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Combien de temps faut-il aux lentivirus pour exprimer les neurones de souris in vivo ?

Combien de temps faut-il aux lentivirus pour exprimer les neurones de souris in vivo ?


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Quelqu'un sait-il combien de temps il faut à un vecteur Lentivirus standard pour exprimer ses gènes (sous un promoteur fort tel que CAG, CB7, etc.), après injection dans le cerveau d'une souris ?

Par ouï-dire je pense que c'est 2 semaines pour une pleine expression, est-ce vrai ?


Cela dépend beaucoup de ce que vous exprimez (comme sa stabilité) et de l'endroit où vous en avez besoin (soma vs dendrites vs axones, et s'il fait l'objet d'un trafic actif dans la cellule).

Pour les constructions optogénétiques, notre laboratoire a généralement observé une expression proche du pic vers 3 semaines, bien que l'expression puisse être appropriée plus tôt et toxique plus tard.


Combien de temps faut-il aux lentivirus pour exprimer les neurones de souris in vivo ? - La biologie

Les vecteurs lentiviraux peuvent délivrer et exprimer des gènes dans une grande variété de cellules en division et non en division. Ceux-ci comprennent les neurones différenciés en phase terminale, les myotubes, les hépatocytes et les cellules souches hématopoïétiques. Nous décrivons maintenant la génération de vecteurs lentiviraux dans lesquels l'expression du transgène peut être régulée. Nous avons développé un système vecteur lentiviral inductible qui contient l'ensemble du système régulé par la tétracycline (Tet) développé par H. Bujard et ses collègues. Le nouveau vecteur exprime le gène rapporteur GFP et le transactivateur tétracycline sous le contrôle du promoteur inductible par la tétracycline et du promoteur CMV humain, respectivement. In vitro la transduction de cellules 293 humaines a entraîné une expression basale très faible de la GFP en présence de la substance effectrice doxycycline. Le retrait de la doxycycline a induit une augmentation de plus de 500 fois de l'expression du transgène. L'activation et la désactivation de l'expression du transgène n'ont modifié ni la cinétique ni l'amplitude de l'induction. La suppression maximale de la transcription de l'ARNm de la GFP a été obtenue dans les 24 heures suivant l'ajout du médicament. Cependant, en raison du taux de renouvellement lent de la GFP, les cellules fluorescentes vertes ont pu être détectées jusqu'à 10 jours après le traitement à la doxycycline. Après transduction du cerveau de rat avec des lentivirus recombinants, l'expression de la GFP régulée par la doxycycline a pu être observée dans les neurones différenciés en phase terminale. Plus précisément, en ajoutant ou en retirant de la doxycycline de l'eau potable des rats, l'induction et la suppression de l'expression de la GFP pourraient être régulées in vivo. Ces études montrent qu'un vecteur lentiviral inductible peut délivrer et réguler l'expression du transgène in vivo. Nous pensons que l'expression génique régulée est un outil essentiel pour des approches de thérapie génique réussies.


2e génération

Le graphique de droite montre comment le génome lentiviral est édité et distribué sur les trois plasmides constituant le système lentiviral de 2e génération. Ce système contient un seul plasmide d'encapsidation codant pour les gènes Gag, Pol, Rev et Tat. Le plasmide de transfert contient les LTR viraux et le signal d'encapsidation psi (non illustré). À moins qu'un promoteur interne ne soit fourni, l'expression génique est dirigée par le 5'LTR, qui est un promoteur faible et nécessite la présence de Tat pour activer l'expression. La protéine d'enveloppe Env (généralement VSV-G en raison de sa large infectivité) est codée sur un troisième plasmide d'enveloppe séparé. Tous les plasmides de transfert lentiviraux de 2e génération doivent être utilisés avec un système d'encapsidation de 2e génération car l'expression du transgène à partir du LTR est dépendante de Tat.

