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Estimation de RPM à RCF dans les méthodes d'anciens papiers

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J'essaie de reproduire une méthode de biologie cellulaire d'un 1958 Enquête en laboratoire papier. Le protocole est pour l'isolement d'une protéine de la matrice extracellulaire, et une étape clé est une centrifugation réalisée pendant 2 heures à 2300 rpm. Apparemment, il n'était pas courant de lister la marque, le modèle et la taille du rotor des centrifugeuses, je suis donc un peu perdu quant aux paramètres à utiliser sur ma propre centrifugeuse pour obtenir le même rcf.

Existe-t-il de bons points de départ pour estimer les paramètres appropriés ? par exemple. qui étaient les principaux fournisseurs de centrifugeuses à l'époque ou quels modèles seraient considérés comme « standard » pour un laboratoire de biologie cellulaire ?


Je ne suis pas sûr de ce qu'ils utilisaient en 1958 (peut-être Sorvall). Cependant, vous pouvez consulter des articles récents sur l'isolement des protéines ECM (si tel était votre objectif).

Jetez un œil à cet article.

Du matériel et des méthodes :

Isolement des protéines ECM.

Les fibroblastes ou les cellules A431 ont été retirés de la surface de la plaque de culture avec 2 mM d'EDTA dans du PBS pendant 3 à 5 min à 37 °C. Les cellules détachées ont été jetées et les protéines ECM restantes attachées à la surface des plaques de culture ont été lavées avec la même solution. L'élimination des cellules a été contrôlée au microscope. Une fois les cellules complètement éliminées, les protéines de la matrice ont été recouvertes d'acide acétique à 5 % et incubées à 4°C pendant une nuit. Ensuite, l'acide acétique a été éliminé et échangé avec un tampon contenant 125 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 0,1 % de SDS, 10 % de glycérol, 1 % de DDT, 0,05 mM de PMSF, un cocktail d'inhibiteur de protéase (Roche, Allemagne) et incubé à 37 °C. pendant 1h. Les protéines ont été retirées avec un grattoir. La procédure a été répétée trois fois. Tous les extraits de protéines, y compris l'acide acétique, ont été combinés et les protéines ECM ont été précipitées par cinq volumes d'acétone. Après incubation à -20°C pendant une nuit et centrifugation à 7000 g pendant 15 min, les culots de protéines ont été dissous dans un tampon approprié pour une analyse plus approfondie par électrophorèse sur gel unidimensionnelle ou bidimensionnelle.

De plus, nous avons obtenu une fraction soluble Triton X-100 de protéines ECM. Les cellules ont été retirées comme décrit ci-dessus; les boîtes ont été remplies de Triton X-100 à 1 % et incubées à 37 °C pendant 30 min. L'extraction a été répétée trois fois. La procédure suivante d'extraction de l'ECM était la même que celle décrite ci-dessus. Les échantillons obtenus à partir des deux fractions ont été dissous dans un tampon pour électrophorèse unidimensionnelle (Laemmli) ou bidimensionnelle (tampon de réhydratation contenant 8 M d'urée, 2 % de CHAPS, 20 mM de DDT, 0,1 % de Triton X-100). Les protéines qui restaient après l'extraction du Triton X-100 ont été dissoutes dans du tampon d'échantillon Laemmli.


Une microcentrifugeuse artisanale pratique à des fins pédagogiques

Nous rapportons une microcentrifugeuse maison pratique à utiliser à des fins pédagogiques. Il a été fabriqué à l'aide d'une essoreuse à salade et de deux supports de tubes de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Il peut accueillir 2 plaques 96 puits de taille standard ou 24 barrettes ou jusqu'à 192 tubes de microcentrifugeuse. La centrifugeuse est actionnée manuellement et est idéale pour de courtes rotations. Enseignement de la biochimie et de la biologie moléculaire Vol. 39, n° 4, p. 298-299, 2011

La centrifugation est l'une des techniques de recherche les plus importantes et les plus largement appliquées en biochimie, biologie cellulaire et moléculaire. Les centrifugeuses de laboratoire sont utilisées pour isoler et séparer les solides des liquides en suspension. Les utilités de la centrifugation sont nombreuses et peuvent inclure la sédimentation de cellules et de virus, la séparation d'organites subcellulaires et l'isolement de macromolécules telles que l'ADN, l'ARN, les protéines ou les lipides. Une centrifugeuse de laboratoire comprend généralement un rotor contenant deux, quatre, six ou plusieurs puits numérotés à l'intérieur desquels des tubes à centrifuger peuvent être placés. Il existe différents types de centrifugeuses, selon la taille et la capacité de l'échantillon. Dans un laboratoire de biologie moléculaire, trois types de centrifugeuses sont courants. Ultracentrifugeuse, qui accélère jusqu'à 70 000 tr/min. Grande centrifugeuse qui accélère jusqu'à environ 20 000 tr/min et peut accepter des tubes de différentes tailles, selon les rotors et les micro-centrifugeuses qui accélèrent jusqu'à 12 ou 13 tr/min et sont conçues pour faire tourner des centrifugeuses en plastique de 0,2 à 2 ml. Ces petites centrifugeuses sont très pratiques pour faire tourner de petites quantités de matériau à basse et moyenne vitesse.

La plupart des protocoles de biologie moléculaire utilisent une microcentrifugeuse et, par conséquent, la plupart des exercices de laboratoire ont besoin d'une microcentrifugeuse [ 1-3 ]. Différentes expériences telles que la PCR et les puces à ADN nécessitent une microcentrifugeuse utilisée dans le but de faire tourner de petites quantités d'ADN matrice ainsi que d'autres composants de la réaction. Néanmoins, il s'agit d'un équipement coûteux pour un laboratoire d'enseignement. Les microcentrifugeuses moins chères sont minuscules et pratiques, ont une petite capacité, 6 à 12 tubes de 0,2 à 2 ml et nécessitent généralement l'utilisation d'adaptateurs. La majorité de ces centrifugeuses de paillasse personnelles n'ont pas de rotors ou d'adaptateurs interchangeables pour centrifuger des barrettes et/ou des plaques à 96 puits et, par conséquent, une centrifugeuse plus grande et plus chère devrait être utilisée à cet effet. Disposer de ces centrifugeuses plus chères et plus grandes dans un laboratoire n'est pas toujours facile, que ce soit pour des raisons économiques ou/et parce que la paillasse est pleine de matériaux. Pour pallier le manque d'une centrifugeuse appropriée dans le laboratoire des étudiants qui empêche de faire certains types d'expériences, nous avons conçu une centrifugeuse peu coûteuse et manuelle qui peut être utilisée pour faire tourner des tubes PCR courts, des barrettes ainsi que des plaques à 96 puits.

La centrifugeuse a été assemblée en utilisant les matériaux suivants : une essoreuse à salade, deux supports de tubes PCR et deux élastiques pour maintenir les supports à la passoire intérieure (voir figures 1 et 2). Pour faire fonctionner la centrifugeuse, placez simplement les bacs dans les racks, fermez le couvercle et faites-le tourner. Cinq ou six tours suffiront pour faire tourner les liquides. La centrifugeuse ne peut centrifuger que des liquides, pas des solides, et est aussi efficace qu'une « rotation courte » effectuée dans une centrifugeuse commerciale. Pour tester cette affirmation, une expérience préliminaire a été menée dans le laboratoire de recherche où une centrifugeuse commerciale, capable de centrifuger des tubes et des plaques PCR, est disponible. Nous avons fait une amplification PCR de microsatellites, qui est l'expérience la plus fréquemment réalisée dans notre laboratoire [ 4 ]. Les amplifications ont été réalisées en duplicata à l'aide de tubes, de barrettes et de plaques. Dans l'une des répliques, seul le spin commercial a été utilisé alors que, comme dans l'autre, la centrifugeuse artisanale a été utilisée. Aucune différence n'a été observée lorsque les amplifications PCR ont été vérifiées sur gel d'agarose (voir Fig. 3) ou lorsque les microsatellites ont été chargés dans l'analyseur génétique ABI 3100 (appliqué Biosystems) et visualisés sur l'ordinateur.

En haut : vue générale de la centrifugeuse artisanale. En bas : Détail des tubes à l'intérieur de la centrifugeuse. L'image montre également comment les élastiques sont attachés à la passoire interne.

Vue détaillée de la centrifugeuse artisanale. Il a trois composants, un couvercle, une passoire intérieure où les supports étaient fixés et un bol en plastique extérieur.

Photographies d'un gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium et visualisé par transillumination UV. Rangée supérieure (lignes 1 à 10) : amplifications PCR réalisées à l'aide d'une centrifugeuse commerciale. Lowe row (lignes 1 à 10) : amplifications PCR réalisées à la centrifugeuse artisanale.

Nous utilisons régulièrement cette centrifugeuse au laboratoire d'enseignement. L'une des classes de démonstration, qui sont effectuées au laboratoire, est la détection d'aliments génétiquement modifiés. La pratique est basée sur les travaux de Brinegar et Levee [ 5 ] et Thion et al. [ 6 ]. Ils sont utilisés pour détecter de manière respectable le maïs et le soja transgéniques dans les produits alimentaires. Pour les expériences, il est nécessaire d'effectuer de nombreuses réactions PCR. Les réactions incluent l'ADN extrait de différents types d'aliments ainsi que les contrôles positifs et négatifs. Nous avons observé que les amplifications PCR sont plus efficaces lorsque les étudiants travaillent avec des barrettes de tubes au lieu de tubes individuels, car cela minimise le nombre d'erreurs. Au laboratoire, nous avons plusieurs microcentrifugeuses dans lesquelles les tubes PCR individuels peuvent être centrifugés, mais pas les barrettes. La centrifugeuse a été initialement conçue à cet effet. Chaque groupe d'élèves, deux ou trois, peut disposer d'une centrifugeuse. Nous avons testé que les résultats de la PCR réalisée sont comparables à ceux obtenus à l'aide d'une centrifugeuse commerciale. En plus des cours pratiques, la centrifugeuse est également utilisée dans le laboratoire de recherche pour faire tourner des liquides lors de l'utilisation de plaques à 96 puits.

La centrifugeuse présente plusieurs avantages, est très simple et très bon marché à réaliser, ne nécessite aucun soin particulier et d'autre part, elle n'est pas sujette aux déséquilibres, et donc elle peut être utilisée sans aucun soin particulier.


