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La sénescence cellulaire en culture est-elle comparable à celle in vivo ?

La sénescence cellulaire en culture est-elle comparable à celle in vivo ?


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Une cellule est « sénescente » lorsqu'elle a définitivement quitté le cycle cellulaire. Cela peut être causé par des stress ou par l'atteinte de la « limite de Hayflick » (la cellule a atteint sa durée de vie réplicative, telle que définie par ses télomères).

Cellules cultivées in vitro peuvent servir de modèles pour étudier la sénescence (ou parfois le "vieillissement", bien que la distinction n'entre pas nécessairement dans le cadre de cette question) en faisant croître la même population de cellules pendant une longue période (nombreux passages). Une méthode courante pour identifier une population de cellules sénescentes consiste à utiliser la coloration à la bêta-galactosidase.

Je me demandais dans quelle mesure les cellules sénescentes en culture (identifiées par coloration bêta-gal) sont réellement comparables à celles auxquelles vous pourriez vous attendre in vivo. Je demande parce qu'il me semble qu'une cellule en phase terminale de sénescence peut ne pas survivre longtemps dans un organisme, donc ce que nous appelons des cellules sénescentes in vivo sont en fait des cellules pré-sénescentes ? Je n'ai aucune base pour cela, juste un sentiment. (Très scientifique je sais).


La sénescence n'équivaut pas à la mort cellulaire, mais est simplement un état arrêté dans lequel la cellule reste toujours viable (1). Il a été montré dans la littérature que cet état correspond à un profil de cycle cellulaire altéré différent de l'inhibition du contact ou de l'arrêt induit par les dommages (2). Cela correspond à une taille cellulaire agrandie, à une expression génique altérée (3, 4) et à l'expression dépendante du pH de la -galactosidase (5). Cela a été démontré à la fois dans des cellules cultivées et dans des modèles animaux (6, 7).

  1. Goldstein, S. (1990) Science 249, 1129-1133.
  2. Sherwood, S.W. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. , ETATS-UNIS 85, 9086-9090.
  3. Cristofalo, V.J. et al. (1998) Critique. Rev. Eucaryot Gene Expr. 8, 43-80.
  4. Linskens, M.H. et al. (1995) Acide nucléique Res. 23, 3244-3251.
  5. Dimri, G. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., États-Unis 92, 9363-9367.
  6. Swarbrick, A. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci., États-Unis 105, 5402-7.
  7. Efeyan, A. et al. (2009) PLoS Un 4, e5475.

La sénescence cellulaire en culture est-elle comparable à celle in vivo ? - La biologie

La sénescence cellulaire dans les reins de rat in vivo augmente avec la croissance et l'âge malgré l'absence de raccourcissement des télomères.

Fond

Les cellules somatiques in vitro ont une espérance de vie limitée avant d'entrer dans un état de sénescence, mais il n'est pas clair si cet état se produit in vivo dans le développement, la croissance et le vieillissement des reins. Nous avons précédemment montré que le cortex rénal humain présente un raccourcissement des télomères avec l'âge. Dans cette étude, nous avons comparé les changements structurels et fonctionnels du rein de rat avec l'âge aux phénomènes associés à la sénescence cellulaire in vitro.

Méthodes

Nous avons évalué les changements dans les reins de rats Fischer 344 âgés de 1 à 9 mois pour définir la croissance et le développement et de 9 à 24 mois pour définir le vieillissement.

Résultats

Les télomères des reins du rat mesuraient environ 35 à 40 kb de long et ne se raccourcissaient pas de manière significative. L'expression de l'ARNm de p16 INK4a, un gène de sénescence caractéristique in vitro, était indétectable chez la plupart des jeunes rats, mais a augmenté de 27 fois pendant la croissance et de 72 fois pendant le vieillissement. La protéine p16 INK4a était localisée dans le noyau et augmentait avec l'âge. L'ARNm de p16 INK4a a également augmenté dans d'autres tissus. La lipofuscine et la -galactosidase associée à la sénescence ont augmenté dans l'épithélium avec la croissance et le vieillissement et leur apparition était significativement associée les unes aux autres. La lipofuscine a été particulièrement trouvée dans les néphrons atrophiques.

Conclusion

Nous concluons que la sénescence cellulaire se produit à la fois dans la croissance et le vieillissement dans le rein du rat et peut contribuer à la pathologie liée à l'âge. Ces changements ne sont pas dus au raccourcissement des télomères, mais peuvent refléter un stress environnemental cumulatif.


Analyse de la sénescence cellulaire en culture in vivo : le dosage de la -galactosidase associée à la sénescence

La sénescence réplicative, un processus décrit pour la première fois il y a près de 40 ans, entraîne un arrêt de croissance irréversible avec des fonctions métaboliques soutenues, et elle est également associée à une résistance accrue aux signaux apoptotiques. L'intérêt pour ce processus a considérablement augmenté au cours des 10 dernières années, car il a été démontré que la sénescence peut fonctionner comme un puissant mécanisme suppresseur de tumeur. Bien que de plus en plus de preuves suggèrent que le phénotype sénescent est associé à un ensemble extraordinairement complexe de modèles d'expression génique et d'interactions avec le microenvironnement, il n'existe qu'un seul marqueur largement accepté pour distinguer ces cellules in vitro et in vivo. Ce marqueur est l'expression associée à la sénescence d'une β-galactosidase à pH 6 (SA-β-gal). Ici, une méthode d'analyse de l'expression de SA-β-gal dans des cellules cultivées et dans des tissus humains et animaux est décrite, et des paramètres importants à prendre en compte lors de la réalisation de tels tests sont également mis en évidence.


Une analyse comparative de la biologie cellulaire de la sénescence et du vieillissement

Divers organites intracellulaires, tels que les lysosomes, les mitochondries, les noyaux et les cytosquelettes, changent au cours de la sénescence réplicative, mais l'utilité de ces changements en tant que marqueurs généraux de la sénescence et leur importance par rapport aux altérations fonctionnelles n'ont pas été examinées en détail. De plus, la pertinence de ces altérations pour les changements cellulaires et fonctionnels chez les animaux vieillissants est mal comprise. Dans cet article, nous passons en revue les études qui rapportent ces changements associés à la sénescence dans diverses cellules vieillissantes et leurs mécanismes sous-jacents. Les changements associés aux lysosomes et aux mitochondries se trouvent non seulement dans les cellules subissant une sénescence réplicative ou induite, mais aussi dans les cellules postmitotiques isolées d'organismes âgés. En revanche, d'autres changements se produisent principalement dans les cellules subissant une sénescence in vitro. La comparaison des changements liés à l'âge et de leurs mécanismes sous-jacents dans les cellules sénescentes in vitro et les cellules postmitotiques âgées révélerait la pertinence de la sénescence réplicative pour les processus physiologiques se produisant dans les cellules postmitotiques à mesure que les individus vieillissent.

