans l'exon 5 du gène F7, entraînant un changement d'acide aminé asn75 à asp (N57D) dans le domaine EGF1 de la protéine du facteur VII. Les individus ont montré une activité procoagulante réduite par rapport à l'antigène du facteur VII. Des tests d'expression fonctionnelle in vitro ont montré que la mutation N57D affecte le repliement du premier domaine EGF1 entraînant une diminution de la sécrétion cellulaire d'un mutant F7 qui est incapable de se lier au facteur tissulaire et est donc biologiquement inactif.

.0008 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez 2 frères et sœurs, nés de parents consanguins, avec un déficit sévère en facteur VII (227500), McVey et al. (1998) ont identifié une transition homozygote G-à-A dans l'intron 4 du gène F7, entraînant une mutation du site d'épissage, le saut de l'exon 4 et un ARNm codant pour le facteur VII avec une délétion dans le cadre de la première croissance épidermique domaine de type facteur. La mutation s'est produite au niveau d'un dinucléotide GT invariant au site d'épissage 5-prime de l'intron 4. Un petit frère et une petite sœur sont décédés à l'âge de 10 jours et 1 mois, respectivement, d'une hémorragie intracrânienne liée à un déficit sévère en facteur VII, les parents n'ont pas été affectés. Dans cette famille, un déficit complet en facteur VII a été associé à une diathèse hémorragique sévère mais aucune anomalie du développement, suggérant que le facteur VII fœtal n'est pas requis pour les fonctions angiogéniques putatives du facteur tissulaire (F3 134390) chez l'homme.

.0009 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un homme japonais de 82 ans présentant des polypes du côlon chez qui un déficit en facteur VII (227500) a été découvert au cours d'études préopératoires, Ozawa et al. (1998) ont identifié une transition 38T-C homozygote dans le gène F7, entraînant une substitution leu-à-pro au codon -26 (L-26P) dans le noyau hydrophobe du peptide signal. Cette substitution devrait affecter la translocation de la protéine dans le réticulum endoplasmique et entraîner une réduction des taux plasmatiques de facteur VII. Le patient n'a pas eu d'épisodes hémorragiques, le variant a été appelé facteur VII Morioka.

.0010 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez 2 frères et sœurs présentant un déficit partiel en facteur VII (227500), Bernardi et al. (1994) ont identifié une hétérozygotie composée pour 2 mutations dans le gène F7 : une transition 10798C-T dans l'exon 8, entraînant une substitution ala294-à-val (A294V), et une délétion de 17 pb conduisant à un décalage du cadre de lecture et à une terminaison prématurée au codon 255 (613878.0011). Les taux d'antigène du facteur VII étaient de 38 % et 25 % de la normale, et les taux d'activité étaient de 18 % et 7 % de la normale, respectivement.

Dans une étude en Allemagne, Wulff et Herrmann (2000) ont découvert que la mutation faux-sens A294V et la double mutation A294V/11128delC (613878.0012) étaient de loin les plus répandues.

.0011 CARENCE EN FACTEUR VII

Pour la discussion de la délétion de 17 pb dans le gène F7 qui a été trouvée à l'état hétérozygote composé chez les patients présentant un déficit partiel en facteur VII (227500) par Bernardi et al. (1994), voir 613878.0010.

.0012 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un patient polonais présentant un déficit en facteur VII (227500), Arbini et al. (1994) ont identifié une délétion homozygote de 1 pb (11128delC) dans le gène F7, frameshift. Les niveaux d'antigène et d'activité du facteur VII étaient inférieurs à 4 % de la normale.

.0013 INFARCT DU MYOCARDE, DIMINUTION DE LA SENSIBILITÉ À

Girelli et al. (2000) ont découvert qu'une insertion de 10 pb à la position -323 dans le promoteur F7, connue sous le nom de polymorphisme F7 5-prime, était associée à une réduction substantielle du risque d'infarctus du myocarde (608446) chez les patients atteints d'une maladie grave, documentée par angiographie athérosclérose coronarienne. L'allèle A2, comme l'insertion de 10 pb est désignée, a été trouvé en homozygotie chez environ 4 % des patients et des témoins. L'allèle A2 s'est avéré être en déséquilibre de liaison avec le polymorphisme R353Q (613878.0014), qui est indépendamment associé à une diminution de l'incidence d'IM chez les patients atteints d'athérosclérose coronarienne documentée. Les patients avec le génotype A2A2 avaient un niveau de facteur VII activé qui était 66% inférieur aux niveaux de ceux avec le génotype de type sauvage.

.0014 INFARCT DU MYOCARDE, DIMINUTION DE LA SENSIBILITÉ À

Girelli et al. (2000) ont découvert que les individus porteurs d'un polymorphisme arg353-à-gln (R353Q) dans le gène F7 présentaient une incidence nettement réduite d'infarctus du myocarde (608446) malgré une athérosclérose coronarienne sévère documentée par angiographie. Le génotype QQ était associé à une réduction de 72 % de l'activité du facteur VII activé par rapport au génotype de type sauvage. Les porteurs hétérozygotes de l'allèle Q avaient un risque d'IM de 0,47 par rapport aux patients avec le génotype de type sauvage (IC à 95 %, 0,27-0,81). L'allèle Q s'est avéré être en déséquilibre de liaison avec l'allèle A2 du polymorphisme 5-prime F7 (613878.0013). Chacun était indépendamment associé à une diminution du risque d'IM chez les patients atteints d'athérosclérose coronarienne sévère.

.0015 CARENCE EN FACTEUR VII

Arbini et al. (1997) ont identifié une substitution homozygote T-à-G en position -61 dans la région régulatrice 5-prime du gène F7 chez un patient présentant un déficit sévère en facteur VII (227500). La mutation a complètement éliminé l'interaction avec le récepteur nucléaire orphelin HNF4 (600281). Dans les dosages du gène rapporteur de l'hormone de croissance, l'activité d'un plasmide contenant le promoteur mutant était de 6,7 % du type sauvage. Les résultats ont indiqué que HNF4 exerce un effet régulateur positif majeur sur l'expression de F7 et ont fourni des preuves in vivo que la liaison de ce facteur de transcription est critique pour l'expression normale du facteur VII.

.0016 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un patient canadien-français issu d'une famille consanguine présentant un déficit sévère en facteur VII (227500), Carew et al. (1998) ont identifié une transversion C-à-G homozygote à la position -94 dans la région régulatrice 5-prime du gène F7. La mutation a empêché la liaison et la transactivation par Sp1 (189906) et d'autres protéines nucléaires. Le patient présentait des taux plasmatiques résiduels d'antigène du facteur VII et d'activité coagulante du facteur VII inférieurs à 1 %, et présentait des hémarthroses et une arthropathie chronique. Les données ont souligné l'importance de cette région du promoteur F7 pour l'expression in vivo du gène F7.

.0017 CARENCE EN FACTEUR VII

Carew et al. (2000) ont décrit un homme polonais de 25 ans présentant un déficit sévère en facteur VII (227500) qui était hétérozygote composé pour 2 mutations du gène F7. L'allèle paternel contenait 3 anomalies génétiques structurelles et l'allèle maternel portait une transition C-à-T à la position -55 par rapport au site de début de la traduction. Cette mutation a partiellement entravé la liaison de l'activateur transcriptionnel HNF4 (600281) au promoteur F7 tout en réduisant considérablement l'expression du gène rapporteur dans les cellules hépatiques.

.0018 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez une femme chinoise de 55 ans présentant un déficit en facteur VII (225700), Au et al. (2000) ont identifié une hétérozygotie composée pour 2 mutations dans le gène F7 : une transversion 6003C-A dans l'exon 4, entraînant une substitution cys61-à-ter (C61X), et une transversion 10902T-G dans l'exon 8, entraînant une cys329 substitution -à-gly (C329G 613878.0019). Elle s'est présentée avec une hémoptysie et une douleur à l'épaule droite, et s'est avérée avoir une arthrite de l'épaule droite compatible avec une arthropathie hémophilique chronique. Elle avait eu 3 accouchements vaginaux non compliqués et n'a signalé aucun antécédent de saignement anormal. Cependant, ses 2 jeunes frères seraient morts de saignements, l'un à la naissance et l'autre à l'âge de 9 mois. Deux filles étaient hétérozygotes pour la première de ces mutations et présentaient un phénotype compatible avec une mutation non-sens. Une fille était hétérozygote pour la mutation C329G et présentait des niveaux d'antigène normaux, compatibles avec une mutation faux-sens. Au et al. (2000) ont déclaré qu'il s'agissait des premières mutations F7 rapportées en chinois.

