Informations

Comment les différentes classes de gènes d'E coli sont-elles déterminées ?

Comment les différentes classes de gènes d'E coli sont-elles déterminées ?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

En regardant certains tableaux d'utilisation des codons plus détaillés, les gènes peuvent être regroupés en trois classes de gènes : les gènes métaboliques, les gènes hautement exprimés pendant la croissance exponentielle et le transfert horizontal de gènes. En regardant l'article original de Medique et al., ils ont regroupé les gènes sur la base du CAI, puis par une variante de k-means déterminée 3 classes. Notez que ceci est différent d'un gène de classe II qui est déterminé par les types d'ARN polymérase utilisés.

Comment ont-ils fini par déterminer ce que sont les trois classes ? Il semble qu'ils aient fait cette généralisation sans aucune donnée sur le protéome. Les mêmes gènes seraient-ils classés à l'aide de données d'expression de protéine au cours d'une croissance exponentielle et d'une croissance stationnaire ?


J'ai lu le journal. L'auteur commence par déclarer qu'au moment de la rédaction, deux classes différentes de profils d'utilisation de codons étaient connues (ou du moins supposées). Toutes les 782 séquences CDS uniques utilisées ont été soumises à une méthode de classification en deux étapes. Dans la première étape, chaque CDS a été décomposé en un vecteur à 61 dimensions représentant chacun des 61 codons possibles. Une analyse factorielle en grappes (l'équivalent catégorique et multivarié de l'analyse en composantes principales) a été effectuée sur ces vecteurs, condensant 61 dimensions en 2 dimensions. Maintenant que la complexité des données a été réduite à 2D, il est plus gérable pour un algorithme de k-moyennes de partitionner les données. Au final, les gènes ont été regroupés en 3 groupes orthogonaux (classes I, II et III, avec 502, 191 et 89 CDS, respectivement).

Ce n'est qu'après que les auteurs ont regroupé l'ensemble de gènes qu'ils ont pu revenir en arrière et examiner les définitions canoniques de chaque gène. Il est arrivé, fortuitement, que chaque classe de gènes ait un fort biais pour des sous-ensembles de fonctions cellulaires (par exemple, métabolisme, biosynthèse des protéines, transport). Ils n'ont pas utilisé de données sur le protéome, mais ils ont pu définir le rôle d'un grand nombre de ces gènes en se basant sur la littérature de l'époque.


Survie de Escherichia coli dans l'environnement : aspects fondamentaux et de santé publique

Dans cette revue, notre compréhension actuelle de l'espèce Escherichia coli et sa persistance en milieu ouvert est examinée. E. coli se compose de six sous-groupes différents, qui sont séparables par des analyses génomiques. Les souches au sein de chaque sous-groupe occupent diverses niches écologiques et peuvent être largement caractérisées par un comportement pathogène commensaliste ou différent. Dans les cas pertinents, des îlots génomiques peuvent être identifiés qui sous-tendent le comportement. Ainsi, des îlots génomiques de grande importance environnementale d'une part, et d'autre part de virulence, sont mis en évidence dans le cadre de E. coli survie dans ses niches. L'accent est en outre mis sur les études expérimentales sur la survie des différents types de E. coli dans le sol, le fumier et l'eau. Dans l'ensemble, les données suggèrent que E. coli peuvent persister, pendant des périodes variables, dans ces habitats terrestres et aquatiques. En particulier, la persistance considérable du pathogène E. coli O157:H7 est important, car sa tolérance à l'acide devrait conférer un atout de forme physique dans les environnements les plus acides. Dans ce contexte, dans quelle mesure E. coli interagit avec son hôte humain/animal et la capacité de survie de l'organisme dans les environnements naturels est comparée. De plus, l'effet de la diversité et de la structure communautaire du microbiote indigène sur le sort des envahisseurs E. coli les populations en milieu ouvert est discutée. Une telle relation est importante pour notre connaissance de la santé publique et environnementale.


Motivations

EcoCyc peut être considéré comme un article de synthèse électronique car il s'agit d'une collection d'informations soigneusement tamisées tirées en grande partie (et contenant 1400 citations) de la littérature primaire. EcoCyc est également conçu pour faciliter les calculs complexes sur les données génomiques et métaboliques afin de fournir un in silicio modèle de E. coli qui peuvent être sondés et analysés par des moyens informatiques. Parmi les problèmes pouvant être résolus à l'aide d'EcoCyc figurent les suivants (certaines de ces tâches ne sont pas directement prises en charge par l'interface utilisateur d'EcoCyc et nécessiteraient une programmation supplémentaire).

En raison de ses liens avec des bases de données de séquences telles que Swiss-Prot, EcoCyc pourrait être utilisé pour effectuer une récupération basée sur la fonction de séquences d'ADN ou de protéines, par exemple pour préparer des ensembles de données pour des études sur les relations structure-fonction des protéines. Les scientifiques qui étudient l'évolution du métabolisme pourraient utiliser EcoCyc pour rechercher des exemples de duplication et de divergence d'enzymes et de voies. Des études informatiques systématiques de l'évolution des voies peuvent comparer les voies apparentées de différents organismes. EcoCyc fournit une base pour effectuer des simulations du métabolisme, bien qu'il manque actuellement les données cinétiques nécessaires à la plupart des techniques de simulation.