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Évaluer la sénescence cellulaire dans les tissus et in vivo

Malgré des avancées significatives dans l'étude de la sénescence cellulaire, la détection et l'évaluation de ces cellules in vivo avec des niveaux de confiance élevés restent difficiles. Contrairement aux cultures cellulaires, la grande majorité des cellules dans le corps sont quiescentes ou différenciées en phase terminale, ce qui signifie que certains des marqueurs utilisés pour identifier les cellules sénescentes in vitro, comme l'absence de synthèse ou de prolifération d'ADN, ne sont généralement pas valides. Les caractéristiques supplémentaires facilement observées dans les cultures, telles que les changements morphologiques ou l'augmentation de la taille des cellules, sont rarement préservées in vivo, en raison de restrictions structurelles et architecturales. D'autres marqueurs, y compris les protéines associées au cycle cellulaire, peuvent également être exprimés dans des types cellulaires et des processus spécifiques tels que l'inflammation, ce qui restreint davantage leur fiabilité. De plus, les cellules sénescentes sont généralement peu nombreuses au sein d'un organisme, même chez les animaux âgés [ [67, 90] ]. Ces facteurs, ainsi que l'hétérogénéité du programme de sénescence et la complexité intrinsèque d'un organisme vivant, entravent l'évaluation de la sénescence cellulaire in vivo. C'est pour cette raison que des efforts substantiels sont actuellement déployés afin de fournir des stratégies plus robustes et fiables pour la détection et l'évaluation de la sénescence dans les tissus fixés et les animaux vivants.

Détection immunohistochimique de la sénescence ex vivo

Le repérage de la sénescence cellulaire lors de l'analyse histologique a été essentiel pour l'interprétation et la compréhension de ce mécanisme au sein des structures et de l'architecture des tissus préservés. Malgré des inconvénients évidents dus au manque de spécificité ou au manque de fiabilité des marqueurs, cette méthode conventionnelle a été historiquement déterminante pour l'examen de la sénescence. in situ, et l'International Cellular Senescence Association ont récemment suggéré un flux de travail simplifié pour sa reconnaissance dans les tissus [ [28] ]. Conformément à ces recommandations, nous recommandons de confirmer la présence de sénescence cellulaire in situ en toute confiance par la détection immunochimique concomitante d'au moins trois marqueurs différents dans la même cellule, représentant différentes caractéristiques du phénotype sénescent. Une évaluation valide pourrait inclure, par exemple, la présence d'une activité SA-β-gal avec une co-coloration p16 INK4a et HP1-positive. Un workflow représentatif pour cette détection ex vivo est illustré sur la figure 2B.

Augmentation de la masse et du contenu lysosomal

L'activité SA-β-gal n'est pas seulement un in vitro marqueur comme décrit ci-dessus, mais aussi largement utilisé pour le ex vivo aussi l'évaluation de la sénescence. En 1995, l'activité SA-β-gal a été signalée pour la première fois pour détecter la sénescence dans des échantillons de peau humaine provenant d'individus âgés [ [42] ], et elle a depuis lors été considérée comme l'étalon-or pour la détection de cellules sénescentes putatives dans les tissus. Cependant, il est important de considérer que, comme pour tout autre biomarqueur de sénescence, cette activité enzymatique n'est pas exclusive des cellules sénescentes d'un organisme vivant. La Β-galactosidase est particulièrement enrichie dans certains types cellulaires hautement sécrétoires, tels que les macrophages et les ostéoclastes résidant dans les tissus, les cellules subissant une activité lysosomale accrue au cours de l'autophagie, et dans certaines cellules cancéreuses [ [91-93] ]. La coloration présente également d'autres limitations, car elle ne peut être effectuée que sur des tissus frais, ce qui indique des incompatibilités potentielles avec d'autres fixateurs et méthodes de préparation d'échantillons.

Il convient de noter que l'augmentation du contenu lysosomal des cellules sénescentes les rend également positives pour la coloration histochimique du Soudan Black-B (SBB), qui s'accumule dans la lipofuscine en raison de sa nature non polaire, un granule pigmentaire composé de résidus lipidiques qui est également considéré comme une caractéristique. du vieillissement [ [94] ]. Une version biotinylée de SBB, connue sous le nom de GL13, a ensuite été développée et a démontré une spécificité immunohistochimique plus élevée et une diminution du signal de fond. Surtout, ses performances ne se limitent pas au traitement de tissus frais comme c'est le cas avec le SA-β-gal, et il peut être utilisé pour colorer des échantillons archivés, ce qui présente un avantage notable par rapport à la coloration classique [ [46, 95] ].

Malgré ces limitations, SA-β-gal reste l'un des biomarqueurs les plus largement utilisés pour la détection cytologique ou histologique de la sénescence cellulaire dans les tissus. Un certain nombre de nouvelles stratégies ont été développées pour exploiter cette activité enzymatique, notamment des sondes pour la in vivo le suivi des outils basés sur la sénescence et la fluorescence pour les méthodologies basées sur la microscopie et la cytométrie en flux, qui seront discutés plus tard.

Marqueurs moléculaires du cycle cellulaire et de la prolifération

Comme présenté précédemment, la recherche in vitro a défini l'arrêt du cycle cellulaire comme l'une des caractéristiques les plus déterminantes de la sénescence cellulaire. L'expression de l'inhibiteur de CDK p16 INK4a , codé par le CDKN2A gène, est probablement le marqueur génétique de la sénescence cellulaire le plus largement utilisé in vivo [ [90, 96] ]. Contrairement à SA-β-gal, p16 INK4a joue des rôles mécanistes cruciaux dans la mise en œuvre du programme de sénescence, en arrêtant le cycle cellulaire par la voie p16 INK4a /Rb. Cependant, sa coloration dans les tissus doit être interprétée avec prudence, car elle peut également être exprimée dans les lymphocytes âgés, les cellules à RB inactivé, telles que les cellules tumorales, et lors de certaines conditions physiologiques telles que l'inflammation, l'exposition au clastogène ou la cicatrisation [ [8, 97-99] ]. De plus, les anticorps actuellement disponibles pour la détection histochimique de p16 INK4a murin sont médiocres et peu fiables. Afin de contourner cela, plusieurs modèles murins ont été développés dans lesquels un gène rapporteur est exprimé sous le contrôle du promoteur p16 INK4a, qui ont également fourni des preuves supplémentaires de l'expression de cet inhibiteur de CDK dans des contextes physiologiques autres que la sénescence cellulaire.

A noter, le CDKN2A Le gène code également pour l'inhibiteur de CDK humain p14 ARF et son homologue murin p19 ARF via un cadre de lecture alternatif (ARF). Bien qu'exprimés uniquement dans des types spécifiques de cellules sénescentes, p14 ARF et p19 ARF ont également été utilisés pour la détection histochimique de la sénescence dans les tissus [ [100] ]. De plus, p15 INK4B , codé par CDKN2B, peut également détecter la sénescence cellulaire dans les tissus en l'absence de p16 INK4A [ [101] ].

