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Diluer les plasmides d'ADN avec de l'eau distillée

Diluer les plasmides d'ADN avec de l'eau distillée


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Je viens d'extraire le plasmide d'ADN de E.Coli et les diluer dans du tampon EB. Cependant, je viens de comprendre que l'étape suivante, qui est l'électroporation, nécessitait que le plasmide d'ADN soit dilué dans Distilled H2O. Quelqu'un peut-il m'aider à savoir comment transférer le plasmide d'ADN du tampon EB au distillé H2Oh ? Pour être clair, le tampon EB que j'ai utilisé provient de Qiagen. Il contient du Tris-Cl 10 mM, pH 8,5. https://www.qiagen.com/sg/resources/faq?id=d8ef773f-6a37-4993-908b-8bbc7bc5c8d6&lang=en


Le tampon EB est simplement un tampon Tris 10 mM, pH 8,5. Je pense que vous vous inquiétez des ions présents dans votre électroporation. Il y a deux choses à considérer :

  1. Quelle est la concentration de votre ADN et de combien avez-vous besoin pour l'électroporation ?
  2. Dans quel volume final l'électroporation a-t-elle lieu ?

D'après mon expérience, vous ajoutez généralement une très petite quantité d'ADN (quelques microlitres) à un volume final de 100, 250 ou 400 µl (selon les cuvettes utilisées). Ici, une infime quantité de Tris n'interfère pas et ne provoque pas de court-circuit.


B1- Biologie cellulaire

Dans la deuxième étape, la mitose a lieu. Un jeu de chromosomes est tiré à chaque extrémité de la cellule. Le noyau se divise également.

Température
Plus la température est élevée, plus la vitesse de diffusion est élevée. C'est parce que les molécules ont plus d'énergie cinétique et se déplacent donc plus rapidement

utilisez un perce-bouchon pour produire 3 cylindres de pomme de terre- L'utilisation d'un perce-bouchon garantit que les cylindres ont le même diamètre

Utilisez un scalpel pour couper les cylindres à la même longueur (environ 3 cm)

Mesurer la longueur de chaque cylindre à l'aide d'une règle et la masse de chacun à l'aide d'une balance

Placez maintenant chaque cylindre dans un tube à essai et ajoutez ce qui suit :
- Solution de sucre 0,5 molaire
- Solution de sucre 0,25 molaire
- eau distillée

Laisser les cylindres de pommes de terre pendant la nuit pour permettre à l'osmose d'avoir lieu

Retirez les cylindres de pommes de terre et roulez-les sur une serviette en papier pour éliminer toute humidité de surface


B. Concentration des acides nucléiques par précipitation

Concentration de l'ADN par précipitation à l'isopropanol

Si l'ADN génomique ou plasmidique purifié est trop dilué pour l'application en aval sélectionnée, l'ADN peut être concentré par précipitation à l'isopropanol.

  1. Ajouter 0,7 volume d'isopropanol à température ambiante à l'échantillon purifié.
  2. Vortex, puis centrifugation pendant 15 min à 5 000 × g à 4 °C.
  3. Eliminer le surnageant par décantation en prenant soin de ne pas perturber le culot.
  4. Ajouter 2 ml d'éthanol à 70 % préalablement refroidi à 4 °C. Vortex brièvement et tourner pendant 10 min à 5 000 × g à 4 ° C.
  5. Retirer délicatement le surnageant sans déranger le culot. Sécher à l'air pendant 5 à 10 min. Ne pas trop sécher le culot car cela rendra l'ADN difficile à redissoudre.
  6. Remettre en suspension l'ADN dans le volume souhaité d'un tampon approprié (par exemple., TE pH 8,0 ou Tris-HCl 10 mM pH 8,5). Pour s'assurer que le culot est complètement dissous, incuber à 55 ° C pendant 1 h.

Concentration d'ARNm par précipitation

(Adapté du protocole dans QuickPrep mRNA Kit.)

Solution de glycogène : 5 à 10 mg/mL de glycogène dans de l'eau sans RNase ou traitée au DEPC*

Acétate de potassium : solution d'acétate de potassium 2,5 M (pH 5,0) (préparée avec de l'eau sans RNase ou traitée au DEPC)

Eau traitée au DEPC : préparer une solution à 0,1 % (v/v) de pyrocarbonate de diéthyle dans de l'eau distillée, agiter vigoureusement et laisser reposer une nuit à température ambiante. Autoclaver la solution le lendemain avec le bouchon desserré. L'eau sans RNase disponible dans le commerce peut être utilisée à la place de l'eau traitée au DEPC dans ce protocole.

* 0,1% d'eau traitée au DEPC.

1. Ajouter 75 L (1/10 de volume) de solution d'acétate de potassium et 10 L de solution de glycogène à 0,75 mL d'ARNm dans de l'eau sans RNase. Ajouter 1,5 ml d'éthanol à 95 % réfrigéré (2 à 2,5 volumes) et incuber l'échantillon à -20 °C pendant au moins 15 min. La quantité de glycogène doit rester constante quel que soit le volume de l'échantillon.

2. Recueillir l'ARNm par centrifugation à max. vitesse dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 10 min. Si l'ARN n'est pas utilisé immédiatement, conservez-le dans cet état précipité (dans l'éthanol) à -80 °C.

3. Décanter le surnageant et retourner le tube sur une serviette en papier propre. Tapotez doucement le tube sur la serviette pour faciliter l'élimination de l'excès de liquide. Laver soigneusement le culot en pipetant 1 ml d'éthanol à 80 % prérefroidi dans le tube et inverser doucement plusieurs fois. Centrifuger à pleine vitesse à 4 °C pendant 10 min. Décanter l'éthanol et laisser sécher à l'air. Lorsque toutes les traces d'éthanol ont disparu, redissoudre l'ARN précipité dans un volume approprié d'eau sans RNase. Pour déterminer le volume de remise en suspension approprié, considérez la concentration d'ARN souhaitée, la concentration avant précipitation et le volume de l'échantillon soumis à la précipitation. Cependant, le pourcentage d'ARN récupéré après précipitation dépendra de la quantité totale présente. Avec 10 µg d'ARN par exemple, environ 70 % seront récupérés. Vous pouvez donc souhaiter redissoudre le culot dans un volume 25 à 50 % plus petit que ce qui serait nécessaire si tout l'ARN était récupéré.


Planification stratégique

Les vecteurs rapporteurs de luciférase multiplex générés pour ce protocole sont construits à l'aide d'une méthode de plate-forme d'assemblage d'ADN basée sur le système de clonage GoldenBraid 2.0 (Sarrion-Perdigones et al., 2011, 2013, voir l'article Current Protocols in Molecular Biology de Vazquez-Vilar, et al. , 2020). Ce système implique une réaction en une seule étape, mélangeant plusieurs parties d'ADN à assembler qui sont libérées et ligaturées ensemble pour générer des produits d'assemblage définis dans un plasmide de destination. À l'aide de cette plate-forme d'assemblage, plusieurs éléments génétiques peuvent être combinés en des unités rapporteurs transcriptionnelles uniques, qui peuvent ensuite être combinées davantage pour obtenir plusieurs unités rapporteurs transcriptionnelles dans un seul plasmide. La combinaison de tous les rapporteurs sur un seul vecteur réduit la variabilité plus élevée entre les expériences pour les unités transcriptionnelles de rapporteur et de contrôle, par rapport au moment où toutes les unités de rapporteur, chacune assemblées dans un plasmide individuel, sont cotransfectées.

Auparavant, nous avons conçu le premier test de luciférase multiplex hextuple pour étudier la signalisation transcriptionnelle via les éléments de réponse c-Myc, NF-κβ, TGF-β, p53 et MAPK/JNK, contre un promoteur de contrôle constitutif (promoteur CMV ). Nous avons placé la luciférase ELuc sous le contrôle du promoteur CMV et les cinq autres luciférases sous le contrôle d'éléments régulateurs de l'ADN activés par l'une des cinq voies cellulaires spécifiques. Le signal de contrôle du promoteur CMV est utilisé pour normaliser la lecture de chaque voie. Nous avons déposé le vecteur luciférase hextuple multiplex et toutes les pièces nécessaires pour le construire dans le référentiel public de plasmides Addgene. Dans ce protocole, nous décrivons en détail les différentes étapes effectuées lors du dosage de la luciférase multiplex, en utilisant le même vecteur de luciférase hextuple multiplex, mais appliqué aux changements de sonde dans cinq voies de signalisation cellulaire dans la lignée cellulaire de cancer du poumon A549, démontrant l'applicabilité du même dosage multiplex à travers différents systèmes de modèles cellulaires. Cependant, il est important pour les chercheurs de noter que l'approche multiplex décrite peut également être adaptée aux besoins individuels en incorporant d'autres voies de signalisation dans le test décrit, comme expliqué dans Current Protocols in Molecular Biology (Sarrion-Perdigones et al., sous presse) .


Extraction d'ADN génomique de levure - (13/03/2007)

J'ai du mal à extraire l'ADNg de S. cerevisiae et un de mes collègues a le même problème avec C. albicans. Nous utilisons tous les deux un kit et suivons toutes les instructions, mais ensuite, lorsque nous analysons les échantillons sur agarose, la bande d'ADN ne correspond pas à nos attentes selon les quantifications du spectrophotomètre.

Nos rendements sont excellents et les ratios 260/280 se situent entre 1,8 et 2,0. Nous avons déjà vérifié le spectrophotomètre avec du sperme de saumon avec une concentration sur pied mais tout va bien avec l'équipement. Il doit y avoir quelque chose dans l'extraction.

et si nous continuons avec la PCR, les digestions enzymatiques ou même le marquage aléatoire d'amorçage, ces procédures ne fonctionnent pas / ont des rendements très faibles.

votre ADN est-il exempt d'ARN ?

-Agarose la bande d'ADN ne correspond pas à nos attentes selon les quantifications du spectrophotomètre.

une cause fréquente est la contamination par l'ARN.. qui peut faire varier quelque peu la lecture du spectrophotomètre. La bande d'agarose est la quantité réelle d'ADN.

Quant à l'ADN ne coupant pas avec les enzymes de restriction. la cause est que l'ADN n'est pas assez propre. Effectuer 2 à 3 extractions au phénol et au chloroforme. (le cas échéant remettre en suspension l'ADN dans un volume de 500 ul, car vous pouvez perdre beaucoup de volume pendant l'extraction) Une fois nettoyé, essayez de couper avec EcoRI. S'il ne parvient pas à couper avec EcoRI, effectuez plus d'extractions de phénol/chloroforme. EcoRI, peut être considéré comme l'une des meilleures enzymes du marché. S'il ne peut pas couper votre ADN, rien ne le peut.

Comme l'ADNg n'est pas aussi propre que l'ADN plasmidique, donnez-lui plus de temps pour digérer. Faites également attention à la dégradation de l'ADN par les nucléases. (c'est-à-dire que le frottis de digestion commence à se concentrer sur de très petits fragments d'environ 500 pb.) Puisque vous rencontrez les problèmes ci-dessus, la perte de votre ADN par réactivation de la nucléase dans le tampon de digestion est un réel danger.

Quant à la PCR, encore une fois l'ADN n'est pas assez propre. Et entre mes mains, même 'nettoyé', ce n'est toujours pas assez bon. Je dilue mon échantillon d'ADN génomique au moins 1:5 à 1:50 avec de l'eau distillée stérile pour servir de matrice. La dilution aide à diluer tout contaminant restant. Et la PCR amplifie le signal faible. Notez que l'ADN génomique conservé dans l'eau SD vit longtemps. environ 5-6 mois dans mes mains. Pour un stockage à long terme, gardez toujours l'ADN dans TE.

Mais avec tout dit, il faut un peu de pratique pour obtenir un bon ADN propre. Soyez courageux et fouillez avec votre protocole pour voir s'il peut être amélioré. Si ce n'est pas le cas, voyez ce que vous pouvez faire de plus avec l'ADN une fois que vous l'avez.

À propos de la contamination par l'ARN. Il se peut que je vérifie toujours le pH Ph:Ch avant de commencer l'extraction d'ADN afin que j'aie de l'ADN au lieu de l'ARN.

L'enzyme que j'utilise coupe l'ADN, je peux voir le frottis attendu dans le gel mais encore une fois avec une intensité plus faible que prévu. J'ai déjà essayé de le digérer pendant la nuit mais les résultats sont les mêmes.


Fanos Tadesse 1,2 *, Demasa Negessu 2 , Tsion Bilata 2 , Ayelech Muluneh 2 et Dereje Shegu 2

1 Collège universitaire de médecine vétérinaire d'Addis-Abeba, Éthiopie

2 Centre national de diagnostic et d'investigation en santé animale, Éthiopie

A reçu: 13 décembre 2019 | Publié : 06 janvier 2020

Auteur correspondant: Fanos Tadesse, Collège universitaire de médecine vétérinaire d'Addis-Abeba, Éthiopie [email protected] -->

Résumé

Le clonage de gènes est un moyen de prélever un morceau d'ADN de l'organisme où il se trouve naturellement et de le placer dans un hôte de clonage tel que la bactérie Escherichia coli. Les cellules bactériennes qui contiennent de l'ADN étranger peuvent exprimer l'information génétique et fabriquer les produits géniques. Pour pouvoir effectuer le clonage dans E. coli, le vecteur plasmide pHEN6c a été utilisé pour cloner un fragment d'ADNc d'un ARNm codant pour le nanocorps. Le plasmide de E. coli a été extrait, purifié puis digéré en utilisant les enzymes de restriction PstI et Eco91I. La pureté et la concentration du plasmide étaient respectivement de 1,84 et 39,2 ng/μl. Le vecteur pHEN6c ainsi que l'ADNc du nanocorps ont été digérés avec les enzymes de restriction PstI et Eco91I puis ligaturés pour former un plasmide recombinant. Les constructions ont été transformées dans la souche Escherichia coli par la méthode du choc thermique. Les cellules ont été cultivées pendant une nuit et l'efficacité de transformation a été déterminée à 7867,22 transformants/ug. Dans cette expérience, la séquence cible s'est amplifiée et des bandes ont été obtenues après électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % des produits de PCR de colonie. Pour déterminer la taille de l'ADNc cloné et du vecteur pHEN6c, des graphiques de la morbidité relative par rapport à la taille moléculaire (log pb) ont été utilisés et la taille était de 573 pb et 3842 pb pour l'ADNc et le vecteur respectivement. Les techniques de clonage recèlent de nombreuses recherches futures prometteuses en génie génétique et en biotechnologie. Il est donc important d'apprendre par l'expérimentation pratique et la recherche du clonage à exploiter le meilleur de la nature (organisme vivant) à notre avantage.

Mots clés: Gène de nanocorps de clonage de plasmide

Introduction

La découverte de la structure et du rôle de l'ADN et le tri du code génétique ont conduit au cours des 50 dernières années à une explosion de notre compréhension des organismes et de leur fonctionnement. À l'avant-garde de cette révolution est venu le clonage de gènes. Le terme « clonage de gènes » recouvre un large éventail de techniques permettant de manipuler l'ADN dans une éprouvette et de le restituer à des organismes vivants où il fonctionne normalement. L'importance de cette technologie est qu'elle nous permet d'isoler n'importe quel morceau d'ADN parmi les millions de paires de bases qui composent le génome d'un organisme. Cette première étape est essentielle pour toute une série d'études scientifiques et technologiques, allant de l'étude d'un gène qui contribue à provoquer une maladie héréditaire, à la bio-ingénierie d'une souche de levure qui produit un produit pharmaceutique utile [1]. Le clonage de gènes consiste à prélever un morceau d'ADN de l'organisme où il se trouve naturellement et à le placer dans un hôte de clonage tel que la bactérie Escherichia coli. Il est alors possible d'étudier l'ADN cloné ou de produire la protéine codée par le gène. Pour de nombreuses applications, vous souhaiterez peut-être transférer ultérieurement l'ADN cloné dans un autre organisme, mais les étapes initiales de clonage sont presque toujours effectuées dans E. coli [2].

En utilisant des endonucléases de restriction, l'ADN étranger peut être inséré dans des plasmides bactériens et peut être répliqué). Les cellules bactériennes qui contiennent de l'ADN étranger peuvent exprimer l'information génétique et fabriquer les produits géniques. Ainsi, en clonant ces cellules, nous pouvons en apprendre davantage sur la structure et le fonctionnement de gènes et de produits géniques spécifiques ainsi que sur l'expression de protéines rares. La transformation de plasmides en cellules bactériennes compétentes est une technique clé du clonage moléculaire pour transformer la constitution génétique d'autres organismes [3].

Les plasmides sont les vecteurs les plus couramment utilisés pour le clonage de gènes et sont de petites molécules d'ADN circulaires trouvées dans de nombreux types de bactéries ayant une "origine de réplication" qui dirige la réplication du plasmide et garantit que la cellule clonée contient de nombreuses copies du plasmide qui sont distribuées entre les cellules filles lorsque la cellule se divise [4]. Le nombre exact de copies varie selon le plasmide. Si le gène cloné fait partie d'une molécule d'ADN ayant une origine de réplication, c'est-à-dire cloné dans un plasmide, il sera également copié lors de la copie du plasmide. Les plasmides couramment utilisés dans le clonage contiennent un marqueur sélectionnable, généralement un gène de résistance aux antibiotiques. Cela signifie que nous pouvons savoir quelles bactéries contiennent le plasmide simplement en les étalant sur une plaque de gélose contenant l'antibiotique où la croissance est appréciée dans l'organisme contenant le plasmide [5].