.0019 CARENCE EN FACTEUR VII

Pour la discussion de la mutation cys329-to-gly (C329G) dans le gène F7 qui a été trouvée à l'état hétérozygote composé chez un patient présentant un déficit en facteur VII (225700) par Au et al. (2000), voir 613878.0018.

.0020 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un garçon japonais de 10 mois présentant des saignements intrathoraciques récurrents, des hémorragies cérébrales et des saignements gastro-intestinaux secondaires à un déficit sévère en facteur VII (227500), Takamiya et Okimoto (2001) ont trouvé une hétérozygotie composée pour 2 mutations du gène F7 : un 11099C- transition T dans l'exon 8, entraînant une mutation gln211-to-ter (Q211X) et un changement G-to-A au nucléotide 6071 (noté 6070 ailleurs), dans le dinucléotide GT invariant au site d'épissage 5-prime de intron 4 (613878.0008).

.0021 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un homme japonais asymptomatique de 46 ans présentant une activité du facteur VII et des taux d'antigène respectivement de 1,2 % et 21 % de la normale, Nagaizumi et al. (2002) ont trouvé 2 nouvelles mutations dans le gène F7 : une transition 3895G-A dans l'exon 2, entraînant une mutation glu25-to-lys (E25K), et une transversion 10961T-G dans l'exon 8, entraînant une mutation his348-à- -gln (H348Q 613878.0022). Les résultats étaient compatibles avec un déficit partiel en facteur VII (227500). Les auteurs ont déclaré que les deux mutations étaient «à l'état doublement hétérozygote», mais auraient dû dire «à l'état hétérozygote composé», car la double hétérozygotie est l'hétérozygotie à chacun des 2 loci distincts.

.0022 CARENCE EN FACTEUR VII

Pour la discussion de la mutation his348-vers-gln (H348Q) dans le gène F7 qui a été trouvée à l'état hétérozygote composé chez un patient présentant un déficit partiel en facteur VII (227500) par Nagaizumi et al. (2002), voir 613878.0021.

.0023 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez une femme japonaise souffrant d'épistaxis occasionnelle, Takamiya et Hino (2004) ont trouvé de faibles niveaux d'activité coagulante et d'antigène du facteur VII (227500). Elle était homozygote pour une mutation gly354-to-cys (G354C) dans le domaine catalytique de la protéine. L'analyse des haplotypes a montré que cette mutation était héritée de ses parents consanguins. Bien que le facteur VII intracellulaire cys354 ait été estimé à 67 % de la protéine normale, dans le milieu au cours des expériences d'expression transitoire, l'activité antigénique et coagulante a été réduite à 5 % et 4 %, respectivement, des niveaux sécrétés par le facteur VII de type sauvage. Takamiya et Hino (2004) ont suggéré que l'introduction d'un résidu de cystéine libre supplémentaire dans la molécule de facteur VII entraînait la formation de liaisons disulfure illégitimes et un domaine mal replié, conduisant à une sécrétion défectueuse.

.0024 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un homme de 24 ans présentant un déficit sévère en facteur VII (227500), Bharadwaj et al. (1996) ont identifié une transition homozygote 10907T-C dans l'exon 8 du gène F7, entraînant une substitution phe328-to-ser (F328S) dans le domaine catalytique de la protéine. L'antigène plasmatique du facteur VII du patient était à 38 % de la normale, mais l'activité du facteur VII était inférieure à 1 % de la normale. Des études d'expression fonctionnelle ont montré que la protéine mutante avait une affinité réduite de 2 fois pour le facteur tissulaire et n'a pas réussi à activer le facteur X (voir 227600) ou IX (300746) en présence de facteur tissulaire après activation par le facteur Xa. Le taux d'activation du facteur VII F328S mutant par le facteur Xa était nettement diminué par rapport au type sauvage. La modélisation informatique et les simulations de dynamique moléculaire ont suggéré que l'incapacité du facteur VIIa F328S à cliver les substrats résultait de la formation apparente d'une liaison hydrogène entre tyr377 et asp338, un résidu au fond de la poche de liaison au substrat important pour l'interaction du substrat côté arginine chaînes avec l'enzyme. Bharadwaj et al. (1996) ont conclu que phe328, qui est conservé dans la prothrombine (176930), le facteur IX, le facteur X, le facteur VII et la trypsine (276000), est important pour la catalyse du facteur VIIa.

▼ Voir également:

▼ LES RÉFÉRENCES

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* 613878

FACTEUR DE COAGULATION VII F7

Symboles des titres alternatifs

FACTEUR VII

Symbole de gène approuvé par HGNC : F7

Localisation cytogénétique : 13q34 Coordonnées génomiques (GRCh38) : 13:113,105,772-113,120,684 (de NCBI)

Relations gène-phénotype

Emplacement Phénotype Phénotype
Numéro MIM
Héritage Phénotype
clé de mappage
13q34 608446 3
Déficit en facteur VII 227500 Autosomique récessif 3

TEXTE

La description

Le gène F7 code pour le facteur de coagulation VII, qui est le zymogène du facteur de protéase sérique VIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K qui participe à la voie extrinsèque de la coagulation sanguine. Lors d'une lésion vasculaire, le facteur VII entre en contact avec le facteur tissulaire, également connu sous le nom de facteur III ou TFA (TF 134390), et est clivé en sa forme active : cette réaction est l'événement principal de la coagulation sanguine. Le complexe de facteur tissulaire et de facteur VII activé sert à activer les facteurs IX (F9 300746), X (F10 613872) et (autocatalytiquement) le facteur VII (résumé par O'Hara et al., 1987 et Millar et al., 2000) .

Clonage et expression

Hagen et al. (1986) ont isolé des clones correspondant au gène F7 à partir d'une banque d'ADNc de foie humain. La protéine est synthétisée avec une séquence leader et la protéine circulante mature est un polypeptide à chaîne unique contenant 406 acides aminés. La conversion du facteur VII en facteur VIIa activé est due au clivage par sérine protéase de la liaison entre arg152 et ile153. La forme activée du facteur VII se compose d'une chaîne légère de 20 kD de 152 résidus avec des résidus d'acide gamma-carboxyglutamique et d'une chaîne lourde de 30 kD de 254 résidus, qui contient le domaine catalytique, les 2 chaînes sont maintenues ensemble par une liaison disulfure . Le facteur VII humain est hautement homologue à d'autres protéines dépendantes de la vitamine K, telles que le facteur IX (F9 300746), le facteur X (F10 613872), le facteur II (F2 176930) et la protéine C (PROC 612283).

O'Hara et al. (1987) ont déterminé la séquence nucléotidique du gène F7. L'ARNm du facteur VII est polyadénylé sur plusieurs sites et peut subir un épissage alternatif.

Structure des gènes

O'Hara et al. (1987) ont déterminé que le gène F7 contient 9 exons et s'étend sur environ 12,8 kb.

Cartographie

Le gène F7 correspond au chromosome 13q34 (Millar et al., 2000).

Par effets de dosage dans 7 cas de chromosome 13 anormal, Gilgenkrantz et al. (1986) ont cartographié les gènes F7 et F10 (613872) sur 13q34. Les facteurs de coagulation étaient augmentés dans la trisomie de ce segment et diminués dans la monosomie.

Tariverdian et al. (1986) ont trouvé un déficit en facteurs VII et X dans un cas de l'anneau 13. Le site de la cassure était cohérent avec la localisation des gènes dans le segment 13q34-qter.

Fonction génique

La synthèse des facteurs VII et X (613872), ainsi que des facteurs II (176930) et IX (264900), a lieu dans le foie et nécessite de la vitamine K. Des homologies structurelles de ces facteurs, précurseurs des protéases à sérine, ont été mises en évidence. (Zur et Nemerson, 1981). Ratnoff et Bennett (1973) ont déclaré : « Bien qu'un argument convaincant puisse être avancé selon lequel (elles) sont dérivées d'une seule molécule, la plupart des preuves suggèrent qu'il s'agit de protéines distinctes.

Dans une discussion sur la biologie moléculaire et cellulaire de la coagulation sanguine, Furie et Furie (1992) ont présenté une figure comparant la structure des gènes de 5 proenzymes, 3 procofacteurs et 2 protéines régulatrices. Des similitudes et des différences intéressantes existaient pour les membres de chaque catégorie. Les 5 proenzymes étaient les facteurs VII, XI (264900), IX et X et la prothrombine les 3 procofacteurs étaient le facteur tissulaire et les facteurs VIII (F8 300841) et V (F5 612309) les protéines régulatrices étaient la protéine C (PROC 612283) et la protéine S (PROS1 176880).