Comme décrit précédemment, le réseau p53/p21 est un deuxième régulateur pivot du cycle cellulaire et inducteur de l'arrêt prolifératif. Il convient cependant de noter qu'une agression dommageable transitoire peut activer p53 pour activer les processus de réparation de l'ADN pendant les états de repos in vivo [ [67] ], ainsi que c'est aussi un moteur principal de l'apoptose. Le rôle de l'inhibiteur de CDK p21 CIP1, induit lors de l'activation de p53, est considéré comme important lors de l'apparition de la sénescence et peut également être utile dans la détection de cellules sénescentes dans les tissus. Cependant, l'expression de p21 CIP1 n'est généralement pas maintenue une fois le programme de sénescence établi [ [102] ], et donc les marqueurs moléculaires impliqués dans l'axe p16/p15/Rb sont considérés comme plus fiables dans la détection de la sénescence. ex vivo.

Bien que la grande majorité des cellules dans les tissus soient différenciées en phase terminale, l'analyse de l'absence de prolifération dans certains contextes tels que les échantillons de tumeurs, où p16 ou d'autres marqueurs moléculaires pourraient être exprimés de manière aberrante, peut être pertinente pour l'identification de la sénescence cellulaire. Dans le cas d'échantillons de souris, les animaux peuvent recevoir, avant le prélèvement de tissus, des analogues nucléosidiques qui sont incorporés lors de la synthèse active d'ADN et marquent donc les cellules en division, à savoir EdU ou BrdU. Alternativement, l'utilisation d'anticorps monoclonaux contre des antigènes tels que PCNA et Ki-67 sont largement utilisés comme indicateurs de prolifération et peuvent détecter les cellules dans les phases G1, S, G2 et M, en distinguant de manière fiable les cellules en prolifération des cellules ne se divisant pas dans les échantillons histologiques sans avoir besoin d'antérieur in vivo préparation.

Caractéristiques nucléaires pertinentes ex vivo

Les marques épigénétiques et autres altérations et réarrangements structurels de l'ADN sont généralement considérés comme certains des biomarqueurs de sénescence cellulaire les plus importants. Comme introduit précédemment, les SAHF, qui sont directement liés au silençage des gènes liés à la prolifération [ [103] ], ont un rôle causal clé et sont normalement dosés dans les tissus par immunocytochimie contre les mouchetures HP1, ainsi que, quoique moins fréquemment, contre variante d'histone H2A mH2A, H3K9Me2 et H3K9Me3 marques épigénétiques. Cependant, ces foyers d'hétérochromatine sont le plus souvent trouvés dans l'OIS et peuvent être absents en fonction du type de cellule et d'autres facteurs de sénescence, et ne sont donc généralement pas considérés comme un marqueur fiable dans les tissus [ [54] ]. Il est à noter que les SAHF n'ont pas encore été identifiés dans les cellules de souris et ne sont donc pas utilisés pour la détection de la sénescence dans les tissus murins.

Les marques nucléaires supplémentaires incluent les cassures double brin de l'ADN, également connues sous le nom de ADN-SCARS, qui sont une caractéristique courante de la sénescence induite par des dommages [ [56] ]. Ceux-ci sont généralement détectés dans les tissus par immunoréactivité γH2AX ou, moins fréquemment, par des protéines liées à la DDR accumulées telles que l'immunoréactivité ATR, ATM ou p53. Néanmoins, les marqueurs de dommages à l'ADN présentent également une faible spécificité pour le phénotype de sénescence dans les tissus, non seulement parce qu'ils peuvent être limités aux sous-types de dommages à l'ADN de la sénescence cellulaire, mais aussi parce qu'ils peuvent également être détectés dans les cellules quiescentes et apoptotiques. En tant que marqueur de l'intégrité de l'enveloppe nucléaire perturbée, l'absence de lamine B1 peut également être utilisée pour détecter et quantifier la sénescence cellulaire dans les tissus [ [104, 105] ], bien que cette méthode ne soit pas largement établie.

Dans l'ensemble, la coloration de marqueurs de dommages nucléaires ou d'ADN en combinaison avec d'autres protéines liées au cycle cellulaire et SA-β-gal fournit une stratégie fiable pour confirmer le phénotype dans les tissus fixés.

Détecter la sénescence chez les animaux vivants et les cellules vivantes

Le développement de nouvelles méthodes de détection de la sénescence dans les tissus et organismes vivants est devenu de plus en plus attrayant en raison de la possibilité de dépister la sénescence dans des contextes physiologiques et pathologiques pertinents sans endommager les cellules, ainsi que de les suivre au fil du temps pour obtenir une meilleure compréhension de la rôles et effets dans le tissu (Fig. 2C). Cependant, ces stratégies peuvent parfois être plus contraignantes compte tenu de la difficulté à mettre en œuvre une approche multimarqueurs, et l'interprétation de certaines d'entre elles doit donc être prise avec précaution.

Cytométrie en flux

Les tests basés sur la cytométrie en flux ont le potentiel de remodeler l'évaluation de la sénescence cellulaire, car ils permettent l'analyse et la quantification rapides des traits physiques et de l'immunophénotype de populations hétérogènes simultanément. En raison de sa polyvalence, un certain nombre de tests basés sur cette technique ont été développés pour examiner la sénescence cellulaire dans des suspensions d'échantillons de tissus homogénéisés, en utilisant différentes caractéristiques et paramètres du phénotype de sénescence.

Comme discuté précédemment, le SA-β-gal a permis le développement de composés fluorogènes fonctionnalisés comme substrats qui permettent le marquage des cellules sénescentes lorsqu'elles sont clivées par cette activité enzymatique. Il s'agit notamment de C12FGD [ [45] ] et SPiDER-βgal [ [106] ], qui ont été utilisés avec succès pour détecter β-gal haute -exprimant les cellules dans les tissus vivants [ [107-109] ]. Cependant, pour une plus grande confiance, il est recommandé de les doser en conjonction avec d'autres marqueurs pouvant être détectés simultanément à l'aide de filtres supplémentaires. Comme introduit ci-dessus, la production accrue de ROS dérivée d'un dysfonctionnement mitochondrial peut également être analysée par cytométrie en flux avec l'utilisation de colorants fluorescents [ [78] ]. Dans les tissus vivants, cependant, la détection des ROS peut être difficile et les résultats peuvent être non spécifiques, et son utilité est limitée pour mesurer la sénescence en toute confiance. La cytométrie en flux permet également l'analyse de la taille et de la granularité relatives des cellules via des diffusions vers l'avant et latérales, ce qui s'est avéré utile pour les cultures cellulaires étant donné l'augmentation générale du volume cellulaire, de la vacuolisation et du compartiment lysosomal qui caractérisent la sénescence. in vitro. Néanmoins, il existe des preuves limitées de cellules sénescentes présentant une taille accrue in vivo, probablement en raison de restrictions d'architecture tissulaire, ce qui signifie qu'il n'est pas largement utilisé en cytométrie de flux. L'exclusion de la prolifération avec l'utilisation d'anticorps Ki-67 ou de colorants du cycle cellulaire rend également une valeur limitée dans la plupart des contextes, étant donné que la majorité des cellules dans les tissus sont quiescentes ou différenciées en phase terminale.