Résumé

La caractérisation moléculaire des vésicules extracellulaires (VE) a révélé une grande hétérogénéité dans leur composition au niveau cellulaire et tissulaire. Les méthodes d'isolement actuelles ne parviennent pas à séparer efficacement les sous-types d'EV pour l'analyse protéomique et fonctionnelle. Le but de cette étude était de développer un flux de travail d'isolement reproductible et évolutif pour augmenter le rendement et la pureté des préparations EV. Grâce à une combinaison de précipitation à base de polymère et de chromatographie d'exclusion stérique (Pré-SEC), nous avons analysé deux sous-ensembles de véhicules électriques en fonction de leur contenu en CD9, CD63 et CD81 et de leur temps d'élution. Les véhicules électriques ont été caractérisés à l'aide de la microscopie électronique à transmission, de l'analyse du suivi des nanoparticules et des tests de transfert Western. Pour évaluer les différences de composition protéique entre les fractions EV à élution précoce et tardive, nous avons effectué une analyse protéomique quantitative des véhicules électriques dérivés de MDA-MB-468. Nous avons identifié 286 protéines exclusives dans les fractions à élution précoce et 148 protéines avec une concentration différentielle entre les fractions à élution précoce et tardive. Une analyse en gradient de densité a en outre révélé une hétérogénéité EV au sein de chaque sous-groupe analysé. Grâce à une approche de biologie des systèmes, nous avons trouvé des interactions significatives entre les protéines contenues dans les véhicules électriques qui suggèrent l'existence de clusters fonctionnels liés à des processus biologiques spécifiques. Le flux de travail présenté ici permet l'étude des sous-types EV au sein d'un seul type de cellule et contribue à normaliser l'isolement EV pour les études fonctionnelles.


Résultats

Mise en œuvre d'une méthode d'isolement de l'ADNmt à partir de petits échantillons de tissus

Pour étudier le spectre complet des mutations de l'ADNmt dans les petites régions du cerveau de souris et éviter le biais inhérent à l'amplification PCR, nous avons mis en œuvre une méthode d'épuisement enzymatique de l'ADN nucléaire (ADNn) à partir de l'ADN total [20] extrait du tissu cérébral. Nous avons appauvri enzymatiquement l'ADNn de l'ADN total par traitement avec l'exonucléase V, une enzyme qui cible les extrémités libres de l'ADN linéaire, laissant essentiellement l'ADNmt circulaire intact [20]. Nous avons utilisé des échantillons enrichis en ADNmt directement pour la préparation de la bibliothèque pour le séquençage de nouvelle génération (Fig. 1a).

Le vieillissement augmente la charge des SNV et des suppressions dans l'ADNmt dans toutes les régions du cerveau. une Illustration schématique du flux de travail de la souris à la bibliothèque préparée. En bref, les régions cérébrales d'intérêt ont été rapidement échantillonnées et l'ADN total a été extrait. L'ADN linéaire a été dégradé enzymatiquement par l'exonucléase (ExoV), et l'ADN non linéaire est purifié et utilisé pour la préparation de la bibliothèque. FL : molécule d'ADNmt de pleine longueur, : molécule d'ADNmt avec délétion. b Vue d'ensemble du flux de travail d'analyse pour optimiser la détection des variantes d'ADNmt. Peu de temps après, après un filtrage de qualité, les lectures ont été mappées à mm10 sans le chromosome mitochondrial (MT). Les lectures non mappées ont ensuite été mappées à une référence MT modifiée (dMT : deux références MT en tandem) et des variantes ont été appelées. c Présentation de l'ADNmt de souris. Vert : gènes codant pour l'ARNr bleu : gènes codant pour les protéines rouge : gènes codant pour l'ARNt orange : région non codante (NCR). Schéma montrant les zones isolées comme le cortex (COR), le putamen caudé (CP), le raphé dorsal (DR), le noyau accumbens (NAc), le noyau paraventriculaire du thalamus (PVT) et la substance noire (SN). e L'ADN stocké avant et après la digestion par ExoV a été soumis à une qPCR pour déterminer les niveaux relatifs de trois ADNmt et de trois cibles nucléaires avant et après digestion (indiqués pour deux souris différentes, A et B). La souris C a été traitée comme A et B mais sans l'ajout d'ExoV. Les barres montrent la moyenne des signaux cibles et l'écart type est indiqué. : l'ADNn après le traitement par ExoV n'a pas été détecté ou n'a été détecté qu'à un niveau très faible par qPCR et peut ne pas être visible dans le graphique à barres. F Diagramme de points illustrant l'augmentation en fonction de l'âge de la charge des SNV (à gauche) et des suppressions (à droite) dans les régions du cerveau étudiées (comme indiqué par la légende des couleurs). Tous les échantillons ont été normalisés à la moyenne des variantes à 10 semaines. Les losanges gris indiquent la moyenne de toutes les régions à l'âge indiqué, et l'intervalle de confiance à 95 % est indiqué. L'ANOVA à trois facteurs a montré l'âge, et non la région ou l'animal, de manière significative (p < 0,01) ont contribué aux niveaux de SNV et de délétion. Le test de Tukey a été utilisé post-hoc déterminer p valeurs entre chaque tranche d'âge

Nous avons autorisé une cartographie en lecture séparée pour identifier les délétions avec BBMap [21] (Fig. 1b) en utilisant une référence d'ADNmt personnalisée composée de deux références MT mm10 en tandem (dMT). Dans une approche de cartographie à deux tours, nous avons supprimé les lectures de séquençage dérivées de l'ADNn résiduel, en particulier en raison de la présence de segments d'ADN mitochondrial nucléaire (Chiffres), c'est-à-dire des séquences de type ADNmt dans le génome nucléaire. En raison de la circularité de l'ADNmt (Fig. 1c), les suppressions peuvent s'étendre sur les « extrémités » de la référence d'ADNmt, qui est de nature linéaire, ce qui interférera avec l'appel de suppression. En utilisant la dMT, nous avons contourné cela et avons pu détecter de manière fiable des variantes à n'importe quelle position dans l'ADNmt. Comme les lectures de séquençage générées par Nextera sont bien connues pour présenter un biais GC dans les premières bases de la lecture, nous avons rogné ces bases et exclu 5 pb supplémentaires aux extrémités de lecture lors de l'appel de variante (voir la section « Méthodes »). Sur cette base, nous n'avons aucune raison de croire que l'appel de variante est influencé par le biais de séquence de transposase. Pour l'identification des variantes de l'ADNmt, nous avons échantillonné le cortex sensoriel (COR), le putamen caudé (CP), le raphé dorsal (DR), le noyau accumbens (NAc), le noyau thalamique paraventriculaire (PVT) et la substance noire (SN) (Fig. 1d ) au cours du vieillissement de la souris et a confirmé l'épuisement de l'ADNn par qPCR avant la préparation de la bibliothèque et le séquençage (Fig. 1e).

Accumulation de SNV et délétions liées au vieillissement dans toutes les régions du cerveau

Nous avons initialement cartographié les changements liés au vieillissement dans les mutations de l'ADNmt dans le cerveau de souris de type sauvage (WT) âgées de 10, 50 et 80 semaines (Fig. 1f). Comme prévu, le nombre de SNV chez les souris de 10 semaines était très faible mais a augmenté en moyenne de 10 fois chez les souris de 50 semaines et est resté relativement inchangé à 80 semaines (Fig. 1f, à gauche). De même, les suppressions ont également atteint un plateau à 50 semaines après avoir augmenté de 2,5 à 3 fois à partir de 10 semaines (Fig. 1f, à droite). Le plateau atteint à la fois dans les SNV et les délétions à 50 semaines indique une restriction de la charge de mutations de l'ADNmt. Ceci peut être imposé par la perte de la fonction mitochondriale, limitant ainsi sa propagation ou déclenchant la mitophagie. Alternativement, la réplication sélective des molécules d'ADNmt peut empêcher la charge de mutation d'augmenter davantage. Dans l'ensemble, les SNV et les suppressions semblaient s'accumuler de manière homogène dans les régions cérébrales examinées au cours du vieillissement, mais peuvent être influencés par différents paramètres pathologiques.

Polg D181A l'expression provoque une accumulation de SNV spécifique à une région du cerveau avec le vieillissement

Après avoir établi que notre méthode pouvait être utilisée pour cartographier les mutations de l'ADNmt induites par le vieillissement, nous nous sommes tournés vers notre Polg D181A des souris modèles pour étudier l'influence spécifique à la région du cerveau de la déficience en relecture. Nous avons séquencé l'ADNmt des six régions cérébrales d'intérêt de Polg D181A souris et identifié les SNV dans chaque région à l'âge de 10, 50 et 80 semaines (Fig. 2a).

Les SNV s'accumulent de manière hétérogène dans les régions du cerveau dans Polg D181A souris et provoquent des modèles mutationnels spécifiques à la position de l'ADNmt. une Dot plot illustrant l'augmentation en fonction de l'âge de la charge des SNV dans Polg D181A souris dans les régions cérébrales étudiées (comme indiqué par la légende des couleurs) normalisées à la moyenne des échantillons WT à 10 semaines. Les losanges gris indiquent la moyenne des échantillons de régions cérébrales dérivés de WT pour référence (comme sur la figure 1f). Les losanges rouges indiquent la moyenne de Polg D181A - des échantillons de régions cérébrales dérivés et l'intervalle de confiance à 95 % est indiqué. ANOVA à trois facteurs (âge, région et animal) de Polg D181A -des échantillons dérivés ont montré que l'âge contribuait de manière significative aux niveaux de SNV (p valeurs de post-hoc le test de Tukey sont montrés). L'ANOVA à trois facteurs a montré une contribution significative de toutes les variables (âge, génotype, région). p valeurs de post-hoc Le test de Tukey comparant WT et Polg D181A à chaque âge sont indiqués. Pour la contribution de la région, nous avons trouvé une contribution significative de COR, NAc et PVT aux niveaux de SNV dans Polg D181A souris utilisant un modèle linéaire pour les effets principaux. b Les SNV ont été comptés dans des bacs de 10 pb sans chevauchement pour WT (gris) et Polg D181A (rouge) souris à 10, 50 et 80 semaines, et le nombre de régions avec SNV dans chaque bac calculé. Notez que dans le cas où une région a plus d'un SNV dans un bac, elle n'est comptée que comme une instance d'un SNV. Le chevauchement a été visualisé pour les cases non chevauchantes (« 1 »), les cases partagées entre deux ou trois régions (« 2–3 ») et les cases partagées entre quatre à six régions (« 4–6 »). c Les SNV ont été comptés dans des bacs de 10 pb sans chevauchement pour WT (gris) et Polg D181A (rouge) souris à 50 semaines, et le nombre d'animaux individuels avec SNV dans chaque casier calculé. Notez que dans le cas où un animal a plus d'un SNV dans un bac, il n'est compté que comme une instance d'un SNV. Le chevauchement a été visualisé pour les casiers ne se chevauchant pas (« 1 »), les casiers partagés entre deux ou trois animaux ("2–3") et les casiers partagés par quatre animaux ou plus ("≥ 4"). Pourcentage cumulé de SNV détectés dans chaque région du cerveau examinée (traits fins) à la fois pour WT (gris) et Polg D181A (rouge) à 10, 50 et 80 semaines. Les lignes en gras indiquent la moyenne conditionnelle lisse pour chaque génotype. e La fréquence moyenne relative des allèles SNV pour chaque région pour WT (gris) et Polg D181A (rouge) souris à 10, 50 et 80 semaines, comme indiqué sous forme de boxplots. p valeurs de bilatéral t les tests sont affichés. F Les SNV dans les régions du cerveau ont été regroupés pour chaque génotype à chaque âge et divisés en bacs de 100 pb à travers la référence d'ADNmt et la fraction allélique pour les SNV dans chaque bac additionnés et normalisés (c'est-à-dire le pic le plus élevé fixé à 1).Les zones grises indiquent les régions d'ADNmt où des pics se trouvent dans toutes les variables (??), des pics dépendants du vieillissement (??), et induite par le vieillissement Polg D181A -pics dépendants (??)