Pike et al. (1999) ont décrit des différences structurelles subtiles qui se produisent dans le complexe facteur VIIa/facteur tissulaire, mettant ainsi en lumière le mécanisme de l'augmentation spectaculaire de l'activité du facteur VIIa induite par le facteur tissulaire.

Di Bitondo et al. (2002) ont utilisé l'analyse du gène rapporteur pour montrer que l'inclusion de régions promotrices (résidus -658 à -1 et -348 à -1) de F7 réduisait l'activité de transcription en présence de facteurs œstrogéniques. L'effet était indépendant de l'haplotype polymorphe du promoteur. Les auteurs ont localisé la séquence à laquelle le récepteur des œstrogènes se liait aux résidus -225 à -212 du promoteur F7. L'élément de réponse aux œstrogènes F7 représente un type alternatif, dans lequel les 2 demi-sites sont séparés par seulement 2 nucléotides espaceurs. Les auteurs ont présenté un mécanisme pour la relation inverse entre les niveaux de F7 et d'estradiol observés pendant le cycle menstruel.

Génétique moléculaire

Girolami et al. (1977) ont observé un facteur VII qualitativement anormal, appelé Verona, associé à un déficit en facteur VII.

Déficit en facteur VII

Chez une femme italienne présentant une diathèse hémorragique due à un déficit sévère en facteur VII (227500), Arbini et al. (1996) ont identifié une hétérozygotie composée pour 2 mutations dans le gène F7 (613878.0005 et 613878.0008).

Cooper et al. (1997) ont passé en revue les études structure-fonction du facteur VII basées sur l'analyse de variants naturels, y compris les polymorphismes et les mutations sous-jacentes au déficit en facteur VII. Ils ont totalisé 30 substitutions différentes de paires de bases uniques et 4 courtes délétions. La plupart des lésions signalées responsables d'un déficit en facteur VII n'avaient été notées qu'une seule fois. Les exceptions notables comprenaient la mutation ala244-à-val (A244V 613878.0006) trouvée chez 23 homozygotes et 10 hétérozygotes d'origine juive marocaine/iranienne par Tamary et al. (1996).

Chez 2 frères et sœurs nourrissons, nés de parents consanguins, présentant un déficit sévère en facteur VII entraînant une mort prématurée due à une hémorragie intracrânienne, McVey et al. (1998) ont identifié une mutation du site d'épissage homozygote dans le gène F7 (613878.0008).

Wulff et Herrmann (2000) ont effectué un criblage de mutations chez 87 proposants non apparentés avec des activités de facteur VII réduites ou faibles. Parmi 101 allèles F7 de 77 proposants, 34 lésions différentes ont été trouvées, dont 22 étaient nouvelles. Les 34 lésions différentes comprenaient 31 mutations ponctuelles et 3 petites délétions. Une transition dans le doublet CpG représentait 12 des 34 mutants différents. Seize mutations ont été notées une seule fois. Les mutations de loin les plus courantes trouvées dans cette étude en Allemagne étaient la mutation faux-sens A294V (613878.0010) et la double mutation A294V/11128delC (613878.0012). Ces mutations sont localisées dans l'exon 8 à l'extrémité carboxy-terminale du gène, où se concentre le plus grand nombre de mutations provoquant un déficit en facteur VII. Les deux mutations sont également prévalentes chez les patients polonais et italiens (Arbini et al., 1994 Bernardi et al., 1994), indiquant qu'elles représentent les mutations F7 les plus fréquentes dans les populations européennes. Des études familiales ont montré le même haplotype pour les deux mutations.

Millar et al. (2000) ont séquencé le gène F7 chez 48 individus non apparentés présentant un déficit en facteur VII, produisant un total de 23 nouvelles lésions, dont 15 mutations faux-sens, 2 microdélétions, 5 mutations de jonction d'épissage et une seule substitution de paire de bases dans la région non traduite 5-prime.

McVey et al. (2001) ont décrit une base de données de mutations dans laquelle sont enregistrées les mutations du gène F7 de 238 individus décrits dans la littérature mondiale. Plusieurs polymorphismes ont été identifiés dans le gène F7 et il a été démontré que certains influencent les taux plasmatiques d'antigène du facteur VII.

En utilisant une combinaison de DGGE et de séquençage direct des 9 exons du gène F7, Giansily-Blaizot et al. (2001) ont étudié 37 patients non apparentés, principalement d'origine française et maghrébine, avec une activité coagulante du facteur VII inférieure à 5 % de la normale. Cette stratégie a permis la détection de 68 des 74 allèles mutés prédits (92 %). Au total, 40 mutations différentes ont été détectées dans le gène, dont 18 n'avaient pas été signalées auparavant. Les génotypes des patients présentant une diathèse hémorragique sévère comprenaient des mutations sur les deux allèles, ce qui a empêché la production d'une molécule de FVII fonctionnelle. Les auteurs ont suggéré que dans les groupes légers et asymptomatiques, une mutation non délétère sur un allèle peut permettre la libération d'une quantité infime de protéine FVII qui peut être suffisante pour déclencher la cascade hémostatique.

Diminution de la susceptibilité à l'infarctus du myocarde

Girelli et al. (2000) ont étudié 3 polymorphismes du gène F7 et ont découvert que 2 d'entre eux, le polymorphisme 5-prime F7 (613878.0013) et R353Q (613878.0014), affectent le niveau d'activité du facteur VII et réduisent le risque d'infarctus du myocarde (MI 608446) chez les patients atteints de maladie coronarienne.Ils ont étudié 444 patients, dont 311 avaient une athérosclérose coronarienne sévère documentée par angiographie. Sur ces 311 patients, 175 avaient des antécédents d'IM. Un groupe témoin, 133 patients avec des artériographies coronaires normales, a également été inclus dans l'étude. Le polymorphisme 5-prime F7 implique une insertion de 10 pb à la position -323 dans la région du promoteur 5-prime du gène F7, l'allèle A1 correspond à l'absence du décamère, et l'allèle A2 fait référence à son insertion. Les patients avec le génotype A2A2 avaient une réduction de 66 % de l'activité du facteur VII activé. Le polymorphisme R353Q implique une mutation faux-sens au codon 353 du gène F7, entraînant une substitution arg-à-glu. Les patients homozygotes pour l'allèle Q présentaient une réduction de 72 % de l'activité du facteur VII activé. Les allèles A2 et Q se sont avérés être en déséquilibre de liaison. Il y avait significativement plus d'hétérozygotes que d'homozygotes pour les allèles A2 et Q parmi ceux qui n'avaient pas eu d'IM que parmi ceux qui en avaient eu. L'odds ratio ajusté pour l'IM parmi les patients avec le génotype A1A2 ou RQ était de 0,47.

Histoire

La possibilité d'un gène sur le chromosome 8 régulant le taux de facteur de coagulation VII (F7R, F7E) a été suggérée par l'observation d'un déficit de ce facteur chez 3 sujets trisomiques pour ce chromosome (de Grouchy et al., 1974). Fineman et al. (1975, 1979) pourraient corroborer les conclusions de de Grouchy et al. (1974) mais Stenbjerg et al. (1975) ne pouvait pas. De Grouchy et al. (1984) ont de nouveau conclu qu'un gène régulateur se trouve sur le chromosome 8 et ont également présenté des résultats compatibles avec l'attribution du gène de structure du facteur VII (et celui du facteur X) à 13q34. Dans une note ajoutée en preuve, de Grouchy et al. (1984) ont décrit un facteur VII normal chez un bébé atteint de trisomie 8p due à une duplication en tandem, suggérant que F7R pourrait être sur 8q. Cependant, Fagan et al. (1988), à partir d'études cytogénétiques et de coagulation chez 2 patients présentant différentes anomalies du chromosome 8, ont conclu que la localisation est 8p23.2-p23.1.

Modèle animal

Les expériences d'inactivation du gène chez la souris indiquent que le facteur tissulaire est essentiel au développement embryonnaire au-delà du jour 9, les embryons homozygotes déficients en facteur tissulaire ne parvenant pas à développer une circulation du sac vitellin (Toomey et al., 1996). Comme le facteur VII est le seul ligand connu du facteur tissulaire, il est probable qu'un knock-out du facteur VII serait également mortel.