Les plasmides sont considérés comme des éléments génétiques transférables, ou « réplicons », capables de se répliquer de manière autonome au sein d'un hôte approprié. Bien qu'il soit capable d'auto-réplication, il utilise toujours la machinerie de la cellule hôte pour remplir cette fonction. Les plasmides fournissent un mécanisme de transfert horizontal de gènes au sein d'une population de microbes et fournissent généralement un avantage sélectif dans un état environnemental donné. Les plasmides peuvent porter des gènes qui offrent une résistance aux antibiotiques d'origine naturelle dans une niche environnementale compétitive, ou bien les protéines produites peuvent agir comme des toxines dans des circonstances similaires. Les plasmides peuvent également fournir aux bactéries la capacité de fixer l'azote élémentaire ou de dégrader les composés organiques récalcitrants, ce qui constitue un avantage dans des conditions de privation de nutriments [6].

Dans cette expérience, les principes de base du génie génétique ont été utilisés pour résoudre les défis scientifiques, la recherche et le développement de produits. Pour atteindre notre objectif, des plasmides ont été isolés de la culture bactérienne d'E. coli et un plasmide recombinant contenant des fragments spécifiques de constructions génétiques de nanocorps a ensuite été transformé dans des cellules d'E. coli, conférant une résistance à l'ampicilline aux cellules hôtes. D'autres techniques de base pour l'analyse des résultats par PCR et électrophorèse sur gel d'agarose ont également été utilisées.

Méthodologie

Isolement du plasmide pHEN6c

L'isolement du plasmide pHEN6c a été réalisé en 7 étapes successives : récolte des cellules, remise en suspension des cellules, lyse des cellules, neutralisation, préparation de la colonne, chargement du lysat clarifié, lavage de la colonne et élution de l'ADN. Nous avons récolté la culture d'E. coli pendant la nuit et mis son 1 ml dans un tube Eppendorf. Nous l'avons centrifugé dans une microcentrifugeuse à une vitesse élevée de 10 600 tr/min (12 000 xg) en 1 minute. Après décantation du surnageant, 1 ml supplémentaire de la culture d'E. coli a été ajouté au culot tel que centrifugé à nouveau à grande vitesse en une minute. Le surnageant résultant a été versé dans un bécher à déchets tandis que le culot a été immédiatement remis en suspension dans 2 l de la solution de remise en suspension. Le mélange a été vortexé pour assurer une remise en suspension appropriée et complète. Pour lyser le culot d'E. coli remis en suspension, 2 pi de la solution de lyse ont été ajoutés. Le contenu a été doucement inversé environ 6 à 8 fois (au lieu d'utiliser un vortex, car cela peut provoquer le cisaillement de l'ADN génomique et par conséquent la contamination de l'ADN plasmidique). La neutralisation est immédiatement suivie de l'ajout de 350μl de la solution de neutralisation pour précipiter les débris cellulaires. Le contenu du mélange a ensuite été doucement inversé 4 à 6 fois. Le même contenu a été centrifugé à grande vitesse (12 000 xg) en 10 minutes. Comme notre surnageant ne contenait pas beaucoup de particules flottantes, la deuxième centrifugation s'est avérée inutile.

La colonne a été préparée en insérant une colonne GenEute Miniprep Binding dans un tube de microcentrifugation. 500 pi de la solution de préparation de la colonne ont été ajoutés à la colonne miniprep et centrifugés à grande vitesse (12 000 xg) en 30 secondes à 1 minute. Le liquide qui s'écoulait a été jeté. La colonne préparée a servi au chargement du lysat clarifié (résultant de la neutralisation). Le lysat clarifié a été ajouté à la colonne déjà préparée et centrifugé à grande vitesse de 12 000 xg en 30 secondes à 1 minute. Le lavage de la colonne a ensuite été effectué en ajoutant 750 µl de la solution de lavage diluée à la colonne centrifugée à la vitesse de 12 000 xg pendant 30 secondes à 1 minute également.

Le liquide s'écoulant a été jeté dans un bécher à déchets et la colonne a été de nouveau centrifugée à vitesse élevée 12 000 xg en 1 à 2 minutes pour éliminer tout excès d'éthanol. Nous avons finalement élué l'ADN en transférant la colonne dans un nouveau tube de collecte, puis nous avons ajouté 50μl de la solution d'élution et centrifugé.

Détermination de la pureté de l'ADN plasmidique, concentration

La détermination de la pureté (DO 260/DO 280) et de la concentration (ƞg/μl) de l'ADN plasmidique isolé d'E.coli a été effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre (Nanodrop™) à l'aide du logiciel informatique connecté la valeur pour les deux la pureté et la concentration ont été calculées et générées.

Digestion par endonucléase de restriction du gène de nanocorps et du plasmide pHEN6c

Digestion de l'ADN (plasmide pHEN6c) : La concentration de plasmide d'ADN déterminée, pour notre sous-groupe, était faible (279,6 g/μl) par conséquent, nous avons utilisé une concentration moyenne de plasmide de 317,57 ƞg/μl résultant d'une combinaison des quatre concentrations de plasmide d'ADN les plus élevées 282 g/μl) obtenus par d'autres sous-groupes. A 11,75 l d'eau distillée, un volume de 31,25 l (du plasmide ADN avec 317,57 g/μl) a été ajouté, suivi de l'ajout de 5 l de 10x Buffer-o (Fermantas) et 1 l d'enzyme de restriction Eco91I (10 unités/μl ) et l'enzyme de restriction PstI (10 unités/μl). Le mélange entier (50μl) a ensuite été incubé pendant une nuit à 37°C.

Digestion et purification de l'ADNc amplifié par PCR : Les cDNA (Nanobody gene PCR fragments) déjà préparés et purifiés ont été soumis à une digestion par des enzymes de restriction spécifiques. A 29,41μl d'eau distillée, un volume de 13,59μl (de fragments PCR) a été ajouté, suivi de l'ajout de 5μl de 10x Buffer-o (Fermantas) et 1μl d'enzyme de restriction Eco91I (10unités/μl) et de l'enzyme de restriction PstI ( 10 unités/μl). Le mélange entier (50μl) a ensuite été incubé pendant une nuit à 37°C. Le kit de nettoyage PCR GenElute TM est entré en jeu pour nettoyer (purifier) ​​l'ADNc amplifié par PCR. Nous avons commencé par préparer la colonne (pour maximiser la liaison de l'ADN à la membrane). Un volume de 0,5 ml de la solution de préparation de colonne a été ajouté à une colonne de liaison GenElute Miniprep déjà insérée dans un tube de collecte.

Le tube de collecte a ensuite été centrifugé à 12 000 rcf pendant 30 secondes à une minute. Le rejet a été rejeté. Un volume de 500 l de solution de liaison a été ajouté et mélangé à 50 l de la réaction PCR. La solution de mélange a été transférée dans la colonne de liaison. La colonne (dans le tube collecteur) a été centrifugée à 12 000-16 000 rcf pendant une minute. Le liquide d'élution a été jeté. La solution de lavage diluée, 0,5 ml, a été ajoutée à la colonne et centrifugée à 12 000-16 000 rcf pendant une minute. L'éluat a été jeté. Pour éliminer tout excès d'éthanol, le tube collecteur (avec la colonne dedans) a ensuite été centrifugé à 12 000-16 000 rcf pendant 2 minutes. Le tube de collecte avec l'éluant a été jeté tandis que la colonne a ensuite été transférée dans un nouveau tube de collecte de 2 ml. L'élution a été réalisée par l'ajout de 50μl de la solution d'élution à la colonne. Pour éluer l'ADN, la colonne a été centrifugée à 12 000-16 000 rcf pendant une minute. L'éluat résultant contenait le produit PCR purifié et il a été immédiatement utilisé (ou stocké à -20°C).

Ligature

A 13,9 l d'eau distillée, 2,28 l de fragments PCR, 0,82 de vecteur plasmidique, 2μl de tampon de ligation (0,2 M Tris pH=7,6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 500 ug/ml BSA, 5mM ATP) et 1μl de L'ADN de T4 a été ajouté dans un tube pour obtenir un volume total de 20μl. La solution était à température ambiante pendant 2 heures.

Transformation

Génération de cellules compétentes Cacl2 : Pour préparer des cellules compétentes pour le «choc thermique», 5 ml de LB (sans antibiotiques) ont été inoculés et ajoutés à une seule colonie provenant d'une plaque fraîche, dans un tube stérile de 50 ml. Le milieu ensemencé a ensuite été incubé à 37°C pendant une nuit (sous agitation vigoureuse à 230 tr/min). Le matin suivant, 20 ml de LB ont été inoculés avec 0,2 ml de la culture d'une nuit. Le tube a été placé dans un incubateur pendant 90 à 180 minutes pour faire croître les bactéries inoculées jusqu'à leur phase logarithmique précoce. Plus tard, il a été transféré sur de la glace pendant 10 minutes. Les cellules ont ensuite été recueillies par centrifugation à 3000 tr/min dans un tube eppendorf, le surnageant a été jeté puis le culot a été remis en suspension avec 10 ml de MgCl2 0,1 M glacé stérile. Le culot a de nouveau été remis en suspension avec un autre 10 ml de CaCl2 glacé stérile 0,1 M, suivi de son incubation dans de la glace pendant 1 heure, puis centrifugé à 7 min 3000 tr/min dans une centrifugeuse Eppendorf à 4°C. Le surnageant a été versé et du CaCl2 0,1 M glacé stérile a été ajouté plus 0,3 ml de glycérol 100 % glacé stérile. Le mélange a ensuite été soumis à une incubation de 30 min sur de la glace.

Transformation de choc thermique : Trois tubes Eppendorf de 1,5 ml ont été préparés, chacun contenant 100 µl de suspension cellulaire, et étiquetés respectivement T1, T2 et T3. Parmi les trois tubes, T1, T2 et T2 ont été préparés respectivement comme contrôle positif, tube, tube à essai et tube de contrôle négatif. Un aliquote de 0,05 g d'ADN plasmidique intact purifié a été ajouté à T1, 10 l de ligature non purifiée à T2 et T3 a été laissé avec ses 100 l initiaux de Cacl2. Les trois tubes ont été incubés sur de la glace pendant 30 minutes. Après leur incubation, les trois tubes ont ensuite été transférés dans un bain chaud à 42°C pendant exactement 90 secondes puis remis sur glace pendant 2 minutes. Après incubation, les cellules ont ensuite été cultivées sur gélose LB contenant de l'ampicilline en étalant (avec un paresseux stérile) 100μl de la préparation de transformation de chaque tube sur ses plaques de gélose LB-AMP (marquées T1, T2 et T3). Les plaques cultivées ont été incubées à 37°C la tête en bas pendant une nuit. Le lendemain matin (après 16 à 20 heures), le nombre de colonies a été déterminé sur chaque plaque.

Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Le master mix PCR a d'abord été préparé. Dans chaque tube PCR des cinq, 50 l de master mix (5 l de tampon PCR 10x, 1 l de dNTP, 1 l de FP, 1 l de RP, 0,25 l de Taq ADN polymérase, 41,75 l de dH2O) ont été ajoutés. À l'aide d'embouts de pipette stériles, une colonie a été prélevée sur le test positif (T1) et mélangée dans un tube PCR, une autre colonie a été prélevée dans le tube à essai car il n'y avait aucune croissance de colonie sur la plaque de test T2 et a été plongée dans un Tube PCR également. Le troisième tube auquel il n'y avait pas de colonie ajoutée, a servi de contrôle négatif. Les tubes ont tous été fermés puis transférés dans un thermocycleur qui circulait entre la fusion (à 94°C pendant 30 secondes), le recuit (à 57°C pendant 30 secondes) et les températures de polymérisation (72°C pendant 45 secondes). Les fragments de gènes codant pour le nanocorps (insert d'ADNc de nanocorps), s'ils sont présents dans l'échantillon, ont été amplifiés avec les amorces spécifiques : amorce directe (FP 5'-TTCCCAGTCACGAC-3') et amorce inverse (RP 5'- CACACAGGAAACAGCTATGAC-3') Arbabi Ghahroudi, 1997.

Analyse du produit PCR par électrophorèse sur gel d'agarose

Le gel d'agarose fondu à 1 % (p/v) a d'abord été versé dans 1x TBE dans un plateau. Nous avons ensuite ajouté 30 µl de bromure d'éthidium à 10 mg/ml au gel fondu et ensuite mélangé en agitant avec la pointe de pipette stérile. Un peigne a ensuite été appliqué sur le support de gel et éliminé toutes les bulles d'air possibles à l'aide d'une pointe de pipette nettoyée. On laisse le gel se solidifier pendant 20 minutes. Le gel solide avec son plateau a été placé dans un réservoir de tampon d'électrophorèse puis du tampon d'électrophorèse 1xTBE a été ajouté pour recouvrir complètement le gel. A chaque 5 l de produit PCR échantillon, 2 l de tampon de charge ont été ajoutés alors que pour le contrôle négatif, seulement 1 l de produit PCR a été mélangé avec 1 l de tampon de charge. Les témoins négatifs et positifs ont été mélangés avec 4 l de colorant de charge, puis chargés sur le gel. Le mélange positif a été chargé à partir du deuxième emplacement et le mélange témoin négatif a été chargé dans le dernier emplacement. Nous avons chargé 10 l d'échelle intelligente sur le premier emplacement.

Nous avons mis le couvercle sur le réservoir tampon puis connecté les électrodes positive et négative avec une tension de 125V pendant 1 heure. Le gel a ensuite été observé sous lumière UV pour la séparation des bandes et comparé au marqueur (Hyadder™ 10kb) chargé dans la voie1. La taille du vecteur d'ADN a été calculée en utilisant la relation linéaire du logarithme de la paire de bases et la mobilité relative le long de la champ.

Détermination du poids moléculaire de l'ADN après résolution par électrophorèse sur gel

Le poids moléculaire de l'ADNc du nanocorps et du plasmide (vecteur) a été déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %.

Résultats

Concentration et pureté de l'ADN plasmidique

Après isolement et purification de l'ADN plasmidique pHEN6c, sa concentration et sa pureté ont été déterminées par Nano Drop™. Les échantillons ont ensuite été analysés en utilisant une référence à blanc constituée d'eau qui a été utilisée comme tampon d'élution. Quant à l'ADN pur, la valeur A260/A280 doit être comprise entre 1,7 et 1,9, ainsi l'ADN plasmidique a été isolé sous sa forme pure. Notre concentration d'ADN regroupé était de 317 ng/μL, ce qui correspond à une pureté regroupée de 1,84 et le rendement de notre ADN dans 50 L était de 371 g/μL multiplié par 50 μL, ce qui correspond à 18,5 g.

Concentration d'ADNc digéré

La concentration d'ADNc digéré était de 110,3 ng/μL qui était de 0,1103 et le rendement de notre ADN dans 50 L s'est avéré être de 50 μL multiplié par 0,1103 μg/μL qui est de 5,5 g.

Détermination du poids moléculaire de l'ADNc

Pour la détermination du poids moléculaire de l'ADNc, il a été effectué sur un gel d'agarose à 1 % et les bandes suivantes ont été obtenues et le poids moléculaire de l'ADNc doit être de 573 pb (figure 1).

Détermination du poids moléculaire de l'ADN plasmidique (vecteur)

Pour la détermination du poids moléculaire de l'ADNc, il a été effectué sur un gel d'agarose à 1 % et les bandes suivantes ont été obtenues et le poids moléculaire de l'ADNc doit être de 3842 pb (figure 2).

Figure 1: Bandes obtenues pour l'ADNc par électrophorèse sur gel d'agarose 1%.

LÉGENDE : L-échelle, S1-échantillon 1, s2-échantillon2, s3-échantillon 3, S4-échantillon 4, S5-échantillon 5, S6-échantillon 6

Figure 2: Bandes obtenues pour l'ADN vecteur sur électrophorèse sur gel d'agarose 1%.

Détermination de l'efficacité de la transformation

L'efficacité de la transformation est une mesure de la quantité de cellules dans la culture bactérienne qui sont capables d'absorber des molécules d'ADN. Le calcul a commencé avec la quantité d'ADN plasmidique intact étalé : le nombre de colonies s'est avéré être de 349 cfu (figure 3) dans 50 ng (0,05 ug) d'ADN dans 1 ul a été ajouté à 100 ul de cellules. La concentration d'ADN dans la solution = (0,05 g /101 l) ≈ 0,00049 g/μl. Ensuite, 100 l de culture ont été ajoutés à chacune des plaques, par conséquent la quantité d'ADN plasmidique intact plaqué sur chaque plaque a été calculée comme suit : 0,05/1101 = 4,54 x 10-5 g/μl x 100 l = 4,54 x 10-3 g.

Quantité d'ADN plaqué (μg/ml) : 4,54x10-3μg/100μl = 4,54x10-3μg/0,1ml = 4,54x10-2μg/ml. En utilisant la formule (Efficacité de transformation = nombre de colonies sur plaque LB-AMP divisé par quantité d'ADN plaqué), il a été calculé comme 349cfu/4,54x10-2 ug/ml = 7687,22cfu/1 ug/ml.

Figure 3: Croissance de la colonie sur T2.