Chez les jeunes souris, il n'y a eu aucun changement dans les niveaux de SNV entre WT et Polg D181A chez des souris de 10 semaines. À 50 et 80 semaines, nous avons observé une augmentation significative des niveaux de SNV qui était particulièrement importante dans COR, NAc et PVT (Fig. 2a). Cela a démontré que l'hétérogénéité de la réponse mitochondriale au déficit de relecture est présente à travers un organe et pas seulement entre les organes [6, 16, 22, 23].

Il est important de noter que nous n'avons trouvé aucune relation entre l'expression de la Polg D181A transgène dans les régions cérébrales étudiées et le niveau de SNV détectés (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S5c).

Les SNV sont excessivement partagés entre les régions du cerveau

Nous nous sommes demandé si l'augmentation des SNV avec le vieillissement et Polg D181A l'expression affectait les mêmes positions dans l'ADNmt à travers les régions du cerveau. En effet, en regardant dans des intervalles non chevauchants de 10 pb, nous avons trouvé une augmentation des positions SNV partagées avec le vieillissement qui a été renforcée par Polg D181A expression (Fig. 2b). Le chevauchement entre les animaux individuels était le plus important dans PVT et NAc (Fig. 2c). Comme Polg D181A expression a introduit un décalage de la distribution SNV vers le côté droit de la parcelle de distribution (c'est-à-dire vers la NCR) par rapport à WT (Fig. 2d), nous avons examiné où se trouvaient les SNV partagés. Nous avons constaté que les postes SNV partagés étaient significativement différents des postes SNV non partagés dans Polg D181A souris (t test, p < 1 × 10 −5 ) mais pas en WT (t test, p = 0,254) en regardant à travers tous les âges et décalée vers la région 3′ (c'est-à-dire vers la RCN) (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1a).

L'augmentation des SNV partagées s'est accompagnée d'une augmentation significative de la fréquence des SNV avec Polg D181A expression (Fig. 2e) qui était entraînée par des SNV à haute fréquence dans des régions d'ADNmt spécifiques (Fig. 2f). Ces régions sont apparues fortement dépendantes du contexte, c'est-à-dire des pics que l'on trouve dans tous les échantillons (« α » sur la figure 2f), uniquement chez les souris très âgées (« β »), ou sont Polg D181A -spécifique ("γ"). Cela a été imité dans le Pearson corrélation, où la plupart des régions cérébrales de 50 et 80 semaines Polg D181A les souris forment un groupe distinct et la plupart des échantillons de souris âgées de 10 semaines forment un groupe distinct (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1b) et nous avons trouvé un SNV spécifique points chauds chez des animaux de 10 semaines indépendamment du génotype (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1c). De plus, il y avait un chevauchement significatif des positions spécifiques auxquelles les SNV sont présents dans COR, NAc et PVT (les régions du cerveau les plus sensibles à Polg D181A expression) à 50 et 80 semaines dans Polg D181A souris (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1d, à droite). Pour les souris WT, le chevauchement n'est prononcé qu'à 80 semaines et p les valeurs n'atteignent pas des niveaux de signification similaires (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1d, à gauche).

Nous avons trouvé une augmentation des SNV dans les gènes NCR et complexe III (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1e), tandis que les transitions et transversions (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1f) étaient comparables à celles des études précédentes, et nous n'avons vu aucune indication de soit le vieillissement - soit Polg D181A -mutations oxydatives induites [19, 24], ainsi qu'aucun changement dans les types de mutations (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1g).

Ensemble, ces données ont démontré une dépendance au vieillissement spécifique à une région du cerveau Polg D181A -spectre SNV de l'ADNmt induit, où COR, NAc et PVT sont régionaux points chauds. De plus, certaines positions de l'ADNmt sont très sensibles aux SNV et semblent fonctionner comme des mutations dépendantes du contexte. points chauds.

Dépendant du vieillissement Polg D181A -les délétions induites s'accumulent dans les mêmes régions du cerveau que les SNV

Nous nous sommes ensuite penchés sur l'influence de Polg D181A expression sur l'accumulation de délétions. Nous avons trouvé une accumulation significative de délétions induite par le vieillissement chez les enfants de 50 et 80 ans par rapport aux enfants de 10 semaines. Polg D181A souris, mais nous n'avons observé aucune différence significative entre WT et Polg D181A à tout âge (Fig. 3a). Cependant, l'accumulation de délétions en réponse à Polg D181A a montré une spécificité régionale importante. Alors que CP, DR et SN Polg D181A Les niveaux de SNV n'étaient que légèrement élevés par rapport aux souris WT, COR, NAc et PVT ont montré une très forte accumulation de délétions à 50 et 80 semaines. Nous avons trouvé une différence significative dans les niveaux de délétion entre ces régions par rapport aux autres régions de Polg D181A lors du regroupement des données de souris de 50 et 80 semaines (p = 0,002, ANOVA à un facteur). Comme pour les SNV, nous n'avons trouvé aucune indication que les niveaux d'expression de la Polg D181A transgène étaient le principal moteur des niveaux de délétion dans le Polg D181A souris (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S5c).

Accumulation de délétions induites par Polg D181A l'expression sont spécifiques à la région du cerveau et dépendantes du vieillissement. une Dot plot illustrant l'augmentation en fonction de l'âge de la charge des SNV dans Polg D181A souris dans les régions cérébrales étudiées (comme indiqué par la légende des couleurs) normalisées à la moyenne des échantillons WT à 10 semaines. Les losanges gris indiquent la moyenne des échantillons de régions cérébrales dérivés de WT pour référence (comme sur la figure 1f). Les losanges rouges indiquent la moyenne de Polg D181A - des échantillons de régions cérébrales dérivés et l'intervalle de confiance à 95 % est indiqué. ANOVA à trois facteurs (âge, région et animal) de Polg D181A -les échantillons dérivés ont montré que l'âge contribuait de manière significative aux niveaux de délétion (p valeurs de post-hoc le test de Tukey sont montrés). p valeurs de l'ANOVA à trois facteurs (âge, génotype, région) avec post-hoc Les tests de Tukey sont présentés pour chaque groupe d'âge. Pour la contribution de la région, nous avons trouvé une contribution significative de COR, NAc et PVT aux niveaux de délétion dans Polg D181A souris utilisant un modèle linéaire pour les effets principaux. b Diagrammes d'accords indiquant les suppressions accumulées à 10, 50 et 80 semaines en DR et PVT de WT et Polg D181A souris. Les données sont normalisées pr. région du cerveau, et la largeur de chaque gène indique la fraction allélique additionnée des délétions couvrant le(s) gène(s) indiqué(s). La couleur de l'accord indique le gène dans lequel se trouve la position 5' du point de rupture. Les parcelles ont été faites en utilisant encercler

Les différences entre les régions du cerveau avec le vieillissement du WT et Polg D181A les souris peuvent être appréciées par des diagrammes d'accords montrant l'étendue de toutes les suppressions à chaque instant (Fig. 3b). Où la PVT a montré à la fois un effet induit par le vieillissement et un effet clairement dépendant du vieillissement Polg D181A - induite par l'accumulation de délétions, DR n'a montré qu'une accumulation de délétions induite par le vieillissement, mettant en évidence la sensibilité de l'ADNmt spécifique à une région du cerveau à un contexte d'instabilité de réplication. Pearson corrélation a indiqué des similitudes dans les suppressions trouvées avec le vieillissement de Polg D181A souris (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2a), indiquant que Polg D181A l'expression induit un paysage spécifique de délétions d'ADNmt.

Les délétions partagent des caractéristiques indépendantes du génotype

Les positions auxquelles les suppressions commencent et se terminent sont appelées points d'arrêt et sont basées sur les suppressions concomitantes entre les régions du cerveau de Polg D181A souris, nous avons émis l'hypothèse que les points de rupture doivent être partagés entre différents échantillons. Nous avons examiné des bacs de 100 pb le long de l'ADNmt et avons constaté que les points de rupture partagés se regroupent à des emplacements très distincts (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2b). Certains points de rupture partagés sont indépendants de l'âge et du génotype (

5 ko) tandis que d'autres sont génotypiques (

15 ko). Les tailles des suppressions elles-mêmes suivent une distribution bimodale indépendante de l'âge et du génotype et peuvent être grossièrement divisées en celles < 100 pb et celles > 1 kb, avec peu d'observations dans la plage intermédiaire (Fig. 4a). Même si le nombre de délétions chez les animaux de 10 semaines est faible, ils suivent toujours cette distribution, bien que la fraction de très petites délétions soit élevée par rapport aux animaux âgés.

Les caractéristiques des délétions changent avec l'âge, mais pas l'expression de Polg D181A . une Tracé de densité des tailles de suppression pour WT (gris) et Polg D181A (rouge) pour les souris 10- (ligne pointillée), 50- (ligne pointillée) et 80 semaines (ligne pleine). b La distance moyenne la plus courte entre les paires de points de rupture de délétion 5′ et 3′ à une paire de répétition directe dans le génome mitochondrial pour les délétions observées (couleur plus foncée) et une bibliothèque de longueurs de délétion générée aléatoirement in silico (couleur plus claire) pour les deux WT (à gauche , en gris) et Polg D181A (à droite, en rouge) en utilisant les données regroupées de tous les âges et régions du cerveau examinées pour chaque génotype. p valeurs de bilatéral t les tests sont affichés. c Aiguille score d'identité calculé dans une fenêtre de ± 10 pb aux points d'arrêt de la délétion 5′ et 3′ en fonction de la taille de la délétion après regroupement de WT et Polg D181A échantillons. La corrélation pour chaque âge est indiquée par les lignes pleines et les données de corrélation indiquées dans le même code couleur

Déterminants moléculaires des délétions

Une étude précédente a suggéré que la majorité des délétions d'ADNmt chez les patients atteints de la maladie de Parkinson se produisent lors de répétitions directes [17], une caractéristique proposée [25] bien que très débattue [26] des délétions d'ADNmt humain. Pour étudier l'influence des répétitions directes dans la formation de points d'arrêt dans le cerveau de souris, nous avons identifié des répétitions directes ≥ 8 pb dans l'ADNmt (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2c). Après avoir mis en commun les délétions par génotype, nous avons identifié la paire de répétitions directes avec la distance moyenne la plus courte des points de rupture 5′ et 3′ de WT et Polg D181A délétions ainsi que pour les bibliothèques de délétions générées in silico, de longueur de délétion adaptée pour chaque génotype (voir la section « Méthodes »). La distance moyenne la plus courte était plus courte pour les suppressions dérivées expérimentalement que pour les suppressions générées aléatoirement pour WT et Polg D181A souris (Fig. 4b), mais il n'y avait pas de différence entre WT et Polg D181A (t test, p = 0,905). Cela indique que les répétitions directes peuvent contribuer à au moins une partie des délétions identifiées. Nous avons constaté que c'était le cas à 10 et 50 semaines, mais pas à 80 semaines (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2d), car les suppressions sont significativement plus proches des répétitions directes que les bibliothèques de suppressions in silico pour WT et Polg D181A souris.