Plasmides lentiviraux de deuxième génération

Transduction lentivirale pseudotypique d'astrocytes ou de neurones dans la substance noire du rat

Le transfert de gènes vers le système nerveux central fournit une méthodologie puissante pour l'étude de la fonction des gènes et des interactions gène-environnement in vivo, en plus d'un véhicule pour l'administration de transgènes thérapeutiques pour la thérapie génique. Le but de la présente étude était de déterminer les modèles de tropisme présentés par des vecteurs lentiviraux pseudotypés dans la substance noire du rat, afin d'évaluer leur utilité pour le transfert de gènes dans des modèles expérimentaux de la maladie de Parkinson. Des particules de vecteur lentiviral isogénique codant pour un rapporteur GFP ont été pseudotypées avec des glycoprotéines d'enveloppe dérivées du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV), du virus de Mokola (MV), du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) ou du virus de la leucémie murine de Moloney (MuLV). Des rats Lewis mâles adultes ont reçu des infusions stéréotaxiques unilatérales de vecteur dans la substance noire trois semaines plus tard, les modèles de transduction virale ont été déterminés par détection immunohistologique de la GFP. Différents pseudotypes ont donné lieu à l'expression du transgène dans des populations cellulaires restreintes et distinctes. Les pseudotypes VSV et MV ont transduit les neurones du mésencéphale, y compris un sous-ensemble de neurones dopaminergiques nigraux. En revanche, les lentivirus pseudotypés LCMV et MuLV produisaient une expression transgénique exclusivement dans les astrocytes. Ces données suggèrent que les vecteurs lentiviraux pseudotypés seront utiles pour le transfert expérimental de gènes à la substance noire du rat. En particulier, la disponibilité de vecteurs de ciblage neuronaux et astrocytaires permettra la dissociation des fonctions cellulaires autonomes et cellulaires non autonomes des produits géniques clés. in vivo.

Points saillants de la recherche

►Le tropisme lentiviral chez le rat substantia nigra est dépendant du pseudotype. ►Les lentivirus pseudotypés VSV et Mokola transduisent sélectivement les neurones du mésencéphale, y compris les neurones dopaminergiques nigraux. ►Aucun des pseudotypes n'induit de signes de toxicité dans le système nigrostriatal. ►Les lentivirus pseudotypés LCMV et MuLV transduisent sélectivement les astrocytes du mésencéphale plutôt que les neurones. ►Le tropisme astrocytaire des vecteurs pseudotypés LCMV et MuLV n'est pas expliqué par la distribution cellulaire des récepteurs connus pour médier l'entrée du LCMV ou du MuLV natif.


12.5. CONCLUSIONS

Dans ce chapitre, nous avons brièvement décrit l'utilisation d'un système d'expression génique à base virale pour exprimer de manière aiguë des protéines hétérologues dans le cerveau de rat. in vivo. Nous pensons que cette technique offre plusieurs avantages par rapport aux autres approches utilisées pour exprimer des protéines recombinantes in vivo. En particulier, il permet d'évaluer l'effet de l'expression aiguë de toute protéine d'intérêt d'une manière temporellement et spatialement restreinte tout en minimisant la possibilité de compensations dépendantes du temps en réponse à la manipulation moléculaire. Il permet également une comparaison directe des neurones de contrôle moléculairement manipulés et voisins dans le même tissu dans des conditions physiologiques proches de l'idéal. Cependant, un inconvénient de l'utilisation des virus Sindbis est qu'ils entraînent souvent une surexpression élevée de la protéine recombinante. En théorie, cela pourrait affecter le fonctionnement normal du neurone et faire en sorte que la protéine recombinante ait des effets que la protéine endogène n'a pas. Ainsi, nous encourageons le lecteur à se tenir au courant des dernières versions des virus Sindbis qui présentent le moins de cytotoxicité et à envisager l'utilisation d'autres systèmes d'expression virale tels que les lentivirus, qui permettent un niveau inférieur et à plus long terme. expression de protéines recombinantes. Les lentivirus peuvent être particulièrement avantageux lorsqu'ils sont utilisés pour exprimer l'ARNi afin de supprimer l'expression de protéines endogènes.