Le complexe F7a/TF catalyse l'activation des facteurs IX et X, permettant la génération ultérieure de thrombine et, finalement, la formation d'un caillot de thrombine. Alors que plusieurs protéines anticoagulantes existent pour réguler à la baisse différentes réactions du système de coagulation, par exemple la protéine C activée, la protéine S, le cofacteur II de l'héparine et l'antithrombine III, seul l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI 152310) est connu pour inhiber le complexe F7a/TF. Chan et al. (1999) ont généré des souris doublement hétérozygotes pour un allèle TFPI modifié dépourvu de son domaine 1 de type Kunitz et pour une déficience du gène F7. Les expériences d'accouplement ont indiqué que la descendance homozygote pour la modification TFPI mais avec l'allèle F7 de type sauvage et les souris homozygotes pour la déficience en F7 avec l'allèle sauvage TFPI présentaient des phénotypes précédemment détaillés (c. développement avec saignement périnatal sévère, respectivement). Étonnamment, les souris du génotype combiné (doublement homozygote) sont nées à la fréquence mendélienne attendue mais ont subi l'hémorragie périnatale fatale associée au génotype F7 -/-. Les souris porteuses du génotype hétérozygote F7 et homozygote mutant TFPI ont également été sauvées de la létalité associée au génotype sauvage F7 et homozygote mutant TFPI mais ont succombé à une coagulopathie de consommation périnatale. Ainsi, le sauvetage d'embryons mutants homozygotes TFPI, soit par un déficit en F7 homozygote ou hétérozygote, a suggéré que la diminution de l'activité de F7 exclut la nécessité d'une inhibition médiée par TFPI de la voie de coagulation F7a/facteur tissulaire pendant l'embryogenèse. De plus, les phénotypes de ces états de carence combinés suggèrent que F7 embryonnaire est produit chez les souris dès le jour embryonnaire 9,5 et que tout niveau de F7 maternel dans les embryons à un stade précoce est insuffisant pour provoquer une coagulopathie chez les souris mutantes homozygotes TFPI.

Pour déterminer si une perte supplémentaire du gène du facteur VII a influencé la coagulopathie observée chez les embryons et les nouveau-nés déficients en protéine C (PC -/-), Chan et al. (2000) ont croisé des souris doublement hétérozygotes pour les 2 facteurs pour produire une progéniture possédant les 9 combinaisons génotypiques prédites. Les embryons doublement nuls, bien que présents à leur fréquence mendélienne attendue, présentaient un phénotype qui n'avait été observé ni dans les embryons déficients en facteur VII ni en protéine C. À E12,5 jours après le coït, les embryons doublement nuls présentaient une coagulopathie intra- et extravasculaire qui a progressé avec une hémorragie concomitante substantielle et un œdème périphérique au jour E17,5, entraînant une mortalité immédiatement après la naissance. Les embryons FVII(+/-)/PC(-/-) ont montré un phénotype moins sévère, suggérant un effet de dosage génique. L'absence de sauvetage des embryons et des nouveau-nés PC-/- et l'augmentation de la coagulopathie résultant d'un déficit supplémentaire en FVII hétérozygote ou homozygote étaient dues à une augmentation du facteur Xa (613872) et de la génération de thrombine, résultant de la perte de la voie du facteur tissulaire dépendant du FVIIa. fonction inhibitrice et l'absence de contrôle au niveau des facteurs Va et VIIIa. La présence de fibrine dans les embryons en l'absence de facteur VII fœtal a suggéré qu'un potentiel significatif de génération de caillots existe en dehors de la voie dépendante du facteur VII embryonnaire.

VARIANTES ALLÉLIQUES 24 exemples sélectionnés) :

.0001 FACTEUR VII PADOUE

Chez un homme de 47 ans sans tendance hémorragique clinique mais avec une activité plasmatique du facteur VII indétectable lors d'un test en une étape utilisant le facteur tissulaire cérébral de lapin, O'Brien et al. (1991) ont identifié une transition hétérozygote G-à-A dans le gène F7, entraînant une substitution arg304-à-gln (R304Q). Le plasma du patient a montré des taux normaux d'antigène du facteur VII. Le résidu arg304 est homologue à arg333 du facteur IX, et une mutation arg333-à-gln dans F9 (300746.0056) a été identifiée chez des patients atteints d'hémophilie B sévère (306900) chez lesquels il y a synthèse et expression de la protéine du facteur IX.

Marchetti et al. (1992) ont identifié une substitution R304Q hétérozygote dans le gène F7 comme base du facteur VII anormal de Padoue, décrit par Girolami et al. (1982) chez des personnes originaires de la vallée de la rivière Piave dans le nord-est de l'Italie. Les individus décrits par Girolami et al. (1982) étaient asymptomatiques, mais présentaient une légère prolongation du temps de Quick. L'activité du facteur VII variait entre 45 % et 61 % de la normale, mais le matériel de réaction croisée avec le facteur VII était normal. Une bonne corrélation négative a été trouvée entre le taux de facteur VII et les temps de prothrombine.

.0002 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez 2 patients de différentes régions d'Italie présentant un déficit en facteur VII (227500), Marchetti et al. (1992) ont trouvé une transversion G-à-T dans le gène F7, entraînant une substitution cys310-à-phe (C310F), qui supprimait une liaison disulfure conservée dans le domaine catalytique de toutes les protéases à sérine. Dans la forme homozygote, la mutation a provoqué une réduction sévère de l'activité de la protéase (4 %).

.0003 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un patient présentant un antigène F7 et une activité F7 au niveau de 30 % et 37 %, respectivement, compatibles avec un déficit partiel en facteur VII (227500), Marchetti et al. (1993) ont identifié une transition hétérozygote G-à-A dans l'exon 7 du gène F7, entraînant une substitution cys178-à-tyr (C178Y) dans le domaine catalytique. L'anomalie a été détectée lors d'un test de dépistage préopératoire. Des dimorphismes neutres ont également été trouvés : un dans le codon 115 pour l'histidine et un autre dans le codon 353 pour l'arginine (R353Q 613878.0014).

.0004 CARENCE EN FACTEUR VII

Ohiwa et al. (1994) ont trouvé un déficit homozygote asymptomatique en facteur VII (227500) dans une famille déterminée par un proposita de 45 ans qui avait un temps de prothrombine prolongé. Le niveau d'antigène facteur VII dans le cas index était de 25,9 % de la normale et le niveau d'activité du facteur VII était de 28 % et 24 %, selon le test utilisé. Presque les mêmes niveaux réduits d'antigène et d'activité du facteur VII ont été trouvés chez 2 de ses sœurs, et ses parents, qui étaient des cousins ​​germains, un fils, une fille et une nièce avaient des niveaux modérément réduits d'activité et d'antigène du facteur VII. Des études moléculaires ont identifié une transition G-à-A dans l'exon 8, entraînant une substitution arg247-à-his (R247H). Des tests d'expression transitoire ont suggéré que la substitution conduit à une déficience en facteur VII en altérant la sécrétion de la protéine mutée. Cette mutation a été désignée facteur VII Mie.

.0005 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez une femme italienne de 36 ans présentant un déficit sévère en facteur VII (227500), Arbini et al. (1996) ont identifié une hétérozygotie composée pour 2 mutations dans le gène F7 : une transition 1994C-T, entraînant une substitution thr359-à-met (T359M), et une transition G-à-A dans l'intron 4 (613878.0008), entraînant un défaut d'épissage et un traitement anormal de l'ARNm. Des études d'expression cellulaire ont montré que la protéine mutante T359M s'accumulait de manière intracellulaire et qu'aucun facteur VII n'était détecté dans le milieu après 3 heures de chasse. Les chaînes latérales glucidiques associées à la protéine mutante T359M étaient sensibles à la digestion par l'endo-bêta-N-acétylglucosaminidase H (endo H), ce qui indiquait que la protéine était retenue dans le réticulum endoplasmique. Arbini et al. (1996) ont conclu que la mutation T359M dans F9 entraîne un grave défaut de sécrétion qui est probablement la conséquence d'un repliement anormal de la molécule. Le patient avait des épistaxis récurrentes, une ecchymose facile, une ménorragie, une hémarthrose du genou droit et une hémorragie importante après extraction dentaire. Un frère du patient est décédé à l'âge de 7 ans d'une épistaxis incontrôlée.