La restriction de la similarité de séquence aux répétitions directes est un critère rigoureux. Nous avons donc calculé les scores d'identité de séquence dans une fenêtre de 20 pb entourant tous les points de rupture 5' et 3' (c'est-à-dire 10 pb de chaque côté du point de rupture). Nous avons trouvé une corrélation négative entre le score d'identité de séquence et la longueur de délétion chez les enfants de 50 et 80 semaines. Polg D181A souris (Fig. 4c) et a en outre constaté une différence significative entre les scores d'identité des délétions < 100 pb et > 100 pb à 50 et 80 semaines Polg D181A ainsi que des souris WT (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2e). Ces données impliquent une contribution différentielle de la similarité des séquences répétées non directes aux délétions courtes et longues.

De nombreux multimères NCR sont exclusifs à Polg D181A -expression

Comme prévu, la couverture de séquençage présentait une certaine variabilité, probablement associée à une légère spécificité de séquence de la transposase utilisée pour la préparation de la bibliothèque [27,28,29]. Cependant, dans des régions cérébrales spécifiques des personnes de 50 et 80 semaines Polg D181A souris, nous avons observé une couverture accrue dans la région de 15 kb+ incluant au moins une partie de la NCR (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3a). On pense souvent que la couverture accrue localisée est associée à des régions dupliquées. L'ADN mitochondrial étant circulaire, il n'est pas possible de distinguer les petites duplications des délétions à très longue distance (VLRD) (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3b). Nous nous sommes donc demandé si nos données de délétions d'ADNmt pouvaient soutenir la présence de multimères. En classant les VLRD comme des délétions > 15 kb, nous avons constaté que les VLRD sont spécifiquement enrichis en NAc et PVT à partir de 50 et 80 semaines Polg D181A souris (Fig. 5a) et enrichi dans la région de 15 kb+ (Fig. 5b et fichier supplémentaire 1 : Fig. S3c), soutenant l'idée que les multimères d'ADNmt comprenant au moins une partie de la NCR s'accumulent dans une région du cerveau spécifique et Polg D181A -de manière dépendante avec l'âge. Nous avons également constaté une augmentation des lectures discordantes chez les enfants de 50 semaines Polg D181A souris, ce qui soutient en outre la présence de réarrangements génomiques tels que les multimères (Fig. 5c et fichier supplémentaire 1 : Fig. S3c).

Les multimères NCR putatifs sont Polg D181A -spécifiques et s'accumulent avec l'âge d'une manière hautement spécifique à la région du cerveau. une Diagramme de points illustrant l'augmentation en fonction de l'âge de la charge des VLRD dans Polg D181A souris dans les régions cérébrales étudiées (comme indiqué par la légende des couleurs). Tous les échantillons ont été normalisés à l'échantillon avec le plus petit nombre de variantes détectées. b Pourcentage cumulé de la position 5' des VLRD (c'est-à-dire la position de départ de la séquence multimérique putative) additionné dans les régions du cerveau pour WT (gris) et Polg D181A (rouge) pour les souris 10- (ligne pointillée), 50- (ligne pointillée) et 80 semaines (ligne pleine). c Nombre moyen de lectures discordantes extraites par samtools à 10, 50 et 80 semaines pour WT (gris) et Polg D181A (rouge) et l'écart type est indiqué. p valeurs de bilatéral t les tests sont affichés. Analyse résumée des points de rupture de l'ADNmt des VLRD de Polg D181A souris dans la RCN et la région environnante. Les points de rupture 5′ (violet) et 3′ (turquoise foncé) sont additionnés à chaque position dans toutes les régions du cerveau à 50 (gauche) ou 80 (droite) semaines, et des moyennes conditionnelles lisses sont tracées. Le panneau inférieur montre le phastCons score de conservation via le navigateur de génome UCSC dans la même région. p valeurs de bilatéral t les tests sont affichés. e Boxplot montrant la distance moyenne la plus courte à une répétition directe de tous Polg D181A VLRD séparés par la position VLRD 5′ en < 15 ko (bleu clair) ou > 15 ko (bleu foncé). p valeurs de bilatéral t les tests sont affichés. F Boxplot montrant le Aiguille score d'identité de WT et Polg D181A -les VLRD dérivés regroupés à travers les âges et les régions cérébrales examinées divisés en VLRD avec la position 3′ < 15 kb (bleu clair) et > 15 kb (bleu foncé). p valeurs de bilatéral Wilcoxon les tests sont montrés

Ces multimères putatifs semblent se former dans une région assez restreinte de l'ADNmt car leurs "points de rupture" 5' et 3' (indiquant respectivement la fin et le début de la séquence dupliquée), s'accumulent à des positions plutôt discrètes (Fig. 5d) couvrant un région avec un faible score de conservation parmi les mammifères (Fig. 5d, panneau du bas). Des données antérieures suggéraient la présence de multimères dans le cerveau de la souris mutante [16]. Nous avons utilisé la même approche PCR que Williams et al. et validé le Polg D181A -présence spécifique de multimères (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S4a, panneau haut et milieu). Une configuration PCR alternative qui ne donnerait un produit qu'en présence de multimères a confirmé ces résultats (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S4a, panneau du bas) et les données ultérieures ont également indiqué la présence d'inversions (Fichier supplémentaire 1 : Figs. S4b,c) .

Ensemble, ces données confirment la présence de facteurs de vieillissement induits par le vieillissement hautement spécifiques à une région du cerveau. Polg D181A multimères dépendants qui sont hautement spécifiques à un segment d'ADNmt contenant un NCR partiel spécifiquement dans NAc et PVT.

Les répétitions directes peuvent être impliquées dans la formation de multimères NCR

Les multimères peuvent être formés par plusieurs mécanismes. Un mécanisme est le glissement de brin pendant la réplication qui peut être influencé par l'environnement local entourant le NCR, qui est connu pour interagir avec la membrane mitochondriale interne [9]. Un autre mécanisme est médié par la séquence d'ADN entourant les positions de début et de fin de la région multimère. À l'appui de l'idée du glissement de brin, nous trouvons que les VLRD dans la région de 15 kb+ sont plus proches des répétitions directes par rapport aux multimères dans d'autres parties de l'ADNmt (Fig. 5e), bien que la similitude de séquence globale entourant les points de rupture ne soit pas différente (Fig. .5f). Les SNV ont été enrichis près des points de rupture VLRD 5′ ainsi que

7 kb en amont avec une distance moyenne de 75 ± 462 pb à la SNV la plus proche (Fichier complémentaire 1 : Fig. S5a). Quinze pour cent des points d'arrêt VLRD co-positionnent avec les SNV, un nombre qui n'est pas influencé par les lectures discordantes. Les SNV n'étaient pas enrichis dans la région multimérique putative (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S5b).

Le niveau d'expression du transgène n'entraîne pas de variantes

L'expression des transgènes n'est souvent pas similaire à travers les tissus, ce qui est également vrai pour Polg D181A expression [14]. Pour confirmer que les différences d'expression n'étaient pas à l'origine des différences que nous avons observées dans l'accumulation de mutations en réponse à Polg D181A expression, nous avons évalué les niveaux d'expression de Polg et transgénique Polg D181A . Surtout, nous nous sommes intéressés aux niveaux d'expression relatifs des deux transcrits, en tant qu'endogène et transgénique. Polg seront en compétition pour l'accès à l'ADNmt pendant la réplication. Comme présenté dans les sections précédentes, nous ne trouvons aucune corrélation entre les niveaux de mutation de l'ADNmt et Polg D181A /Polg niveaux à tout âge (Fichier complémentaire 1 : Fig. S5c). Ensemble, cela démontre que les niveaux d'expression du transgène n'étaient pas le principal moteur de la spécificité de la région du cerveau au déficit de relecture dans les mitochondries.

Les variants d'ADNmt se regroupent le long des régions génomiques

Tout au long de notre analyse du spectre de mutation de l'ADNmt de WT et Polg D181A souris, il est devenu de plus en plus clair que différents types de variants étaient souvent trouvés dans des régions spécifiques de l'ADNmt. Pour étudier plus avant cela, nous avons tracé toutes les variantes analysées - SNV, délétions, VLRD (c'est-à-dire multimères) - à travers l'ADNmt dans un tracé circulaire (Fig. 6a). L'inspection visuelle de cette parcelle a montré que différents types de variants s'enrichissent au voisinage les uns des autres. Nous avons trouvé une forte corrélation positive entre le SNV et la charge de délétion au niveau du gène qui est indépendante du vieillissement et du génotype (Fig. 6b), indiquant une sensibilité positionnelle à l'accumulation de mutations qui peut révéler une instabilité génomique sous-jacente dans des régions spécifiques ou être causée par structures d'ordre supérieur.