L'utilisation d'anticorps intracellulaires contre des biomarqueurs nucléaires pertinents en combinaison avec l'analyse SA-β-gal peut être une stratégie efficace. Une méthode récemment développée basée sur cette combinaison, nommée ImageStreamX, a été utilisée pour détecter simultanément les récepteurs spécifiques des tissus SA-β-gal et la perte de HMGB1 en tant que marqueur supplémentaire de la sénescence dans les poumons fibrotiques murins, les xénogreffes traitées à la doxorubicine et plusieurs organes prélevés sur des animaux âgés [ [36] ]. Cependant, les marqueurs intracellulaires sont plus difficiles à mesurer dans les tissus vivants et nécessitent généralement l'altération de la membrane plasmique pour pénétrer dans la cellule, ce qui peut nuire à la viabilité cellulaire. Dans ce domaine, les antigènes membranaires sont d'une plus grande utilité car ils peuvent permettre l'isolement viable de types cellulaires spécifiques, en suivant ce que l'on appelle des codes combinatoires.

Bien qu'il reste à définir des marqueurs membranaires universels ou plus spécifiques de la sénescence cellulaire, des études récentes ont fourni des informations importantes sur le soi-disant surfaceome des cellules sénescentes [ [110-115] ]. En effet, des protocoles de détection de la sénescence cellulaire utilisant une combinaison de marqueurs extracellulaires ont été rendus disponibles, mais uniquement avec l'utilisation de cultures cellulaires [ [112] ]. Cependant, certains de ces récepteurs de surface rapportés, à savoir ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DEP1, B2M, DPP4 STX4, NTAL et plus récemment uPAR, se sont avérés servir de marqueurs fiables de la sénescence dans différents tissus murins via une coloration histologique combinatoire conventionnelle [ [110-112, 116-118]] et présentent donc le potentiel d'être utilisé pour l'analyse par cytométrie en flux. Il convient de noter que l'expression de ces récepteurs n'est pas toujours spécifique mais majoritairement surexprimée dans le phénotype sénescent par rapport aux homologues non sénescents, comme c'est le cas avec d'autres marqueurs, et ils nécessiteront une validation supplémentaire dans d'autres types de sénescence cellulaire, tissus et des modèles.

In vivo modèles de souris

L'utilisation de ce qu'on appelle souris reporter de sénescence a joué un rôle déterminant dans la surveillance en temps réel de ce mécanisme dans les tissus intacts. Étant p16 Ink4a le marqueur génétique de la sénescence cellulaire le plus largement utilisé, les modèles développés à ce jour ont conçu l'expression d'un rapporteur d'une manière dépendante de p16 par le biais d'approches transgéniques ou knock-in.

Le premier de ces modèles a été généré en 2011, lorsque Baker et ses collègues ont développé le INK-ATTAC (Ink4a l'apoptose par activation ciblée de la caspase) lignée transgénique, dans laquelle les cellules exprimant p16 INK4a activent l'expression de l'EGFP avec une protéine de fusion modifiée (FKBP-Casp8), ce qui entraîne l'ablation sélective des cellules lors d'un traitement à la phosphatase alcaline [ [98 ] ]. Cette stratégie a permis non seulement la détection et la collecte de telles cellules, mais aussi leur élimination spécifique, ce qui a remarquablement retardé l'apparition et atténué la progression des troubles liés à l'âge, démontrant pour la première fois le rôle causal des cellules sénescentes au cours du vieillissement dans un milieu vivant. organisme [ [98] ]. En 2013, le premier modèle knock-in avec l'expression de la luciférase sous le promoteur p16 INK4a a été généré, dans lequel les auteurs ont observé une augmentation de la luminescence avec l'âge et lors d'événements néoplasiques précoces [ [99] ]. Un an plus tard, la souche de souris p16-3MR a été conçue en pilotant l'expression de la protéine de fusion trimodale sous le même promoteur, ce qui a permis la détection et l'analyse de cellules sénescentes putatives dans les tissus âgés et pendant la cicatrisation des plaies [ [8] ]. Cette protéine de fusion contient trois domaines, dont deux permettent le suivi et la détection des cellules exprimant p16 grâce à l'expression de la luciférase et d'un monomère de protéine fluorescente rouge, tandis que le troisième entraîne l'élimination de ces cellules grâce à l'activité d'un HSV tronqué. -1 kinase, lors de l'administration de ganciclovir [ [8] ]. Enfin, une stratégie récente a abouti à la génération d'un nouveau p16 INK4a modèle rapporteur nommé p16-Cre/R26-mTmG. Pour générer cela, les auteurs ont introduit une cassette Cre-recombinase dans l'exon 3 de l'endogène Cdkn2a et croisé la lignée knock-in résultante avec une souche Rosa26-mTmG. Cette approche élégante rend toutes les cellules de l'animal positives pour tdTomato et permet le marquage continu de cellules sénescentes putatives lors de l'expression de Cre-recombinase pilotée par p16, qui commute le signal fluorescent rouge sur EGFP [ [119] ].

Bien que ces modèles aient été extrêmement importants pour analyser l'expression accrue de p16 Ink4a dans le vieillissement, l'inflammation et la tumorigenèse, les études au niveau cellulaire sont restées plus difficiles. Par une approche très récente, cependant, Lui et al. ont été en mesure d'isoler, d'énumérer et de caractériser des cellules individuelles exprimant p16 via un allèle rapporteur basé sur la fluorescence avec la tomate en tandem-dimère enfoncée dans le Cdkn2a lieu [ [120] ]. Bien que la seule expression de p16 Ink4a ne soit pas toujours une indication fidèle de la sénescence cellulaire, l'isolement de ces cellules et une caractérisation plus poussée par des stratégies de cytométrie en flux peuvent ajouter de la robustesse à ces stratégies de rapporteur, ce qui en fait des outils très précieux pour l'étude de la sénescence cellulaire dans le vivant. organismes.

Sondes pour le suivi en direct

Un grand nombre de molécules et de traceurs chromogènes et fluorescents ont été développés en exploitant les niveaux généralement accrus de SA-β-gal des cellules sénescentes. Cependant, les courtes longueurs d'onde de la plupart de ces sondes entraînent la dispersion de l'émission de fluorescence, conduisant à une pénétrance tissulaire limitée. De plus, les tissus présentent un signal de fond autofluorescent élevé, ce qui entrave davantage leur détection par les techniques de bio-imagerie dans les organismes vivants. Afin de surmonter cela, des études récentes ont utilisé des stratégies NIR pour de nouvelles sondes, qui permettent une pénétration plus profonde grâce à des longueurs d'onde d'émission plus longues [ [121] ]. Les sondes à deux photons, qui nécessitent l'excitation simultanée de deux photons avec des longueurs d'onde plus longues, sont également apparues comme une alternative qui, en outre, minimise les dommages photo potentiels au tissu. Des exemples de sondes à deux photons et NIR incluent AHGa et NIR-BG, qui ont été utilisées avec succès pour détecter la sénescence induite par la chimiothérapie in vivo [ [47, 49] ]. D'autres pertinents, tels que SG1 et HMRef-β gal, ont été développés et démontrés pour détecter la β-gal haute -expression des cellules in vivo, malgré pas dans le cadre de la sénescence cellulaire [ [48, 122, 123] ]. Des sondes supplémentaires ont été développées pour l'enzyme β-galactosidase traduite de la lacZ gène, qui est codé par la bactérie Escherichia coli opéron lactose. Cependant, cette enzyme et la -galactosidase lysosomale eucaryote endogène ne partagent que 33 % de similitudes au niveau des acides aminés [ [124] ] et nous déconseillons donc l'utilisation de celles-ci pour la détection de la sénescence.