EcoCyc a été utilisé pour prédire le complément métabolique de Haemophilus influenzae de sa séquence génomique (14). Cette prédiction métabolique a été matérialisée sous forme de DB et combinée avec le logiciel EcoCyc pour créer une encyclopédie de la H. influenzae génome, appelé HinCyc. Cette technique d'analyse métabolique extrait un niveau supplémentaire d'informations biologiques à partir d'une séquence génomique et fournit une validation biologique des identifications de gènes prédites par l'analyse de séquence.

Les biotechnologistes cherchent à concevoir de nouvelles voies biochimiques qui produisent des produits chimiques utiles (tels que des produits pharmaceutiques) ou qui catabolisent des produits chimiques indésirables tels que des toxines. EcoCyc fournit le schéma de câblage de E. coli K-12, qui se rapproche du point de départ de l'ingénierie EcoCyc décrit également les variations d'ingénierie potentielles qui peuvent résulter de l'importation E. coli enzymes dans d'autres organismes.


9.14 : E. coli comme système modèle

  • Contribution de Michael W. Klymkowsky et Melanie M. Cooper
  • Professeurs (MSCD et chimie) à l'Université du Colorado à Boulder et à l'Université d'État du Michigan

Chaque surface de votre corps abrite un écosystème microbien florissant. Cela est particulièrement vrai du système gastro-intestinal, qui va de la bouche et de l'œsophage (avec un détour par le nez), à travers l'estomac, dans l'intestin grêle et le gros intestin et le côlon 291 . Chacune de ces régions supporte sa propre communauté microbienne unique (connue sous le nom de microbiome). Ces environnements diffèrent par un certain nombre de propriétés, y compris les différences de pH et d'O2 niveaux. Près de la bouche et de l'œsophage O2 les niveaux sont élevés et les microbes peuvent utiliser l'aérobie (O2 dépendant) respiration pour extraire l'énergie de la nourriture. Se déplacer dans le système O2 les niveaux diminuent jusqu'à anaérobie (sans O2) des mécanismes sont nécessaires. À différentes positions le long de la voie gastro-intestinale, on trouve des microbes avec différentes préférences écologiques et adaptabilités.

Un défi associé à la caractérisation de la complexité exacte du microbiome présent à divers endroits est que souvent les organismes présents dépendent les uns des autres pour leur croissance lorsqu'ils sont isolés les uns des autres, ils ne se développent pas. La méthode standard pour compter les bactéries est de les cultiver en laboratoire à l'aide de plaques de milieu de croissance. Les échantillons sont dilués de manière à ce que les bactéries individuelles atterrissent (isolées les unes des autres) sur la plaque. Lorsqu'elles se développent et se divisent, elles forment des colonies macroscopiques et il est possible de compter le nombre d'unités formant des colonies (UFC) par volume d'échantillon d'origine. Ceci fournit une mesure du nombre de bactéries individuelles présentes. Si un organisme ne peut pas former de colonie dans les conditions du test, il semblera absent de la population. Mais comme nous venons de le mentionner, certaines bactéries sont totalement dépendantes des autres et ne se développent donc pas de manière isolée. Pour éviter ce problème, les nouvelles méthodes moléculaires utilisent des analyses de séquences d'ADN pour identifier les organismes présents sans avoir à les cultiver 292 . Le résultat de ce type d'analyse révèle la véritable complexité des écosystèmes microbiens vivant sur et en nous 293 .

Pour nos besoins, nous nous concentrerons sur un membre bien connu, mais relativement mineur de cette communauté microbienne, Escherichia coli 294 . E. coli est un membre de la famille des bactéries Enterobacteriaceae et se trouve dans le côlon des oiseaux et des mammifères 295 . E. coli est ce qu'on appelle un aérobie facultatif, il peut survivre dans un environnement anaérobie et aérobie. Cette flexibilité, ainsi que E. coli&rsquos les besoins en éléments nutritifs généralement peu exigeants le rendent facile à cultiver en laboratoire. De plus, la souche de laboratoire couramment utilisée de E. coli, connu sous le nom de K12, ne provoque pas de maladie chez l'homme. Cela dit, il existe d'autres souches de E. coli, tel que E. coli O157:H7 qui est pathogène (causant des maladies). E. coli O157:H7 contient 1 387 gènes non trouvés dans le E. coli K12. On estime que les deux E. coli souches divergeaient d'un ancêtre commun

il y a 4 millions d'années. Les détails de ce qui fait E. coli O157:H7 pathogène est un sujet fascinant, mais hors de notre portée ici 296 .

Comportement adaptatif et réseaux de gènes (la réponse lac) : Le lactose est un disaccharide (un sucre) composé de D-galactose et de D-glucose. Il est synthétisé, biologiquement, exclusivement par les mammifères femelles. Les mammifères utilisent le lactose dans le lait comme source de calories (énergie) pour les nourrissons. Une des raisons (on pense) est que le lactose n'est pas facilement digéré par la plupart des microbes. Le système de synthèse du lactose est dérivé d'une modification évolutive d'un gène ancestral qui code pour l'enzyme lysozyme. Par duplication et mutation, un gène codant pour la protéine &alpha-lactoalbumine a été généré. La &alpha-lactoalbumine est exprimée uniquement dans les glandes mammaires, où elle forme un complexe avec une protéine exprimée de manière ubiquitaire, la galactosyltransférase, pour former la protéine lactose synthase 297 .