Les niveaux de différentes variantes sont corrélés entre les gènes d'ADNmt. une Variantes identifiées tracées sur la référence ADNmt pour WT (en haut) et Polg D181A (en bas) échantillons dans toutes les régions à 10, 50 et 80 semaines, comme indiqué. Pistes de l'extérieur vers l'intérieur : (1) les noms des gènes de l'ADNmt (notez que les noms des gènes de l'ARNt ne sont pas affichés), (2) les gènes de l'ADNmt par longueur, (3) le niveau relatif des VLRD (par exemple, les multimères et les inversions), (4) les SNV détectés dans toutes les régions avec une hauteur indiquant la fréquence des allèles transformée en log2, et (5) suppressions tracées sous forme de lignes connectées aux positions de début et de fin. Notez que les points de début et de fin des suppressions ne sont pas indiqués. b La charge de SNV et la délétion pour chaque gène d'ADNmt divisé par la longueur du gène sont tracées pour WT (gris) et Polg D181A (rouge) pour les souris de 10, 50 et 80 semaines. Les données ont été mises à l'échelle (de 0 à 1) avant d'être tracées pour plus de clarté. Pearson la corrélation et la signification de la corrélation sont indiquées sous chaque graphique pour WT (gris) et Polg D181A (rouge)


2. MATÉRIELS ET MÉTHODES

2.1 Modélisation de l'apport de carbone requis dans le sol

(1) où SOC est un vecteur de dimension 4 à quatre composantes, chaque composante faisant référence à la teneur en carbone organique dans l'un des quatre compartiments dynamiques du modèle RothC : le pool végétal résistant (RPM), le pool végétal décomposable (DPM), le pool microbien (BIO) et le pool humique (HUM). est un vecteur de dimension 4 qui représente les montants C incorporés dans les quatre pools dynamiques, et F est une matrice 4 × 4 représentant la minéralisation du COS et les flux de carbone entre les bassins. Le type de végétation influence la distribution des apports de C dans les bassins RPM et DPM, par conséquent, le rapport DPM:RPM dépend généralement du type de végétation. À RothC, quatre types de végétation sont considérés : les terres cultivées, les prairies améliorées, les prairies non améliorées et les forêts avec un rapport DPM:RPM de 1,44, 1,44, 0,67 et 0,25, respectivement. Pour un apport total de carbone et un taux de minéralisation donnés, l'utilisation des terres avec des valeurs inférieures du rapport DPM:RPM présentera des stocks totaux de COS plus élevés.

, appelé ci-après l'état d'équilibre ou d'équilibre, peut alors être facilement calculé et dépend des taux d'apport de carbone organique (CO) et de la F matrice: (2) où est la matrice identité de dimension 4 × 4 et est le vecteur des apports constants de carbone. Inversement, si les estimations de et exister, peut, à son tour, être estimée, en supposant que le sol a atteint l'équilibre et que les conditions climatiques sont constantes. Notez que SOC fait référence à SOC qui est soumis à la dynamique SOC. Pour le modèle RothC, ce SOC dynamique est une fraction du SOC total.

est le SOC total, qui peut être mesuré, et IOM le SOC inerte, qui est, selon RothC, constant dans le temps. L'IOM est généralement estimée à l'aide de la méthode Falloon et al. (1998) équation. L'équation (2) donne : (3)

Comme dans l'équation (1), est un vecteur de dimension 4. Dans un souci de simplicité, (et plus tard ) ci-après désigne les apports totaux de carbone dans le sol, c'est-à-dire la somme des quatre composantes de ce vecteur.

Dans la présente étude, nous avons utilisé le modèle RothC pour estimer (i) les entrées de COS qui seraient nécessaires pour maintenir les stocks de COS actuels, en supposant qu'ils sont à l'état d'équilibre et (ii) l'augmentation des entrées de COS nécessaires pour atteindre les stocks de COS. dans 30 ans, en supposant un taux d'augmentation annuel constant de 4 du COS. A noter que l'hypothèse de régime permanent n'est étayée par aucune donnée car un jeu de données robuste n'est pas encore disponible pour la France métropolitaine. Elle a été testée à un stade ultérieur de nos travaux lorsque nous avons comparé les niveaux d'apport de carbone estimés par RothC sous cette hypothèse et les niveaux de NPP obtenus indépendamment de RothC (voir Section 2.3).

  1. Calculer le SOC 0 comme (Falloon et al., 1998 )
  2. Utilisation des équations (2) et (3)
    1. Diviser parmi , , et
    2. Calculer nécessaire pour faire observer
    L'étape 4 a été réalisée à l'aide d'un algorithme d'optimisation d'évolution différentielle (Ardia et al., 2016). Du estimation, l'augmentation de l'entrée de COS a été calculée comme (4)

    De plus, pour évaluer l'effet du changement climatique sur les apports de COS nécessaires pour maintenir ou augmenter les stocks de COS, RothC a été exécuté avec deux ensembles de données climatiques : des données observées (1980-2010) et des données simulées prenant en compte le changement climatique (RCP 8.5). Ce scénario a été sélectionné car il prédit la plus forte augmentation de la température et du CO cumulé2 émissions, avec des conséquences potentiellement importantes sur la dynamique du COS qui est affectée à la fois par l'augmentation de la température et l'augmentation des apports de C dus au CO2 effet de fertilisation (Meinshausen et al., 2011 Wieder et al., 2015 ). De plus, Schwalm et al. ( 2020 ) a montré que, au milieu du siècle et avant, le RCP 8.5 est clairement le choix le plus utile : il est cohérent avec les émissions cumulées totales historiques pour la période actuelle, et compte tenu des politiques actuelles et déclarées, il donne les émissions cumulées les plus plausibles pour la période 2030-2050. Les résultats pour les conditions climatiques observées de 1980 à 2010 sont d'abord présentés, et ceux du scénario RCP 8.5 (1980 à 2010 et 2020 à 2050) sont ensuite utilisés pour discuter de l'effet du changement climatique.

    Le modèle RothC a été implémenté dans le package RothC R (Martin, 2018 ), les opérations SIG à l'aide du logiciel GRASS GIS (GRASS Development Team, 2018 ) et l'analyse statistique à l'aide du logiciel R (R Core Team, 2015 ).

    2.2 Données pour l'estimation de avec RothC

    RothC a besoin de plusieurs variables d'entrée pour simuler la dynamique du carbone et la minéralisation du COS. La minéralisation du COS est fonction de la teneur en argile du sol (qui détermine la stabilisation du COS dans les différents bassins et l'humidité du sol), la température, les précipitations, l'évapotranspiration potentielle et la couverture du sol (nu ou couvert). La couverture du sol entraîne la minéralisation à la fois directement et indirectement par la teneur en humidité du sol. La température détermine directement la minéralisation, et les précipitations et l'évapotranspiration potentielle entraînent indirectement la minéralisation par le biais de la teneur en eau du sol. De plus, dans notre cadre, nous avions besoin de cartes du COS dans les 23 cm supérieurs du sol (car RothC est paramétré pour modéliser les stocks de COS dans la couche de sol de 0 à 23 cm) comme entrées pour l'équation (3), et la part du C total entre résidus végétaux et fertilisation organique puisque ces deux catégories d'apports en C sont caractérisées par des paramètres spécifiques.

    2.2.1 Données du sol

    Nous avons utilisé les données des produits GlobalSoilMap récemment produits pour la France (Mulder et al., 2016), à la fois pour l'argile et le COS. Les produits GlobalSoilMap fournissent des estimations pour, entre autres, les couches de profondeur 0-5, 5-15, 15-30 cm à une résolution de 90 m pour la France. Les ensembles de données sur l'argile et le COS ont été agrégés à la couche 0-23 cm en utilisant des moyennes pondérées des estimations pour les couches GlobalSoilMap. Les stocks de COS ont été calculés en supposant une teneur en fragments de roche constante (2 %) et en estimant la densité apparente avec une fonction de pédotransfert (voir Meersmans et al., 2012 pour plus de détails). Pour les sols français, les estimations GSM de la densité apparente ne sont pas encore disponibles principalement en raison de la rareté des données et des problèmes liés aux méthodes de mesure. Il en va de même pour le contenu en fragments de roche. Les estimations de la profondeur du sol (Lacoste et al., 2016) ont été utilisées pour tronquer les profils de sol sur les pixels. Par exemple, lorsque la profondeur du sol est inférieur à 23 cm, les stocks sont calculés sur 0- cm au lieu de 0–23 cm. Tous les calculs ont d'abord été effectués sur une grille de résolution de 90 m, puis agrégés sur une grille de résolution de 1 km. Tous les travaux ultérieurs ont été effectués sur cette grille de résolution de 1 km pour réduire le temps de calcul. Une résolution plus fine n'a pas été nécessaire pour notre étude, car les cartes produites n'ont été utilisées que pour analyser les tendances régionales et nationales.

    2.2.2 Données climatiques

    Les précipitations mensuelles (mm mois −1 ), l'évapotranspiration de référence (PET, mm mois −1 ) et la température (moyennes mensuelles, en degrés Celsius) ont été moyennées sur la période 1980-2010 à partir de la réanalyse française SAFRAN afin d'obtenir une année de référence représentant climat actuel en France sur 8 × 8 km 2 pixels (Quintana-Segui et al., 2008 ). La TEP a été calculée à l'aide de la méthode FAO Penman-Monteith (Allen et al., 1998 ). Les données des projections climatiques sont issues du modèle climatique français ALADIN (CNRM-CM5/CNRM-ALADIN53) pour le CO2 scénario de concentration RCP 8.5. Les projections climatiques ont été débiaisées avec la réanalyse SAFRAN sur chaque pixel en utilisant une méthode de réduction d'échelle statistique basée sur une approche de cartographie quantile. Le PET a à nouveau été calculé avec des données climatiques réduites (température, humidité relative, rayonnement solaire et vitesse du vent).

    2.2.3 Couverture terrestre

    La couverture terrestre a été estimée à l'aide des données écoclimatiques (Faroux et al., 2013 ), à une résolution de 1 km (voir Figure 1 Informations à l'appui S1). Les prévisions de l'écoclimat ont été regroupées en quatre catégories principales (c'est-à-dire les terres cultivées, les prairies, les forêts et autres). Les simulations n'ont été effectuées que sur des terres cultivées, des prairies permanentes et des forêts. Nous avons distingué les prairies permanentes améliorées des prairies permanentes non améliorées en utilisant les données sur les types de prairies d'une étude précédente (Tibi & Therond, 2018), qui s'appuyait sur une classification proposée par Devun et Legarto ( 2011 ).