.0006 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez 13 patients israéliens présentant un déficit en facteur VII (225700), Tamary et al. (1996) ont identifié une transition homozygote 10648C-T dans le gène F7, entraînant une substitution ala244-à-val (A244V). La mutation était associée à une diminution de l'activité du facteur VII et des niveaux d'antigène. Dix autres patients étaient hétérozygotes pour la mutation. Sur les 36 allèles A244V, 20 ont été observés chez des patients d'origine marocaine, 10 chez des patients juifs iraniens et 6 chez des patients d'autres origines ethniques. Un modèle informatique du domaine sérine protéase du facteur VII suggéré à Tamary et al. (1996) que la substitution A244V peut provoquer une distorsion de la structure entière de la protéine. Les analyses de sites polymorphes intragéniques (analyse des haplotypes) ont révélé un effet fondateur pour les patients marocains et juifs irano-iraniens. La mutation A244V s'est avérée avoir une fréquence allélique de 1:42,5 chez les Juifs marocains et de 1:40 chez les Juifs iraniens. Comme les Juifs marocains sont séparés des Juifs iraniens depuis plus de 2 000 ans, les données suggèrent que la mutation A244V s'est produite dans les temps anciens.

.0007 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez les membres affectés d'une parenté présentant un déficit en facteur VII (613878), Leonard et al. (1998) ont identifié une transition 5989G-A hétérozygote dans l'exon 5 du gène F7, entraînant un changement d'acide aminé asn75 à asp (N57D) dans le domaine EGF1 de la protéine du facteur VII. Les individus ont montré une activité procoagulante réduite par rapport à l'antigène du facteur VII. Des tests d'expression fonctionnelle in vitro ont montré que la mutation N57D affecte le repliement du premier domaine EGF1 entraînant une diminution de la sécrétion cellulaire d'un mutant F7 qui est incapable de se lier au facteur tissulaire et est donc biologiquement inactif.

.0008 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez 2 frères et sœurs, nés de parents consanguins, avec un déficit sévère en facteur VII (227500), McVey et al. (1998) ont identifié une transition homozygote G-à-A dans l'intron 4 du gène F7, entraînant une mutation du site d'épissage, le saut de l'exon 4 et un ARNm codant pour le facteur VII avec une délétion dans le cadre de la première croissance épidermique domaine de type facteur. La mutation s'est produite au niveau d'un dinucléotide GT invariant au site d'épissage 5-prime de l'intron 4. Un petit frère et une petite sœur sont décédés à l'âge de 10 jours et 1 mois, respectivement, d'une hémorragie intracrânienne liée à un déficit sévère en facteur VII, les parents n'ont pas été affectés. Dans cette famille, un déficit complet en facteur VII a été associé à une diathèse hémorragique sévère mais aucune anomalie du développement, suggérant que le facteur VII fœtal n'est pas requis pour les fonctions angiogéniques putatives du facteur tissulaire (F3 134390) chez l'homme.

Voir aussi 613878.0005 et Arbini et al. (1996).

.0009 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un homme japonais de 82 ans présentant des polypes du côlon chez qui un déficit en facteur VII (227500) a été découvert au cours d'études préopératoires, Ozawa et al. (1998) ont identifié une transition 38T-C homozygote dans le gène F7, entraînant une substitution leu-à-pro au codon -26 (L-26P) dans le noyau hydrophobe du peptide signal. Cette substitution devrait affecter la translocation de la protéine dans le réticulum endoplasmique et entraîner une réduction des taux plasmatiques de facteur VII. Le patient n'a pas eu d'épisodes hémorragiques, le variant a été appelé facteur VII Morioka.

.0010 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez 2 frères et sœurs présentant un déficit partiel en facteur VII (227500), Bernardi et al. (1994) ont identifié une hétérozygotie composée pour 2 mutations dans le gène F7 : une transition 10798C-T dans l'exon 8, entraînant une substitution ala294-à-val (A294V), et une délétion de 17 pb conduisant à un décalage du cadre de lecture et à une terminaison prématurée au codon 255 (613878.0011). Les taux d'antigène du facteur VII étaient de 38 % et 25 % de la normale, et les taux d'activité étaient de 18 % et 7 % de la normale, respectivement.

Dans une étude en Allemagne, Wulff et Herrmann (2000) ont découvert que la mutation faux-sens A294V et la double mutation A294V/11128delC (613878.0012) étaient de loin les plus répandues.

.0011 CARENCE EN FACTEUR VII

Pour la discussion de la délétion de 17 pb dans le gène F7 qui a été trouvée à l'état hétérozygote composé chez les patients présentant un déficit partiel en facteur VII (227500) par Bernardi et al. (1994), voir 613878.0010.

.0012 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un patient polonais présentant un déficit en facteur VII (227500), Arbini et al. (1994) ont identifié une délétion homozygote de 1 pb (11128delC) dans le gène F7, frameshift. Les niveaux d'antigène et d'activité du facteur VII étaient inférieurs à 4 % de la normale.

.0013 INFARCT DU MYOCARDE, DIMINUTION DE LA SENSIBILITÉ À

Girelli et al. (2000) ont découvert qu'une insertion de 10 pb à la position -323 dans le promoteur F7, connue sous le nom de polymorphisme F7 5-prime, était associée à une réduction substantielle du risque d'infarctus du myocarde (608446) chez les patients atteints d'une maladie grave, documentée par angiographie athérosclérose coronarienne. L'allèle A2, comme l'insertion de 10 pb est désignée, a été trouvé en homozygotie chez environ 4 % des patients et des témoins. L'allèle A2 s'est avéré être en déséquilibre de liaison avec le polymorphisme R353Q (613878.0014), qui est indépendamment associé à une diminution de l'incidence d'IM chez les patients atteints d'athérosclérose coronarienne documentée. Les patients avec le génotype A2A2 avaient un niveau de facteur VII activé qui était 66% inférieur aux niveaux de ceux avec le génotype de type sauvage.

.0014 INFARCT DU MYOCARDE, DIMINUTION DE LA SENSIBILITÉ À

Girelli et al. (2000) ont découvert que les individus porteurs d'un polymorphisme arg353-à-gln (R353Q) dans le gène F7 présentaient une incidence nettement réduite d'infarctus du myocarde (608446) malgré une athérosclérose coronarienne sévère documentée par angiographie. Le génotype QQ était associé à une réduction de 72 % de l'activité du facteur VII activé par rapport au génotype de type sauvage. Les porteurs hétérozygotes de l'allèle Q avaient un risque d'IM de 0,47 par rapport aux patients avec le génotype de type sauvage (IC à 95 %, 0,27-0,81). L'allèle Q s'est avéré être en déséquilibre de liaison avec l'allèle A2 du polymorphisme 5-prime F7 (613878.0013). Chacun était indépendamment associé à une diminution du risque d'IM chez les patients atteints d'athérosclérose coronarienne sévère.

.0015 CARENCE EN FACTEUR VII

Arbini et al. (1997) ont identifié une substitution homozygote T-à-G en position -61 dans la région régulatrice 5-prime du gène F7 chez un patient présentant un déficit sévère en facteur VII (227500). La mutation a complètement éliminé l'interaction avec le récepteur nucléaire orphelin HNF4 (600281). Dans les dosages du gène rapporteur de l'hormone de croissance, l'activité d'un plasmide contenant le promoteur mutant était de 6,7 % du type sauvage. Les résultats ont indiqué que HNF4 exerce un effet régulateur positif majeur sur l'expression de F7 et ont fourni des preuves in vivo que la liaison de ce facteur de transcription est critique pour l'expression normale du facteur VII.

.0016 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un patient canadien-français issu d'une famille consanguine présentant un déficit sévère en facteur VII (227500), Carew et al. (1998) ont identifié une transversion C-à-G homozygote à la position -94 dans la région régulatrice 5-prime du gène F7. La mutation a empêché la liaison et la transactivation par Sp1 (189906) et d'autres protéines nucléaires. Le patient présentait des taux plasmatiques résiduels d'antigène du facteur VII et d'activité coagulante du facteur VII inférieurs à 1 %, et présentait des hémarthroses et une arthropathie chronique. Les données ont souligné l'importance de cette région du promoteur F7 pour l'expression in vivo du gène F7.

.0017 CARENCE EN FACTEUR VII

Carew et al. (2000) ont décrit un homme polonais de 25 ans présentant un déficit sévère en facteur VII (227500) qui était hétérozygote composé pour 2 mutations du gène F7. L'allèle paternel contenait 3 anomalies génétiques structurelles et l'allèle maternel portait une transition C-à-T à la position -55 par rapport au site de début de la traduction. Cette mutation a partiellement entravé la liaison de l'activateur transcriptionnel HNF4 (600281) au promoteur F7 tout en réduisant considérablement l'expression du gène rapporteur dans les cellules hépatiques.