Guide de sélection des vecteurs lentivirus

Nous proposons une variété de vecteurs lentiviraux hautement optimisés pour de nombreuses applications. Ces vecteurs lentiviraux sont des acteurs clés dans tous nos systèmes de délivrance de gènes Lenti-X, qui peuvent être utilisés avec presque tous les types de cellules de mammifères, y compris les cellules en division et non en division, les cultures cellulaires primaires, les cellules souches et les neurones. Tous nos vecteurs lentiviraux pLVX contiennent des LTR du VIH-1 et le signal d'empaquetage lentiviral (&Psi), et nous avons inclus des éléments spécifiques pour améliorer l'expression du transgène, le titre viral et la fonction globale du vecteur lentiviral :

  • WPRE : Un élément régulateur post-transcriptionnel du virus de l'hépatite de la marmotte empêche la lecture du site poly(A), favorise le traitement et la maturation de l'ARN et augmente l'exportation nucléaire de l'ARN. Dans les transcrits génomiques, il améliore l'empaquetage du vecteur et augmente le titre. Dans les cellules cibles transduites, le WPRE stimule l'expression du transgène en facilitant la maturation du transcrit de l'ARNm.
  • cPPT/CTS : UNE tractus polypurine central/séquence de terminaison centrale crée un « volet d'ADN » qui augmente l'importation nucléaire du génome viral pendant l'infection des cellules cibles. L'élément cPPT/CTS améliore l'intégration vectorielle et l'efficacité de transduction.
  • RRE : UNE Élément de réponse Rev augmente les titres en favorisant l'exportation nucléaire de l'ARN génomique viral non épissé.

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Utilisez ces vecteurs lentiviraux avec l'un de nos systèmes d'emballage Lenti-X de 4 e génération hautement avancés, sûrs et faciles à utiliser, qui produisent des titres élevés de lentivirus VSV-G ou écotrope pseudotypé.

Cliquez sur les cases ci-dessous pour afficher les informations vectorielles et la carte.

Exprimez votre gène d'intérêt à partir d'un puissant promoteur CMV et sélectionnez pour l'intégration lentivirale en utilisant la sélection d'antibiotiques.

Pour les types de cellules où le promoteur du CMV est réduit au silence, comme les cellules hématopoïétiques ou souches.

Co-exprimez votre gène d'intérêt et un marqueur sélectionnable antibiotique ou fluorescent à partir du même transcrit à l'aide de ces systèmes de vecteurs lentiviraux contenant IRES.

Obtenez une expression inductible et étroitement contrôlée de votre gène d'intérêt avec un seul vecteur en utilisant les systèmes Tet-One.

Clonez votre gène en aval d'un domaine de déstabilisation ProteoTuner (DD) et contrôlez la stabilité de votre protéine avec Shield1.

Clonez votre gène in-frame avec l'une de nos nombreuses protéines fluorescentes et surveillez l'expression et la localisation subcellulaire de votre protéine.

Surveillez l'activité de votre promoteur préféré à l'aide d'un système rapporteur qui exprime une protéine fluorescente cyan, verte ou rouge à la demande.

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Décrypter la fonction des facteurs impliqués dans la neuroinflammation de la moelle épinière et la plasticité tissulaire associée à la douleur neuropathique

La douleur pathologique est caractérisée par une modification importante des systèmes impliqués dans la transmission et la modulation du signal douloureux au niveau rachidien (neurones sensoriels primaires et moelle épinière) et probablement au niveau cérébral. Les douleurs chroniques, notamment d'origine neuropathique, peuvent également conduire à un remodelage tissulaire (plasticité). Cela peut inclure, par exemple, la perte d'interneurones spinaux, un réarrangement anormal des afférences centrales des neurones sensoriels primaires et l'activation et la prolifération des cellules gliales. Ces modifications durables sont médiées par ou associées à des changements dans la production de molécules clés impliquées dans le traitement nociceptif. Les techniques basées sur les gènes permettent d'utiliser des interventions locales ou même spécifiques à un type cellulaire pour corriger la production anormale de certaines de ces protéines, moduler l'activité des voies de transduction du signal ou surproduire diverses protéines thérapeutiques sécrétées. En fait, avec ces approches, il peut être possible non seulement de soulager la douleur continue établie, mais d'inverser la situation pathologique sous-jacente à la douleur chronique.