Détermination du pourcentage de transformants ayant l'insert

Après avoir effectué la PCR de colonie, les échantillons amplifiés d'une colonie sélectionnée au hasard ainsi que des témoins positifs et négatifs communs ont été analysés sur du gel d'agarose à 1% et inexistants ou faibles et ont été obtenus sous exposition aux UV.

Mesure de la densité optique (DO) de la cellule

La densité optique (DO) a été mesurée pour les cellules cultivées à une phase logarithmique par spectrophotomètre à une DO 600 et le résultat est de 0,213 où la norme se situe entre 0,2 et 0,4.

Croissance chez LB+Ampicilin

La croissance des colonies a été observée dans la plaque positive et la plaque de test, mais aucune croissance d'une seule colonie n'a été trouvée dans le troisième échantillon qui est le contrôle négatif (Figures 4 et 5).

Figure 4 : Pas de croissance de colonie sur T2.

Figure 5 : Croissance des colonies à la fois sur T1 (contrôle positif) et absence de croissance des colonies sur T3.

Discussion

La concentration obtenue à partir du spectrophotomètre Nanodrop (18,5 g/50 l) à partir de 2 ml de culture d'E. coli contenant pHEN6c indique que l'isolement de l'ADN plasmidique par dénaturation alcaline est une méthode efficace. Notre résultat est en accord avec les découvertes de Sabine (2003)[7], en utilisant la procédure de dénaturation alcaline et le rendement de 2 à 5 µg d'ADN à partir d'une culture de 1,5 ml d'E. coli contenant un plasmide dérivé de pBR322, et de trois à cinq des rendements plus élevés peuvent être attendus des plasmides dérivés de pUC. L'efficacité de transformation représente le nombre total de cellules bactériennes contenant l'ADN inséré. Dans notre expérience, l'efficacité de transformation était élevée à 7687,22cfu/1μg/ml de transformants/μg par rapport à Baraka [8] qui a obtenu 1,107 x 102 transformants/μg. Cette efficacité implique que nos plasmides ont été absorbés avec succès par les bactéries hôtes qui ont permis la croissance sur milieu additionné d'ampicilline. La protéine β-lactamase est produite et sécrétée par des bactéries qui portent la construction plasmidique insérée inactivant l'ampicilline présente dans la gélose LB, permettant la croissance bactérienne [9]. Seules les bactéries transformées contenant le plasmide et exprimant la β-lactamase se sont développées sur des plaques contenant de l'ampicilline [10].

Les cellules non transformées comme la plaque numéro deux de notre échantillon n'ont pas pu se développer sur les plaques de sélection d'ampicilline, permettant ainsi la sélection des seuls transformants positifs. Certains facteurs qui pourraient avoir influencé l'efficacité de la transformation sont l'ajout de chlorure de calcium, qui a incité la cellule bactérienne à absorber l'ADN en augmentant sa perméabilité membranaire. La quantité d'ADN nu placé dans l'environnement de la bactérie pourrait également jouer un rôle, plus il y a d'ADN, plus la transformation serait efficace [11]. Les produits de PCR ont été résolus sur du gel d'agarose à 1 % et une bande faible a pu être détectée à la fois dans les échantillons et dans le contrôle positif. L'échec de l'amplification peut être dû à l'échec de l'amorce PCR ou à une faible activité enzymatique de la polymérase, un problème de tampon. Ceci est également soutenu par Roux [12] qui déclare que la séquence des amorces pourrait être synthétisée ou diluée correctement, le tampon et les inhibiteurs ont été incriminés pour affecter l'amplification, pour résoudre ce problème, une nouvelle conception pour une paire d'amorces optimale est nécessaire pour atteindre l'amplification requise. L'échec de la PCR des colonies peut également être causé par une trop grande quantité de cellules dans la réaction PCR, pour éviter cela, les colonies peuvent être diluées dans de l'eau distillée stérile avant de lancer la PCR [13].

Conclusion

Étant donné que les nanocorps ont une bonne expression dans les systèmes microbiens et les propriétés biochimiques bénéfiques (bonne solubilité, bonne stabilité dans des conditions difficiles, affinité et spécificité élevées pour l'antigène, petite taille et comportement monomérique strict), ils constituent un outil idéal à des fins de recherche ou de diagnostic ou thérapeutique. applications. Même si la PCR de la colonie dans notre expérience n'a pas réussi (en raison d'un défaut de tampon et d'enzyme), la procédure de clonage a été d'une aide complète pour l'insertion de l'ADNc du gène Nanobody dans le génome bactérien, souche E.Coli WK6. Les techniques de clonage recèlent de nombreuses recherches futures prometteuses en génie génétique et en biotechnologie. Il est donc important d'apprendre par l'expérimentation pratique et la recherche du clonage à exploiter le meilleur de la nature (organisme vivant) à notre avantage.

Déclaration

Ce travail n'a jamais été soumis et il est original dans son type et j'autorise la revue académique iiste.org à le publier.

Les références

  • Lodge J, Lund PA, Minchin S (2007) Clonage de gènes : principes et applications. Groupe Taylor et Francis.
  • Carson S, Robertson D (2005) Manipulation et expression de l'ADN recombinant. San Diego : presse académique Elsevier.
  • Lipps G (2008) Plasmides : Recherche actuelle et tendances futures. Presse académique Caister.
  • Hanahan D (1985) Techniques de clonage d'ADN : Une approche pratique. Dans : DM Glover (éd.). (IRL Press, Oxford) 1 : 109.
  • Campbell, Neil A (2005) Biologie. Dans : Neil A Campbell, Jane B Reece (éds.), 7 e (éd.). CA : Pearson Education. Inc, San Francisco, États-Unis, pages 384-388.
  • Kenneth H Roux (2001) Optimisation et dépannage dans le génome PCR. Res 1995 4: S185-S194.
  • Lee AB, TA Cooper (1995) Écran PCR direct amélioré pour les colonies bactériennes. BioTechniques 18 : 225-226.
  • Barakat (2011) rapport pratique de l'IPMB.
  • Primrose SB, Twyman RM, Old RW (2006) Principes de manipulation des gènes. Blackwell Science, Inc : Malden.
  • Steven Odongo (2013) Manuel de formation des étudiants pour IPMB.

Solution de décontamination (v1.4)

10% Javel achetée en magasin (2L par 20L)
1% NaOH (200g par 20L)
1% Sparkleen ou détergent en poudre similaire (200g par 20L)

Mode d'emploi:

  • Pour la plupart des applications (essuyer les plans de travail, l'équipement, les pipettes), la solution de décontamination peut être diluée 2 à 3 fois, essuyée, laissée à tremper pendant plusieurs minutes, puis rincée avec de l'eau distillée et des serviettes. Des dégâts plus tenaces peuvent être atteints avec un mélange non dilué.
  • Le verre et les pièces peuvent être mis à tremper dans un mélange de décontamination pur ou dilué (2-3X), puis lavés normalement et rincés à l'eau distillée.
  • Ne laissez pas le mélange de décontamination entrer en contact avec l'aluminium anodisé, il prendra la couleur tout de suite !
  • Le dernier mélange de décontamination le plus simple. Abandon de l'ajout de bicarbonate de sodium car le Sparkleen en contient une bonne partie et il fournit le détergent pour l'action de mouillage. Merci au lecteur qui l'a suggéré !

Solution de décontamination (v1.3) (ancienne version héritée)
10-15% Javel achetée en magasin (100-150 mL/L)
1% NaOH (10 g/L)
1% Alconox/Sparkleen/savon à vaisselle (10 g/L) *
Bicarbonate de sodium 90 mM (7,5 g/L) **

* Les versions commerciales utilisent le SDS, mais à des concentrations plus élevées (=>1%) le SDS aura tendance à se bloquer. À moins que vous n'ayez le parfum/émulsifiant 2141-BG, utilisez une concentration plus faible de SDS (<0.1%) ou utilisez les détergents ci-dessus *

** Sparkleen et Alconox contiennent déjà du bicarbonate de sodium à des concentrations élevées, jusqu'à

40% pour Alconox, l'ajout de bicarbonate peut donc ne pas être nécessaire.

En supposant que Sparkleen contienne 30% de bicarbonate, 10 grammes de sparkleen contiennent 3 grammes de bicarbonate, ce qui ferait une solution finale contenant 36 mM de bicarbonate, qui pourrait toujours fournir une inhibition de la corrosion, dépend de la force avec laquelle vous voulez croire les 90 mM du brevet DNAzap. **

*** Ce mélange de décontamination corrode l'aluminium et le fer/l'acier inoxydable bon marché à des concentrations élevées et lors d'un traitement prolongé. L'inox de bonne qualité tient bien. ***

**** Ce mélange est génial pour nettoyer la verrerie, laissez un bécher reposer dans un mélange de décontamination 0,5X ou 1X pendant un certain temps, le plus longtemps sera le mieux. Il brillera après le rinçage ! La teneur élevée en NaOH rappelle les bains de base utilisés par les chimistes pour graver une belle couche propre sur leur verre. ****

Pour plus d'informations sur la façon dont je suis arrivé à cette recette, consultez mon deuxième article sur le sujet, il suffit de le blanchir


RÉSULTATS

À la fin de ce projet de laboratoire, les étudiants produisent un rapport sous forme de manuscrit qui résume leurs données. Ils doivent inclure des gels contenant des digestions doubles, une courbe standard, un tableau de toutes les tailles de fragments d'ADN observées et déduites, et une carte de restriction plasmidique circulaire. Comme la carte de restriction de pBR322 est connue, les étudiants ne reçoivent pas l'identité du plasmide. Ce cours étant dispensé chaque année, l'identité plasmidique n'est jamais divulguée et le jeu d'enzymes de restriction utilisé est cependant modifié chaque année, puisque les étudiants doivent produire des gels représentatifs et être capables d'expliquer la logique utilisée pour construire la carte, connaissant l'identité des plasmide serait de peu d'utilité.

Chaque ensemble de quatre enzymes de restriction utilisé au cours d'une année contient deux enzymes qui coupent le plasmide une fois et deux qui coupent deux ou trois fois. L'une des enzymes de coupure unique est arbitrairement placée à la paire de bases zéro du plasmide, et les étudiants sont invités à cartographier d'autres sites de restriction par rapport à ce site d'enzyme.Cinq séries différentes d'enzymes utilisées pour couper pBR322 sont données ci-dessous (voir tableau II), ces séries fonctionnent bien et ont toujours donné des résultats interprétables.

Ensemble 1 Ensemble 2 Ensemble 3 Ensemble 4 Ensemble 5
Bam HI (1) Éco IR (1) Éco IR (1) Éco IR (1) Bam HI (1)
Ava I (1) Ava I (1) Hinc II (2) Ava I (1) Ava I (1)
Hinc II (2) Hinc II (2) Rsa I (3) Bsr BI (2) Bsr BI (2)
Rsa I (3) Rsa I (3) Sph I (1) Rsa I (3) Hinc II (2)
  • Chaque série contient soit Bam HI soit Eco RI comme site de référence donné à la paire de bases zéro du plasmide. Le nombre indiqué entre parenthèses indique le nombre de sites d'endonucléase dans pBR322.

Comme le montrent les gels représentatifs, plusieurs bits de données présentent régulièrement des défis pour les étudiants, fournissant d'excellents exemples de l'ambiguïté présente dans tout type d'analyse de données, ainsi que la nécessité d'une observation minutieuse et de la prédiction des résultats attendus. Dans l'ensemble 2, les doubles digestions Hinc/Rsa produisent un fragment de 60 paires de bases qui n'est presque jamais visible. De plus, cette digestion produit deux fragments d'ADN de taille similaire (1 629 et 1 565). résoudre les deux fragments. Il en est de même pour les fragments de 931 et 879 paires de bases produits par une double digestion BglI/Eco RI. Dans ce cas, le doublet est plus évident car il est plus brillant que le fragment d'ADN de plus grande taille au-dessus sur le gel. Plusieurs ensembles d'enzymes produisent des fragments de 124 à 160 paires de bases, mais leur présence est généralement plus facile à déduire. Les légendes des figures indiquent ces défis et d'autres dans les données.

Alors que toute endonucléase qui coupe le plasmide une seule fois peut être utilisée comme « paire de bases zéro », il faut choisir une enzyme qui coupe de manière très fiable. Eco RI et Bam HI servent bien cet objectif.

Évaluation de l'apprentissage des élèves

L'apprentissage des étudiants a été évalué par l'observation par l'instructeur des travaux de laboratoire et des rapports écrits des étudiants, par des évaluations de cours annuelles et par une enquête en ligne auprès d'étudiants ayant suivi des cours de biologie moléculaire à l'Université Lawrence au cours des trois dernières années.

L'augmentation de la perception des étudiants de leurs compétences et de leur compréhension des techniques et concepts de laboratoire présentés par ce projet de laboratoire a été évaluée directement par le biais d'un sondage en ligne auprès de 33 étudiants récents du cours de biologie moléculaire à l'Université Lawrence. Tous les étudiants qui avaient suivi des cours de biologie moléculaire au cours des deux dernières années et qui étaient encore sur le campus (21 étudiants) et 12 nouveaux diplômés pour lesquels des adresses e-mail étaient disponibles ont été interrogés. Le taux de réponse total était de 69 %. Les personnes interrogées ont été invitées à évaluer leur capacité et leur confiance à entreprendre des compétences de laboratoire particulières ainsi que leur compréhension conceptuelle des techniques sur une échelle de 0 à 6, rétrospectivement, avant et après avoir suivi des cours de biologie moléculaire (les questions se trouvent dans le tableau III ). Les étudiants ont également été invités à fournir des commentaires écrits sur les aspects positifs et négatifs de l'expérience en laboratoire. Seize des 22 répondants ont choisi d'écrire de longues réponses, qui étaient toutes très positives.

Q3 : Compréhension de l'utilisation appropriée des micropipettes
Q4 : Préparation d'un gel d'agarose
Q5 : Utilisation d'un gel d'agarose pour séparer les fragments d'ADN (chargement, exécution, coloration du gel)
Q6 : Calcul et réalisation des dilutions des solutions mères (comme pour les doubles digestions)
Q7 : Interprétation des données d'un gel d'agarose (y compris la détermination de la taille des fragments d'ADN)
Q8 : Comprendre le fonctionnement des résumés de restriction
Q9 : Comprendre les principes de l'électrophorèse sur gel
Q10 : Comprendre le mappage des restrictions
  • Les répondants ont été invités à classer leurs compétences (Q3-7) ou leur compréhension (Q8-10) à la fois avant et après le cours de biologie moléculaire sur une échelle de 0 à 6 dans laquelle 0 = aucune capacité ou aucune compréhension et 6 = pleinement capable de la compétence ou une compréhension complète du concept.

Dans l'ensemble, la compréhension auto-évaluée des étudiants des techniques courantes de laboratoire de biologie moléculaire a été considérablement améliorée après l'achèvement du projet de cartographie de restriction. Cela ressort clairement de la comparaison des classements des étudiants pour chaque technique avant l'inscription au cours et après l'achèvement du projet. L'augmentation du niveau de confiance variait de 2,31 à 3,48 points, correspondant à une augmentation de 39 à 58 % de la compréhension. En moyenne, les étudiants ont classé leur compréhension de chaque technique après l'achèvement de l'exercice de laboratoire à 2,9 points de plus que le classement de la technique avant l'inscription au cours.

Une évaluation distincte des classements des niveaux de confiance des diplômés et des étudiants de premier cycle a reflété le modèle de réponse global (données non présentées). Les étudiants actuellement inscrits à l'Université Lawrence et les étudiants qui ont depuis terminé leurs exigences de premier cycle ont chacun signalé une augmentation globale de leur niveau de confiance dans chaque technique. Les réponses du premier cycle montrent une augmentation du niveau de confiance allant de 2,64 à 4,09 points, soit une augmentation de 44 à 68 % de la compréhension. Les notes des diplômés récents affichent une augmentation plus modérée de 23 à 44%, principalement parce que ces étudiants ont classé leurs capacités et leur compréhension avant de suivre la biologie moléculaire comme étant plus élevées que les étudiants de premier cycle actuels.

Lorsqu'on leur a demandé des commentaires sur le projet, les répondants ont fourni des réponses extrêmement positives. Dix des 16 réponses volontaires provenaient d'étudiants qui fréquentaient encore l'université, tandis que les six autres étaient celles de diplômés récents. Dans l'ensemble, les réponses ne différaient pas de façon marquée entre les deux groupes, même si pour la plupart les étudiants de premier cycle ne pouvaient pas appliquer les compétences qu'ils avaient acquises à d'autres études ou aspects de leur carrière. Pour cette raison, les étudiants de premier cycle ont continuellement commenté l'utilité de la répétition des techniques et l'importance de rédiger un rapport de laboratoire cohérent. Un étudiant a généreusement dit « s'il y a un cours qui m'a fait sentir un biologiste compétent… c'était moléculaire, en grande partie en raison de l'expérience pratique requise pour effectuer le laboratoire de restriction », tandis qu'un autre a déclaré que « la répétition était très précieuse… et je ont constaté que les techniques et les concepts sont restés avec moi dans une plus grande mesure que j'ai expérimenté avec d'autres classes. Les diplômés ont également apprécié la répétition des techniques de laboratoire et l'exposition à la rédaction scientifique, mais la plupart ont également commenté la valeur du travail de laboratoire indépendant comme préparation pour devenir scientifique. Un répondant a commenté avec enthousiasme que « les compétences que j'ai acquises en moléculaire, en particulier celles du laboratoire de cartographie de restriction, m'ont permis de réussir dans mon poste actuel. En fait, la profondeur de compréhension que j'ai acquise grâce à la répétition du laboratoire m'a permis d'assumer la tâche d'enseigner aux nouveaux étudiants diplômés ces mêmes compétences… » Un autre a déclaré avec appréciation « Je suis maintenant un étudiant diplômé utilisant des techniques moléculaires au quotidien. base. J'ai découvert que j'étais BEAUCOUP plus compétent que mes homologues d'autres universités. D'autres étudiants avaient pratiqué des techniques similaires mais ne les comprenaient pas vraiment et n'étaient certainement pas prêts à travailler de manière indépendante dans un laboratoire, je l'étais. Ces commentaires typiques soulignent l'importance de la répétition pour l'apprentissage pratique et le développement des compétences en résolution de problèmes.