    2.2.4 Scénario de gestion et de données d'entrée pour RothC

    Lorsqu'il est exécuté en mode inverse, c'est-à-dire afin d'estimer les niveaux d'apport de carbone requis pour atteindre un niveau de COS donné, RothC n'a besoin que de deux données d'entrée liées à la gestion. Le premier est le nombre de mois pendant lesquels les sols sont laissés nus. Cette variable d'entrée, applicable uniquement pour les terres cultivées, a été fixée à 4 mois sauf lorsque les sols appartenaient à des zones vulnérables aux nitrates où elle a été fixée à 2 mois puisque les cultures de couverture sont obligatoires dans ces zones. La deuxième variable d'entrée est la proportion d'apports de carbone dans le sol qui se compose d'amendements organiques. Les apports d'OC dans le sol sont principalement le résultat de résidus végétaux et d'ajouts de fumier animal et d'autres produits organiques (ci-après dénommés amendements organiques). A RothC, le devenir du carbone apporté par les résidus végétaux et les amendements organiques est spécifique, reflétant leur différence en termes de décomposabilité. Par conséquent, afin d'utiliser RothC avec le cadre présenté ci-dessus, pour estimer la quantité d'apport de C nécessaire pour maintenir un stock de carbone donné, ou pour l'augmenter, il faut décider de la part entre les résidus végétaux et les amendements organiques dans les apports de C. Cette proportion était donc prescrite, sur la base d'études antérieures l'ayant estimée à l'échelle régionale pour la France (Tibi & Therond, 2018 ). Par ailleurs, nous avons considéré que le seul type d'amendement organique était le fumier de ferme, pour lequel RothC fournit une composition par défaut et qui représente environ 60 % des amendements organiques épandus sur les sols agricoles en France (Houot et al., 2014). Dans RothC, le CO de cette matière organique est réparti entre les pools RPM, DPM et HUM dans les proportions suivantes : 49 %, 49 % et 2 %. Bien qu'une autre paramétrisation ait été proposée pour RothC (Peltre et al., 2012), avec une fraction HUM plus élevée pour les amendements organiques, sa prise en compte n'était pas possible car les données spatiales sur la nature des amendements organiques n'étaient pas disponibles pour notre étude. Les amendements organiques n'étaient autorisés que sur les terres cultivées et les prairies, pas sur les forêts. Nous avons également considéré qu'une augmentation des apports totaux de CO pendant la période de stockage de carbone 4‰ (c'est-à-dire entre t0 et t0 + 30 ans) n'a été possible que par une augmentation des apports de résidus végétaux, et non par des accroissements d'amendements organiques. En France métropolitaine, tous les déjections animales sont déjà épandues sur les sols agricoles de sorte qu'il n'est pas possible d'augmenter la disponibilité de cette ressource (Houot et al., 2014). De plus, en raison de la faible acceptabilité sociale de l'épandage de produits organiques urbains et industriels, il est peu probable que l'on augmente la quantité épandue sur les sols agricoles. Notez que d'autres informations sur les pratiques de gestion dans les terres cultivées, les prairies et les forêts ont été utilisées dans cette étude, mais à une étape ultérieure du processus, c'est-à-dire pour estimer indépendamment de RothC la centrale nucléaire disponible s'écoulant dans le sol (voir également la figure 1), qui est présenté dans la section suivante.

    2.3 Bilan carbone des centrales nucléaires et des écosystèmes disponibles

    (5) où NPP est la productivité primaire nette, est la quantité de centrale nucléaire allouée pour augmenter la biomasse végétale, sont des exportations dues à l'activité humaine, le carbone renvoyé par les déjections animales et l'épandage de fumier, et est la proportion des apports de C totaux dans les sols alloués à la seule couche de sol 0-23 cm (qui est la couche considérée par le modèle RothC, et qui correspond, pour la France, à la profondeur moyenne de la couche de labour Arrouays et al., 2001). a été dérivée d'estimations récemment publiées des débits souterrains des centrales nucléaires (Balesdent et al., 2018 ), en fonction de l'utilisation des terres, de la teneur en argile, de la température annuelle moyenne et du rapport moyen des précipitations annuelles à l'évapotranspiration potentielle. Pour les prairies et les terres cultivées, a été supposée égale à 0 étant donné que, sur la base d'une moyenne annuelle, la quantité de carbone dans la biomasse végétale aérienne et souterraine reste constante à long terme, contrairement aux systèmes forestiers non matures. Nous avons défini le bilan carbone d'un sol donné comme la différence entre les NPP disponibles s'écoulant vers la couche de sol considérée () et l'apport de carbone du sol (), tel qu'estimé avec le modèle RothC, était nécessaire pour maintenir les niveaux de COS actuels ou pour atteindre les stocks de COS cibles de 4‰. (6) avec égal à ou (voir la section 2.1 sur le cadre de modélisation), ce qui donne, respectivement, et .

    Centrale nucléairele surf et ont été évalués avec des méthodes et des sources de données distinctes, et le calcul de l'équilibre entre eux a abordé la question suivante : l'apport de carbone dans les sols est-il nécessaire pour maintenir les stocks actuels ou pour atteindre l'objectif 4‰ disponible ? La figure 2 résume cette approche basée sur une comparaison entre l'apport de carbone requis, représenté par le variable, et l'apport de carbone disponible est représenté par la centrale nucléairele surf variable, estimée ici à partir de données sur la productivité des plantes et les activités humaines. Étudier le signe de peut conduire à des conclusions différentes selon l'hypothèse de la stationnarité des stocks de COS. Si diffère de zéro, l'hypothèse de régime permanent n'est actuellement pas valide. indique que n'est pas suffisant pour maintenir les stocks de COS existants qui sont sur une tendance à la baisse. Si , les stocks de COS pourraient suivre une tendance à la hausse. Alternativement, lorsque RothC est utilisé pour calculer , c'est-à-dire le carbone nécessaire pour atteindre l'objectif 4 après 30 ans, négatif les valeurs indiquent que, compte tenu des niveaux des centrales nucléaires et de l'activité humaine, il n'y a effectivement pas assez de carbone pour atteindre cet objectif. Des valeurs positives indiquent que des cibles plus élevées pourraient, en effet, être atteintes. Noter que les calculs ont été effectués à l'aide d'une base de données actuelle, donc basée sur la productivité actuelle des plantes et les systèmes agricoles et forestiers existants. De plus, le cadre proposé ignore certains des flux relativement mineurs qui entraînent des entrées et des sorties de C. Ceux-ci incluent l'érosion, les incendies, la lixiviation du carbone organique dissous, les émissions de méthane et les émissions de carbone organique volatil (voir Soussana et al., 2019 pour une comptabilité complète de ces composants). Ce choix a été fait en raison des données disponibles et dans un souci de simplicité. Cependant, comme tous ces flux entraînent des pertes de COS, cela pourrait induire une surestimation globale des bilans carbone proposés ici. RothC lui-même ne représente pas certains flux de sortie, y compris le transport vertical dans la couche profonde dû à la bioturbation ou à l'advection ou le transport latéral dû à l'érosion. Cela peut également contribuer à une surestimation du bilan carbone mais ces flux non représentés sont considérés comme de second ordre par rapport à la respiration hétérotrophe (Jagercikova et al., 2014 Naipal et al., 2018 Warner et al., 2019) et sont particulièrement difficiles à modèle à l'échelle régionale.

    Schéma de l'approche proposée. Les principales variables d'entrée sont les stocks actuels de carbone organique du sol (), productivité primaire nette disponible () et la teneur en argile. Deux cas sont envisagés. Le premier traite des stocks de SOC actuels et le second de l'objectif 4‰. Les deux bilans carbone (, équation 6) et le déficit de saturation en carbone (, équation 7) sont utilisées pour évaluer l'état des stocks actuels de COS et la faisabilité de l'objectif 4‰. Notez que la variable d'entrée sol argileux est utilisée pour les calculs RothC pour les deux et . L'hypothèse de régime permanent permet d'estimer en utilisant l'équation (3), dont le membre de droite est appelé ici par souci de concision. Les tendances attendues des stocks actuels et la faisabilité des 4 ne tiennent pas compte des changements futurs possibles des taux de minéralisation du COS

    Plusieurs ensembles de données ont été combinés pour produire des estimations spatiales de , , et sur notre grille de 1 km × 1 km, en fonction de l'utilisation des terres des cellules de la grille. La comparaison des résultats produits par les différentes sources de données d'entrée a ensuite été utilisée pour discuter de l'incertitude de nos résultats. Ces ensembles de données comprenaient des estimations de NPP dérivées de MODIS pour la période 2001-2012 (Zhao et al., 2005 ), NPP et son appropriation humaine pour l'année 2006 (Plutzar et al., 2016 , en utilisant le modèle LPJml pour les forêts et les prairies et un modèle basé sur les statistiques régionales de rendement des terres cultivées). LPJml est un modèle global (GM), ce qui signifie que bien qu'il rende compte des variations de productivité des plantes, dans les zones aménagées et non aménagées, il le fait moins spécifiquement que les modèles de domaine (DM), par exemple, les modèles dédiés aux prairies et aux terres cultivées. Les données d'inventaires français ont été utilisées pour estimer l'appropriation humaine en forêt (IGN, 2018). Données de NPP et d'appropriation humaine issues de simulations précédentes (Tibi & Therond, 2018 ) avec les modèles de domaine STICS (un modèle de culture, Brisson et al., 1998 , 2003 ) et PASIM (un modèle de simulation de pâturage, Riedo et al., 1998 ) ont également été utilisés. Enfin, pour le variable, nous avons utilisé des données issues d'inventaires nationaux pour estimer la fertilisation organique (Tibi & Therond, 2018 ). La manière dont les différentes sources de données ont été combinées en fonction de l'utilisation des terres est détaillée dans le tableau 1 des informations à l'appui S1.

    2.4 Estimations des niveaux de saturation du COS et du déficit de saturation

    Plusieurs études ont évalué le potentiel de séquestration du C ou le déficit de saturation du C (c'est-à-dire un COS supplémentaire qui peut être stabilisé dans la fraction fine) à travers différentes utilisations des terres (terres cultivées, prairies, forêts) dans une large mesure (Angers et al., 2011 Chen et al., 2018 Wiesmeier, Hübner, Spörlein, et al., 2014 ). Nous avons estimé le niveau de saturation du COS () basé sur les concentrations de fractions minérales fines et appliqué l'équation proposée par Hassink ( 1997 ). La teneur en fraction fine comprend la particule de taille <20 um (%). Pour estimer les fractions de limon fin (2-20 m) pour chacune de nos cellules de grille de 1 km × 1 km, nous avons combiné les prédictions GlobalSoilMap d'argile (<2 m) avec des estimations du rapport argile:limon fin basées sur les données du réseau français de surveillance des sols ( Réseau de Mesures de la Qualité des Sols : RMQS, Jolivet et al., 2006 ). La somme des fractions d'argile et de limon fin a ensuite été utilisée dans l'équation de Hassink pour estimer les niveaux de saturation du COS. À partir de la teneur en COS à saturation, le stock de COS à saturation a été estimé en utilisant la même méthode que celle expliquée précédemment pour les prédictions basées sur la teneur en COS de GobalSoilMap. Le déficit de saturation du COS a ensuite été estimé à (7) où (Mg ha −1 ) est le stock de COS à saturation et et sont le stock de SOC dans les pools HUM et IOM tel que prévu par RothC pour le stock de SOC actuel. Ce faisant, nous avons supposé que les pools RPM et DPM de RothC sont les mêmes que la matière organique particulaire, par définition non inclus dans la matière organique du sol liée à la fraction fine (Stewart et al., 2007 ), et en outre, nous avons supposé que le carbone dans le pool BIO était négligeable par rapport à celui des pools HUM et IOM.