L'importance des changements dans l'état des cellules gliales (appelée activation) dans la moelle épinière, 1, 2, 3, 4 ganglions de la racine dorsale (DRG) 5 et même les structures cérébrales 6, 7 dans la génération et aussi probablement le maintien de la douleur neuropathique est maintenant bien établi. En effet, l'activation de la glie de la moelle épinière a été associée à presque tous les modèles animaux de douleur neuropathique (voir la section L Watkins dans ce volume). La glie activée (microglie et astrocytes) produit et libère plusieurs molécules (gliotransmetteurs) qui peuvent agir directement sur les neurones sensoriels (modifiant l'excitabilité des neurones de premier et de second ordre) et/ou les cellules gliales elles-mêmes (maintenant leur haut niveau d'activité) . Bien que l'altération de la fonction des cellules gliales participe clairement au développement de la neuroinflammation à long terme dans la moelle épinière, ayant ainsi une fonction importante dans la douleur pathologique, les mécanismes précis impliqués sont encore un sujet de débat. Des études pharmacologiques ont impliqué de nombreux récepteurs, voies de transduction et médiateurs sécrétés dans la sensibilisation centrale de la moelle épinière à la suite d'une lésion nerveuse périphérique. Cependant, des outils doivent être développés pour déterminer l'apport relatif de la glie et des neurones. En effet, tant les neurones que la glie expriment plusieurs récepteurs potentiellement impliqués dans l'activation de la glie (par exemple, les récepteurs de certaines cytokines, chimiokines, glutamate, ATP, substance P) et dans les deux types cellulaires plusieurs voies de transduction du signal sont également activées suite à une lésion des nerfs périphériques (par ex. exemple, p38 MAP kinase, 8 JNK 9 et ERK 10 ). La source réelle des médiateurs pro-inflammatoires et algogéniques présents dans la moelle épinière après une lésion nerveuse périphérique est difficile à déterminer, étant donné que la plupart d'entre eux (glutamate, cytokine IL-6, chimiokine CCL2, ATP, oxyde nitrique, prostaglandines, etc.) peuvent être synthétisés et libérés à la fois par les neurones et les cellules gliales. Ainsi, séparez in vivo des études de la glie ou des neurones, utilisant différents modèles de douleur chronique et distinguant les mécanismes périphériques (en particulier ceux impliquant les neurones sensoriels primaires) et centraux, seront nécessaires pour déterminer la nature précise et l'ordre chronologique des événements conduisant au développement et au maintien de la douleur . Les approches pharmacologiques classiques ne sont pas suffisantes pour remplir ces critères. En effet, la sélectivité de certaines molécules n'est que relative, la délivrance locale est problématique du fait de la diffusion importante des agents, la délivrance intrathécale de divers composés conduit fréquemment à leur accumulation massive dans la pie-mère et dans les DRG, 9, 11, 12 délivrance prolongée de médicaments n'est possible qu'avec des systèmes à minipompes, conduisant à une action large et diffuse du médicament, et un traitement sélectif des cellules est presque impossible.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans l'activation de la glie médullaire et/ou l'induction de produits délétères dérivés de la glie représentent sans aucun doute des cibles thérapeutiques d'intérêt potentiel. Il peut être possible d'utiliser des interventions locales et sélectives de type cellulaire pour moduler certains de ces mécanismes cellulaires dans la glie de la moelle épinière et déterminer l'importance de ces mécanismes dans la modification de la fonction des cellules gliales, la production de médiateurs algogéniques et, finalement, dans la douleur chronique. Cette approche nécessiterait une injection intraparenchymateuse directe de vecteurs plutôt qu'une administration intrathécale, qui tend à la transduction prédominante des cellules méningées ou des neurones sensoriels DRG et seulement à une transduction très modeste du tissu de la moelle épinière. 13, 14, 15 De plus, l'injection intraparenchymateuse du vecteur dans le système nerveux central (SNC) limite la réponse immunitaire systémique, induisant ainsi une réponse inflammatoire négligeable. 16


Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Hiromu Yawo, Michisuke Yuzaki et Atsushi Miyawaki pour avoir fourni les matériaux, la construction FCK-Halo-GFP et le plasmide pCS2-Venus, respectivement. Ce travail a été soutenu par des subventions de JSPS KAKENHI (16H04675), le programme JSPS Core-to-Core, A. Advanced Research Networks, et une subvention de recherche de la Takeda Science Foundation à ST, et une subvention de JSPS KAKENHI (16K18397) à VOUS Enfin, nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l'édition en anglais.


Résultats

Induire la neurogenèse dans la moelle épinière adulte

Nous avons utilisé un système de délivrance de gènes lentiviraux pour cibler à la fois les cellules en prolifération et au repos dans la moelle épinière de souris adultes. L'expression des gènes était régulée par la protéine acide fibrillaire gliale humaine (hGFAP) promoteur, qui est actif principalement dans les astrocytes 30 . Pour approfondir l'examen des types cellulaires ciblés par ce système lentiviral dans la moelle épinière adulte, 1,5 l de protéine fluorescente verte (GFP)-virus exprimant (hGFAP-GFP) a été injecté en deux positions distantes de 3 à 5 mm au niveau thoracique 8 (T8). Une semaine après l'injection virale (wpi), des analyses immunohistochimiques de coupes longitudinales autour des régions injectées ont montré que les cellules GFP+ étaient détectables dans une large zone, en particulier dans la substance blanche, atteignant une distance de

3,0 mm du site d'injection à la fois rostrale et caudale (Fig. 1a supplémentaire). Alors que quelques cellules GFP + ont été colorées positivement pour les marqueurs de neurones (NeuN, <0.82%), les précurseurs d'oligodendrocytes et les péricytes (OLIG2, 4,94±3,10 % et NG2, 4,36±2,83% moyenne±s.d., m= 3), la grande majorité exprimait le marqueur spécifique des astrocytes GFAP (95,09 ± 4,15 %, moyenne ± s.d., m=3) (Fig. complémentaire 1b–e,i). Les marqueurs des oligodendrocytes matures (MBP et PLP) ou de la microglie (IBA1) n'ont pas été détectés dans les cellules GFP + (Fig. 1f–i). Ces résultats indiquent que les astrocytes spinaux sont le principal type cellulaire ciblé par les lentivirus sous la régulation de hGFAP promoteur.

Sur la base de leurs rôles dans les CNS et/ou la neurogenèse, 12 gènes (SOX2, PAX6, NKX6.1, NGN2, ASCL1, OLIG2, SOX11, Tlx, OCT4, c-MYC, KLF4 et PTF1a) ont été choisis comme candidats. Lentivirus exprimant ces candidats sous le hGFAP promoteur a été injecté individuellement dans la région T8 de la moelle épinière adulte et analysé pour sa capacité à induire la neurogenèse adulte (Fig. 1a). La neurogenèse a été initialement examinée par coloration pour l'expression de la doublecortine (DCX), une protéine associée aux microtubules qui est largement exprimée dans les neuroblastes et les neurones immatures au cours du développement et dans les régions neurogènes du cerveau adulte 31,32. L'expression de DCX est principalement associée à la neurogenèse adulte mais pas à la gliose réactive ou à la croissance axonale régénérative 33 . Conformément à ces résultats, le DCX n'a ​​été détecté ni dans les moelles épinières intactes ni dans celles présentant des lésions induites par l'hémisection (Fig. 2 supplémentaire). À l'opposé, les cellules DCX + ont été identifiées dans la moelle épinière injectée avec le virus exprimant SOX2, mais aucun des 11 autres gènes candidats à 4 wpi. Cela a en outre été confirmé avec un virus exprimant GFP-T2A-SOX2 afin que les cellules transduites par le virus puissent être identifiées par la coexpression de GFP (Fig. 1b–d).