Des commentaires écrits à l'aide d'un formulaire standard d'évaluation de cours universitaires ont été sollicités chaque année. Bien qu'aucune question n'ait été conçue pour évaluer l'effet de ce seul laboratoire, plusieurs questions incitaient à des commentaires sur les travaux de laboratoire. Les réponses de 45 évaluations de 2001 à 2004 sont résumées ci-dessous. En réponse à la question « Est-ce que votre expérience en laboratoire a fait progresser votre compréhension des principes et des méthodes en la matière ? » La plupart des élèves ont simplement répondu « oui », mais les réponses suivantes sont typiques de ceux qui ont écrit des commentaires supplémentaires :

"Le laboratoire de cartographie des enzymes de restriction était vraiment soigné et utile pour apprendre à utiliser des gels et à les lire."

"J'étais très enthousiaste à l'idée de faire bon nombre des protocoles que je n'avais lu que précédemment."

« L'expérience pratique des principales techniques vous a permis de vous sentir plus fort d'une manière étrange. »

En réponse à la question « Quel(s) devoir(s) avez-vous le plus contribué à atteindre les objectifs du cours, et pourquoi ? » les réponses suivantes étaient typiques :

« Le premier rapport de laboratoire [restriction mapping] était difficile. Je n'étais probablement pas préparé, mais je pense que c'est le résultat de mon inexpérience plutôt que du cours. Les rapports de laboratoire nous ont aidés à analyser ce que nous avions appris en laboratoire.

« Notre laboratoire de cartographie m'a beaucoup aidé à comprendre ce sujet. »

« La structure des rapports de laboratoire nous a obligés à penser comme un biologiste moléculaire. »

Les observations de l'instructeur confirment les perceptions des élèves quant à l'amélioration des compétences et de la compréhension. Pratiquement tous les étudiants sont confus au départ lorsqu'ils sont confrontés à leurs premiers résultats d'électrophorèse, et tous les étudiants ont des questions sur la façon de modifier les conditions de tampon lors de l'ajout d'une deuxième enzyme de restriction à une réaction. Il est évident que les étudiants maîtrisent ces compétences, car tous les étudiants sont finalement capables de produire et d'interpréter des modèles de fragments de restriction complexes dans des gels d'agarose pour leurs rapports écrits.


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J'espère que cet article aidera à clarifier une partie de la science autour de la méthode du filtre à spin de silice pour les extractions d'ARN et d'ADN afin que vous puissiez faire votre propre diagnostic et corriger. Ainsi, lorsque vous appelez le service technique, vous aurez d'abord vérifié quelques-unes des causes les plus probables de problèmes et au lieu de passer par de nombreuses arnaques, vous pourrez trouver une résolution beaucoup plus rapidement. Même s'il s'agit d'un kit d'extraction d'ADN de remplacement gratuit !

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Publié à l'origine le 28 juin 2010. Mis à jour et révisé le 11 juillet 2015.


Diluer les plasmides d'ADN avec de l'eau distillée - Biologie

Projet 1 : Criblage des éléments P-transposables dans un type sauvage
Souche de Drosophila melanogaster

Projet 2 : Isolement et Caractérisation des Mutations
Chez Drosophila melanogaster

Projet 1 : Criblage d'éléments P-transposables dans une souche de type sauvage de Drosophila melanogaster

Résumé du projet
Les génomes de nombreuses souches de type sauvage de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, contiennent des éléments P. Les éléments P, comme d'autres éléments transposables, sont une cause majeure de mutation et jouent un rôle important dans l'évolution. Les éléments P sont de courts segments d'ADN qui peuvent se déplacer dans le génome. Quelle est la prévalence des éléments P dans les populations de mouches des fruits sauvages ? Est-ce que chaque souche de D. melanogaster isolée dans la nature possède les transposons ? Tous les éléments P trouvés dans les mouches des fruits sauvages sont-ils les mêmes ? Pour tenter de répondre à ces questions, l'objectif de ce projet est de déterminer si les souches de type sauvage de D. melanogaster, isolées sur ce campus, contiennent ou non des éléments P dans leurs génomes. Vous réaliserez ce projet au cours de 8 séances de laboratoire. Vous isolerez l'ADN génomique des mouches des fruits de type sauvage et essayerez de détecter et d'amplifier les séquences d'éléments P de l'ADN en utilisant la technique de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Vous aurez ensuite séquencé des fragments PCR d'éléments P sélectionnés et vous utiliserez une approche bioinformatique pour comparer ces séquences entre elles et avec des séquences d'éléments P connues. Pour faire un contrôle positif, vous préparerez de grandes quantités d'ADN d'élément P de type sauvage en transformant des cellules bactériennes avec un plasmide recombinant contenant l'élément P complet, en isolant le plasmide des cellules et en purifiant l'élément P contenant fragments par PCR et électrophorèse sur gel.

introduction

Drosophile Éléments P
La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un organisme modèle idéal pour une utilisation dans les analyses génétiques et moléculaires (pour plus d'informations sur Drosophila melanogaster, voir le projet 2). Les génomes de nombreuses souches de type sauvage de Drosophila melanogaster contiennent des éléments P. Les éléments P sont de courtes portions d'ADN (<=2,9 kilo paires de bases [kb]) qui sont des éléments transposables, ou transposons (ou « gènes sauteurs »), c'est-à-dire qu'ils peuvent physiquement exciser d'un chromosome et se déplacer vers un autre. , ou ils peuvent se déplacer d'un point à un autre à l'intérieur d'un chromosome. Les éléments P varient en longueur mais sont tous dérivés de la séquence complète de l'élément P de 2,9 kb, qui code pour une transposase (l'enzyme qui découpe et déplace son propre tronçon d'ADN). L'élément P complet est en fait plus que le gène de la transposase, et ses dérivés sont généralement incomplets, mais pour des raisons de simplicité, nous désignerons désormais l'élément P comme notre "gène d'intérêt". Les transposons sont courants. dans la nature et relativement facile à détecter dans une séquence d'ADN connue, puisque la transposase fonctionne par reconnaissance d'une caractéristique caractéristique du transposon : les répétitions inversées flanquantes. Lorsqu'un transposon se déplace, souvent, seule une partie de la séquence d'ADN "sautera" vers un nouvel emplacement, et une partie de la séquence du gène reste dans la position d'origine. Par conséquent, alors que les éléments P peuvent varier en longueur de 0,5 à 2,9 kb, tous sont reconnaissables par les répétitions inversées de 31 paires de bases (pb) flanquantes (l'« empreinte de transposon » 8221). L'excision incomplète et le mouvement des éléments P conduisent également à un nombre élevé de copies, c'est-à-dire à la présence de nombreuses copies de tout ou partie de l'élément P dispersées dans le génome de la drosophile. Étant donné que le but de notre expérience est de détecter des éléments P dans une population de type sauvage de Drosophila melanogaster, leur nombre élevé de copies convient bien à notre objectif.

Technologie de l'ADN recombinant
Le développement relativement récent de la technologie de l'ADN recombinant a permis aux chercheurs en biologie de faire de grands progrès dans notre compréhension des structures et des fonctions des gènes. Avant le développement de la technologie de l'ADN recombinant, les génomes complexes des eucaryotes étaient extrêmement difficiles à analyser. La technologie de l'ADN recombinant permet aux chercheurs de diviser de grands génomes en fragments spécifiques, qui peuvent ensuite être insérés dans une molécule d'ADN d'une espèce différente, telle qu'une bactérie, et analysés avec une relative facilité. La molécule d'ADN dans laquelle les fragments sont insérés est appelée vecteur, et des molécules d'ADN recombinant peuvent être fabriquées en insérant des fragments d'ADN de presque n'importe quelle espèce dans un vecteur. Les molécules d'ADN recombinant sont couramment introduites dans des cellules "hôtes" bactériennes par le processus de transformation. Les vecteurs utilisés pour construire des molécules d'ADN recombinant sont généralement capables de réplication, donc une fois à l'intérieur d'une cellule bactérienne, la molécule d'ADN recombinant sera répliquée, entraînant l'amplification (réplication de nombreuses copies) d'un fragment d'ADN spécifique. Des copies de la molécule d'ADN recombinant seront transmises à chaque cellule fille après la division cellulaire. L'insertion d'un fragment d'ADN dans un vecteur et la réplication subséquente de la molécule d'ADN recombinant sont souvent appelées "clonage d'ADN". La capacité de produire de nombreuses copies d'une séquence d'ADN donnée a été extrêmement utile dans l'analyse de la structure et de la fonction des gènes. Le projet du génome humain et d'autres projets sur le génome seraient impossibles sans la technologie de l'ADN recombinant. De plus, des gènes codant pour des polypeptides médicalement et industriellement importants peuvent être insérés dans des vecteurs, et maintenus et amplifiés dans des cellules hôtes. Les cellules hôtes capables de synthétiser les produits polypeptidiques de ces gènes recombinants fournissent un moyen de produire de grandes quantités de molécules importantes. Par exemple, l'insuline, nécessaire au traitement de certains types de diabète, est produite à peu de frais et en grande quantité par des cellules bactériennes qui expriment le gène de l'insuline humaine à partir d'un vecteur recombinant. La technologie de l'ADN recombinant a été rendue possible par la découverte et le développement d'un certain nombre d'"outils" importants - dont certains sont discutés ci-dessous.

Les enzymes de restriction
Les endonucléases de restriction (ou enzymes de restriction), découvertes à la fin des années 1960, sont des outils précieux pour caractériser et manipuler les molécules d'ADN. Les endonucléases de restriction sont des enzymes qui reconnaissent des séquences nucléotidiques spécifiques, souvent longues de 4, 6 ou 8 pb, et coupent l'ADN au niveau de ces séquences uniquement. Chaque enzyme de restriction reconnaît sa propre séquence spécifique de nucléotides, appelée "site de restriction". Il existe de nombreuses enzymes de restriction différentes qui reconnaissent et coupent à de nombreuses séquences nucléotidiques différentes. Les enzymes de restriction sont produites par les bactéries pour se défendre contre l'invasion de l'ADN étranger - en particulier des bactériophages. Une bactérie modifie son propre ADN pour protéger l'ADN des enzymes de restriction. L'ADN étranger qui pénètre dans la cellule bactérienne sera reconnu et digéré, ou "restreint" par les enzymes de restriction de la cellule. Les enzymes de restriction sont purifiées à partir de cellules bactériennes pour être utilisées dans des expériences de biologie moléculaire.

En coupant un morceau donné d'ADN avec des enzymes de restriction spécifiques, nous pouvons déterminer les emplacements des sites de restriction pour ces enzymes sur cet ADN, et générer une "carte de restriction" de l'ADN donné. Nous pouvons identifier les fragments de différentes tailles résultant de la digestion d'un morceau donné d'ADN avec une certaine enzyme de restriction en "électrophorisant" l'ADN digéré par restriction sur un gel d'agarose, comme indiqué dans Figure 1. Brièvement, l'ADN digéré (constitué d'un mélange de plusieurs copies de chacun de ces trois fragments) est chargé dans l'un des puits d'échantillon à une extrémité d'un gel électrophorétique d'agarose. Une tension est établie à travers le gel de telle sorte que les puits d'échantillon soient les plus proches de l'électrode négative et que l'extrémité éloignée du gel soit la plus proche de l'électrode positive. L'ADN a une charge nette négative et migre donc (se déplace) à travers le gel vers l'électrode positive (ce processus est appelé électrophorèse). Le gel est composé d'une matrice poreuse qui agit comme un tamis moléculaire. Les fragments d'ADN plus petits traversent le gel plus rapidement que les fragments d'ADN plus gros. Après que l'électrophorèse de l'ADN digéré ait été effectuée pendant un certain temps, elle est arrêtée et l'ADN dans le gel est coloré pour le rendre visible. L'ADN est souvent visible sous forme de bandes discrètes. Chaque bande représente une collection de nombreux fragments d'ADN qui sont tous de la même taille et ont donc migré sur la même distance dans le gel. Les enzymes de restriction nous permettent également de casser de grands génomes en petits fragments spécifiques qui peuvent être insérés dans des vecteurs pour fabriquer des molécules d'ADN recombinant.

Génération de molécules d'ADN recombinant
La combinaison de deux molécules d'ADN différentes est facilitée par le fait que de nombreuses enzymes de restriction laissent de courtes régions d'ADN simple brin à leurs sites de coupure. Ceci entraîne la génération d'extrémités cohésives ou "collantes" au niveau des sites de restriction. Si deux molécules d'ADN sont coupées avec la même enzyme de restriction, elles auront des extrémités collantes complémentaires qui peuvent être jointes (ligaturées) par appariement de bases à l'aide d'enzymes appelées ADN ligases.

Figure 2 montre un exemple d'un cas dans lequel un ADN vecteur circulaire et un ADN génomique humain sont tous deux coupés avec l'enzyme de restriction, EcoR I, qui reconnaît le site de restriction

et coupe entre G et A sur les deux brins, laissant de courts surplombs d'ADN simple brin de chaque côté du site de restriction. Si ce vecteur particulier n'a qu'un seul site EcoR I, le condensé donne un vecteur linéaire avec deux extrémités collantes, qui ressemble à (N représente un nucléotide de n'importe quel type) :

Une extrémité collante d'une molécule d'ADN peut se lier à, ou s'hybrider avec une extrémité collante d'une autre molécule d'ADN en raison de l'appariement complémentaire entre les bases nucléotidiques dans les surplombs simple brin qui sont générés au niveau des sites de restriction :

-------------------------------Ces bases peuvent s'apparier avec ces bases

La digestion de l'ADN génomique humain avec EcoR I conduit à un très grand nombre de molécules d'ADN linéaires à extrémités cohésives complémentaires des extrémités cohésives de l'ADN vecteur digéré. N'importe lequel de ces fragments d'ADN humain peut être combiné à l'ADN vecteur par appariement de bases entre des extrémités cohésives complémentaires. Les molécules d'ADN digérées sont mises en solution ensemble, et les extrémités collantes se rencontrent lorsque les molécules d'ADN se déplacent au hasard dans la solution et se heurtent les unes aux autres. Le traitement avec une enzyme ADN ligase rejoindra de manière covalente les molécules d'ADN appariées pour former une molécule d'ADN recombinante circulaire. Le fragment d'ADN qui est lié à l'ADN vecteur est appelé "insert".

Des molécules recombinantes peuvent également être produites en digérant l'ADN vecteur avec un mélange de deux enzymes de restriction différentes, et en digérant l'ADN à cloner avec les deux mêmes enzymes de restriction. Ce processus est appelé clonage "directionnel", puisque l'ADN inséré sera épissé dans l'ADN vecteur dans une orientation spécifique, comme le montre la figure 3 .

Vecteurs
Plusieurs types différents de vecteurs peuvent être utilisés dans la génération de molécules d'ADN recombinant. Ces vecteurs proviennent de bactériophages (virus qui infectent les cellules bactériennes), de bactéries, mais aussi d'eucaryotes, comme les levures. Dans ce laboratoire, nous utiliserons un vecteur bactérien, et cette discussion sera limitée aux vecteurs phagiques et bactériens. Une bonne discussion sur les vecteurs eucaryotes peut être trouvée dans le chapitre 10 du manuel, Griffiths, A.J.F., W.M. Gelbart, J.H. Miller et R.C. Lewontin (1999). Analyse génétique moderne. New York. W.H. Freeman and Co. Certains vecteurs non eucaryotes couramment utilisés comprennent :

Plasmides
Les plasmides sont de petites molécules d'ADN circulaires. Les plasmides peuvent être introduits dans des cellules bactériennes compétentes par transformation. À l'intérieur de la cellule bactérienne, un plasmide existe et se réplique indépendamment du génome bactérien beaucoup plus grand, comme le montre la figure 4 . Les plasmides peuvent (et ont été) conçus pour porter des gènes qui confèrent aux cellules les contenant une résistance à des antibiotiques spécifiques. Les plasmides peuvent également porter des gènes codant pour certaines enzymes qui peuvent être utilisés pour "marquer" les cellules bactériennes en testant les cellules pour la présence de ces enzymes. Étant donné que les plasmides se répliquent dans les cellules bactériennes, ils permettent l'amplification de la molécule d'ADN insérée en de nombreuses copies. Un inconvénient des vecteurs plasmidiques est qu'ils ne peuvent pas contenir de gros inserts. La plupart des vecteurs plasmidiques ne peuvent contenir que des inserts inférieurs à 10 kilobases (kb) (1 kb = 1 000 paires de bases). Dans ce projet de laboratoire, nous utiliserons un plasmide recombinant appelé pPi25.1 (aimablement fourni par B. Engels). pPi25.1 contient des séquences d'éléments P. Une carte de site de restriction linéarisée de pPi25.1 est montrée dans Figure 5. Le vecteur plasmidique qui fait partie du plasmide recombinant pPi25.1 est appelé pBR322.