.0018 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez une femme chinoise de 55 ans présentant un déficit en facteur VII (225700), Au et al. (2000) ont identifié une hétérozygotie composée pour 2 mutations dans le gène F7 : une transversion 6003C-A dans l'exon 4, entraînant une substitution cys61-à-ter (C61X), et une transversion 10902T-G dans l'exon 8, entraînant une cys329 substitution -à-gly (C329G 613878.0019). Elle s'est présentée avec une hémoptysie et une douleur à l'épaule droite, et s'est avérée avoir une arthrite de l'épaule droite compatible avec une arthropathie hémophilique chronique. Elle avait eu 3 accouchements vaginaux non compliqués et n'a signalé aucun antécédent de saignement anormal. Cependant, ses 2 jeunes frères seraient morts de saignements, l'un à la naissance et l'autre à l'âge de 9 mois. Deux filles étaient hétérozygotes pour la première de ces mutations et présentaient un phénotype compatible avec une mutation non-sens. Une fille était hétérozygote pour la mutation C329G et présentait des niveaux d'antigène normaux, compatibles avec une mutation faux-sens. Au et al. (2000) ont déclaré qu'il s'agissait des premières mutations F7 rapportées en chinois.

.0019 CARENCE EN FACTEUR VII

Pour la discussion de la mutation cys329-to-gly (C329G) dans le gène F7 qui a été trouvée à l'état hétérozygote composé chez un patient présentant un déficit en facteur VII (225700) par Au et al. (2000), voir 613878.0018.

.0020 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un garçon japonais de 10 mois présentant des saignements intrathoraciques récurrents, des hémorragies cérébrales et des saignements gastro-intestinaux secondaires à un déficit sévère en facteur VII (227500), Takamiya et Okimoto (2001) ont trouvé une hétérozygotie composée pour 2 mutations du gène F7 : un 11099C- transition T dans l'exon 8, entraînant une mutation gln211-to-ter (Q211X) et un changement G-to-A au nucléotide 6071 (noté 6070 ailleurs), dans le dinucléotide GT invariant au site d'épissage 5-prime de intron 4 (613878.0008).

.0021 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un homme japonais asymptomatique de 46 ans présentant une activité du facteur VII et des taux d'antigène respectivement de 1,2 % et 21 % de la normale, Nagaizumi et al. (2002) ont trouvé 2 nouvelles mutations dans le gène F7 : une transition 3895G-A dans l'exon 2, entraînant une mutation glu25-to-lys (E25K), et une transversion 10961T-G dans l'exon 8, entraînant une mutation his348-à- -gln (H348Q 613878.0022). Les résultats étaient compatibles avec un déficit partiel en facteur VII (227500).Les auteurs ont déclaré que les deux mutations étaient «à l'état doublement hétérozygote», mais auraient dû dire «à l'état hétérozygote composé», car la double hétérozygotie est l'hétérozygotie à chacun des 2 loci distincts.

.0022 CARENCE EN FACTEUR VII

Pour la discussion de la mutation his348-vers-gln (H348Q) dans le gène F7 qui a été trouvée à l'état hétérozygote composé chez un patient présentant un déficit partiel en facteur VII (227500) par Nagaizumi et al. (2002), voir 613878.0021.

.0023 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez une femme japonaise souffrant d'épistaxis occasionnelle, Takamiya et Hino (2004) ont trouvé de faibles niveaux d'activité coagulante et d'antigène du facteur VII (227500). Elle était homozygote pour une mutation gly354-to-cys (G354C) dans le domaine catalytique de la protéine. L'analyse des haplotypes a montré que cette mutation était héritée de ses parents consanguins. Bien que le facteur VII intracellulaire cys354 ait été estimé à 67 % de la protéine normale, dans le milieu au cours des expériences d'expression transitoire, l'activité antigénique et coagulante a été réduite à 5 % et 4 %, respectivement, des niveaux sécrétés par le facteur VII de type sauvage. Takamiya et Hino (2004) ont suggéré que l'introduction d'un résidu de cystéine libre supplémentaire dans la molécule de facteur VII entraînait la formation de liaisons disulfure illégitimes et un domaine mal replié, conduisant à une sécrétion défectueuse.

.0024 CARENCE EN FACTEUR VII

Chez un homme de 24 ans présentant un déficit sévère en facteur VII (227500), Bharadwaj et al. (1996) ont identifié une transition homozygote 10907T-C dans l'exon 8 du gène F7, entraînant une substitution phe328-to-ser (F328S) dans le domaine catalytique de la protéine. L'antigène plasmatique du facteur VII du patient était à 38 % de la normale, mais l'activité du facteur VII était inférieure à 1 % de la normale. Des études d'expression fonctionnelle ont montré que la protéine mutante avait une affinité réduite de 2 fois pour le facteur tissulaire et n'a pas réussi à activer le facteur X (voir 227600) ou IX (300746) en présence de facteur tissulaire après activation par le facteur Xa. Le taux d'activation du facteur VII F328S mutant par le facteur Xa était nettement diminué par rapport au type sauvage. La modélisation informatique et les simulations de dynamique moléculaire ont suggéré que l'incapacité du facteur VIIa F328S à cliver les substrats résultait de la formation apparente d'une liaison hydrogène entre tyr377 et asp338, un résidu au fond de la poche de liaison au substrat important pour l'interaction du substrat côté arginine chaînes avec l'enzyme. Bharadwaj et al. (1996) ont conclu que phe328, qui est conservé dans la prothrombine (176930), le facteur IX, le facteur X, le facteur VII et la trypsine (276000), est important pour la catalyse du facteur VIIa.

Voir également:

LES RÉFÉRENCES

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Typhonium flagelliforme induit l'apoptose dans les cellules CEMss via l'activation de la caspase-9, le clivage PARP et le cytochrome c libération : Son activation couplée à l'arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1

La plante Typhonium flagelliforme (TF), communément appelé « tubercule de rongeur » en Malaisie, est souvent utilisé comme remède traditionnel contre le cancer, y compris la leucémie.

Le but de l'étude

Nous avions précédemment identifié morphologiquement que la fraction riche en acide linoléique (DCM/F7) des tubercules de cette plante induit des effets anti-prolifératifs sélectifs et l'apoptose dans les cellules CEMss. Dans cette étude, nous avons soumis la même fraction DCM/F7 à des analyses d'activité cellulaire afin de déterminer le mécanisme possible de mort cellulaire dans les cellules leucémiques CEMss in vitro.

Matériaux et méthodes

Extraction de Typhonium flagelliforme le tubercule a fait et le fractionnement a été fait par chromatographie sur colonne liquide sous vide. L'activité anti-proliférative a été dosée à l'aide de MTT et la détection de l'apoptose a été effectuée par l'annexine V et le test d'échelonnage de l'ADN. Le dosage colorimétrique des caspases et l'analyse par immunoblot ont été utilisés pour détecter l'expression de la protéine associée à la mort cellulaire. L'analyse du cycle cellulaire a été effectuée en utilisant la cytométrie en flux.

Résultats

Nous avons constaté que l'effet inhibiteur du cancer de la fraction DCM/F7 dans les cellules CEMss était de 3 ± 0,08 g/ml (IC50). Une induction apoptotique précoce dans les cellules CEMss a été observée par dosage à l'Annexine V, qui a montré une nette fragmentation de l'ADN dose-dépendante observée dans l'électrophorèse sur gel à 10 et 20 g/ml. La fraction DCM/F7 à 3 µg/ml a arrêté significativement les cellules CEMss en phase G0/G1 (p < 0.05). Un indice Sub-G0/G1 constant mais croissant lié au modèle a été observé entre 12 et 72 h de traitement. En relation avec cela, nous avons étudié plus en détail les événements biochimiques conduisant à la mort cellulaire et avons constaté que la fraction DCM/F7 augmentait les niveaux cellulaires de caspase-3 et -9 sur les cellules traitées. Nos résultats ont indiqué que le cytochrome c des mitochondries dans le cytosol augmentait progressivement à mesure que la concentration de DCM/F7 augmente, ce qui conduit plus tard au clivage ultérieur de PARP en fragments de 85 kDa. Au contraire, la protéine Bcl-2 s'est avérée diminuer de manière concomitante pendant le traitement.

Conclusion

Collectivement, les résultats présentés dans cette étude ont démontré que la fraction DCM/F7 inhibait la prolifération des cellules leucémiques, conduisant à la mort cellulaire programmée, qui a été confirmée par la voie mitochondriale.