E. coli est capable de métaboliser le lactose, mais seulement lorsqu'il n'y a pas de meilleurs sucres (plus faciles) à manger. Si du glucose ou d'autres composés sont présents dans l'environnement, les gènes nécessaires pour métaboliser le lactose sont désactivés. Deux gènes sont nécessaires pour E. coli métaboliser le lactose. Le premier code pour la lactose perméase. Le lactose, étant gros et hautement hydrophile ne peut pas traverser le E. coli membrane cellulaire. La lactose perméase est une protéine membranaire qui permet au lactose d'entrer dans la cellule, en descendant son gradient de concentration. Le deuxième gène impliqué dans l'utilisation du lactose code pour l'enzyme & bêta-galactosidase, qui divise le lactose en D-galactose et D-glucose, qui peuvent tous deux être métabolisés par des protéines exprimées de manière constitutive (c'est-à-dire tout le temps) dans la cellule. Alors, comment fonctionne exactement ce système ? Comment les gènes d'utilisation du lactose sont-ils désactivés en l'absence de lactose et comment sont-ils activés lorsque le lactose est présent et que de l'énergie est nécessaire. Les réponses illustrent les principes généraux des réseaux d'interaction contrôlant l'expression des gènes.

Dans E. coli, comme de nombreuses bactéries, plusieurs gènes sont organisés en ce qu'on appelle des opérons. Dans un opéron, une seule région régulatrice contrôle l'expression de plusieurs gènes. Il est également courant chez les bactéries que plusieurs gènes impliqués dans une seule voie métabolique soient situés dans le même opéron (la même région de l'ADN). Une approche puissante de l'étude des gènes consiste à rechercher des phénotypes mutants pertinents. Comme nous l'avons dit, type sauvage (c'est-à-dire normal) E. coli peuvent se développer sur le lactose comme seule source d'énergie. Donc, pour comprendre l'utilisation du lactose, nous pouvons regarder mutant E. coli qui ne peut pas pousser sur le lactose 298 . Pour rendre le criblage de telles mutations plus pertinent, nous vérifions d'abord que le mutant peut se développer sur le glucose. Pourquoi? Parce que nous ne nous intéressons pas vraiment (dans ce cas) aux mutations des gènes qui perturbent le métabolisme standard, par exemple la capacité à utiliser le glucose, nous cherchons à comprendre les gènes impliqués dans le processus spécifique du métabolisme du lactose. Une telle analyse a révélé un certain nombre de classes distinctes de mutations :. certains ont conduit à une incapacité à répondre à la présence de lactose dans le milieu, d'autres ont conduit à la dé-répression, c'est-à-dire l'expression constante de deux gènes impliqués dans la capacité à métaboliser le lactose, la lactose perméase et la &beta-galactosidase. Dans ces souches mutantes, les deux gènes étaient exprimés là où le lactose était présent ou non. En cartographiant (à l'aide du système Hfr, voir ci-dessus) où ces mutations se trouvent dans le génome de E. coli, et un certain nombre d'autres expériences, le modèle suivant a été généré.

Les gènes codant pour la lactose perméase (de dentelle) et la &bêta-galactosidase (lacZ) font partie d'un opéron, connu sous le nom de lac opéron. Cet opéron est régulé par deux facteurs distincts. Le premier est le produit d'un gène constitutivement actif, lacI, qui code pour un polypeptide qui s'assemble en une protéine tétramère qui agit comme un répresseur transcriptionnel. Dans une cellule typique, il y a

10 protéines répresseurs lac présentes. La protéine répresseur lac se lie à des sites dans le promoteur de la lac opéron. Lorsqu'elle est liée à ces sites, la protéine répresseur bloque la transcription (expression) de la lac opéron. Les sites de liaison du répresseur au sein du lac le promoteur de l'opéron semble être ses seuls sites de liaison fonctionnellement significatifs dans l'ensemble E. coli génome. Le deuxième élément régulateur du système est connu sous le nom de site activateur. Il peut se lier à la protéine activatrice de catabolyte (ou CAP), qui est codée par un gène situé en dehors de l'opéron lac. L'activité de liaison à l'ADN du CAP est régulée par la liaison d'un cofacteur, l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc). L'AMPc s'accumule dans la cellule lorsque les nutriments, en particulier l'énergie libre fournissant des nutriments (comme le glucose) sont faibles. Sa présence agit comme un signal que la cellule a besoin d'énergie. En l'absence d'AMPc, le CAP ne se lie pas ou n'active pas l'expression du lac opéron, mais en sa présence (c'est-à-dire lorsque l'énergie est nécessaire), la protéine CAP-AMPc est active, se lie à un site dans le lac promoteur de l'opéron, recrute et active l'ARN polymérase, conduisant à la synthèse d'ARN et de protéines de lactose perméase et de &beta-galactosidase. Cependant, même si les niveaux d'énergie sont faibles (et les niveaux d'AMPc sont élevés), le lac l'opéron est inactif en l'absence de lactose en raison de la liaison de la protéine répresseur lac aux sites (marqué 01, 02, et 03) dans lac la région régulatrice de l'opéron.