    2.5 Analyse d'incertitude

    Notre analyse d'incertitude a consisté à estimer la variance du bilan carbone 4 () et du déficit de saturation (). Nous avons inclus toutes les variables et tous les paramètres utilisés dans leur calcul et pour lesquels des informations sur la variance étaient disponibles. Nous avons utilisé les estimations d'incertitude des estimations d'argile et de COS attachées aux données GlobalSoilMap. Bien que l'incertitude liée aux produits de la centrale nucléaire n'était pas disponible, nous avons explicitement inclus dans l'analyse la variance résultant de l'utilisation de différentes sources de données de la centrale nucléaire. Cet écart a été considéré comme représentatif de l'incertitude associée à la connaissance actuelle des niveaux des centrales nucléaires. Nous avons également inclus l'incertitude liée aux paramètres lorsqu'elle était disponible, c'est-à-dire pour les paramètres de la ple surf (Balesdent et al., 2018 ), pour les paramètres de la fonction utilisée pour estimer la quantité de carbone organique inerte (Falloon et al., 1998 ) et pour les paramètres de l'équation utilisée pour estimer le déficit de saturation en carbone (Hassink, 1997). La propagation de l'incertitude attachée à ces variables et paramètres d'entrée a été basée sur une formulation analytique de et , en profitant, entre autres, de la simplicité du modèle RothC et de la disponibilité de solutions explicites de l'équation (1) (voir Informations complémentaires S3). Nous avons appliqué une analyse de Taylor du premier ordre pour calculer la variance des fonctions intermédiaires de et , une approche qui était auparavant appliquée en sciences du sol (Heuvelink et al., 1989 Román Dobarco et al., 2019 ). L'utilisation de l'analyse de Taylor permet d'approximer la variance de toute fonction continuellement différentiable d'un ensemble de variables ou de paramètres. Cette approche présente l'avantage majeur de réduire le temps de calcul (par rapport aux approches Monte-Carlo) et de faciliter l'identification des différentes sources d'incertitude. Les détails de notre procédure sont présentés dans les informations à l'appui S2.


    Résultats

    Reproductibilité de mesures uniques répétées

    Il n'y avait pas de différences absolues ou relatives systématiques dans VO2 et HR entre la première et la deuxième mesure en laboratoire (tableau 3).

    Positionnement des cadences de travail pour le HR-VO2 relations au laboratoire

    Les trois taux de travail sous-maximaux, utilisés dans les deux modèles de HR-VO2 équations de régression, induit des niveaux moyens de FC allant en moyenne de 97 ± 8 à 139 ± 18 battements par minute pour les mâles, et de 98 ± 8 à 150 ± 10 pour les femelles (tableau 3). Pour la FC maximale et d'autres aspects descriptifs des cadences de travail utilisées, voir les tableaux 3 et 4.

    Niveaux de FC du vélo de banlieue utilisés pour estimer les niveaux de VO2

    Les valeurs moyennes des segments de fréquence cardiaque les plus bas, intermédiaires et les plus élevés de 20 % pendant le trajet domicile-travail et leurs valeurs de FC moyennes sont décrites dans le tableau 5.

    Les niveaux correspondants de pourcentage de réserve de fréquence cardiaque et de pourcentage de FCmax sont également donnés (moyenne ± SD).

    Les niveaux moyens de tous les RH (non représentés) étaient quelque peu inférieurs au 1/5 intermédiaire du RH commandé par la taille. En effet, le 1/5 le plus bas de la FC est clairement plus éloigné du 1/5 intermédiaire que la distance du 1/5 le plus élevé de la FC.

    Reproductibilité du HR-VO2 équations de régression et niveaux estimés de VO2 (modèle 1)

    Le test et retest HR-VO2 les équations de régression et les niveaux estimés d'absorption d'oxygène à partir de trois niveaux de FC sont présentés dans les tableaux 6 et 7. Il y avait une tendance à une diminution de l'ordonnée à l'origine et une plus grande pente dans les équations de régression au retest par rapport au test (tableau 6) . Sur la base des calculs de tous les sujets, il n'y avait pas de différences systématiques dans les niveaux absolus estimés de VO2 entre test et retest. Les différences relatives entre le test et le retest étaient de 0,99 ± 11,0 (n.s.), 2,67 ± 6,48 (p<0,1) et 3,57 ± 6,24 % (p<0,05) sur la base des estimations des niveaux de FC les plus bas aux plus élevés (tableau 7). Les données individuelles de tous les tableaux (tableaux 6 à 11) liées aux évaluations de la HR-VO2 les relations sont données en tant qu'informations à l'appui des résultats S1. Les limites d'accord à 95% pour les variations individuelles des différences de VO estimées2 entre le test et le retest variait entre -0,3155 et 0,2923) (L · min -1 ) pour la FC basse, -0,3922 et 0,2764 pour la FC moyenne, et -0,4735 et 0,3029 pour la FC élevée (Fig 2).

    Les axes y montrent les différences absolues de VO2 contre les valeurs moyennes des estimations des mesures répétées sur les abscisses.

    Reproductibilité du HR-VO2 équations de régression et niveaux estimés de VO2 (modèle 2)

    Le test et retest HR-VO2 les équations de régression et les niveaux estimés d'absorption d'oxygène à partir de trois niveaux de FC sont présentés dans les tableaux 8 et 9. Il n'y avait pas de différences significatives entre le test et le retest dans les constituants des équations de régression (ordonnée à l'origine, pente et valeur r) (tableau 8). Sur la base des calculs de tous les sujets, il n'y avait pas de différences systématiques dans les niveaux absolus estimés d'absorption d'oxygène entre le test et le retest. Les différences relatives entre le test et le retest, basées sur des estimations de trois niveaux différents de HR, étaient de 1,09 ± 10,6, 1,75 ± 6,43 et 2,12 ± 5,92 % (tous n.s.) (tableau 9). Les limites d'accord à 95% pour les variations individuelles des différences de VO estimées2 entre le test et le retest variait entre -0,2894 et 0,2684)(L · min -1 ) pour la FC basse, -0,3233 et 0,2539 pour la FC moyenne, et -0,3649 et 0,2722 pour la FC élevée (Fig 3).

    Les axes y montrent les différences absolues de VO2 contre les valeurs moyennes des estimations des mesures répétées sur les abscisses.

    Comparaisons dans les équations de régression et VO estimée2 entre le HR-VO2 relations dans les modèles 1 et 2

    Les différences entre les deux HR-VO2 modèles dans l'ordonnée à l'origine, la pente, la valeur r ainsi que dans les trois niveaux de VO estimé2 au test et au retest ont été comparés pour tous les sujets (tableaux 10 et 11). Toutes les différences entre les modèles étaient faibles et non significatives. Les différences absolues et relatives moyennes de VO2 variait de 0,00 ± 0,04 à -0,04 ± 0,10 litre/min (toutes n.s.) et de 0,10 ± 3,39 à -1,46 ± 3,30 % (toutes n.s.), respectivement.


    ZONE D'ÉTUDE

    La zone d'étude était située dans le parc naturel d'El Estrecho, à Tarifa (sud de l'Espagne) sur la rive nord du détroit de Gibraltar (Fig. 1 36°07′−36°06′N, 5°45′−5° 46′W). Cette zone était la zone protégée la plus méridionale d'Europe. C'était un parc maritime-terrestre le long de 54 km de côtes en Andalousie et une zone importante pour les oiseaux (Guerra García et al. 2009 , BirdLife International 2017 ). Dans ce domaine, Ferrer et al. ( 2012 ) ont signalé les taux de collision les plus élevés jamais publiés pour les oiseaux (1,33/turbine/an), le vautour fauve étant l'espèce la plus fréquemment tuée (0,41 décès/turbine/an). Il y avait plusieurs colonies de vautours fauves dans la région, composées d'environ 320 couples nicheurs au total. Nous nous sommes concentrés sur une colonie sur un escarpement orienté nord-sud, à 4 km du détroit de Gibraltar avec environ 65 couples reproducteurs (Del Moral 2009 ). Notre analyse a été limitée à l'espace utilisé par un vautour fauve marqué, l'espace englobait une superficie de 152 km 2 et comprenait 20 parcs éoliens avec 269 éoliennes opérationnelles (tableau 1).

    Modèle Couleur sur la Fig. 1 Nombre de turbines Hauteur du moyeu Longueur de la lame Hauteur totale
    ECOTECNIA ECO-74 34 70 35.5 105.5
    ENERCON E-70 20 84 33.5 117.5
    GAMESA G-80 30 67 40.0 107.0
    GAMESA G-87 11 78 42.3 120.3
    FAIT AE-56 43 60 27.3 87.3
    FAIT AE-59 55 60 28.8 88.8
    VESTAS V-72 4 78 36.0 114.0
    VESTAS V-80 6 78 40.0 118.0
    VESTAS V-90 66 80 44.0 124.0

    2 FLUX DE TRAVAIL DE NETTOYAGE ET D'INTÉGRATION DES DONNÉES

    Comme décrit par 2016, Enquist et al. (2016, en préparation), la génération de la base de données BIEN consiste en un flux de travail lié qui (1) normalise la taxonomie en corrigeant l'orthographe des noms d'espèces et en mettant à jour les synonymes des noms actuellement acceptés via le Taxonomic Name Resolution Service ou TNRS (Boyle et al ., 2013 ) (2) détecte et signale les observations avec des coordonnées géographiques erronées et (3) signale les cultivars et les espèces non indigènes via le Native Species Resolver (http://bien.nceas.ucsb.edu/bien/tools/nsr/ ). Les coordonnées étaient signalées comme erronées si elles se situaient en dehors des régions politiques spécifiées, si la latitude était exactement de 0 ou 90 degrés, la longitude était exactement de 0 ou 180 degrés, ou si le point tombait dans l'océan. La détection des cultivars et des enregistrements non indigènes repose sur des listes d'espèces indigènes, qui ne sont pas disponibles dans tout le Nouveau Monde, de sorte que cette filtration est imparfaite.

    Des cartes de répartition ont été construites pour chaque espèce en utilisant une méthode déterminée par le nombre d'observations de cette espèce. Une espèce avec un seul enregistrement s'est vu attribuer une aire de répartition qui ne comprenait que la cellule de 100 km 2 où elle a été trouvée. Les aires de répartition des espèces avec 2 à 3 mentions étaient des cadres de délimitation rectangulaires avec les limites fixées par la latitude et la longitude minimales et maximales de toutes les occurrences. Les aires de répartition des espèces avec 4 à 9 enregistrements ont été construites avec des enveloppes convexes (le polygone d'ajustement minimum qui englobe toutes les occurrences de cette espèce). Pour les espèces avec des enregistrements >9, nous avons construit des modèles de distribution des espèces en utilisant l'algorithme de Maxent (Phillips, Anderson, & Schapire, 2006). Un seul enregistrement d'occurrence par cellule (en cas d'enregistrements multiples) a été utilisé pour la construction du modèle Maxent. La construction du modèle Maxent a généralement suivi les recommandations décrites dans (Merow, Cory, & Silander, 2014 Merow, Cory, Smith, & Silander, 2013). Les paramètres du modèle ont été choisis pour équilibrer le surajustement, qui sous-estime les tailles des plages, avec le sous-ajustement, ce qui entraîne des modèles excessivement lisses qui surprédisent la taille des plages. Seules les fonctionnalités linéaires, quadratiques et produit ont été utilisées et la régularisation a été définie sur la valeur par défaut.