INTRODUCTION

La grande région cis-régulatrice de la BX-C est divisé en neuf domaines de chromatine spécifiques au parasegment qui contrôlent l'expression des trois gènes homéotiques BX-C le long de l'axe antéropostérieur (AP) (Ubx, abd-A et Abd-B) (pour des revues, voir Duncan, 1987 Maeda et Karch, 2006). Le modèle d'expression précis de ces gènes, spécifique au parasegment, détermine l'identité segmentaire de chacun des segments des deux tiers postérieurs de la mouche. Chaque domaine est séparé et autonome par des éléments spécialisés connus sous le nom de limites de domaine (Barges et al., 2000 Gyurkovics et al., 1990 Karch et al., 1994 Mihaly et al., 1997). Dans les constructions transgéniques, ces éléments frontières se comportent comme des isolants, bloquant l'activité de l'amplificateur lorsqu'ils sont placés entre l'amplificateur et son promoteur cible (Barges et al., 2000 Gruzdeva et al., 2005 Hagstrom et al., 1996 Zhou et al., 1996). Cependant, dans leur contexte natif, ils se trouvent souvent entre un amplificateur et son promoteur cible. La façon dont les amplificateurs BX-C contournent les limites intermédiaires est toujours un sujet de discorde.

Les suppressions de limites indiquent que ces éléments sont nécessaires pour fournir une autonomie fonctionnelle aux amplificateurs et aux silencieux dans la grande région de régulation cis. Les Fab-7 élément de frontière, par exemple, se trouve normalement séparant le iab-6 et iab-7 domaines cis-régulateurs (voir Fig. 1A). Les iab-6 la région d'amélioration contrôle le niveau de Abd-B expression dans le paragraphe 11 (PS11) et détermine l'identité du segment A6. Les iab-7 région, cependant, contrôle le niveau de Abd-Bexpression dans PS12 et détermine l'identité du segment A7 (Celniker et al., 1990 Galloni et al., 1993 Mihaly et al., 2006 Sanchez-Herrero, 1991). Lorsque Fab-7 est supprimé, le iab-6 et iab-7 les domaines sont fusionnés en un seul domaine, permettant à la fois le iab-6 et iab-7 rehausseurs ou silencieux pour devenir actifs dans PS11 et PS12. Dans la plupart des cellules de PS11, le iab-7 les activateurs sont activés par iab-6 éléments d'initiation, résultant en une transformation homéotique de PS11/A6 en PS12/A7. Cependant, dans d'autres cellules de PS11, le iab-6les initiateurs ne parviennent pas à activer le domaine fusionné avant iab-7 Les éléments de réponse Polycomb (PRE) font taire le domaine, ce qui fait que ces cellules prennent une identité PS10/A5 (Galloni et al., 1993 Gyurkovics et al., 1990 Mihaly et al., 1997).

Auparavant, nous avons montré que des isolants tels que gitan(Geyer et Corces, 1992) ou scs (Kellum et Schedl, 1992) ne peut se substituer à Fab-7 au sein de la BX-C (Hogga et al., 2001). Ces deux isolateurs bloquent les interactions entre la partie distale Abd-B les améliorateurs et les Abd-B promoteur. Pour tester si les limites de la BX-C peuvent se remplacer fonctionnellement, nous avons utilisé la conversion génique pour échanger le Fab-7 et Fab-8 limites au sein de la BX-C. Bien que ces deux frontières remplissent des fonctions similaires, elles partagent peu d'identité de séquence. De manière surprenante, nous constatons que le Fab-7 frontière est presque complètement capable de remplacer le Fab-8 limite, indiquant qu'il existe une similitude dans le mécanisme de la fonction de limite qui ne peut pas être prédite par l'analyse de séquence moderne.


La plasticité épigénétique entraîne la différenciation adipogène et ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle*

La différenciation terminale des cellules souches multipotentes est obtenue grâce à une cascade coordonnée de facteurs de transcription activés et de modifications épigénétiques qui entraînent la transcription des gènes responsables du destin cellulaire unique. Au sein de la lignée mésenchymateuse, des facteurs tels que RUNX2 et PPARγ sont indispensables pour l'ostéogenèse et l'adipogenèse, respectivement. Nous avons donc étudié la liaison génomique des facteurs de transcription et les modifications épigénétiques associées qui se produisent au cours de la différenciation ostéogénique et adipeuse des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées de la moelle osseuse de souris. Comme évalué par les analyses de séquençage de ChIP et de séquençage d'ARN, nous avons constaté que les gènes vitaux pour l'identité ostéogénique étaient liés à RUNX2, C/EBPβ, aux sites de liaison des récepteurs du rétinoïde X et de la vitamine D, tandis que la différenciation adipocytaire favorisait PPARγ, le récepteur du rétinoïde X, Sites de liaison C/EBPα et C/EBPβ. Les marques épigénétiques étaient des prédicteurs clairs des loci de différenciation actifs ainsi que des activités amplificatrices et de l'expression sélective des gènes. Ces CSM dérivées de la moelle ont présenté un modèle épigénétique qui suggérait une préférence par défaut pour la voie ostéogénique, cependant, ces modèles ont été rapidement modifiés près de la Adipoq, Cidec, Fabp4, Lèvre, Plin1, Pparg, et Cebpa gènes au cours de la différenciation adipeuse. Étonnamment, nous avons constaté que ces cellules présentaient également une plasticité épigénétique qui leur permettait de se différencier des adipocytes aux ostéoblastes (et vice versa) après engagement, comme évalué par coloration, expression génique et analyse PCR quantitative ChIP. La voie de défaut ostéogénique peut être renversée dans des conditions pathologiques, entraînant une fragilité squelettique et une augmentation de l'adiposité médullaire au cours du vieillissement, une carence en œstrogènes et une décharge squelettique. Ensemble, nos données fournissent une compréhension mécanistique accrue des programmes épigénétiques nécessaires à la différenciation multipotente des CSM qui peuvent s'avérer bénéfiques dans le développement de stratégies thérapeutiques.

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grants DK-072281 (à J. W. P.) et AR-066616 (à J. R.). Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts avec le contenu de cet article. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Tous les ensembles de données ChIP-seq et RNA-seq (y compris les fichiers de séquençage bruts, les pics, les bedGraphs et les RPKM) sont publiés sous SuperSeries GSE79815 dans le NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). Les hubs de piste ChIP-seq sont accessibles au public pour cette étude sur le référentiel hub UCSC Genome Browser.


Comment réparer un four GE avec un code d'erreur F7 ?

Pour réparer un four GE avec un code d'erreur F7, déterminez la cause exacte du problème. En règle générale, la carte de commande ou le panneau de touches doit être remplacé pour résoudre le problème. Les réparations peuvent nécessiter plusieurs heures.

    Isoler le problème

Pour déterminer la cause exacte du code d'erreur F7, appuyez sur le bouton Off ou Clear sur le panneau de commande et débranchez le four. Débranchez le connecteur ruban sur la carte de commande et branchez le four. Si le code F7 apparaît après 30 secondes, il peut être nécessaire de remplacer la carte de commande. L'absence du code indique la nécessité de remplacer le panneau de clé. Un ohmmètre peut être utilisé pour tester le panneau de touches avant de le remplacer en cas de doute sur la pièce à remplacer.

Débranchez le four et reportez-vous au manuel du propriétaire pour localiser la position exacte du panneau de touches ou du tableau de commande. Le panneau de touches et le tableau de commande sont généralement situés derrière l'affichage de l'horloge sur les fours GE. Déconnectez la pièce appropriée et remplacez-la. Rebranchez le câblage approprié.

Replacez le panneau d'accès et allumez le four pour déterminer si le problème a été résolu.


Informations sur l'auteur

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Fatma-Elzahraa Eid, Haitham A. Elmarakeby, Yujia Alina Chan.

Affiliations

Broad Institute of MIT et Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Fatma-Elzahraa Eid, Haitham A. Elmarakeby, Yujia Alina Chan, Nadine Fornelos, Eliezer M. Van Allen et Kasper Lage

Département de génie des systèmes et informatique, Université Al-Azhar, Le Caire, Égypte

Fatma-Elzahraa Eid & Haitham A. Elmarakeby

Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, États-Unis

Haitham A. Elmarakeby & Eliezer M. Van Allen

Département informatique et systèmes, Division de la recherche en ingénierie, Centre national de recherche, Gizeh, Égypte

Virginia Polytechnic Institute et State University, Blacksburg, VA, États-Unis

Département de chirurgie, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, États-Unis

Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

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Contributions

FRAIS. et K.L. conçu et conçu l'étude. FRAIS. développé l'approche d'audit, analysé les données et mis en œuvre l'étude avec la contribution de S.E. et K.L. F.E.E., Y.A.C., N.F. et K.L. a écrit l'article avec la contribution de tous les auteurs. Y.A.C. et N.F. substantiellement édité et révisé le document. M.E., E.V.A., L.S.H. et K.L. supervisé l'étude. Tous les auteurs ont lu et approuvé l'article.