Alors, que se passe-t-il lorsque le lactose apparaît dans l'environnement cellulaire ? Eh bien, évidemment rien, puisque les cellules expriment le répresseur lac, donc aucune perméase de lactose n'est présente, et le lactose ne peut pas entrer dans la cellule sans lui. Mais cette prédiction suppose qu'au niveau moléculaire, le système fonctionne parfaitement et de manière déterministe. Ce n'est pas le cas, cependant, le système est stochastique, c'est-à-dire soumis aux effets de processus aléatoires - il est bruyant et probabiliste. Compte tenu du petit nombre de molécules de répresseur lac par cellule (

10), il y a une chance faible mais significative que, au hasard, l'opéron lac d'une cellule particulière soit exempt de répresseur lié. Si cela se produit dans des conditions dans lesquelles la PAC est active, alors, si du lactose est présent, nous voyons l'effet de la boucle de rétroaction positive 299 . Lorsque du lactose est ajouté, les cellules qui ont, par hasard, exprimé à la fois la lactose perméase et la &beta-galactosidase (un petit pourcentage de la population cellulaire totale) répondront : le lactose entrera dans ces cellules (puisque la perméase est présente) et, puisque la &beta-galactosidase est également présente, elle sera convertie en allolactone (une réaction catalysée par la &beta-galactosidase. L'allolactone se lie à et inhibe l'activité de la protéine répresseur lac. En présence d'allolactone, le répresseur n'inhibe plus lac expression de l'opéron et il y a une augmentation supplémentaire (

1000 fois) dans le taux d'expression de la lactose perméase et de la &beta-galactosidase. La &beta-galactosidase catalyse également l'hydrolyse du lactose en D-galactosidase et D-glucose, qui sont ensuite utilisés pour piloter le métabolisme cellulaire. Grâce à ce processus, la cellule passe de pratiquement aucune expression de la lac opéron à pleine expression, et avec une pleine expression devient capable de métaboliser le lactose. Dans le même temps, les cellules qui n'ont pas exprimé (par hasard) la lactose perméase et la &beta-galactosidase ne pourront pas du tout métaboliser le lactose. Ainsi, même si tous les E. coli les cellules présentes dans une culture peuvent être génétiquement identiques, elles peuvent exprimer des phénotypes différents en raison de la nature stochastique de l'expression des gènes. Un exemple d'un tel comportement est présenté dans l'applet 300 des bases de l'expression des gènes PhET. Dans le cas du système lac, au fil du temps, la nature bruyante de l'expression des gènes conduit de plus en plus de cellules à activer leur copie de l'opéron lac. Une fois &ldquoon&rdquo, tant que le lactose est présent dans le système, son entrée dans la cellule et sa conversion en allolactone maintiendront la protéine répresseur lac dans un état inactif et permettront une expression continue de l'opéron lac.

Que se passe-t-il si le lactose disparaît de l'environnement, qu'est-ce qui détermine le temps nécessaire aux cellules pour revenir à l'état dans lequel elles n'expriment plus le lac opéron ? La réponse est déterminée par les effets de la division cellulaire et des processus de régulation. En l'absence de lactose, la concentration en allolactone chute et la protéine répresseur lac revient à son état actif et inhibe l'expression de la lac opéron. Aucune nouvelle lactose perméase et &beta-galactosidase ne sera synthétisée et leurs concentrations chuteront en raison de la dégradation. Dans le même temps, et encore parce que leur synthèse s'est arrêtée, à chaque division cellulaire la concentration de la lactose perméase et de la &beta-galactosidase diminuera de

50%. Avec le temps les protéines vont se diluer (et se dégrader) et ainsi les cellules retournent à l'état initial, c'est-à-dire avec le lac opéron désactivé et aucune copie de la lactose perméase ou de la &beta-galactosidase n'est présente.


Écologie

Escherichia coli se trouve couramment dans les intestins inférieurs des humains et des mammifères. Lorsque E. coli se localise dans le gros intestin humain, il peut aider les processus de digestion, la dégradation et l'absorption des aliments et la production de vitamine K. Différentes souches de E. coli peuvent être trouvés dans différents types d'animaux, nous pouvons donc déterminer la source (humaine ou animale) des selles en examinant quelle souche de E. coli est présent dans les selles. E. coli peuvent également être trouvés dans des environnements à température plus élevée, comme au bord des sources chaudes.

E. coli est couramment utilisé comme indicateur dans le domaine de la purification de l'eau. Les E. coli-index peut indiquer la quantité d'excréments humains dans l'eau. La raison pour laquelle E. coli est utilisé comme indicateur est dû à une plus grande quantité de E. coli dans les selles humaines que d'autres organismes bactériens. La plupart des souches de "E. coli" ne sont pas nocives pour leurs hôtes, cependant, de plus en plus de souches nouvellement découvertes contribuent à la population existante par mutation et évolution. Certains peuvent causer des maladies graves, comme E. coli O157:H7.