Figure 5. Carte de restriction du plasmide recombinant pPi25.1. Un élément P complet et un peu d'ADN chromosomique flanquant de la position chromosomique 17C de chaque côté ont été coupés du chromosome avec l'enzyme de restriction, BamH1, et inséré dans le vecteur plasmidique pBR322, qui avait également été coupé avec BamH1 (notez que le plasmide est montré linéarisé) (de O'Hare, K., Rubin, G.M. 1983. Structures of P éléments transposables and their sites of insertion and excision in the Drosophila melanogaster génome.Cellule 34:25-35)

Vecteurs de bactériophage lambda
Des dérivés du bactériophage lambda peuvent être utilisés pour cloner des fragments d'ADN plus gros - fragments de l'ordre de 15 à 20 kb. Le génome linéaire du phage lambda peut être transformé en un vecteur de clonage en supprimant une grande partie de sa partie centrale, qui peut ensuite être remplacée par des fragments d'ADN étrangers, ce qui donne des molécules recombinantes. Les phages recombinants sont ensuite répliqués dans des cellules bactériennes hôtes E. coli.

Vecteurs cosmiques
Les vecteurs cosmidiques sont des hybrides entre des vecteurs plasmidiques et phagiques. Les cosmides peuvent être utilisés pour cloner des fragments d'insert d'une longueur maximale de 45 kb. Les cosmides peuvent être maintenus dans des cellules bactériennes sous forme de plasmide circulaire et ils peuvent être purifiés à partir des cellules par encapsidation dans des particules de phage.


Réaction en chaîne par polymérase (PCR)
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode permettant de faire de nombreuses copies ou d'amplifier une séquence d'ADN spécifique (telle qu'un gène ou une région particulière du génome). La PCR est réalisée en utilisant une paire d'amorces spécifiques, qui sont elles-mêmes des séquences d'ADN simple brin, généralement longues d'environ 20 bases. Une amorce est conçue pour être complémentaire en séquence à une région spécifique du génome, et une paire d'amorces qui flanque une région spécifique du génome est utilisée pour amplifier (faire de nombreuses copies de) cette région génomique, appelée matrice. Les amorces amorcent la réplication de l'ADN génomique par une enzyme appelée Taq ADN polymérase, ou Taq. L'ADN polymérase Taq est isolée d'une bactérie appelée Thermus aquaticus, qui vit dans l'eau très chaude des cheminées géothermiques, et dont toutes les enzymes sont actives à haute température. L'ADN polymérase Taq est stable à 94 °C et active de manière optimale à 72 °C. Une réaction PCR a lieu dans un tube à centrifuger (également appelé tube "Eppendorf"). Le mélange réactionnel contient généralement de l'ADN génomique (modèle), des paires d'amorces, de la Taq, des désoxynucléotides triphosphates libres (dNTP - A, C, T et G) et les tampons et sels appropriés, y compris le magnésium - un cofacteur nécessaire pour l'enzyme Taq. Le tube de microcentrifugeuse contenant le mélange réactionnel est placé dans un thermocycleur (une machine permettant de faire varier la température sur un nombre prédéfini de cycles. En PCR, l'ADN génomique est chauffé pour dénaturer les molécules d'ADN double brin, les rendant monocaténaires (c'est le Étape de dénaturation). Le mélange réactionnel est ensuite refroidi, permettant aux amorces de s'hybrider à des séquences complémentaires sur les brins opposés de l'ADN génomique matrice (par liaison hydrogène entre bases complémentaires : AT, GC) flanquant le segment d'ADN à amplifier La réaction est ensuite portée à une température intermédiaire et, en utilisant des désoxyribonucléotides libres ajoutés au mélange réactionnel, la Taq ADN polymérase étend ces amorces de leurs extrémités 3' vers l'autre, comme le montre la figure 6 (c'est ce qu'on appelle l'extension , ou étape d'élongation). Cela réplique la région entre les deux amorces et génère deux molécules d'ADN double brin à partir de l'original. Une fois ce cycle de réplication terminé ed, le mélange réactionnel est chauffé pour dénaturer les molécules d'ADN double brin, puis la température est abaissée pour permettre aux amorces de s'hybrider à nouveau - cette fois avec le double du nombre de matrices. La réaction est ensuite ramenée à une température intermédiaire à nouveau, permettant l'extension. Ce processus est répété pendant un certain nombre de cycles (généralement 20 à 30 cycles), entraînant la production de nombreuses copies de la séquence d'ADN matrice. Ces copies sont appelées le(s) produit(s) PCR ou "amplicons". Si tout se passe comme prévu, le nombre d'amplicons devrait doubler à chaque cycle. Donc, étant donné une molécule d'ADN matrice, combien de copies d'un amplicon donné devrions-nous avoir à la fin de 40 cycles ?
Selon le nombre de paires de bases de nucléotides présentes entre les deux amorces utilisées dans une réaction PCR, des fragments d'ADN (produits) de différentes tailles seront générés dans la réaction. Nous pouvons identifier les fragments d'ADN de différentes tailles résultant des réactions PCR en électrophorèse le(s) produit(s) de cette réaction sur un gel d'agarose.

Séquençage ADN
Les techniques de séquençage d'ADN sont utilisées pour déterminer la séquence de paires de bases d'un certain fragment d'ADN. Actuellement, la méthode de séquençage d'ADN la plus couramment utilisée est automatisée et basée sur la méthode de séquençage didésoxy de Sanger, développée par Fred Sanger. Cette technique utilise une matrice d'ADN monocaténaire et une synthèse d'ADN en présence de didésoxy nucléotides, dépourvus de groupe 3'-OH, ne pouvant donc pas former de liaison phosphodiester. Les didésoxynucléotides peuvent être incorporés dans une chaîne en croissance, mais ils terminent la synthèse. Chaque réaction de séquençage utilise quatre tubes de réaction, qui contiennent chacun une matrice d'ADN pour la séquence d'intérêt, l'enzyme ADN polymérase et une amorce d'ADN simple brin complémentaire aux séquences vectorielles (ou autre séquence connue adjacente à l'ADN à séquencer). Chacun des quatre tubes reçoit une petite quantité de l'un des quatre nucléotides didésoxy différents (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP), ainsi que les quatre dNTP normaux. Chaque ddNTP est marqué avec son propre colorant fluorescent unique. Par exemple, ddATP peut être marqué en vert, ddCTP peut être marqué en bleu, ddGTP peut être marqué en violet et ddTTP peut être marqué en rouge. Les tubes de réaction sont ensuite incubés à la température facultative de l'enzyme ADN polymérase. L'enzyme ADN polymérase démarre au niveau de l'amorce et synthétise un nouveau brin d'ADN qui est complémentaire au brin d'ADN matrice en cours de séquençage. Dans n'importe quel tube donné, diverses longueurs de chaîne seront produites, chacune correspondant au point auquel le ddNTP respectif a été incorporé et a terminé la croissance de la chaîne. Chaque brin d'ADN nouvellement synthétisé sera ainsi marqué avec une couleur en fonction du ddNTP qui se trouve à son extrémité 3'. Dans n'importe lequel des quatre tubes de réaction, un ensemble spécifique de brins d'ADN de différentes longueurs sera nouvellement synthétisé. La taille dépendra de l'endroit où le ddNTP respectif a été ajouté au brin en croissance et a terminé la synthèse. Le scientifique exécute ensuite les produits de chacune des 4 réactions distinctes dans la même voie d'un gel électrophorétique spécial appelé gel de polyacrylamide, qui séparera les molécules d'ADN dont la taille diffère d'un nucléotide. Un scanner est ensuite utilisé pour lire le gel, détecter la couleur de chaque bande, et ainsi déterminer le ddNTP à la fin du fragment. Le scanner lit à partir du bas du gel en déterminant la couleur de chaque bande pour lire la séquence du brin nouvellement synthétisé dans un 5’ -? 3’ sens. Par exemple, si le scanner détecte la séquence de couleurs suivante allant du bas du gel vers le haut (du plus court au plus long des fragments nouvellement synthétisés) : Rouge, Vert, Bleu, Rouge, Rouge, Violet, Vert alors la séquence des le brin nouvellement synthétisé est 5’-TACTTGA-3’.

Recherches BLAST et autres analyses bioinformatiques
En termes simples, la « bioinformatique » est l'utilisation d'ordinateurs pour analyser des données biologiques. Les données analysées à l'aide d'une approche bioinformatique sont souvent des données de séquences (soit des séquences d'acides nucléiques, soit des séquences d'acides aminés). Par exemple, une fois que la séquence de paires de bases de nucléotides d'une molécule d'ADN particulière a été déterminée, vous pouvez l'analyser en utilisant une approche bioinformatique. Pour analyser la séquence, vous pouvez faire une recherche BLAST. BLAST signifie Outil de recherche d'alignement local de base. En effectuant une recherche BLAST, vous soumettez une séquence d'intérêt (la séquence “query”, qui est dans ce cas une séquence nucléotidique) à un site Web spécial développé et maintenu par le National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Lorsque vous effectuez une recherche BLAST, un algorithme informatique est utilisé pour comparer votre séquence de requête aux séquences des bases de données informatiques. Celles-ci peuvent inclure toutes les séquences nucléotidiques connues ou un sous-ensemble auquel vous limitez votre recherche. Selon le site Web du NCBI,


“ BLAST trouve des régions de similarité locale entre les séquences. Le programme compare les séquences de nucléotides ou de protéines aux bases de données de séquences et calcule la signification statistique des correspondances. BLAST peut être utilisé pour déduire des relations fonctionnelles et évolutives entre les séquences ainsi que pour aider à identifier les membres des familles de gènes.”

Lorsque la recherche BLAST est terminée, vous recevrez une liste de toutes les séquences qui partagent des régions de similarité avec votre séquence de requête. Le degré de similarité que chaque séquence partage avec la requête sera évalué sur la base de plusieurs scores différents, et les séquences seront classées par ordre décroissant de similarité avec la séquence de requête. Une recherche BLAST peut vous dire quelles autres séquences sont liées (par évolution) à la vôtre. Il existe de nombreuses autres façons d'analyser des séquences à l'aide d'une approche bioinformatique, et nous en discuterons en classe et en laboratoire.

Ce projet de laboratoire

Transformation de cellules bactériennes avec des molécules recombinantes
Nous avons une très petite quantité d'un plasmide recombinant appelé pPi25.1 (aimablement fourni par B. Engels). pPi25.1 contient des séquences d'éléments P. Nous utiliserons des cellules bactériennes E. coli pour produire les quantités massives de ce plasmide dont nous avons besoin. Pour ce faire, le plasmide sera introduit dans des cellules E. coli par le processus de transformation. Les cellules bactériennes à transformer doivent d'abord être traitées d'une manière spéciale pour les rendre "compétentes" pour absorber l'ADN étranger. Au cours du processus de transformation, dans des conditions particulières, les cellules bactériennes compétentes absorbent des molécules d'ADN étrangères du milieu environnant.

Sélection de cellules contenant des plasmides
Le vecteur plasmidique qui fait partie du plasmide recombinant contenant l'élément P est appelé pBR322. Une carte simple de pBR322 sera fournie. pBR322 contient un gène qui confère une résistance à l'antibiotique ampicilline aux cellules qui portent le plasmide. Les cellules qui portent pBR322 peuvent donc être distinguées et purifiées des cellules sans pBR322 en cultivant le mélange de cellules avec et sans le plasmide sur un milieu qui comprend de l'ampicilline. Les cellules avec pBR322 prospéreront sur le milieu contenant de l'ampicilline, tandis que l'antibiotique empêchera les cellules dépourvues du plasmide de se développer sur les plaques. PBR322 contient également un autre gène qui fournit une résistance à l'antibiotique tétracycline. De plus, pBR322 possède des sites de restriction uniques pour de nombreuses enzymes de restriction couramment utilisées (chacune de ces enzymes coupera ainsi pBR322 en un seul site distinct, linéarisant le plasmide). Beaucoup de ces sites de restriction se trouvent dans le gène de résistance à la tétracycline. L'insertion de fragments d'ADN étrangers (tels que des séquences d'éléments P de Drosophila) dans ces sites de restriction perturbera ainsi le gène de résistance à la tétracycline, le rendant incapable de fournir une résistance à la tétracycline. Les cellules qui portent des plasmides recombinants avec des inserts de séquence d'éléments P dans le gène de résistance à la tétracycline ne se développeront pas sur des plaques contenant de la tétracycline.

Dans ce projet, vous plaquerez des cellules que vous avez tenté de transformer avec pPi25.1 et avec le plasmide de contrôle pBR322 sur deux types différents de plaques de gélose nutritive. Le premier type de plaques contiendra de l'ampicilline. Le deuxième type de plaques contiendra de la tétracycline.

Qu'attendez-vous de voir sur chacune des différentes assiettes que vous allez mettre en place ?

Amplification des séquences spécifiques de l'élément P à partir des plasmides recombinants
Après avoir purifié votre ADN plasmidique p𗜙.1, vous mettrez en place une réaction PCR pour amplifier spécifiquement les séquences des éléments P. Les amorces pour cette réaction PCR ont été conçues après avoir examiné la séquence de paires de bases de nucléotides de l'élément P (disponible sur le World Wide Web). Une fois la réaction PCR terminée, vous exécuterez les produits PCR sur un gel électrophorétique d'agarose. Vous chercherez une bande sur le gel qui contient des séquences d'éléments P, et en fait couperez cette bande du gel avec une lame de rasoir, préparant ainsi un échantillon pur d'ADN d'élément P à séquencer et à utiliser comme contrôle positif pour un Séquence d'éléments P.
Utilisation de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour tenter de détecter les éléments P
Pour vérifier la présence d'éléments P dans vos échantillons d'ADN génomique de mouche, vous utiliserez une stratégie basée sur la PCR. Vous allez d'abord isoler l'ADN génomique de la souche locale, ainsi que d'autres souches, de Drosophila melanogaster. Vous utiliserez la paire d'amorces PCR décrite ci-dessus pour tenter d'amplifier et de détecter les éléments P dans le génome de la souche locale de drosophile. Vous rechercherez des bandes sur le gel pouvant contenir des séquences d'éléments P. Vous allez en fait couper des bandes sélectionnées du gel avec une lame de rasoir et extraire l'ADN de l'agarose, préparant ainsi des échantillons purs d'ADN à séquencer et à analyser.
Analyse de vos données de séquence à l'aide d'une approche bioinformatique
Une fois les séquences de paires de bases nucléotidiques de vos produits PCR déterminées, vous les analyserez en utilisant une approche bioinformatique. Pour analyser les séquences, vous effectuerez des recherches BLAST. Vous ferez également d'autres analyses bioinformatiques, et nous en discuterons en classe et en laboratoire.

Aperçu du projet de laboratoire
* = travailler avec l'ADN de l'élément P témoin positif du plasmide recombinant p𗜙.1
# = travailler avec l'ADN génomique des mouches
*# = travailler à la fois avec l'ADN de l'élément P de contrôle positif du plasmide recombinant p𗜙.1 et l'ADN génomique de la mouche

Session de laboratoire 1
1) *Transformer les cellules E. coli avec un plasmide contenant l'ADN de l'élément P de contrôle positif et plaquer les cellules.

Session de laboratoire 2
1) #Commencer à isoler l'ADN génomique de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster.
2) *Identifiez les colonies de transformants sur vos plaques à partir de la session de laboratoire 1 et calculez les efficacités de transformation.

Session de laboratoire 3
1) #Terminez d'isoler l'ADN génomique de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster.
2) #Configurer et exécuter des réactions PCR pour amplifier des séquences d'éléments P putatifs en utilisant l'ADN génomique de mouche comme matrice. Vous effectuerez une analyse électrophorétique du ou des produits PCR lors de la session 5.

Session de laboratoire 4
1) *Votre instructeur cultivera 2 ml de cultures de colonies sélectionnées à partir de vos plaques que vous aurez mises en place lors de la session 1.
2) *Vous isolerez l'ADN plasmidique recombinant contenant les séquences de contrôle positif de l'élément P à partir de ces cellules cultivées.
3) * Mettre en place une réaction PCR pour amplifier spécifiquement les séquences d'éléments P à partir du plasmide recombinant. Conservez ces produits PCR pour l'analyse électrophorétique lors de la session 5.

Session de laboratoire 5
1) *#Exécutez un gel sur tous les produits PCR et isolez les bandes d'ADN sélectionnées.

Session de laboratoire 6
1) *#Nettoyez l'ADN dans les bandes coupées des gels pendant la session de laboratoire 5. Envoyez l'ADN pour qu'il soit séquencé.

Session de laboratoire 7
1) *#Recevez et organisez vos données d'analyse de séquence.