Les techniques d'imagerie couramment utilisées en clinique, telles que l'imagerie TEP, attirent de plus en plus l'attention dans le développement d'outils axés sur la sénescence. Parce que la TEP permet la détection de changements biochimiques dans les tissus grâce à des traceurs radioactifs, l'augmentation de la SA-β-gal des cellules sénescentes est particulièrement utile. Notamment, un traceur PET récemment développé nommé FPyGal a montré une corrélation entre l'activité β-gal et l'absorption du traceur dans les tumeurs traitées par chimiothérapie in vivo [ [125, 126] ]. Ces stratégies sont d'un intérêt particulier en raison de leur transposabilité potentielle aux paramètres humains.

Des efforts substantiels sont actuellement déployés pour générer des sondes de nouvelle génération afin de réduire les fuites et les dommages photo, ainsi que d'améliorer leur rétention dans les cellules sénescentes. Bien que ces outils ne soient pas encore disponibles dans le commerce, il est certain qu'ils deviendront extrêmement populaires dans les années à venir. Ils permettent non seulement la surveillance longitudinale à long terme des cellules sénescentes présumées dans des conditions physiologiques pertinentes sans mettre fin aux expériences, mais ont également le potentiel d'être traduits en outils de diagnostic en clinique.


Remerciements

Nous remercions les membres de nos laboratoires et de nombreux collègues pour les discussions qui ont aidé à la préparation de ce manuscrit.

F. Rodier est soutenu par des subventions de l'Institut du Cancer de Montréal (Initiative René Malo pour la recherche innovante) et de la Société de recherche sur le cancer (SRC). J. Campisi est soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (National Institute on Aging, National Cancer Institute) et du ministère de l'Énergie. Les auteurs ne déclarent aucune affiliation commerciale et aucun conflit d'intérêts.


Une épée à double tranchant

Le jeune Leonard Hayflick n'a pas oublié que, alors que les cellules cancéreuses semblent se multiplier pour l'éternité en culture, ce n'est pas le cas des fibroblastes humains sains. À un moment donné, après 50 divisions cellulaires, les fibroblastes grossissent et s'aplatissent et refusent de proliférer. Lorsque Hayflick, alors au Wistar Institute de Philadelphie, a fait cette observation pour la première fois à la fin des années 1950, la plupart des chercheurs ont blâmé les conditions de culture inadéquates pour le manque apparent de croissance des cellules. Mais grâce à une série d'expériences avec le cytogénéticien Paul Moorhead, Hayflick a démontré que les cellules sont entrées dans un état qu'il a appelé la sénescence en raison d'un phénomène cellulaire intrinsèque, apparemment une réponse à un stress réplicatif prolongé. Pourtant, le concept a d'abord été rejeté par la communauté scientifique, et même si la sénescence cellulaire en culture cellulaire a été progressivement acceptée au cours de la décennie suivante, les chercheurs ont continué à supposer que le phénomène n'était pas pertinent pour les organismes vivants.

L'un des premiers indices qu'ils se trompaient est venu dans les années 1990 des travaux de Manuel Serrano, alors post-doctorant dans le laboratoire du biologiste cellulaire David Beach au Cold Spring Harbor Laboratory à New York. Serrano a observé la même morphologie agrandie et aplatie que Hayflick avait décrite des décennies plus tôt, cette fois en réponse à la surexpression d'une forme oncogène du gène régulateur de croissance cellulaire. Ras dans les fibroblastes murins. Peut-être que les cellules étaient en train de sénescent pour éviter de devenir malignes, a émis l'hypothèse Serrano. Lorsque les cellules sont exposées à des formes de stress qui déclencheraient normalement un cancer, comme des dommages à l'ADN dus à une réplication prolongée ou à d'autres lésions cellulaires qui surviennent avec la vieillesse, elles pourraient subir une sénescence afin d'éviter de transmettre des dommages aux cellules filles.

Les chercheurs soutiennent que bien que de nombreux agents vantés comme des élixirs de jeunesse aient échoué à plusieurs reprises à montrer des avantages dans les études cliniques, le concept de sénolytiques résistera à l'épreuve du temps.

"Cette étude et les suivantes ont donné une" raison biologique "à l'existence des cellules sénescentes, qui était de les protéger du cancer", explique Bill Keyes, un biologiste cellulaire qui étudie la sénescence à l'Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire en France. Cette idée a depuis été validée, tandis que Keyes et d'autres ont découvert que les cellules sénescentes peuvent affecter les processus biologiques de l'embryogenèse à l'induction du travail jusqu'à la cicatrisation des plaies. (Voir « Le bon côté de la sénescence » ci-dessous.)

Pourtant, il est vite devenu clair que la sénescence a aussi un inconvénient. Intriguée par les observations d'accumulations de cellules sénescentes dans les tissus vieillissants chez l'homme, la biologiste cellulaire et moléculaire Judith Campisi du Buck Institute for Research on Aging en Californie a décidé d'examiner de plus près les gènes et les protéines exprimés par les cellules sénescentes. En 2008, elle et ses collègues ont rapporté que les sécrétions des cellules sénescentes contenaient des dizaines de protéines telles que des cytokines inflammatoires et immunomodulatrices qui pourraient endommager les cellules voisines. Ces protéines aideraient plus tard à expliquer de nombreux effets pathologiques des cellules sénescentes dans les tissus vieillissants.

Pendant ce temps, le généticien de la Mayo Clinic, Jan van Deursen, enquêtait sur les fortes concentrations de cellules sénescentes qu'il avait trouvées dans une souche mutante de souris qui présentaient un vieillissement accéléré, ou progeria. Après que certaines expériences aient suggéré que les cellules pourraient être la cause des symptômes des animaux, van Deursen, Kirkland et d'autres ont conçu une technique pour déclencher l'apoptose uniquement dans les cellules produisant la protéine p16, un marqueur imparfait de la sénescence. En 2011, l'équipe a signalé que l'utilisation de cette approche pour tuer les cellules sénescentes retardait l'apparition des cataractes des animaux et d'autres pathologies liées à l'âge dans les tissus du corps et maintenait leur fonction musculaire plus longtemps. Plus tard, l'équipe de van Deursen a démontré que le traitement avait un effet similaire chez des souris naturellement vieillissantes.

"Il y a eu la démonstration clé qu'en fait, si vous éliminez [les cellules sénescentes], cela fait une différence significative pour la santé", a déclaré Paul Robbins, biologiste moléculaire à l'Université du Minnesota, à propos de l'étude de van Deursen en 2011. Avec les recherches de Campisi, « qui a changé la façon de penser de tout le monde » sur la sénescence cellulaire, ajoute Robbins.