OUTILS DE LA TECHNOLOGIE DE L'ADN RECOMBINANT

Voici les principaux outils de la technologie de l'ADN recombinant :
Enzymes de restriction, enzymes polymérases, ligases, vecteurs et organisme hôte

Les enzymes de restriction

Les enzymes qui coupent l'ADN sont appelées enzymes de restriction. Hind II a été la première endonucléase de restriction découverte. Hind II coupe toujours les molécules d'ADN à un point particulier en reconnaissant une séquence spécifique de six paires de bases. Cette séquence de bases spécifique est appelée séquence de reconnaissance pour Hind II. Aujourd'hui, plus de 900 enzymes de restriction sont connues. Différentes enzymes reconnaissent différentes séquences.

Exonucléase : Ces enzymes éliminent les nucléotides des extrémités de l'ADN.

Endonucléase : Ces enzymes font des coupures à des positions spécifiques dans l'ADN.

Nomenclature des enzymes de restriction : Chaque enzyme porte le nom de la bactérie à partir de laquelle elle a été isolée. Le système de nommage est basé sur le genre, l'espèce et la souche bactériens. Le tableau suivant montre le nom de l'enzyme de restriction EcoRI et le système de nommage implicite.

Dérivation du nom EcoRI
AbréviationSensLa description
EEscherichiaGenre
cocoliespèce
RRY 13Souche
jePremière identificationOrdre d'identification

Palindrome : Un groupe de lettres qui forment le même mot lorsqu'il est lu à la fois en avant et en arrière est appelé un palindrome. Enzyme de restriction coupée au niveau de la séquence palindrome dans un ADN. Voici un exemple de séquence palindrome :

5' —— CAATT —— 3'
3' —— CTTAAG —— 5'

Les enzymes de restriction coupent le brin d'ADN un peu à l'écart du centre des sites palindromes, mais entre les deux mêmes bases sur les brins opposés. Cela laisse des portions simple brin aux extrémités. Il y a des tronçons en surplomb appelés extrémités collantes sur chaque brin. Ceux-ci sont nommés ainsi car ils forment des liaisons hydrogène avec leurs homologues coupés complémentaires. Ce caractère collant des extrémités facilite l'action de l'enzyme ADN ligase.

Lorsqu'ils sont coupés par la même enzyme de restriction, les fragments d'ADN résultants ont le même type de « bouts collants » et ceux-ci peuvent être assemblés (de bout en bout) à l'aide d'ADN ligases.

À moins que le vecteur et l'ADN source ne soient coupés avec la même enzyme de restriction, la molécule de vecteur recombinant ne peut pas être créée.

Séparation et isolement de fragments d'ADN : La coupure de l'ADN par les endonucléases de restriction conduit aux fragments d'ADN. Ces fragments peuvent être séparés par une technique connue sous le nom d'électrophorèse sur gel. Étant donné que les fragments d'ADN sont des molécules chargées négativement, ils peuvent être séparés en les forçant à se déplacer vers l'anode sous un champ électrique à travers un milieu/matrice.

L'agarose est la matrice la plus couramment utilisée. C'est un polymère naturel qui est extrait des algues marines.

Les fragments d'ADN se séparent selon leur taille grâce à l'effet de tamisage fourni par le gel d'agarose. Ainsi, les fragments plus petits se déplacent plus loin que les fragments plus longs.

Les fragments d'ADN séparés sont colorés au bromure d'éthidium. Après cela, l'exposition aux rayons UV les rend visibles. Les fragments d'ADN apparaissent sous forme de bandes orange vif dans ce cas.

Les bandes d'ADN séparées sont découpées dans du gel d'agarose et extraites en construisant de l'ADN recombinant en les joignant à des vecteurs de clonage.

Vecteurs de clonage

Un petit morceau d'ADN prélevé sur un virus, un plasmide ou la cellule d'un organisme supérieur, qui peut être maintenu de manière stable dans un organisme, et dans lequel un fragment d'ADN étranger peut être inséré à des fins de clonage est appelé vecteur de clonage.

Voici les caractéristiques requises pour faciliter le clonage dans un vecteur.

  1. Origine de réplication (ori) : La séquence à partir de laquelle la réplication commence dans l'ADN est appelée l'origine de réplication (ori). Lorsqu'un morceau d'ADN est lié à cette séquence, il peut être amené à se répliquer dans la cellule hôte. Si vous souhaitez récupérer de nombreuses copies de l'ADN cible, il doit être cloné dans un vecteur dont « ori » prend en charge un nombre élevé de copies.
  2. Marqueur sélectionnable : Ce sont les substances qui aident à identifier et à éliminer les non-transformants et permettant sélectivement la croissance des transformants. Généralement, les gènes qui codent pour la résistance aux antibiotiques (ampicilline, chloramphénicol, tétracycline, kanamycine, etc.) sont considérés comme des marqueurs sélectionnables utiles pour E. coli. Le normal E. coli les cellules ne sont résistantes à aucun de ces antibiotiques.
  3. Sites de clonage : Tous les vecteurs de clonage ont des sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction couramment utilisées. Mais pour lier l'ADN étranger, le vecteur doit avoir très peu de sites de reconnaissance, de préférence un seul. La ligature de l'ADN étranger est réalisée au niveau d'un site de restriction présent dans l'un des deux gènes de résistance aux antibiotiques.