Session de laboratoire 8
1) *#Analysez vos données d'analyse de séquence en effectuant des recherches BLAST, etc.Procédures expérimentales

Session de laboratoire 1
1. Transformer les cellules d'E. coli avec un plasmide contenant l'ADN de l'élément P de contrôle positif et plaquer les cellules.

Au cours de cette session de laboratoire, vous commencerez le processus de préparation de grandes quantités d'ADN de contrôle positif de l'élément P. Vous allez introduire un plasmide recombinant appelé p𗜙.1, qui contient des séquences d'éléments P, dans E.coli, "transformant" les cellules bactériennes. Vous plaquerez ensuite les cellules sur des plaques de gélose nutritive qui contiennent l'antibiotique, l'ampicilline, qui tuera les cellules non transformées. Vous ferez également des expériences de contrôle. Vous allez transformer des cellules E. coli avec un plasmide pur appelé pBR322, qui est le plasmide vecteur de p𗜙.1 (pBR322 = p𗜙.1 – séquences d'éléments P). Vous plaquerez vos deux ensembles de cellules transformées sur deux types de plaques différents. Un type de plaque contiendra de l'ampicilline, tandis que l'autre contiendra un antibiotique différent appelé tétracycline. PBR322 contient des gènes pour la résistance à l'ampicilline et la résistance à la tétracycline, donc les cellules transformées avec pBR322 devraient se développer sur les deux types de plaques. Après avoir observé les cartes de restriction de p𗜙.1 et pBR322, faites une prédiction sur les plaques sur lesquelles les cellules transformées avec ce plasmide recombinant se développeront.

Procédure
1) Obtenir deux tubes de microcentrifugation d'ADN plasmidique, étiquetés pBR322 et p𗜙.1, et deux tubes de microcentrifugation contenant 90 µl de liquide de dilution (solution saline stérile). Pipeter 10 µl d'échantillon d'ADN plasmidique pBR322 dans l'un des tubes avec 90 µl de liquide de dilution pour faire une dilution de 10-1. Étiquetez ce tube “pBR322 DNA Only control”. Répétez l'opération pour l'échantillon d'ADN plasmidique p𗜙.1, puis mettez ces deux échantillons d'ADN dilués (10-1) de côté pendant un certain temps.

2) Obtenir un tube de microcentrifugation contenant des cellules d'E. coli compétentes et le placer sur de la glace.

3) Tapotez doucement le tube de cellules compétentes avec le bout de votre doigt pour vous assurer que les cellules sont bien en suspension.

4) À l'aide d'une pipette, transférer 0,2 ml (200 µl) de cellules compétentes dans le tube contenant ce qui reste de l'ADN plasmidique pBR322 non dilué. Bouchez le tube et tapotez-le avec le bout de votre doigt pour mélanger les cellules avec l'ADN. Mettez le tube sur de la glace pendant 20 minutes. Les cellules compétentes, qui sont suspendues dans CaCl2, commenceront à capter l'ADN plasmidique recombinant.

5) De même, à l'aide d'une pipette, transférez 0,2 ml (200 µl) de cellules compétentes dans le tube restant d'ADN plasmidique p𗜙.1 non dilué. Boucher et tapoter comme précédemment, et mettre le tube sur de la glace pendant 20 minutes.

6) De même, à l'aide d'une pipette, transférez 0,2 ml (200 µl) de cellules compétentes dans un tube étiqueté "Cells Only"8221, qui ne contient que 5 µl de solution saline stérile. Boucher et tapoter comme précédemment, et mettre le tube sur de la glace pendant 20 minutes.

7) Après le traitement de glace de 20 minutes, placez les trois tubes dans un bain-marie à 42o C pendant 1,5 minutes. Ce choc thermique facilite l'absorption d'ADN par les cellules bactériennes.

8) Transférer les tubes dans la glace pendant 1,5 minutes.

9) À l'aide d'une pipette, ajoutez 0,8 ml (800 & microl) de LB (L Broth, un milieu de croissance bactérien riche en nutriments) dans chaque tube, y compris les deux tubes de contrôle “DNA Only”.

10) Incuber les tubes à 37o C pendant 20 minutes, puis tapoter chaque tube pour bien mélanger son contenu. Remettez-les à 37o C pendant 20 minutes supplémentaires. Cette période d'incubation permet aux cellules de récupérer du traitement au CaCl2 et de commencer à exprimer les gènes de résistance à l'ampicilline et/ou à la tétracycline sur le plasmide. Mélanger le contenu de chacun des tubes en tapotant .

11) Vous allez maintenant diluer vos mélanges de transformation avant de les étaler sur milieu gélosé sélectif. Transférer 0,1 ml (100 µl) du mélange de transformation pBR322 dans un tube contenant 9,9 ml de liquide de dilution. Il s'agit d'une dilution 1:100 (ou 10-2). Faites également une dilution 10-3 en transférant 1,0 ml de la dilution 10-2 dans un tube contenant 9,0 ml de liquide de dilution

12) Répétez l'étape 11 pour le mélange de transformation p𗜙.1.

13) À l'aide de la « technique de placage par étalement » (que votre instructeur de laboratoire vous expliquera et vous démontrera), étaler 0,2 ml (200 microl) de chacune des trois dilutions du mélange de transformation pBR322 (non dilué, 10-2, 10-3) sur plaques LBAmp et également sur plaques LBTet.

14) Répétez l'étape 13 pour les trois dilutions du mélange de transformation p𗜙.1, en utilisant des plaques LBAmp et LBTet.

15) Plaque 0,1 ml (100 & microl) des “Cells Only” à la fois sur une plaque LBAmp et une plaque LBTet. En outre, plaquez 0,2 ml (200 µl) de chacun des deux contrôles “DNA Only” (10-1 dilutions d'échantillons d'ADN plasmidique + 800 µl LB) sur des plaques LB séparées (plaque avec LB mais pas d'antibiotique).

16) Il devrait y avoir un total de 16 assiettes en tout. Incubez ces plaques à l'envers à 37o C. Demain matin, votre instructeur déplacera les plaques au réfrigérateur pour les conserver jusqu'à la semaine prochaine.

17) De plus, votre instructeur de laboratoire doit étaler plusieurs dilutions (essayez 3 dilutions différentes : 10-4, 10-5, 10-6) de cellules E. coli non transformées qui ont subi les procédures d'amplification et de transformation sur des plaques de gélose nutritive. manque d'antibiotique. Cela servira de contrôle qui vous permettra de déterminer le titre (concentration) de la suspension originale de cellules, et ainsi de calculer les efficacités de transformation que vous atteignez.

Session de laboratoire 2
1. Commencez à isoler l'ADN génomique de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster.
2. Identifiez les colonies de transformants sur vos plaques à partir de la session de laboratoire 1 et calculez les efficacités de transformation.

Au cours de cette session de laboratoire, vous commencerez également le processus d'isolement de l'ADN génomique des mouches des fruits. Vous allez anesthésier environ 50 mouches adultes, puis les broyer (les homogénéiser) dans un tampon spécial qui maintient l'ADN stable. Vous traiterez ensuite l'homogénat résultant avec un détergent pour perturber les membranes cellulaires et une enzyme protéase pour détruire les protéines. Enfin, vous mélangerez l'homogénat avec une combinaison de phénol, de chloroforme et d'alcool isoamylique, et vous le conserverez au congélateur jusqu'à la prochaine session de laboratoire.
Vous examinerez également les plaques que vous avez préparées lors de la dernière session, à la recherche de colonies bactériennes. Vous comptez le nombre de colonies sur chacune de vos plaques et déterminez les efficacités de transformation. Partie 1. Isolement de l'ADN génomique de Drosophila melanogaster

Procédure
1) Vous recevrez d'abord un flacon contenant des mouches des fruits. Anesthésiez toutes les mouches dans le flacon comme démontré par votre instructeur de laboratoire. Placez les mouches anesthésiées sur une carte en papier blanc et visualisez-les à l'aide d'un microscope à dissection. Pour plus d'informations sur les mouches des fruits, voir le projet 2.

2) Entraînez-vous à déplacer les mouches sur la carte en papier blanc avec un pinceau fin. Transférer environ 50 mouches dans un tube à centrifuger de 1,7 ml. Gardez le tube sur de la glace.

3) Ajouter 500 µl de tampon HOM* aux mouches dans le tube de microcentrifugeuse. À l'aide d'un homogénéisateur en plastique bleu, homogénéiser les mouches. Utilisez plusieurs coups et ne soyez pas trop brutal. Ajouter 500 microlitres supplémentaires de tampon HOM dans le tube et continuer à homogénéiser les mouches jusqu'à ce qu'aucune partie du corps ne soit reconnaissable.

(*HOM : 80 mM d'EDTA, 100 mM de Tris-Cl, 160 mM de saccharose, pH 8,0)

4) Transférer l'homogénat dans un tube à centrifuger de 15 ml. Ajouter 500 microlitres supplémentaires de HOM dans le tube de microcentrifugation d'origine, puis le transférer dans le tube de centrifugation de 15 ml.

5) Ajouter 75 µl de SDS 10 % et 25 µl de 10 mg/ml de protéinase K.

6) Incuber pendant au moins 1 heure à 68o C.
Pendant cette incubation, faites la partie 2 de la session de laboratoire d'aujourd'hui.

7) Après l'incubation à 68°C, refroidissez-le sur de la glace jusqu'à ce qu'il redescende à température ambiante.

8) Ajoutez une quantité de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) égale à la quantité de liquide dans votre tube (

2 ml) et mélanger. Conservez-le au congélateur jusqu'à la prochaine période de laboratoire.

Partie 2. Examen des plaques de transformation
1) Obtenez les assiettes que vous avez préparées lors de la dernière session.

2) Votre instructeur vous montrera comment compter efficacement le nombre de colonies sur chaque plaque et déterminer l'efficacité de la transformation.

Terminez la partie 1 de la session de laboratoire d'aujourd'hui.

Session de laboratoire 3
1. Terminer l'isolement de l'ADN génomique de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster.
2. Configurer et exécuter des réactions PCR en utilisant l'ADN génomique comme matrice.

Au cours de cette session de laboratoire, vous terminerez le processus d'isolement de l'ADN génomique des mouches des fruits. Vous effectuerez une série d'extractions au phénol:chloroforme:alcool isoamylique pour éliminer les impuretés de l'ADN, et vous précipiterez l'ADN des autres impuretés avec de l'éthanol. Vous allez dissoudre l'ADN génomique de votre mouche dans un tampon appelé TE. Enfin, vous configurerez et exécuterez des réactions PCR pour détecter des séquences d'éléments P putatifs en utilisant l'ADN génomique de votre mouche comme matrice.

Procédure
1) Retirez votre échantillon de la session de laboratoire 2 du congélateur et laissez-le décongeler à température ambiante.

2) Centrifuger votre échantillon à 5 000 tr/min pendant 5 minutes.

3) Transférer la couche aqueuse (supérieure) dans un tube à centrifuger propre de 15 ml et y ajouter 1 volume de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1). Mélanger et centrifuger à 5 000 tr/min pendant 5 minutes.

4) Transférer la couche aqueuse (supérieure) dans un tube à centrifuger propre et y ajouter 1 volume de chloroforme. Mélanger et centrifuger à 5 000 tr/min pendant 5 minutes.

5) Transférer la couche aqueuse (supérieure) dans un tube à centrifuger propre et y ajouter 1 volume de chloroforme. Mélanger et centrifuger à 5 000 tr/min pendant 5 minutes.

6) Transférer la couche aqueuse (supérieure) dans un tube à centrifuger propre et y ajouter 225 µl d'acétate de potassium 8M (KOAc). Mélangez et placez-le sur de la glace pendant au moins 30 minutes.

7) Centrifuger à 13 000 tr/min pendant 20 minutes.

8) Transférer le surnageant dans un tube propre et y ajouter 1 volume d'éthanol à 95 %. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante pour précipiter l'ADN génomique de drosophile.

9) Centrifuger à 10 000 tr/min pendant 10 minutes. Retirez l'éthanol et laissez le culot sécher légèrement à l'air.

10) Remettre le culot en suspension dans 50 µl de tampon TE.

11) Transférer tout l'ADN remis en suspension dans un tube de microcentrifugeuse propre et étiqueter le tube de manière appropriée.

Procédure
1) Étiquetez un tube de microcentrifugation avec vos initiales et la lettre Q (pour “quantification sample”). Distribuer 250 µl d'eau distillée dans le tube.

2) À l'aide de la micropipette de 2 µl, ajoutez 0,5 µl d'ADN de votre échantillon au tube Q. Bien mélanger au vortex.

3) Déterminez la concentration de vos échantillons d'ADN à l'aide du spectrophotomètre UV. Votre instructeur fera la démonstration.

4) Étiquetez un tube de microcentrifugeuse frais avec vos initiales, les abréviations des échantillons et P (pour la PCR). À partir de vos données de quantification, calculez le volume d'échantillon nécessaire pour ajouter 40 ng d'ADN génomique de drosophile au tube (cela différera probablement entre les échantillons et vous devrez peut-être diluer des aliquotes d'ADN avec du tampon TE). Ajoutez la quantité appropriée d'ADN, d'amorce et de mélange réactionnel PCR dans le tube et placez-le dans le thermocycleur. Lorsque les échantillons de tout le monde sont dans le thermocycleur, il est allumé et exécuté pendant le nombre de cycles approprié.
Une fois les réactions PCR terminées, votre instructeur arrêtera le thermocycleur et stockera vos échantillons pour vous jusqu'à la semaine prochaine.
Conservez le reste de votre ADN génomique de drosophile dans le congélateur.

Session de laboratoire 4
1. Votre instructeur aura cultivé 2 ml de cultures de colonies sélectionnées à partir de vos plaques que vous avez mises en place au cours de la session 1.
2. Vous isolerez l'ADN plasmidique recombinant contenant les séquences de contrôle positif de l'élément P à partir de ces cellules cultivées.
3. Mettre en place une réaction PCR pour amplifier spécifiquement les séquences d'éléments P à partir du plasmide recombinant. Conservez ces produits PCR pour l'analyse électrophorétique lors de la session 6.

L'après-midi précédant cette session de laboratoire, votre instructeur a sélectionné des colonies bactériennes à partir de vos plaques que vous avez mises en place au cours de la session 1. Ces colonies bactériennes sont constituées de cellules qui ont été transformées avec le plasmide recombinant p𗜙.1 (contient des séquences d'éléments P). Votre instructeur a inoculé 2 ml de LB (bouillon nutritif) + ampicilline à chaque colonie. Les cultures inoculées ont été cultivées pendant la nuit à 37 °C. Au cours de cette session de laboratoire, vous isolerez l'ADN plasmidique de ces cultures liquides pendant la nuit. Vous allez ensuite mettre en place une réaction PCR pour amplifier les séquences d'éléments P à utiliser comme contrôle positif. Vous enregistrerez ces produits PCR pour l'analyse électrophorétique au cours de la session 6.

Partie 1. Isolement de l'ADN plasmidique recombinant

Procédure
1) Chaque paire d'étudiants doit obtenir deux tubes à essai contenant 2 ml de cultures d'une nuit, chacun à partir d'une seule colonie de cellules transformées avec le plasmide recombinant p𗜙.1 (contient des séquences d'éléments P).

2) Verser 1,5 ml d'une nuit dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté de manière appropriée. Verser 1,5 ml de l'autre culture pendant la nuit dans un deuxième tube de microcentrifugeuse étiqueté de manière appropriée. Les instructions suivantes s'appliquent à chacun des deux tubes de microcentrifugeuse.

3) Centrifuger le tube à pleine vitesse pendant 20 secondes pour sédimenter les cellules.

4) Verser le surnageant hors du tube. Jeter le surnageant.

5) Remettre les bactéries en suspension dans 100 µl (0,1 ml) de tampon GTE en vortexant bien.

6) Ajouter 200 µl (0,2 ml) de solution NS dans chaque tube pour lyser les bactéries. Mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Laisser le tube à température ambiante pendant 5 minutes.

7) Ajouter 100 µl (0,1 ml) d'acétate de potassium (KOAc) dans le tube. Mélanger en agitant vigoureusement le tube. Vous devriez voir un précipité épais et coagulé d'ADN génomique bactérien, de protéines, de lipides et de glucides.

8) Centrifuger le tube à pleine vitesse pendant 2 minutes.

9) Retirer le surnageant avec une pipette de transfert en plastique. Essayez d'éviter les débris blancs flottants et la pastille. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse étiqueté de manière appropriée.

10) Ajouter 500 µl (0,5 ml) d'isopropanol dans le tube contenant le surnageant. Mélanger en retournant le tube plusieurs fois.

11) Centrifuger le tube à pleine vitesse pendant 2 minutes.

12) Retirer le surnageant avec une pipette de transfert en plastique et jeter le surnageant. Le culot contient de l'ADN plasmidique. Remettre en suspension le culot dans 100 microlitres (0,1 ml) de Tris 50 mM, pH 8,3.

13) Ajouter 50 µl d'acétate d'ammonium 8 M (NH4Ac). Mélangez le contenu du tube et placez-le dans un bain de glace carbonique/éthanol jusqu'à ce que le contenu soit solidement congelé (

14) Laisser décongeler le contenu du tube à température ambiante, puis le centrifuger à pleine vitesse pendant 2 minutes.

15) Le surnageant contient l'ADN plasmidique. Transférer ce surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse étiqueté de manière appropriée.