Le bon côté de la sénescence

Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont non seulement découvert le côté obscur de la sénescence, mais aussi ses effets positifs apparents sur les organismes vivants. Dans les années 1990, les travaux du biologiste cellulaire Manuel Serrano suggéraient que la sénescence pourrait agir comme un mécanisme pour supprimer la formation de tumeurs. When cells are exposed to genetic or cellular damage that would normally trigger uncontrollable replication, the senescence program would be activated as a means of arresting growth entirely, Serrano and other researchers argue. This would save the cell from passing on damage to its progeny, and the organism from growing tumors. “Senescence protects us from cancer,” Serrano says.

Senescent cells may also be crucial in early development. Research led by Bill Keyes , a cell biologist at the Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology in France, suggests that senescent cells could guide development in chick embryos. In the limb, a senescent cell could “become secretory and start instructing and informing and telling the other cells . . . which cell type to become and how to pattern the limb,” Keyes explains. Waves of senescence also occur in mouse and human embryos, where they may similarly guide cell differentiation and tissue patterning of surrounding cells via the proteins they secrete. This proposed embryological mechanism may be the driver of senescence evolution, likely co-opted later as a cancer prevention feature in maturity, Serrano explains.

Other possible functions of senescence in development continue to emerge. Just last year, for instance, the University of Texas’s Ramkumar Menon , who studies fetomaternal communication, found that cells within the membranes surrounding human fetuses undergo senescence when the fetus is fully developed and generate inflammatory signals in the womb, which he proposes acts as a cue to the mother’s body to initiate labor.

Senescence appears to maintain its importance throughout life: studies indicate that in addition to the proinflammatory factors that senescent cells secrete, they also exude growth factors and enzymes that stimulate tissue repair. For this reason, “we need to be really intelligent about how we manipulate it in the elderly to improve [health later in life],” notes cell and molecular biologist Judith Campisi of the Buck Institute for Research on Aging in California. A major challenge she sees in developing senolytic drugs will be to find compounds that kill groups of senescent cells that are harmful to their environment while sparing beneficial ones. “I think that’s going to be the wave of the future,” she says, “drilling down and understanding this complexity so that the drugs can be more tailored to eliminate subpopulations as opposed to all of them.”

Many researchers now view senescence as a beneficial process that evolved as a developmental and cancer prevention mechanism, but one that came with a tradeoff of the damage senescent cells can cause as they accumulate with age. There are still many unanswered questions about how these cells function, but it is already clear to scientists in the field that senescent cells influence a range of age-related pathologies, at least in rodents. Genetic ablation of senescent cells reduces the number of atherosclerotic plaques in mice, improves cartilage development in mouse models of osteoarthritis, boosts bone strength in murine models of osteoporosis, and even staves off neurodegenerative symptoms in models of Alzheimer’s disease.

These findings have a number of scientists thinking: If clearing senescent cells had such beneficial effects on health, could drugs be developed to do just that?


Cellular senescence and markers

"Senescence" is simply defined as the process of detonation associated with ageing. As we know, nothing lasts forever, and the proliferative capacity of cells is no different. The Hayflick limit describes how cells growing in vitro enter a state called cellular senescence after approximately 60 cell divisions 1 (PMID: 13905658). This permanent arrest of the cell cycle leaves them viable but unable to grow, changing their phenotype. At first it seemed to be an artifact of culturing cells in a dish but after observing senescence in aging and its cancer lesions, it emerged that a similar phenomenon is also found in vivo, where cells enter a state of irreversible, non-proliferative senescence that has implications for the tissue and the organism.

Is senescence helpful or harmful?

While senescence ends the division of cells, it also divides opinion as to its purpose. One hypothesis suggests that cellular senescence is bénéfique it evolved as an anti-cancer process to suppress tumor growth. Another hypothesis proposes that cellular senescence is detrimental, as the loss of cells’ regenerative capacity leads to ageing 2 (PMID: 24954210).

Decades later, neither hypothesis has prevailed. In fact, as research has developed, we consider that senescence may have both positive and negative effects, selon le contexte. When an organism is younger, the anti-tumor effect of senescence is useful but as the organism ages this same process becomes harmful – this occurs typically after reproduction, thus the process has persisted through generations. This is known as antagonistic pleiotropy.

Senescence is found in all tissues and may play a role in many diseases, meriting investigation across different fields of biology.

Is senescence relevant in disease?

Dans cancer, senescence is interesting because it may have a protective or a causative effect. Oncogene expression can induce the cell cycle arrest seen in early senescence, preventing the aberrant growth of malignant tissue. Interestingly, certain cancer therapies at low doses reduce toxicity and increase senescence 8 (PMID: 20078217), helping to lessen the side effects of these treatments. However, prolonged senescence and expression of the senescent-associated secretory phenotype (SASP) is known to alter the microenvironment 7 (PMID: 27797960). In fact, some factors expressed as part of the SASP, such as MMP-3, may even promote tumor metastasis. It is necessary to distinguish between the helpful and harmful outcomes of senescence in the context of cancer at a very basic level before it can be applied to treatments more effectively.

Cellular senescence is key in normal aging, but there is evidence to show that senescence may also play a role in maladie neurodégénérative 9 (PMID: 30261683). Age is one of the key risk factors for Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease, and even for the transition in Multiple Sclerosis (MS) from relapsing-remitting to progressive. The accumulation of senescent cells through aging may contribute to the increased risk of developing these diseases. The SASP releases a number of pro-inflammatory factors, which aligns with the upregulation of similar molecules in the AD brain. Les inability of older brains to repair damage, particularly in remyelination in MS, has been linked to the inability to replicate and so has been associated with senescence. There is evidence for the senescence markers in several brain cell types, and though this has not been fully elucidated it is an active area of research.

Which markers are used to identify senescence?

Studying senescence as researchers presents problems, as there is no single marker for use in identifying this state. Senescent cells are metabolically active but do not divide, and though they are distinct from cells in quiescence, as both are post-mitotic, it means that a lack of proliferation is not sufficient to call a cell senescent. Certain features can be used to distinguish these cells, but they must be used in a panel.

Intracellular stress leads to double-strand breaks and DNA damage, particularly in telomeres, which causes DDR in cells. This leads to a change in the expression of proteins such as H2AX that can be used as a marker of senescence. DDR can also be visualized by punctate staining of DAPI, which are known as senescence-associated heterochromatin foci 3 (PMID: 23140366).

Figure 1. Immunofluorescent analysis of (4% PFA) fixed HeLa cells using 10856-1-AP (Histone H2A.X antibody) at dilution of 1:50 and Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L).

Staining for p16ink4a is one of the best-acknowledged markers for senescence. Normally this tumor suppressor protein slows the cell cycle at the G1 phase to S phase checkpoint. Other cell cycle regulators that act at this checkpoint are p21 and p53, thus the presence of high concentrations of any of these proteins leads to cell cycle arrest and indicates senescence. If they are all expressed at high levels, there is greater confidence in the senescent phenotype 4 (PMID: 23416979).

Figure 2. Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human cervical cancer tissue slide using 10355-1-AP (P21 CDKN1A Antibody) at dilution of 1:400 (under 40x lens). Heat mediated antigen retrieved with Tris-EDTA buffer (pH9).

Senescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal) is uniquely found in senescent cells. This hydrolase normally converts β-galactosides into monosaccharides but accumulates in the lysosome in senescent cells. A simple assay that shows senescent cells in vitro uses the chromogenic galactose X-gal, where this substrate turns blue when cleaved by β-gal 5 (PMID: 20010931).

Figure 3. Immunofluorescent analysis of Hela cells, using 15518-1-AP (GLB1 antibody) at 1:25 dilution and Rhodamine-labeled goat anti-rabbit IgG (red).

Aggregates in the lysosomes of senescent cells are known as lipofuscin and consist of undigested lipids, proteins, and cations. They can be detected using a dye derived from Sudan Black-B in tissue and in vitro 6 (PMID: 24848057).

Figure 4. Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human liver tissue slide using 27102-1-AP (LIMPII Antibody) at dilution of 1:200 (under 40x lens).

The change in gene expression in senescence leads to a senescence-associated secretory phenotype, where there is an increase in the expression of a number of soluble factors, including interleukins like IL-6, chemokines like IL-8, and growth factors like VEGF 7 (PMID: 27797960). There is also an increase in certain non-soluble factors such as nitric oxide. The SASP affects surrounding tissue and may be able to induce senescence in nearby cells.

Figure 5. Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human tonsillitis tissue slide using 21865-1-AP (IL-6 antibody) at dilution of 1:200 (under 40x lens). Heat mediated antigen retrieved with Tris-EDTA buffer (pH9).

Using a combination of different biomarkers alongside each other is the best way to demonstrate senescence, while investigating it in the context of diseases provides the opportunity to bring together the different roles of this process and unite the research in this area.


REVIEW article

Jing Liu 1,2† , Yue Ding 3† , Zhongmin Liu 1,2* and Xiaoting Liang 1,4*
  • 1 Research Center for Translational Medicine, Shanghai East Hospital, School of Medicine, Tongji University, Shanghai, China
  • 2 Department of Cardiovascular Surgery, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai, China
  • 3 Department of Organ Transplantation, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, China
  • 4 Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai, China

Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells capable of self-renewal and differentiation. There is increasing evidence of the therapeutic value of MSCs in various clinical situations, however, these cells gradually lose their regenerative potential with age, with a concomitant increase in cellular dysfunction. Stem cell aging and replicative exhaustion are considered as hallmarks of aging and functional attrition in organisms. MSCs do not proliferate infinitely but undergo only a limited number of population doublings before becoming senescent. This greatly hinders their clinical application, given that cultures must be expanded to obtain a sufficient number of cells for cell-based therapy. Here, we review the current knowledge of the phenotypic and functional characteristics of senescent MSCs, molecular mechanisms underlying MSCs aging, and strategies to rejuvenate senescent MSCs, which can broaden their range of therapeutic applications.


Senescence and regeneration in salamanders

Cellular senescence is a state in which cells stop dividing but remain metabolically active. Moreover, they usually express a pro-inflammatory secretome, upregulate immune ligands and are positive for specific activities such as senescence-associated b-galactosidase (SA-bgal). Cells can enter senescence after DNA damage and activation of oncogenes, for example, to prevent cell proliferation. Recently, senescence has been linked to aging and aged-related pathologies, as in many species senescent cells accumulate with aging. In mammals, our limited regenerative abilities are further compromised with age. A recent report indicates that the decline in muscle regeneration with age could be related to an increase of cellular senescence. But what happens in those other vertebrates such as amphibians capable of regenerating repetitively over most part of their lifespan? Very few studies have addressed the regulation of senescence and its relationship with regeneration in those regeneration-competent species. Now, a recent paper from the laboratory of Maximina Yun (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25942455) reports on cellular senescence during amphibian limb regeneration.

First, the authors set up a system to identify senescent cells in cell culture and tissue sections in salamanders. As senescence stops the proliferation of damaged or dysfunctional cells they use UV irradiation to induce DNA damage leading to senescence. Twelve days after irradiation about 80% of newt A1 cells entered a senescent state characterized, among others, by high levels of SA-bgal activity, sustained production of reactive oxygen species (ROS) and extended mitochondrial and lysosomal networks. Also, they acquired a secretory phenotype. In contrast to quiescent cells, these senescence ones did not re-enter the cell cycle upon serum stimulation. All these traits observed in salamander senescent cells were comparable to those previously observed in mammalian cells.

Next the authors analysed cellular senescence in vivo in normal and regenerating newts. During regeneration they observed a significant induction of cellular senescence during the intermediate stages of this process. However, the number of senescent cells decreased at later stages. Senescent cells were found at the amputation plane and within the blastema and included different cell types such as cartilage, muscle, fibroblasts and epidermal glands. Similar results were observed in axolotls, another amphibian model for regeneration. Remarkably, this induction and posterior disappearance of senescent cells was specific of regeneration, as it was not observed during normal limb development.

Salamanders can go through multiple consecutive rounds of regeneration so the authors checked the senescence response over repetitive events of amputation and regeneration. Interestingly, no accumulation of senescent cells was observed after five regeneration cycles over a period of 1.5 years. These results indicate that senescent cells were effectively eliminated during each round of regeneration. Moreover, whereas in other species, including mammals, senescent cells accumulate with age the authors found that senescent cells in heart, spleen and liver did not accumulate in older salamanders. These results suggest that some mechanism of senescent cell clearance functions in both normal and regenerating salamanders. In order to determine whether such mechanism really exists, the authors implanted either senescent cells or normal cells labelled with GFP within newt limbs and followed them over time. Implanted normal cells persisted for at least 40 days and contributed to different structures. However, 80% of the implanted senescent cells were cleared after 2 weeks. These results suggest that salamanders have an active mechanism to get rid of senescent cells. A remarkable observation done by the authors was that when a mixture of 1:1 senescent and normal cells was implanted both cell populations were cleared with time. The reason for that is that these salamander senescent cells were capable to induce senescence in the neighbour cells (a property of the senescence cells seen in other systems). The authors showed here that this effect was mediated by a paracrine factor.

Finally, the authors tried to better characterize this clearance mechanism. Based on previous results on the role of the immune system in both the clearance of senescent cells in other systems as well as in amphibian regeneration, they analysed the role of macrophages in their system. First, they saw that, in vivo, macrophages and senescent cells are in close proximity during limb regeneration. The implantation of senescent cells triggers the recruitment of macrophages to their vicinity, which was not observed when normal cells were implanted. Then, after macrophage depletion, these implanted senescent cells remained over time and were not cleared. Therefore, these results indicate that macrophages were actively involved in the clearance of senescent cells during limb regeneration.

Overall, this study shows for the first time that salamanders possess a senescence surveillance mechanism that operates during regeneration. Remarkably, senescence is strongly induced in the regenerating blastema at mid stages of regeneration. Future experiments should try to determine the biological significance of this senescence upregulation for a successful regeneration.


Probing the depths of cellular senescence

Cellular senescence is a state of irreversible cell cycle arrest that has been documented to both suppress cancer and promote aging. Although not well understood, extensive nuclear changes, including the remodeling of chromatin, take place as cells become senescent. In this issue, Ivanov et al. (2013. J. Cell Biol. http://dx.doi.org/jcb.201212110) report that chromatin fragments are released from the nuclei of senescent cells and are subsequently targeted for processing through the autophagy/lysosomal pathway.