Exemple: Un ADN étranger peut être ligaturé au site Bam H I du gène de résistance à la tétracycline dans le vecteur pBR322. Les plasmides recombinants perdront leur résistance à la tétracycline en raison de l'insertion d'ADN étranger, mais ils peuvent toujours être sélectionnés parmi les plasmides non recombinants en étalant les transformants sur un milieu contenant de l'ampicilline.

Après cela, les transformants (croissant sur un milieu contenant de l'ampicilline) sont transférés sur un milieu qui contient de la tétracycline.

Le recombinant se développera dans un milieu contenant de l'ampicilline mais pas dans un milieu contenant de la tétracycline.

Mais les non-recombinants se développeront dans un milieu contenant les deux antibiotiques. Dans ce cas, un gène de résistance aux antibiotiques aide à sélectionner les transformants, tandis qu'un autre gène de résistance aux antibiotiques est inactivé en raison de l'insertion d'ADN étranger. Ainsi, il aide à la sélection des recombinants.

Noter: La sélection de recombinants due à l'inactivation des antibiotiques nécessite un placage simultané sur deux plaques ayant des antibiotiques différents. Il s'agit donc d'un processus lourd.

D'autres marqueurs sélectionnables ont été développés qui peuvent différencier les recombinants des non-recombinants sur la base de leur capacité à produire une couleur en présence d'un substrat chromogène.

Dans ce cas, un ADN recombinant est inséré au sein de la séquence codante d'une enzyme, la -galactosidase. Il en résulte une inactivation de l'enzyme. (C'est ce qu'on appelle l'inactivation insertionnelle).

La présence de substrat chromogène donne des colonies de couleur bleue si le plasmide dans les bactéries n'a pas d'insert.

La présence d'insert entraîne une inactivation par insertion de la -galactosidase et aucune couleur n'est produite par les colonies. De telles colonies sont identifiées comme des colonies recombinantes.

Vecteurs pour le clonage de gènes chez les plantes et les animaux : Les bactéries et les virus ont transféré leurs gènes pour transformer les cellules eucaryotes afin de les forcer à faire ce que veulent les bactéries ou les virus. Désormais, ces outils d'agents pathogènes peuvent être transformés en vecteurs utiles pour délivrer des gènes bénéfiques à l'homme. Par exemple, le plasmide inducteur de tumeur (Ti) de Agrobacterium tumifaciens a maintenant été modifié en un vecteur de clonage qui n'est plus pathogène pour les plantes. Ce vecteur peut maintenant être utilisé pour transférer des gènes bénéfiques dans de nombreuses plantes.

Hôte compétent (pour la transformation avec de l'ADN recombinant)

Nous savons que l'ADN est une molécule hydrophile. Par conséquent, il ne peut pas traverser les membranes cellulaires. Afin de forcer les bactéries à absorber le plasmide, la cellule bactérienne doit être «compétente» pour absorber l'ADN. Cela se fait en traitant les cellules bactériennes avec une concentration spécifique d'un cation divalent, par ex. calcium. Il augmente l'efficacité avec laquelle l'ADN pénètre dans la bactérie à travers les pores de sa paroi cellulaire.

L'ADN recombinant peut ensuite être forcé dans de telles cellules en suivant les étapes suivantes :

  • Les cellules ainsi que l'ADN recombinant sont incubés sur de la glace.
  • Ils sont ensuite placés brièvement à 42°C (choc thermique).
  • Ensuite, ils sont remis sur glace.

Micro-injection : Dans cette méthode, l'ADN recombinant est directement injecté dans le noyau d'une cellule animale.

Gène Gun : Cette méthode est appliquée pour les cellules végétales. Dans cette méthode, les cellules sont bombardées de microparticules à grande vitesse d'or ou de tungstène recouvertes d'ADN.

Agent pathogène désarmé : Lorsque l'agent pathogène désarmé infecte la cellule, il transfère l'ADN recombinant dans l'hôte.


Comment les différentes classes de gènes d'E coli sont-elles déterminées ? - La biologie

Gènes essentiels dans E. coli

Cette page a été mise à jour pour la dernière fois en mars 2004. Elle fournit des liens vers des données sur les gènes essentiels dans E. coli, et montre une courte liste de gènes essentiels d'E. coli identifiés à partir de l'analyse de Neidhardt E. coli livres (Neidhardt et Curtiss, 1996). Je définis les gènes essentiels comme les gènes qui sont requis dans la souche WT MG1655 pour la formation de colonies sur un milieu riche solide dans les 24 heures d'incubation à 37 degrés C. Une méthode pour établir l'essentialité d'un gène est l'échec à obtenir une valeur nulle mutation en elle. Cette approche est sujette à la fois aux faux positifs et aux faux négatifs (voir Gerdes et al. 2003 et Kang et al. 2004). Afin d'identifier sans équivoque un gène essentiel, un mutant létal conditionnel doit être réalisé (voir Herring et Blattner, 2004).

La meilleure source de données sur l'identité des gènes essentiels dans E. coli est le tableau # S2 réalisé par Svetlana Gerdes et d'autres d'Integrated Genomics, associé à leur article récent (Gerdes et al. 2003). Il est disponible ici. Il compare les déterminations d'essentialité de 3 sources : la base de données PEC, le projet de mutagenèse systématique du Tn5 du laboratoire Blattner et leurs propres travaux.