(une) Schéma expérimental. (b) Les cellules DCX+ sont détectées chez les animaux injectés avec des lentivirus exprimant SOX2 mais pas de contrôle GFP à 4 ou 5 wpi. Les noyaux ont été contre-colorés avec Hoechst 33342 (Hst) (c,) Quantification des cellules DCX + induites par SOX2 autour des régions d'injection de virus dans la moelle épinière adulte (moyenne + s.d. m= 3 souris par groupe n.d., non détectées). (e) Images confocales d'une cellule DCX + représentative (indiquée par des flèches). Les cellules DCX + induites par SOX2 sont tracées par la GFP coexprimée, indiquant une origine de cellules infectées par le virus. Ils sont également co-marqués par TUBB3 et ont des processus bipolaires ou multipolaires. Les astérisques et les pointes de flèche indiquent respectivement les corps cellulaires et les processus neuronaux. (F) Images représentatives de cellules DCX + induites dans la moelle épinière de souris âgées (>12 mois). Barres d'échelle, 50 m (b,F) et 20 m (e).

Les cellules DCX + induites par SOX2 ont été principalement identifiées autour de la région d'injection du virus et ont montré une morphologie neuronale immature typique avec des processus bipolaires ou multipolaires (Fig. 1b, e). Ils ont coexprimé la bêtaIII-tubuline (TUBB3, également connue sous le nom de TUJ1), un marqueur panneuronal, et ont été marqués par GFP, montrant une origine de cellules transduites par le virus (Fig. 1e). L'efficacité d'induction des cellules DCX + a été estimée à 6 à 8 % des cellules GFP + entourant les sites d'injection du noyau à 4 ou 5 wpi (Fig. 1d). Fait intéressant, SOX2 ectopique a également entraîné la production de cellules DCX + chez les souris âgées (>12 mois, figure 1f). Ensemble, ces données suggèrent que la neurogenèse peut être induite par un seul facteur de transcription, SOX2, dans la moelle épinière adulte, similaire aux observations faites dans le striatum adulte 29 .

Induire la neurogenèse dans la moelle épinière avec des blessures graves

Une lésion traumatique grave de la moelle épinière adulte provoque une mort cellulaire massive, une inflammation et une gliose 1,25,34, qui entraînent un microenvironnement pathologique radicalement différent de celui de la blessure par arme blanche induite par l'injection d'aiguille. Pour examiner si la neurogenèse pouvait également être induite dans cette condition pathologique cliniquement pertinente, nous avons injecté un lentivirus dans le parenchyme de la moelle épinière gravement blessée immédiatement après l'hémisection au niveau T8 (Fig. 2a). Les deux sites d'injection étaient à 1,5 mm du noyau de la blessure de chaque côté (Fig. 3a supplémentaire). Des analyses histologiques ont été réalisées sur des coupes de moelle épinière couvrant le site de la lésion. Semblable à ce qui a été observé dans la moelle épinière intacte, le virus témoin hGFAP-GFP pourraient transduire efficacement les cellules entourant les sites d'injection avec une majorité exprimant le marqueur astrocytaire GFAP (95,21 ± 3,95 %, moyenne ± écart type, m=3 Fig. 3b,i supplémentaire). Seul un faible pourcentage de cellules GFP + a exprimé des marqueurs pour les neurones, les précurseurs d'oligodendrocytes ou les péricytes (NeuN + , <0.91% OLIG2, 4.73±2.94% NG2, 3.73±2.74% moyenne ± s.d., m=3) (Fig. complémentaire 3c–e,i). Aucun n'a exprimé les marqueurs des oligodendrocytes matures MBP et PLP ou le marqueur de la microglie IBA1 (Fig. 3f-i). Ces résultats sont très similaires à ceux de la moelle épinière sans hémisection (Fig. supplémentaire 1), suggérant qu'une blessure grave ne modifie pas les types cellulaires ciblés par le lentivirus.