Auteurs correspondants


Que sont les touches F1 à F12 ?

Les les touches de fonction ou Touches F sur un clavier d'ordinateur, étiqueté F1 par F12, sont des touches avec une fonction spéciale définie par le système d'exploitation ou le programme actif. Dans certains cas, ils peuvent être combinés avec les touches Alt ou Ctrl.

Sur certains claviers et ordinateurs portables plus petits, les touches F peuvent avoir un objectif dédié, comme modifier la luminosité de l'écran, le volume ou d'autres fonctions spécifiques à l'appareil. Sur ces claviers, il y a un Fn touche que vous pouvez maintenir enfoncée pour basculer ce que fait la touche F. Consultez notre page Fn pour plus d'informations et de l'aide sur l'utilisation de cette clé.

Vous trouverez ci-dessous un aperçu des fonctions les plus courantes des touches F (F1 - F12) pour Windows et macOS.

  • Utilisé comme touche d'aide dans presque tous les programmes. Lorsque vous appuyez dessus, un écran d'aide s'ouvre ou vous êtes dirigé vers une page Web.
  • Entrez dans la configuration du BIOS pendant que l'ordinateur démarre. + F1 ouvrirait le centre d'aide et de support de Microsoft Windows.
  • Dans Excel, appuyez sur Alt + Maj + F1 pour créer un nouvel onglet de feuille de calcul.
  • Ouvrez le volet des tâches.
  • Appuyez sur Ctrl + F1 pour exécuter une vérification orthographique dans Corel WordPerfect.

Consultez notre page F1 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Dans Microsoft Windows, renomme une icône, un fichier ou un dossier en surbrillance dans toutes les versions de Windows.
  • Dans Microsoft Excel, modifie la cellule active.
  • Alt + Ctrl + F2 ouvre la fenêtre du document ouvert dans Microsoft Word et vous permet de sélectionner un document à ouvrir dans Word.
  • Ctrl + F2 affiche la fenêtre d'aperçu avant impression dans Microsoft Word.
  • Entrez dans la configuration du BIOS pendant que l'ordinateur démarre.

Consultez notre page F2 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Ouvre souvent une fonction de recherche pour de nombreux programmes, y compris Microsoft Windows, sur le bureau Windows sous Windows 7 et versions antérieures.
  • Dans certains programmes, après avoir effectué une recherche initiale, F3 trouve la valeur de recherche suivante.
  • Dans la ligne de commande MS-DOS ou Windows, F3 répète la dernière commande entrée.
  • Dans Microsoft Word, Ctrl + F3 met en minuscule tout texte en surbrillance.
  • Maj + F3 modifie le texte dans Microsoft Word de majuscule à minuscule ou une majuscule au début de chaque mot. + F3 ouvre la fenêtre Recherche avancée dans Microsoft Outlook.
  • Dans l'explorateur Windows, lancez la fonction de recherche.
  • Ouvrez Mission Control sur un ordinateur Apple exécutant le système d'exploitation macOS X.

Voir notre page F3 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Ouvrez la fenêtre de recherche dans Windows 95 à XP.
  • Ouvrez la barre d'adresse dans Windows Explorer et Internet Explorer.
  • Répétez la dernière action effectuée (Word 2000+). ferme la fenêtre du programme actuellement active dans Microsoft Windows.
  • Ctrl + F4 ferme la fenêtre ou l'onglet ouvert dans la fenêtre active de Microsoft Windows.
  • Dans la zone Excelformula, appuyez sur F4 pour basculer entre une référence de cellule absolue et relative.

Voir notre page F4 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Dans tous les navigateurs Internet modernes, appuyez sur F5 pour actualiser ou recharger la page ou la fenêtre du document.
  • Ctrl + F5 force une actualisation complète de la page Web, efface le cache et télécharge à nouveau tout le contenu de la page.
  • Actualiser la liste du contenu d'un dossier.
  • Ouvrez la fenêtre Rechercher, remplacer et accédez à Microsoft Word.
  • Appuyez sur F5 pour démarrer un diaporama dans PowerPoint à partir de la première diapositive. Appuyez sur Shift + F5 pour démarrer le diaporama à partir de la diapositive actuellement active.
  • Appuyer sur F5 lorsque l'ordinateur charge MS-DOS pour la première fois charge les paramètres par défaut.

Voir notre page F5 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Déplacez le curseur sur la barre d'adresse dans Internet Explorer, Mozilla Firefox et la plupart des autres navigateurs Internet.
  • Ctrl + Maj + F6 s'ouvre sur un autre document Microsoft Word ouvert.

Voir notre page F6 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Couramment utilisé pour vérifier l'orthographe et la grammaire d'un document dans des programmes Microsoft tels que Microsoft Word, Outlook, etc.
  • Maj + F7 exécute une vérification du dictionnaire des synonymes sur le mot mis en surbrillance.
  • Active la navigation Caret dans Google Chrome et Mozilla Firefox.
  • Ouvrez le Couches panneau dans Adobe Photoshop.
  • Dans la ligne de commande Windows, appuyez sur F7 pour afficher un historique de toutes les commandes entrées dans cette fenêtre.

Consultez notre page F7 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Touche de fonction utilisée pour entrer dans le menu de démarrage de Windows, couramment utilisée pour accéder au mode sans échec de Windows.
  • Utilisé par certains ordinateurs pour accéder au système de récupération Windows, mais peut nécessiter un CD d'installation de Windows.
  • Affiche une image miniature pour tous les espaces de travail dans macOS.
  • Appuyez sur la touche F8 pour ouvrir la fenêtre Remplacer dans TextPad.

Voir notre page F8 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

    document dans Microsoft Word.
  • Envoyez et recevez des e-mails dans Microsoft Outlook.
  • Ouvre le Des mesures barre d'outils dans Quark 5.0.
  • L'utilisation simultanée des touches Fn et F9 ouvre Mission Control sur un ordinateur Apple exécutant le système d'exploitation macOS X.

Consultez notre page F9 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Dans la plupart des programmes Microsoft Windows, par défaut, F10 active la barre de menus ou le ruban d'une application ouverte.
  • Maj + F10 revient à cliquer avec le bouton droit sur une icône, un fichier ou un lien Internet en surbrillance.
  • Accédez à la partition de récupération cachée sur les ordinateurs Compaq, HP et Sony.
  • Entrez dans la configuration du BIOS pendant que l'ordinateur démarre.
  • Avec macOS 10.3 ou version ultérieure, affiche toutes les fenêtres ouvertes pour le programme actif.

Consultez notre page F10 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Entrez et quittez le mode plein écran dans tous les navigateurs Internet modernes.
  • Ctrl + F11 lorsque l'ordinateur commence à accéder à la partition de récupération cachée sur de nombreux ordinateurs Dell.
  • Appuyez sur F11 seul pour accéder à la partition de récupération cachée sur les ordinateurs eMachines, Gateway et Lenovo.
  • Avec macOS 10.4 ou version ultérieure, masque toutes les fenêtres ouvertes et affiche le bureau.

Consultez notre page F11 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.

  • Ouvrez la fenêtre Enregistrer sous dans Microsoft Word.
  • Ctrl + F12 ouvre un document dans Word.
  • Shift + F12 enregistre le document Microsoft Word (comme Ctrl + S ).
  • Ctrl + Maj + F12 imprime un document dans Microsoft Word.
  • Ouvrez Firebug, Chrome Developer Tools ou un autre outil de débogage du navigateur.
  • Avec un Apple exécutant macOS 10.4 ou une version ultérieure, F12 affiche ou masque le tableau de bord.
  • Aperçu d'une page dans Microsoft Expression Web.
  • Accédez à la liste des périphériques amorçables sur un ordinateur au démarrage, ce qui vous permet de sélectionner un autre périphérique à partir duquel démarrer (par exemple, un disque dur, un lecteur de CD ou de DVD, un lecteur de disquette, un lecteur USB et un réseau).

Consultez notre page F12 pour plus d'informations sur cette touche et ses fonctions secondaires possibles.


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