Une autre excellente source est la base de données PEC (Profiling of Escherichia coli chromosome), qui répertorie les gènes essentiels identifiés à partir de recherches bibliographiques. Il peut également contenir des données expérimentales, mais ce n'est pas tout à fait clair.

Une autre source potentielle provient des mutants antisens fabriqués par les employés d'Elitra Pharmaceuticals. Ils n'ont pas publié leurs travaux, mais la plupart des données sont disponibles dans les demandes de brevet américain n° 20020045592 et 2002022718, disponibles ici. Leurs travaux avec Staphylococcus ont été publiés (Forsyth et al. 2002).

. S'il vous plaît écrivez-moi avec des suggestions ou des données sur les gènes essentiels.

Liste partielle des gènes essentiels identifiés à partir des livres Neidhardt E. coli et Salmonella (Neidhardt et al. 1996). Notez qu'en mars 2004, j'ai supprimé certains des gènes précédemment listés (dinD, ftsE, ftsX, glmS, glmU, htrA, htrB, htrC, infC, lnt, nusB, rfaD, ribB, rpoE, surA) car ils ne correspondaient pas à mes définition des gènes essentiels (ils n'étaient requis que dans certaines conditions, comme une température élevée ou une faible teneur en sel). Ces données doivent être utilisées avec prudence - une enquête approfondie des références primaires n'a PAS été effectuée.


Résistance multidrogue et prévalence élevée des intégrons de classe 1 dans Escherichia coli Isolé de l'eau d'irrigation et des légumes dans certaines parties de Nsukka et d'Enugu, au Nigeria

La contamination des produits frais par les eaux d'irrigation a conduit à des épidémies de maladies d'origine alimentaire, mais les eaux usées traitées se présentent comme une alternative intéressante à l'eau de qualité rare dans les pays en développement. Le transfert horizontal d'intégrons joue un rôle important dans la propagation et le maintien de la résistance aux antimicrobiens parmi les Entérobactéries.

Objectif de l'étude

Cette étude a évalué les effluents de l'Université du Nigeria, l'usine de traitement des eaux usées de Nsukka (UNN-WWTP) ainsi que les légumes irrigués avec les effluents et les légumes vendus sur des marchés sélectionnés pour la présence de Escherichia coli et déterminé la prévalence des intégrons dans les isolats multirésistants.

Méthodes

Isolement et identification des présomptions E. coli a été fait en utilisant des plaques de gélose à l'éosine bleu de méthylène (EMB) et la procédure de coloration de Gram. La confirmation de E. coli et entérotoxinogène E. coli (ETEC) ont été obtenus par détection par réaction en chaîne par polymérase (PCR) de la bêta-glucuronidase cible (fluideA) et la toxine thermolabile (ll) gènes respectivement. La résistance aux antibiotiques a été déterminée en utilisant la méthode de diffusion sur disque de Bauer-Kirby et les critères du Clinical and Laboratory Standard Institute. Les intégrons ont été détectés par PCR multiplex en utilisant des amorces spécifiques pour les intégrons de classe 1 et 2.

Résultats

Un total de 178 E. coli les isolats ont été obtenus à partir d'effluents de STEP (41), de légumes de serre (46), Légumes de la ferme (55) et Légumes du marché (36). Vingt-trois de ces 178 isolats (12,9 %) ont été confirmés comme entérotoxinogènes E. coli (ETEC). Les taux d'isolement de l'ETEC pour les différents types d'échantillons étaient : effluents de station d'épuration, 20 % (n=60), légumes de serre 8,3 % (n=60), légumes de la ferme 4,8 % (n=84) et légumes du marché 2,4 % (n =84). Tous les isolats étaient multirésistants. Les types de résistance les plus fréquents dans le 178 E. coli les isolats étaient : cloxacilline (100 %), métronidazole (100 %), vancomycine (98,8 %), érythromycine (94,3 %) et clarithromycine (89,6 %). La multirésistance aux médicaments (MDR) a été détectée dans les isolats de toutes les sources, allant d'une résistance à cinq médicaments observée dans un seul isolat à 16 profils de résistance aux médicaments trouvés dans deux isolats différents. Sur les 178 E. coli isolats, des intégrons de classe 1 ont été détectés dans 175 (98,3 %) et des intégrons de classe 2 ont été détectés sur 5 (2,8 %). Tous les intégrons de classe 2 ont été trouvés dans des isolats positifs pour la classe 1.

Conclusion

Les taux de détection élevés de E. coli dans les échantillons d'effluents et végétaux étudiés représentent des risques potentiels pour la santé publique accrus par la multirésistance observée dans tous les isolats et la prévalence élevée des intégrons de classe 1. It is concluded that UNN-WWTP is a significant reservoir for diarrheagenic E. coli. Vegetable farming at the site should therefore be discontinued as it presents significant threat to the health of consumers of such vegetables.


Scientists create new class of “Turing patterns” in colonies of E. coli

Commentaires des lecteurs

Partagez cette histoire

Shortly before his death, Alan Turing published a provocative paper outlining his theory for how complex, irregular patterns emerge in nature—his version of how the leopard got its spots. These so-called Turing patterns have been observed in physics and chemistry, and there is growing evidence that they also occur in biological systems. Now a team of Spanish scientists has managed to tweak E. coli in the laboratory so that the colonies exhibit branching Turing patterns, according to a recent paper published in the journal Synthetic Biology.