16) Ajouter 500 µl d'éthanol. Mélanger le contenu en retournant le tube plusieurs fois. Centrifuger le tube à pleine vitesse pendant 2 minutes.

17) Verser le surnageant d'éthanol hors du tube. Jeter l'éthanol. Faites tourner le tube rapidement, puis retirez le reste de l'éthanol du tube, en laissant le culot d'ADN plasmidique intact.

18) Laisser le culot sécher à l'air pendant environ 5 minutes, puis remettre le culot en suspension dans 25 µl de tampon TE.

Procédure
1) Pour chacun de vos échantillons d'ADN, étiquetez un tube de microcentrifugation avec vos initiales, le nom de l'échantillon d'ADN et la lettre Q (pour “quantification sample”). Distribuer 998 µl d'eau distillée dans chaque tube.

2) À l'aide de la micropipette 5-40 µl, ajoutez 2,0 µl de chacun de vos échantillons d'ADN plasmidique recombinant dans le tube Q correctement étiqueté. Mélanger chaque puits au vortex.

3) Déterminez la concentration de vos échantillons d'ADN à l'aide du spectrophotomètre UV. Votre instructeur fera la démonstration. Choisissez l'échantillon d'ADN avec la concentration la plus crédible à utiliser dans une analyse plus approfondie.

4) Diluer une aliquote de votre échantillon d'ADN plasmidique à une concentration de 8 ng/ µl.

5) Ajouter 5 µl (= 40 ng) d'ADN plasmidique recombinant dans le tube contenant le mélange réactionnel PCR (tampon de réaction, désoxynucléotide triphosphates [dNTP], amorces et Taq ADN polymérase), et le placer dans le thermocycleur. Lorsque les échantillons de tout le monde sont dans le thermocycleur, il est allumé et exécuté pendant le nombre de cycles approprié.
Une fois les réactions PCR terminées, votre instructeur arrêtera le thermocycleur et stockera vos échantillons pour vous jusqu'à la semaine prochaine.

Session de laboratoire 5
1. Passer un gel sur les produits PCR et isoler le fragment d'ADN.
Dans cette session de laboratoire, vous analyserez vos produits PCR en les électrophorèse sur un gel d'agarose spécial à basse température de fusion. À partir des résultats de cette expérience, vous serez en mesure de déterminer la taille du fragment d'ADN de l'élément P amplifié résultant de votre réaction PCR. Vous allez isoler les fragments qui contiennent de l'ADN pur de l'élément P en les découpant du gel avec une lame de rasoir. Ce faisant, vous préparerez de l'ADN d'élément P pur.

Partie 1. Analyse électrophorétique des produits PCR

Procédure
1) Sortez les tubes contenant tous vos produits de réaction PCR du congélateur, et chauffez-les dans un bain-marie à 70o C pendant 5 minutes, puis placez-les sur de la glace.

2) Vous recevrez un autre tube à centrifuger, étiqueté "lambda-Hind III". Ce tube contient du phage ? ADN complètement digéré par Hind III. Cet ADN digéré sera constitué de fragments d'ADN de longueur connue, qui serviront d'étalons de taille d'ADN sur votre gel électrophorétique. Placez ce tube dans un bain-marie à 70°C pendant 5 minutes, puis gardez-le sur de la glace jusqu'à ce que vous soyez prêt à l'utiliser.

3) Ajoutez 5 µl de tampon d'échantillon d'électrophorèse aux tubes contenant vos produits PCR. Tapotez les tubes pour mélanger le contenu.
Attention : Le gel et le tampon de réservoir utilisés dans les étapes 4 à 8 contiennent du bromure d'éthidium (etBr), un agent cancérigène. Portez des gants lorsque vous manipulez des objets contenant de l'etBr !

4) Chargez tout le contenu du tube "lambda-Hind III" et 25 µl de chaque réaction PCR dans les puits d'échantillon d'un gel d'agarose comme indiqué :

5) Couvrir l'unité d'électrophorèse et brancher les fils sur l'alimentation électrique. Les fils sont codés par couleur de sorte que le fil rouge se branche sur la borne positive et le fil noir se branche sur la borne négative. Les puits d'échantillon dans le gel doivent être les plus proches de l'électrode négative (noire).

6) Allumez la source d'alimentation et réglez la tension à environ 100 volts. Électrophorèse jusqu'à ce que le bleu de bromophénol (colorant) dans les échantillons ait migré à moins de 5 mm de l'extrémité de l'électrode positive (rouge) du gel. À 100 volts, cela devrait prendre environ 1 heure.

7) Une fois votre test de gel terminé, coupez l'alimentation et débranchez les câbles. Retirez le gel de l'appareil et placez-le sur un transilluminateur ultraviolet (UV).

8) Allumez le transilluminateur UV et photographiez votre gel à l'aide d'un imageur de gel comme démontré par votre instructeur.

9) À l'aide des informations de la partie « Interprétation des données d'électrophorèse » de ce manuel (p. 19-20) et des conseils de votre instructeur de laboratoire, déterminez la (les) taille(s) des fragments d'ADN dans toutes les bandes du & #8220PCR Products” voies de votre gel.

10) Consultez la séquence de l'élément P et décidez quelles bandes sur le gel contiennent des fragments d'ADN pur de l'élément P. Votre instructeur montrera comment couper ces bandes du gel à l'aide d'une lame de rasoir propre, isolant ainsi l'ADN pur de l'élément P à utiliser comme contrôle positif pour une séquence de l'élément P. Après avoir découpé les bandes d'ADN appropriées, placez chacune d'elles dans un tube à centrifuger séparé et conservez les tubes au réfrigérateur.

Session de laboratoire 6
1. Nettoyez l'ADN dans les bandes coupées des gels pendant la session de laboratoire 5.
2. Envoyez l'ADN pour qu'il soit séquencé.

Afin de séquencer vos produits PCR, vous devrez purifier votre produit PCR afin de ne pas contaminer l'agarose. Pour ce faire, utilisez des colonnes “spin” d'un kit disponible dans le commerce.Vous enverrez ensuite vos échantillons d'ADN purifiés à une entreprise de biotechnologie pour les faire séquencer.

Partie 1. Purification du produit PCR

Procédure
1) Obtenez une masse pour votre produit PCR : tarez la balance avec un tube de microcentrifugeuse vide puis pesez votre tranche de gel dans son tube.

2) À l'aide d'une micropipette, ajoutez le tampon QG dans le tube contenant la tranche de gel (ajoutez 300 ul de QG pour chaque 10 mg de tranche de gel), chauffez la tranche de gel dans le tampon dans un bloc chauffant à 65o C pendant 10 minutes ou jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

3) Retirer la solution de tranche de gel du bloc chauffant et ajouter de l'isopropanol (100 & microl pour chaque 10 mg de tranche de gel).

4) À l'aide de votre micropipette, transférez la solution de tranche de gel dans une colonne de centrifugation. Placer la colonne de centrifugation dans un tube collecteur et centrifuger à pleine vitesse pendant 1 minute (si vous avez trop de volume pour tenir dans la colonne, remplissez la colonne aux 2/3 environ, centrifugez-la et jetez le flux continu. Ajoutez ensuite le reste de votre solution dans la colonne et centrifuger une seconde fois).

5) Jetez l'écoulement du tube de collecte.

6) Laver la colonne de centrifugation en ajoutant 500 µl de tampon QG à la colonne de centrifugation et centrifuger à pleine vitesse pendant 1 minute. Jeter l'écoulement à travers le tube de collecte.

7) Laver la colonne de centrifugation une seconde fois, cette fois en ajoutant 750 µl de tampon PE dans la colonne de centrifugation, et centrifuger à pleine vitesse pendant 1 minute. Jeter l'écoulement à travers le tube de collecte.

8) Sécher la colonne de centrifugation en tournant une minute supplémentaire dans la microcentrifugeuse à 13 000 tr/min.

9) Pour éluer votre ADN, déplacez votre colonne de centrifugation dans un tube de microcentrifugeuse propre. Ajoutez 50 µl de tampon TE à votre colonne et laissez le tampon pénétrer dans la matrice de la colonne pendant au moins 1 minute.

10) Eluer par centrifugation à pleine vitesse pendant 1 minute. Votre ADN sera maintenant au fond du tube de microcentrifugeuse.

11) Déterminez la concentration de vos échantillons d'ADN à l'aide du spectrophotomètre UV comme vous l'avez fait dans les sessions de laboratoire 3 et 4.

12) Votre instructeur vous montrera comment préparer votre (vos) échantillon(s) d'ADN pour l'expédition à la société de biotechnologie pour le séquençage.

Session de laboratoire 7
Recevez et organisez vos données d'analyse de séquence.
Nous aurons reçu les données du séquençage de vos échantillons d'ADN. Les données seront envoyées par courrier électronique et seront disponibles en ligne. Votre instructeur vous montrera comment récupérer et interpréter les données de séquençage. Vous devez vous familiariser avec les données et les organiser de manière à pouvoir les analyser lors de la prochaine session de laboratoire.

Session de laboratoire 8
Analysez vos données d'analyse de séquence en effectuant des recherches BLAST. Vous ferez également d'autres analyses bioinformatiques, et nous en discuterons en classe et en laboratoire. Veuillez apporter un ordinateur portable au laboratoire aujourd'hui si vous le pouvez !
Votre instructeur vous montrera comment analyser votre (vos) séquence(s) d'ADN en effectuant une recherche BLAST. Vous effectuerez ensuite une analyse bioinformatique approfondie de vos données de séquence. En faisant cela, vous devriez être en mesure de répondre à de nombreuses questions, notamment les suivantes :

-Est-ce que les ADN de contrôle positif de l'élément P ont la séquence attendue ?
-Vos séquences sont-elles amplifiées à partir de séquences d'éléments P d'ADN génomique de drosophile ?
-Si vos séquences amplifiées à partir d'ADN génomique de drosophile sont, en fait, des séquences d'éléments P, sont-elles exactement comme la séquence d'éléments P de type sauvage publiée ? Si non, en quoi sont-ils différents ?
- Si vos séquences amplifiées à partir de séquences d'éléments P d'ADN génomique de drosophile ne sont pas des séquences d'éléments P, quelles sont-elles ? Comment ont-ils pu être amplifiés à l'aide des amorces que vous avez utilisées ?

Vous devriez penser à d'autres questions et votre groupe discutera de l'ensemble du projet et des résultats. S'amuser!

Interprétation des données d'électrophorèse

1) La figure 7 montre les longueurs (en kb) des fragments d'ADN dans chaque bande résultant de l'électrophorèse de l ADN coupé avec Hind III seul (les standards de taille d'ADN dans cette expérience). Examinez les bandes dans la voie lambda-Hin d III de votre gel et déterminez la longueur des fragments qui composent chaque bande. Par exemple, la bande la plus proche du puits d'échantillon représente le plus grand fragment, qui mesure 23,1 kb. Déterminer la distance (en mm) à laquelle chacune de ces bandes lambda-Hin d III a migré depuis les puits d'échantillon. En utilisant du papier graphique semi-log, tracer la distance de migration (en mm) de chaque bande lambda-Hin d III sur l'axe X et la longueur du fragment d'ADN (en kb) de cette bande sur l'axe Y. Tracez une ligne entre les points de votre graphique. À partir de ce graphique, déterminez la longueur des fragments qui composent chaque bande dans les voies expérimentales de votre gel ou autoradiogramme en fonction de leurs distances de migration. Procédez comme suit pour chaque bande :

a) Trouvez la distance de migration de la bande sur l'axe X de votre graphique.
b) Trouvez le point sur la ligne qui est directement au-dessus de cette coordonnée X.
c) Trouvez le point sur l'axe Y qui est directement à gauche de ce point sur la ligne. Cette coordonnée Y est la taille du fragment (en kb).

Projet 2 : Isolement et caractérisation des mutations chez Drosophila melanogaster

L'un des organismes les plus largement utilisés dans les études génétiques est la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Thomas Hunt Morgan a été le pionnier des études génétiques sur la drosophile à l'Université de Columbia en 1911. Aujourd'hui, il existe un vaste corpus de connaissances concernant la génétique de la mouche des fruits. La drosophile possède quatre paires de chromosomes (un nombre relativement petit) qui ont été largement caractérisés. En moins de deux semaines, la mouche des fruits subit une séquence de développement spécifique depuis l'œuf fécondé jusqu'à la larve, la prénymphe, la nymphe, puis l'adulte. Le généticien peut suivre l'héritage des modèles morphologiques, physiologiques et développementaux. Dans ce projet, vous (le généticien) effectuerez un criblage pour identifier et caractériser les mutants de drosophile qui présentent des anomalies morphologiques. Vous caractériserez ensuite les mutations que vous identifiez, dans l'espoir d'en savoir plus sur les gènes impliqués.

Les chromosomes de Drosophila melanogaster

La drosophile individuelle a quatre paires de chromosomes. Une femme a chacun deux chromosomes 1 (plus communément appelé chromosome X), 2, 3 et 4. Un homme a un chromosome X, un chromosome Y et deux chacun des chromosomes 2, 3 et 4. Le chromosome Y et le chromosome 4 sont tous deux très petits et portent peu de gènes. La majorité des gènes de la mouche sont portés sur les chromosomes X, 2 et 3. Les chromosomes X et Y sont impliqués dans la détermination du sexe et sont donc appelés chromosomes sexuels. Les chromosomes 2, 3 et 4 sont appelés autosomes. Chez la mouche des fruits, le sexe est déterminé par le nombre relatif de chromosomes X et d'autosomes. Si une mouche a deux chromosomes X et deux de chaque autosome (un rapport X:autosome de 1:1), elle se développera comme une femelle. Si une mouche n'a qu'un seul chromosome X et deux de chaque autosome (un rapport X:autosome de 1:2), elle se développera comme un mâle. Chez la drosophile, le chromosome Y ne détermine pas la masculinité ! (Ceci est en contraste avec le cas chez les mammifères, dans lesquels la présence du chromosome Y détermine la masculinité.). En fait, une mouche qui a deux chromosomes X et un chromosome Y se développera comme une femelle.

Développement de Drosophila melanogaster

L'accouplement chez la mouche des fruits a lieu 6 à 8 heures après la sortie de la femelle adulte de sa nymphe. Les œufs peuvent être pondus à ce moment-là, ou conservés et pondus plus tard. Une femelle reçoit environ 4000 spermatozoïdes d'un mâle et les stocke dans des sacs spéciaux. Les spermatozoïdes sont libérés au fur et à mesure que les ovules sont produits. Chaque femelle peut pondre plusieurs centaines d'œufs fécondés à la surface d'une source de nourriture. Chaque œuf fécondé se développe sur une période de 24 heures en une larve. La larve s'enfouit dans la source de nourriture et mange des cellules de levure. Quatre à cinq jours et deux mues (perte de la cuticule extérieure de la larve) plus tard, la larve grimpe sur une surface solide et se nymphose pour former une prénymphe qui se couvre d'un étui nymphal dur. La prépupe se développe en nymphe en 12 heures. Au cours des 4 à 5 jours suivants, la nymphe se développe en un adulte, qui émerge de l'étui nymphal en cours d'éclosion. Initialement, la mouche est longue et mince, avec des ailes repliées et de couleur claire. Progressivement, les ailes s'étendent et la mouche prend une forme plus arrondie et une couleur plus foncée. L'ensemble du cycle de vie, qui dure de 10 à 14 jours à 25 °C, est illustré à la figure 1.

Figure 1. Le cycle de vie de la drosophile.

L'étude des mutations chez Drosophila melanogaster

Les mutations sont des outils puissants en analyse génétique. La logique derrière l'analyse mutationnelle est que nous pouvons en apprendre davantage sur la fonction d'un gène en examinant ce qui ne va pas lorsque ce gène ne fonctionne pas correctement. Les gènes peuvent être modifiés par rapport à leurs formes de type sauvage par des mutations, qui souvent perturbent ou éliminent complètement la fonction des gènes. L'analyse mutationnelle a été appelée "dissection génétique". La première étape d'une dissection génétique est la chasse aux mutants (organismes individuels porteurs de gènes mutants). Les mutants apparaissent spontanément dans toute population à faible fréquence. Cependant, grâce à l'utilisation de mutagènes, nous pouvons augmenter considérablement la probabilité de trouver des mutants utiles. L'utilisation d'un mutagène pour induire des mutations est appelée mutagenèse. Un mutagène qui s'est avéré extrêmement efficace pour induire des mutations chez la drosophile est le produit chimique éthyl méthane sulfonate (EMS). L'EMS peut ajouter un groupe éthyle (-CH2CH3) à de nombreuses positions sur les quatre bases présentes dans l'ADN, modifiant ainsi leurs propriétés d'appariement. Le changement le plus courant induit par l'EMS est l'ajout d'un groupe éthyle à la guanine (G), lui permettant de s'apparier avec la thymine (T). Cet appariement illégitime conduit à des transitions GC --> AT au prochain cycle de réplication (voir le manuel de Griffiths, p. 596).
L'EMS induit une forte proportion de mutations ponctuelles. Ce mutagène est facilement administré aux mouches adultes en les plaçant sur du papier filtre saturé d'une solution aqueuse mixte d'EMS et de sucre. Les mâles nourris avec 0,025 M EMS produisent des spermatozoïdes porteurs de mutations mortelles sur 70 % de tous les chromosomes X, et sur presque tous les chromosomes 2 et 3. À ces niveaux d'induction de mutation, il est possible de rechercher (dépister) des mutations à des loci spécifiques, ou pour les mutants qui présentent des phénotypes inhabituels (voir le manuel de Griffiths, p. 202). Dans ce projet, vous allez cribler des mouches qui ont subi une mutagénèse avec EMS, pour trouver des mutants avec des phénotypes anormaux.