More than 50 years ago, Leonard Hayflick and Paul Moorhead observed that fibroblasts from healthy human donors had a finite proliferation capacity in cell culture. When these cells reached their “Hayflick limit” they became irreversibly arrested, or “replicatively senescent” (Hayflick and Moorhead, 1961). A similar irreversible cell cycle arrest, now designated as “cellular senescence,” can be induced by a variety of stresses, including (but not limited to) activation of oncogenes, telomere maintenance defects, oxidative stress, and excessive DNA damage (Campisi and d’Adda di Fagagna, 2007 Collado et al., 2007 Kuilman et al., 2010).

Senescent cells are believed to be very stable over long periods of time, both in culture as well as in tissues (although evidence for the latter is very limited). In this issue, Ivanov et al. are challenging this dogma by providing evidence that senescence may be a more dynamic process than we have previously appreciated. They show that some senescent cells contain cytoplasmic chromatin fragments (CCFs) that apparently bud off from the nuclei. CCFs were found to be devoid of lamin A/C, but were highly positive for the histone variant γ-H2AX (a mark of DNA double-strand breaks) and enriched for the histone H3 lysine 27 trimethyl modification (H3K27me3 a mark of heterochromatin). They also observed down-regulation of lamin B1 and a striking loss of nuclear envelope integrity features that they speculate may permit CCF formation and release. Once in the cytoplasm, CCFs were engaged by the autophagy pathway and ultimately proteolytically degraded in lysosomes. A decrease in the nuclear content of core histones was also noted, the obvious implication being that this is causally connected with the generation and destruction of CCFs. Taken together, these results represent a challenge to the classical view of cellular senescence as a single end point, and point to a more fluid situation where important changes take place after the initial cell cycle arrest, and in all likelihood progress and evolve over extended periods of time (Fig. 1).

The concepts of “deepening” and “late” senescence have been suggested by a number of previous studies. γ-H2AX–positive DNA damage foci become very abundant as cells approach and enter senescence, but greatly diminish as the cultures are maintained for extended periods of time (Chen and Ozanne, 2006). Passos et al. (2010) proposed that a persistent DNA damage response triggers continued production of reactive oxygen species, forming a dynamic feedback loop that actively maintains a deep senescent state. De Cecco et al. (2013) reported that after cells become fully senescent by all conventional criteria, the expression of the long interspersed nuclear element (LINE) retrotransposon L1 increased dramatically during extended culture, culminating in active transposition. This is consistent with previous observations that Alu retrotransposon expression also increases in senescent cells (Wang et al., 2011). Retrotransposon transcripts are assembled in the cytoplasm with reverse transcriptase and integrase (along other essential proteins) into ribonucleoprotein particles that subsequently have to enter the nucleus in order to insert into new genomic locations. The loss of nuclear integrity observed by Ivanov et al. (2013) could be one explanation why deeply senescent cells are supportive of retrotransposition.

Depletion of core histones, without concomitant loss of DNA, has been noted to accompany aging in yeast and nematodes (Feser et al., 2010 Ni et al., 2012), and a reduction in the biosynthesis of histones was reported in human fibroblasts during entry into senescence (O’Sullivan et al., 2010). Ivanov et al. (2013) observed that steady-state levels of all core histones progressively decreased as cells were maintained in a senescent state. As a consequence, one would anticipate a decompression of chromatin and a more “open” epigenome. This view is consistent with emerging literature from multiple species and model systems, suggesting that proper maintenance of heterochromatin has anti-aging effects (O’Sullivan and Karlseder, 2012).

The loss of histones in senescent cells is, however, complicated by the fact that total nuclear protein content actually increases (De Cecco et al., 2011). Histone loss during senescence is accompanied by recruitment of high mobility group (HMG) proteins to heterochromatic foci (Funayama et al., 2006 Narita et al., 2006). It is therefore likely that the chromatin of senescent cells undergoes a transition from being packed with histones to nonhistone proteins. It will be interesting to determine the identity of these nonhistone proteins in future studies.

One perplexing observation made by Ivanov et al. (2013) is that relatively few cells exhibit CCFs, even in fully senescent cultures. Furthermore, the number of CCFs formed is also quite low, usually less than two foci per cell. Hence, CCF formation alone would not appear to represent a robust biomarker for defining deeply senescent cells. The lysosomal processing of CCFs raises the interesting issue of whether these processes in any way reinforce other known senescence phenotypes. For example, one could ask whether the proteolytically cleaved products can serve as input material to promote the senescence-associated secretory phenotype (SASP Coppé et al., 2008). It would also be of great interest to know the in vivo occurrence of CCFs, examining a variety of tissues, ages, or pathological states.

It is currently unclear whether the low frequency of CCFs may be explained by a dynamic steady state, where cells continuously produce and turn over CCFs (like a conveyor belt), or if CCF formation occurs only in a distinct subpopulation of senescent cells. However, given that CCFs appear to contain DNA as well as histones, neither alternative readily explains the relative stability of nuclear DNA levels in the face of significantly declining levels of core histones. It may be that histones can also be depleted by a CCF-independent process. Further characterization of the CCFs, their content, and turnover should shed light on these issues.

Notwithstanding these uncertainties, the work of Ivanov et al. (2013) presents a picture of very substantial loss of nuclear composition and integrity, especially if extrapolated over long periods of time. It is hard to reconcile these degenerative changes with the many historical observations of the apparent long-term stability and viability of senescent cells. Recent studies have suggested that senescent cells can be manipulated to regain proliferative capacity by modulating the interaction with the extracellular matrix (Choi et al., 2011), or by reprogramming using induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies (Lapasset et al., 2011). At face value, one would surely expect the processes described by Ivanov et al. (2013) to have profoundly negative effects on cell survival, and make cell cycle reentry unlikely for cells that have entered deeper stages of senescence.

It will also be important to develop a coherent nomenclature for describing the apparently dynamic state of cellular senescence. The classical criterion of irreversible proliferation arrest thus likely represents only an early, or “shallow” step in the process. These shallow steps may not even be necessary, given a recent report that differentiated, postmitotic cells can acquire some features of senescence (Jurk et al., 2012). It has been speculated that “senescent after differentiation” (SAD) cells may significantly affect the development of a variety of age-related diseases in humans (Naylor et al., 2013).

In a more mechanistic vein, it will be critically important to define the molecular and cellular markers of a deeply senescent cell versus an early senescent cell. Furthermore, it will be necessary to determine the chronology, and most importantly functional relevance, of these steps during the “deepening” process. Such knowledge would address the possibility of turning back cells, at specific points during the progression of senescence, into potentially normally functioning cells. It will also be relevant to compare these features in vitro and in vivo. For example, if “deepening” is observed in vivo, do the markers of this process vary between tissues and organisms? Do they vary between oncogene-induced senescence and other forms? There are obviously many, many interesting questions to investigate, but Ivanov et al. (2013) have provided us with an intriguing first look into where these paths may take us.