"By using synthetic biology, we have a unique opportunity to interrogate biological structures and their generative potential," said co-author Ricard Solé of Universitat Pompeu Fabra in Barcelona, Spain, who is also an external professor at the Santa Fe Institute. "Are the observed mechanisms found in nature to create patterns the only solutions to generate them, or are there alternatives?"

In synthetic biology, scientists typically stitch together long stretches of DNA—which can be taken from other organisms, or be entirely novel—and insert them into an organism's genome.

As we've reported previously, Turing was attempting to understand how natural, nonrandom patterns emerge (like a zebra's stripes or a leopard's spots), and he focused on chemicals known as morphogens in his seminal 1952 paper. He devised a mechanism involving the interaction between an activator chemical that expresses a unique characteristic (like a tiger's stripe) and an inhibitor chemical that periodically kicks in to shut down the activator's expression.

Lectures complémentaires

Both activator and inhibitor diffuse throughout a system, much like gas atoms will do in an enclosed box. It's a bit like injecting a drop of black ink into a beaker of water. Normally this would stabilize a system: the water would gradually turn a uniform gray. But if the inhibitor diffuses at a faster rate than the activator, the process is destabilized. That mechanism will produce a so-called "Turing pattern": spots (like on a leopard) or stripes (like on a tiger).

James Murray, emeritus professor of mathematical biology at the University of Oxford and an applied mathematician at Princeton, imagined a field of dry grass dotted with grasshoppers for an article I wrote for Quanta back in 2013:

If the grass were set on fire at several random points and no moisture were present to inhibit the flames, Murray said, the fires would char the entire field. If this scenario played out like a Turing mechanism, however, the heat from the encroaching flames would cause some of the fleeing grasshoppers to sweat, dampening the grass around them and thereby creating periodic unburned spots in the otherwise burned field.

Scientists have tried to apply this basic concept to many different kinds of systems. For instance, neurons in the brain could serve as activators and inhibitors, depending on whether they amplify or dampen the firing of other nearby neurons—possibly the reason why we see certain patterns when we hallucinate. There is evidence for Turing mechanisms at work in zebra-fish stripes, the spacing between hair follicles in mice, feather buds on a bird's skin, the ridges on a mouse's palate, as well as the digits on a mouse's paw. Certain species of Mediterranean ants will pile the dead bodies of ants into structures that seem to exhibit Turing patterns, and there is evidence of Turing patterns in the movement of Azteca ant colonies on coffee farms in Mexico.

In essence, it's a type of symmetry breaking. Any two processes that act as activator and inhibitor will produce periodic patterns and can be modeled using Turing's diffusion function. The challenge is moving from Turing's admittedly simplified model to pinpointing the precise mechanisms serving in the activator and inhibitor roles. This is especially challenging in biology, where scientists are keen to shed more light on the question of how a complex embryo can emerge from tissue that is completely homogenous.

For this latest study, Solé and his collaborators opted to work with colonies of E. coli, genetically engineering the bacteria to introduce a mechanism to generate spatial patterns. "We wanted to build symmetry breaking that is never seen in colonies of E. coli, but is seen in patterns of animals, and then to discover which are the essential ingredients needed to generate these patterns," said co-author Salva Duran-Nebreda, now a postdoc at the Institut de Biologia Evolutiva in Barcelona.

Solé's team found inspiration in the underlying mechanisms of how ants and termites build their nests. Their altered E. coli system consisted of three critical components: a group of regular-sized cells that divided and diffused normally (the activator) a group of elongated cells unable to divide or diffuse (the inhibitor) and a molecule known as a lactone that helps regulate gene expression in E. coli, enabling them to communicate through so-called quorum sensing.

The researchers then observed how the colony grew and evolved. The shape started out as a circle, but as the days progressed and it kept spreading outward, the colony began sprouting regularly spaced "branches" around the edge, in keeping with Turing's theory—like a flower with petals.

"We have seen that by modulating three ingredients we can induce symmetry breaking. In essence, we have altered cell division, adhesion between cells and long-distance communication capacity (quorum sensing), that is to say, perceive when there is a collective decision," said Duran-Nebreda.

The authors hope to apply their findings to other biological systems, such as social insects. Their work provides "a new conceptual framework to create Turing-like patterns in microbial communities, and the relevance of this study goes far beyond this specific implementation," said Solé. "We suspect that hidden under the complexity of entangled gene interactions lies the kind of self-organization principles envisioned by Turing."


Discovery of E. coli.

E. coli was first identified in 1885 by German-Austrian pediatrician and microbiologist Theodor Escherich. Escherich first discovered the bacteria in the feces of his patients as a part of his research identifying the role of gut flora in early infantile and childhood development. Escherich demonstrated that gut flora, including E. coli, is a critical part of digestion and that imbalances in gut flora can cause pathologies. He was also well known for his pioneering work in using X-rays as a diagnostic tool in children.


Voir la vidéo: Les Enterobactéries: Escherichia coli en bactériologie médicale (Décembre 2022).