L'utilisation du chromosome X attaché dans la mutagenèse de la drosophile

La majorité des mutations intéressantes qui seront détectées dans un criblage suivant la mutagenèse EMS seront récessives, ne produisant ainsi aucun phénotype mutant à moins d'être homozygote. Une exception à cette exigence d'homozygotie pour l'expression de phénotypes mutants récessifs est le cas des mutations liées au chromosome X chez les mouches mâles. Étant donné qu'une mouche mâle n'a qu'un seul chromosome X (et est donc appelée hémizygote pour tous les gènes liés à l'X), elle exprimera le phénotype anormal associé à toute mutation récessive sur le X. En utilisant un chromosome spécial appelé X attaché chromosome (représenté par X^X), il est possible de dépister les mâles de la génération F1 à la recherche de mutations intéressantes sur le chromosome X. Le chromosome X attaché est un chromosome composé formé par la fusion de deux chromosomes X. Un chromosome X^X est hérité comme une seule unité, et les mouches portant un chromosome X^X seront des femelles. Une femelle qui a un chromosome X^X et qui a également un chromosome Y peut être accouplée avec un mâle normal pour produire une femelle X^X/Y et une progéniture F1 mâle X/Y, comme le montre la figure 2. Chromosomes X attachés permettent d'effectuer une mutagenèse rapide par EMS et un criblage de mutants en administrant des EMS aux mâles de la génération parentale, en les accouplant à des femelles X^X et en criblant les mâles de la descendance F1 résultants pour les phénotypes anormaux. Un schéma pour effectuer ce type de mutagenèse et de criblage est décrit dans la figure 3. Dans la génération F1, seuls les mâles porteront des chromosomes X mutagénisés. Étant donné que les mâles sont hémizygotes pour tous les gènes liés à l'X, des mutations récessives liées à l'X seront exprimées chez ces mâles F1.

Dans ce projet de laboratoire, vous recevrez un grand groupe de descendants F1 résultant de l'accouplement de mâles de type sauvage traités par EMS avec des femelles X attachées. Ce groupe de mouches F1 devrait contenir un certain nombre de mutants liés à l'X. Vous êtes à la recherche de mutants intéressants. Vous travaillerez en binôme, mais toute la classe coopérera à cette recherche de mutants, et vous pourrez partager des mutants entre vous. Vous découvrirez ces mutants en recherchant des mouches présentant des phénotypes différents du type sauvage. Un exemple d'un tel phénotype serait des yeux qui sont d'une couleur différente de la couleur des yeux rouge foncé de type sauvage. Vous pouvez également trouver des mouches qui ont des ailes, des poils ou d'autres parties du corps d'apparence anormale. Une fois que vous aurez identifié autant de mutants intéressants que possible, vous voudrez les caractériser. Pour une mutation donnée, vous voudrez déterminer si cette mutation peut être transmise à la génération suivante. Vous voulez également déterminer si chaque mutation est, en fait, sur le chromosome X. Vous devriez concevoir des expériences pour répondre à ces questions. Une fois que vous avez déterminé lesquelles de vos mutations sont transmissibles, il est temps d'en choisir une à examiner plus en détail. Vous voudrez mapper la mutation à une région spécifique du chromosome X. Ce manuel de laboratoire est conçu pour vous fournir des conseils. Il n'est pas destiné à vous guider étape par étape à travers chaque expérience. Vous devez effectuer cette analyse de la manière la plus indépendante possible ! Avec l'aide de vos instructeurs, vous devez concevoir et réaliser des expériences pour répondre aux questions énumérées ci-dessus. Un calendrier potentiel pour ce projet est présenté ci-dessous.

Procédures expérimentales (travail en groupe de 4)

Au cours de cette session de laboratoire, vous commencerez le dépistage des mouches mutantes. Vous allez d'abord anesthésier et examiner un groupe de drosophiles de type sauvage. Vous devez vous familiariser avec l'apparence d'une mouche de type sauvage et apprendre à distinguer les mâles des femelles. Une fois que vous vous sentirez à l'aise de travailler avec des mouches, vous recevrez une bouteille de culture contenant une descendance F1 de mâles de type sauvage traités par EMS accouplés avec des femelles X attachées. La bouteille contiendra des femelles X F1 attachées et des mâles X*/Y F1. (Voir Figure 3) Vous vous concentrerez sur les mâles, à la recherche de mouches aux phénotypes anormaux.

Il vous sera fourni :

un flacon contenant des mouches des fruits de type sauvage
un anesthésiant pour mouches
mouche anesthésique chimique
une carte en papier blanc
un pinceau
un microscope à dissection
un grand groupe de descendants F1 résultant de l'accouplement de mâles de type sauvage traités par EMS avec
femelles attachées-X.
un flacon de femelles vierges attachées X [ C (1) A, y ]
flacons de culture de mouches vides

Examen des mouches des fruits de type sauvage

Vous recevrez d'abord un flacon contenant des mouches des fruits de type sauvage. Anesthésiez toutes les mouches dans le flacon comme décrit ci-dessous et tel que démontré par votre instructeur de laboratoire.

1) Retirez le capuchon inférieur de votre anesthésiant à mouches et retirez le tampon en caoutchouc mousse qui se trouve à l'intérieur de l'appareil.

2) "Chargez" votre anesthésiant anti-mouches en mettant environ 10 gouttes d'anesthésique Fly Nap sur le coussin en caoutchouc mousse et en replaçant le coussin à l'intérieur de l'appareil. Remettez le capuchon inférieur.

3) Retirez le capuchon supérieur de votre anesthésiant anti-mouches. Tapotez légèrement et rapidement le fond du flacon de mouches sur un tampon sur votre paillasse, puis retirez le bouchon du flacon. Retournez rapidement le flacon anti-mouches sur le dessus de l'anesthésique ouvert et tapotez le tout légèrement et rapidement sur un tampon, de sorte que les mouches tombent dans l'anesthésique.

4) Fermez rapidement l'anesthésiant et gardez les mouches dans la chambre d'anesthésie jusqu'à ce qu'elles cessent toutes de bouger (cela devrait prendre quelques minutes).

5) Videz les mouches anesthésiées de l'anesthésiant sur une carte en papier blanc et visualisez-les à l'aide d'un microscope à dissection.

6) Entraînez-vous à déplacer les mouches sur la carte en papier blanc avec un pinceau fin. Remarquez la couleur rouge foncé des yeux de type sauvage.

7) À l'aide des schémas de la figure 4 et fournis dans la salle de laboratoire, séparez les mâles des femelles. Les mâles ont des abdomens plus étroits que les femelles, et l'extrémité postérieure de l'abdomen des mâles est plus pigmentée que celle de la femelle. Les mâles ont des organes génitaux sombres sur les extrémités postérieures extrêmes de leur abdomen que les femelles n'ont pas. Les mâles ont également des poils spécialisés appelés "peignes sexuelles" sur leur paire de pattes la plus antérieure. Si vous avez du mal à distinguer les mâles des femelles en regardant l'extrémité de l'abdomen, les peignes sexuels identifieront positivement un mâle.

8) Une fois que vous vous sentez à l'aise de travailler avec les mouches et de distinguer les mâles des femelles, il est temps de commencer le dépistage des mouches mutantes !

Figure 4. Distinguer les drosophiles mâles et femelles

Vous recevrez un grand groupe de descendants F1 résultant de l'accouplement de mâles de type sauvage traités par EMS avec des femelles X attachées.

1) Anesthésiez et examinez soigneusement les mouches, en vous concentrant sur les mâles. Les mâles et les femelles devraient être faciles à distinguer, car les femelles attachées X ont un corps jaune, tandis que les mâles, à moins d'être modifiés par une mutation nouvellement induite affectant la couleur du corps, auront un corps bronzé foncé. Les femelles auront des corps jaunes, car les chromosomes X attachés portent la mutation, jaune (en abrégé, y ). Le nom du chromosome X attaché que ces femelles portent est C(1)A, y . Cela signifie "Compound Chromosome 1 (le X) d'Armentrout (le scientifique qui a fabriqué le chromosome), porteur de la mutation, jaune ". Les deux chromosomes X qui composent C (1) A, y portent la mutation jaune, de sorte que les femelles sont homozygotes pour cette mutation récessive et présentent la couleur de corps jaune mutante. Gardez à l'esprit que si vous voyez un mâle de couleur jaune, cela est potentiellement dû à une mutation liée à l'X nouvellement induite, et vous devriez l'examiner plus avant.

2) Recherchez des mâles qui présentent des différences par rapport au type sauvage. Sauvez chaque mâle d'apparence mutant que vous trouvez dans sa propre fiole de culture. Si vous ne parvenez absolument pas à trouver un mutant, NE VOUS INQUIÉTEZ PAS ! Ce sera un effort d'équipe, et vous pouvez obtenir un mutant d'un autre groupe d'étudiants si vous en avez besoin. Votre instructeur fournira également des mutants supplémentaires.

3) Avec l'aide de votre instructeur de laboratoire (si vous le souhaitez), concevez et commencez une expérience pour déterminer si les mutations que vous avez identifiées sont transmissibles à la génération suivante. Vous recevrez tout (y compris les mouches) dont vous avez besoin pour mettre en place ces expériences. Vous devriez discuter de votre approche avec votre instructeur. Vous devriez également réfléchir à la façon dont vous allez mapper vos mutations sur une région du chromosome X.

Au cours de cette période de laboratoire, vous interpréterez les résultats de votre expérience conçue pour déterminer si chacune de vos mutations nouvellement identifiées est transmissible.

1) Anesthésiez les mouches dans les flacons dans lesquels vous avez mis en place des croisements pendant la séance de laboratoire 1. Examinez toutes les mouches. Ces mouches, la descendance du ou des croisements que vous avez mis en place lors de la session de laboratoire 1, sont la génération F2. Recherchez les mouches F2 présentant les phénotypes mutants que vous avez identifiés lors de la séance de laboratoire 1. Faites attention aux différences entre les mâles et les femelles.

-Lesquelles de vos mutations sont transmissibles ?

-Parmi les mutations transmissibles, pouvez-vous dire si certaines sont dominantes ou récessives ? Pouvez-vous dire si certains sont liés à l'X ou autosomiques ? Expliquez votre raisonnement.

-Si une mutation particulière ne s'est pas transmise, réfléchissez à la raison.

2) Si une mutation particulière est transmissible, commencez votre expérience pour la mapper sur une région du chromosome X. Vous recevrez des mouches des fruits femelles vierges homozygotes pour un chromosome X à marquage multiple.Ce chromosome X multi-marqué porte plusieurs mutations récessives différentes qui sont faciles à identifier. Un exemple de chromosome X à marquage multiple est le
y cv v f chromosome. Ce chromosome porte des allèles mutants récessifs de quatre gènes qui sont espacés le long du chromosome. Ces gènes sont :

y = jaune (cartes vers le télomère, ou l'extrémité gauche du chromosome X, Position de la carte = 0) Les mouches femelles homozygotes (ou les mouches mâles hémizygotes) pour les mutations en jaune ont une couleur de corps jaune très clair, par opposition au corps beige couleur des mouches de type sauvage.

cv = crossveinless (Carte Position = 13,7, ce qui signifie qu'il est de 13,7 Map Units à droite du télomère) Les mouches femelles homozygotes (ou les mouches mâles hémizygotes) pour les mutations dans crossveinless manquent d'un certain ensemble de nervures qui sont censées être dans leurs ailes .

v = vermillon (position sur la carte = 33,0, ce qui signifie qu'il se trouve à 33 unités de la carte à droite du télomère) Les mouches femelles homozygotes (ou les mouches mâles hémizygotes) pour les mutations du vermillon ont une couleur des yeux rosâtre anormale, par opposition à l'œil rouge foncé couleur des mouches de type sauvage.

f = fourchue (Position sur la carte = 56,7, ce qui signifie qu'elle est à 56,7 unités de la carte à droite du télomère) Les mouches femelles homozygotes (ou les mouches mâles hémizygotes) pour les mutations de la fourche ont une courbure anormale à l'extrémité de leurs poils, ce qui rend les soies fourchues semblent assez différentes des soies droites et pointues des mouches des fruits de type sauvage.

Une carte schématique du chromosome y cv v f ressemblerait à ceci :

Si la mutation que vous souhaitez cartographier est liée à l'X, établissez un croisement de mâles hémizygotes pour votre mutation nouvellement identifiée avec des femelles vierges homozygotes pour le chromosome X à marquage multiple. Vous interpréterez les résultats de cette expérience au cours de la session de laboratoire 3.

Au cours de cette période de travaux pratiques, vous continuerez vos expériences de cartographie. Vous interpréterez les résultats du ou des croisements que vous avez configurés lors de la session de laboratoire 2 et créerez un autre croisement (ou des croisements).

1) Anesthésiez les mouches dans les flacons dans lesquels vous avez configuré les croisements pendant la session de laboratoire 2. Ces mouches, la descendance des croisements que vous avez configurés pendant la session de laboratoire 2, sont la génération F3. Examinez toutes les mouches. Recherchez les mouches présentant les phénotypes mutants que vous avez identifiés lors de la séance de laboratoire 1. Faites attention aux différences entre les mâles et les femelles.

-A quoi ressemblent les mouches mâles ?

-A quoi ressemblent les mouches femelles ?

-Est-ce que l'une des mouches présente le phénotype mutant que vous avez identifié lors de la session de laboratoire 1 ?

-À partir de vos résultats, pouvez-vous déterminer si votre mutation nouvellement identifiée est dominante ou récessive ?

-À partir de vos résultats, pouvez-vous déterminer si votre mutation nouvellement identifiée est allélique à une mutation connue ?

2) Les femelles F3 sont hétérozygotes pour le chromosome X portant votre mutation nouvellement identifiée et le chromosome X à plusieurs marques. Au cours de la méiose chez ces femelles, un croisement peut se produire entre ces deux chromosomes X, ce qui donne des œufs porteurs de chromosomes X recombinants. En examinant la descendance F4 résultant d'un croisement entre ces femelles et les mouches mâles appropriées, vous pouvez déterminer les fréquences de recombinaison entre votre mutation nouvellement identifiée et les mutations connues sur les chromosomes X à marquage multiple. Cela vous permettra de calculer une position sur la carte pour votre nouvelle mutation.
Puisque vous avez affaire à des mutations liées à l'X, vous pouvez prévoir de restreindre votre analyse de la descendance F4 aux mâles F4. Chaque mâle F4 héritera d'un seul chromosome X de sa mère F3 hétérozygote et affichera les phénotypes associés à toute mutation sur ce chromosome X. Chaque mâle F4 sera soit de type parental, soit recombinant en ce qui concerne les différentes mutations avec lesquelles vous travaillez. Déterminer le pourcentage de descendants mâles F4 qui sont recombinants vous permettra de calculer une position sur la carte pour votre mutation nouvellement identifiée.
Puisque vous ne regarderez que les mâles de la génération F4, le génotype des mâles que vous croiserez avec vos femelles hétérozygotes F3 n'a pas d'importance. Vous pouvez considérer ces hommes comme de simples donneurs de sperme. Faites un croisement de vos femelles hétérozygotes F3 avec les mâles disponibles.

Au cours de cette période de laboratoire, vous devriez être en mesure de terminer votre expérience de cartographie proposée et de déterminer à quelle région du chromosome X chacune de vos mutations correspond.

1) Anesthésiez les mouches dans les flacons dans lesquels vous avez configuré les croisements pendant la session de laboratoire 3. Ces mouches, la descendance des croisements que vous avez configurés pendant la session de laboratoire 3, sont la génération F4. Examinez toutes les mouches. Séparez les mâles des femelles et jetez les femelles. Vous concentrerez cette analyse sur les mâles F4 uniquement.

2) Choisissez trois mutations sur lesquelles concentrer votre attention . Ces trois mutations doivent inclure votre mutation nouvellement isolée et deux des mutations sur le chromosome X à marquage multiple. Vous pouvez maintenant considérer votre étude comme un croisement en trois points, comme décrit aux pages 156-167 du manuel Griffiths et al. (2002) Analyse génétique moderne, 2e édition. New York, W.H. Freeman et Compagnie. Votre premier travail sera de déterminer le phénotype (mutant ou sauvage) de chacun des mâles F4 par rapport aux trois mutations que vous envisagez. Vous pouvez ensuite déterminer le nombre de mâles F4 de type parental et de type recombinant par rapport à chacune des trois mutations.

3) Après avoir évalué tous les mâles F4 pour le phénotype, déterminez quelle classe de descendance représente les doubles croisements. Déterminer le nombre de croisements uniques qui se sont produits entre chacune des trois mutations. Avec ces chiffres, vous devriez pouvoir cartographier les trois mutations les unes par rapport aux autres. Puisque vous connaissez les positions sur la carte de deux des mutations, vous devriez être en mesure de déterminer une position sur la carte pour votre mutation nouvellement isolée.

4) Dessinez une carte du chromosome X montrant les positions sur la carte de votre mutation nouvellement isolée et des deux autres mutations que vous avez utilisées.


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