    Les prédicteurs environnementaux pour les SDM ont été obtenus à partir des données climatiques du courant WorldClim (1960-1990) à une résolution de 10 minutes d'arc (Hijmans, Cameron, Parra, Jones et Jarvis, 2005) et rééchantillonnés à une résolution de 10 km. Les prédicteurs comprenaient la température annuelle moyenne, la plage de température diurne moyenne, les précipitations annuelles, la saisonnalité des précipitations, les précipitations dans le trimestre le plus chaud/(précipitations dans le trimestre le plus chaud + précipitations dans le trimestre le plus froid) et cinq vecteurs propres spatiaux (De Marco, Diniz-Filho et Bini, 2008 ). Les vecteurs propres spatiaux capturaient essentiellement les différences régionales d'occurrence à grande échelle et servaient principalement de limitation de la dispersion à grande échelle des aires de répartition des espèces, limitant les prédictions loin dans l'espace géographique des lieux de présence (Blach-Overgaard, Svenning, Dransfield, Greve et Balslev, 2010) .

    Les prédictions continues de Maxent ont été converties en prédictions binaires de présence/absence en choisissant un seuil basé sur le 75e centile de la sortie cumulée.

    Nous avons construit une phylogénie de 18 641 espèces sur la base d'une liste standardisée d'espèces du Nouveau Monde et des régions de gènes atpB-rbcL, ndhF, psbA, psbA-psbH, rbcL et trnT-trnL-trnF, en utilisant le logiciel PHLAWD (Smith, Beaulieu , & Donoghue, 2009 ). La phylogénie a été construite avec RAxML (7.3.0 Stamatakis, 2006) avec une recherche ML sans contrainte et les temps de divergence ont été estimés en utilisant la vraisemblance pénalisée et le progiciel tree PL (Smith & O'Meara, 2012). Des détails supplémentaires sur la méthodologie utilisée pour extraire ces données de GenBank et les aligner sont présentés dans Hinchliff et Smith (2014). Sur cette phylogénie, nous avons greffé les taxons supplémentaires de l'ensemble de données BIEN en utilisant la taxonomie (appartenance au genre) comme guide pour les autres c. 72 000 espèces. Ce greffage a été répété pour créer un ensemble de 100 phylogénies pour tenir compte de l'incertitude dans le placement des espèces sans information génétique. Des informations complémentaires sur les phylogénies BIEN sont disponibles en ligne (http://bien.nceas.ucsb.edu/bien/biendata/bien-2/phylogeny/).


    3. RÉSULTATS

    3.1 Le PRF maintient la viabilité et augmente la prolifération des macrophages

    Pour étudier l'impact des extraits solubles des membranes PRF sur la viabilité cellulaire, un essai MTT reflétant la production de formazan NAD(P)H-dépendante a été réalisé. Les concentrations inférieures à 10 % de PRF ont notamment augmenté la production de formazan dans les macrophages primaires et les cellules RAW264.7 (figure 1A). En outre, 30 % de lysats de PRF n'ont pas affecté la viabilité des cellules de moelle osseuse murines fraîchement isolées (données non présentées). La viabilité cellulaire a en outre été confirmée par une coloration des morts-vivants dans les cellules RAW264.7 (figure 1B). De plus, le PRF a encore amélioré l'incorporation de BrdU, indiquant une prolifération accrue de cellules RAW264.7 (voir le tableau d'informations complémentaires 2 en ligne Journal de parodontologie). De plus, le PRF avait tendance à réduire les niveaux d'expression de Bax pro-apoptotique et de la caspase-3 ainsi que le gène marqueur anti-apoptotique du lymphome à cellules B-2 (BCL2L1) (voir le Tableau 3 des informations complémentaires en ligne Journal de parodontologie). Cette tendance a été renforcée par l'exposition des cellules RAW264.7 à 30 % de PRF. Les lysats de PRF ont supprimé les niveaux basaux de caspase-3 clivée (voir la figure supplémentaire 1 dans en ligne Journal de parodontologie) et a provoqué une faible réduction de l'activité de la caspase-3 (voir les informations complémentaires Figure 1 dans en ligne Journal de parodontologie). Dans l'ensemble, ces résultats révèlent que les extraits solubles des membranes PRF maintiennent la viabilité et augmentent la prolifération des macrophages primaires.

    3.2 Le PRF réduit l'expression de TRAP et de Cathepsine K

    Pour déterminer la condition expérimentale la plus appropriée, nous avons évalué l'effet de diverses concentrations de PRF sur l'expression des gènes. Des cellules de moelle osseuse murines ont été incubées avec différentes concentrations d'extraits solubles de membranes PRF en présence de RANKL et de M-CSF. Les courbes dose-réponse ont révélé une suppression des gènes marqueurs des ostéoclastes TRAP et Cathepsine K par l'ajout de PRF (figure 2A). Ensuite, des cellules de moelle osseuse murines ont été incubées avec les mêmes concentrations de PRF mais en présence de RANKL, M-CSF et TGF-β. Encore une fois, le PRF a réduit l'expression des gènes marqueurs des ostéoclastes TRAP et Cathepsine K d'une manière dose-dépendante (figure 2B). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que 50 % d'extraits solubles de membranes de PRF sont une concentration appropriée pour réduire sensiblement les gènes marqueurs d'ostéoclastes susmentionnés.

    3.3 Le PRF réduit la différenciation des ostéoclastes in vitro

    Pour examiner plus avant le rôle potentiel du PRF dans la différenciation des ostéoclastes, des cellules de moelle osseuse murines ont été cultivées en présence d'extraits solubles à 50 % de membranes de PRF avec RANKL et M-CSF. Nous rapportons ici que le PRF a fortement diminué le nombre de cellules multinucléées colorées positives pour TRAP (figures 3A et 3B) ainsi que le nombre respectif de noyaux par cellules (voir le tableau d'informations à l'appui 4 en ligne Journal de parodontologie). Conformément à cette observation, le PRF a diminué l'expression de TRAP et de la cathepsine K, les deux enzymes nécessaires à la résorption osseuse (figure 3C). En outre, les autres gènes marqueurs des ostéoclastes DCSTAMP, NFATc1 et OSCAR ont également été supprimés par des extraits solubles de membranes PRF (Figure 3C). Dans l'ensemble, ces observations indiquent que le PRF peut inhiber l'ostéoclastogenèse.

    3.4 Le PRF réduit la différenciation des ostéoclastes induite par RANKL, M-CSF et TGF-β

    Pour déclencher encore plus l'ostéoclastogenèse, du TGF-β a été ajouté au RANKL et au M-CSF comme décrit précédemment. 20 Comme prévu, l'ajout de TGF-β a nettement augmenté l'ostéoclastogenèse par rapport aux cultures RANKL et M-CSF. 20 Plus particulièrement, des extraits solubles de membranes PRF à une concentration de 50 % ont réduit de manière significative l'ostéoclastogenèse dans ces conditions, comme indiqué par le nombre réduit de cellules positives TRAP multinucléées (Figures 4A et 4B) et le nombre réduit de noyaux par cellules (voir Informations complémentaires Tableau 4 dans en ligne Journal de parodontologie). De plus, les lysats de PRF ont diminué l'expression de TRAP et de Cathepsine K ainsi que DCSTAMP, NFATc1 et OSCAR (Figure 4C). Cette suppression de l'ostéoclastogenèse par les lysats de PRF a été en outre validée par un test de formation de fosses (voir les informations à l'appui Figure 2 dans en ligne Journal de parodontologie). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le PRF supprime l'ostéoclastogenèse indépendamment de l'essai biologique.

    3.5 Le PRF ne peut pas inverser l'ostéoclastogenèse à des stades ultérieurs

    Considérant que le PRF a réduit la différenciation des ostéoclastes de leurs progéniteurs, la question se pose alors de savoir si le PRF peut inverser ce processus. Pour répondre à cette question, des cellules de moelle osseuse murines ont été cultivées en présence de RANKL et de M-CSF. Après 72 heures, le PRF a été ajouté aux cellules pendant 72 heures supplémentaires. Comme le montrent les figures 5A et 5D, de grandes cellules multinucléées colorées pour TRAP ont été observées indépendamment du fait que du PRF ait été ajouté ou non. De plus, le PRF n'a pas été en mesure de réduire le nombre d'ostéoclastes (figures 5D et 5F) ni le nombre de noyaux par cellule (données non présentées). De plus, le PRF n'a pas pu modifier de manière significative l'expression génique des gènes marqueurs des ostéoclastes (figure 5C), également en présence de TGF-β (figure 5F). Ces résultats indiquent que le PRF est incapable d'inverser l'ostéoclastogenèse lorsque le processus a commencé.

    3.6 Les facteurs de croissance naturellement libérés par le PRF diminuent l'ostéoclastogenèse

    Enfin, pour simuler la libération naturelle des facteurs de croissance des membranes PRF, les membranes ont été transférées dans du milieu de culture. Après 24 et 72 heures, le milieu conditionné a été récupéré. 18 Nos données montrent que le milieu conditionné PRF, indépendamment du temps de récolte, a diminué l'ostéoclastogenèse en présence de RANKL, M-CSF et TGF-β, indiqué par la coloration TRAP (non montrée) et l'expression de TRAP et de Cathepsine K (Figures 6A et 6B). Au total, ces observations suggèrent que le PRF libère une activité qui diminue l'ostéoclastogenèse.


    Les adénosine triphosphatases de type vésiculaire ou vacuolaire (V-ATPases) sont des pompes à protons à plusieurs composants, commandées par l'ATP, qui jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques en acidifiant les vésicules intracellulaires, les organites et le milieu extracellulaire. Les défis de longue date dans la purification des V-ATPases de mammifères ont limité l'étude biochimique et structurelle de la V-ATPase de mammifères. Ici, nous fournissons un protocole pour purifier des milligrammes de V-ATPase humaine et des procédures détaillées pour la reconstruction de sa structure par cryo-EM. Notre méthode peut être appliquée à toute étude biochimique et biophysique de la V-ATPase humaine.

    Pour plus de détails sur l'utilisation et l'exécution de ce protocole, veuillez vous référer à Wang et al. (2020).


    Voir la vidéo: Méthode destimation de la charge ultime en RC corporelle auto basée sur des données individuelles (Décembre 2022).