(une) Schéma expérimental. Le lentivirus a été injecté dans la moelle épinière immédiatement après l'hémisection au niveau T8. (b) Quantification des cellules DCX + induites par SOX2 autour des régions d'injection de virus dans la moelle épinière lésée (moyenne + s.d. m= 4 souris par groupe n.d., non détectées). (c) Pourcentage de cellules GFP + exprimant DCX autour des régions d'injection de virus dans la moelle épinière lésée (moyenne + s.d. m= 4 souris par groupe n.d., non détectées). () Images représentatives des cellules DCX + induites par le virus exprimant SOX2 mais pas le contrôle GFP à 4, 6 ou 8 wpi. Barre d'échelle, 40 m.

Aucune cellule DCX+ n'a été détectée dans les moelles épinières blessées injectées avec le virus témoin hGFAP-GFP à 4, 6 ou 8 wpi (Fig. 2b–d). À l'opposé, ces cellules ont été spécifiquement induites par l'injection de hGFAP-GFP-T2A-SOX2 virus (Fig. 2b–d). Toutes les cellules DCX+ induites exprimaient également la GFP indiquant une origine à partir de cellules transduites par le virus (figure 2d). Une estimation de 3 à 6 % des cellules GFP + entourant les sites d'injection virale de base ont été reprogrammées par SOX2 pour devenir des cellules DCX + entre 4 et 8 wpi (Fig. 2c). Ces cellules DCX+ étaient également colorées positivement pour le marqueur neuronal TUBB3 (Fig. 2d). Ensemble, ces données indiquent que la neurogenèse peut être induite par SOX2 dans un environnement lésé de la moelle épinière adulte.

La neurogenèse induite par SOX2 provient des astrocytes spinaux

La source cellulaire pour les cellules DCX + induites par SOX2 a été déterminée par le traçage de la lignée génétique. L'expression des gènes sous le hGFAP le promoteur n'a pas été détecté dans les oligodendrocytes matures ou la microglie (figures supplémentaires 1,3), les excluant ainsi comme origine possible pour les cellules DCX + induites par SOX2. Bien que moins de 5 % des cellules NG2+ aient été ciblées par le hGFAP promoteur (Figs supplémentaires 1,3), ces cellules ont été spécifiquement examinées car elles sont des précurseurs cycliques pour les oligodendrocytes, présentent une plasticité après une lésion dans le système nerveux central adulte 35 et sont susceptibles d'être reprogrammées en culture 15 . Les cellules NG2+ et leurs dérivés ont été tracés à l'aide de Ng2-Cré Souris transgéniques BAC 36 et le rapporteur Rosa-YFP (Fig. 3a). A respectivement 71 et 64% des cellules YFP + ont exprimé NG2 et OLIG2 dans la moelle épinière adulte (Fig. supplémentaire 4a,b,d). Les marqueurs des astrocytes (GFAP), de la microglie (IBA1) ou des neurones (TUBB3) n'ont pas été détectés dans les cellules tracées par YFP (Fig. 4c, d). Des souris transgéniques ont ensuite été injectées avec hGFAP-SOX2 lentivirus et examiné à 5 wpi. L'immunohistochimie a montré que les cellules DCX + étaient induites autour des régions injectées par le virus mais qu'aucune n'était co-marquée avec YFP (Fig. 3b). Ce résultat indique que les cellules DCX + induites par SOX2 sous le hGFAP promoteur ne proviennent pas des cellules NG2 + de la moelle épinière adulte.

(une,b) Les cellules DCX + induites par SOX2 ne proviennent pas de cellules NG2 +. Ng2-CreRosa-YFP souris (une) ont reçu une injection de lentivirus exprimant SOX2 ou vide et ont été analysés à 5 wpi. Les images confocales sont affichées dans le panneau (b). (cg) Les nouveaux neurones induits par SOX2 proviennent des astrocytes. (c) mGfap-CreRosa-tdT des souris ont reçu une injection de virus exprimant GFP-T2A-SOX2 ou GFP (comme contrôle) et ont été analysées à 5 wpi. () Images confocales représentatives montrant que les cellules DCX + induites par SOX2 proviennent d'astrocytes infectés par des lentivirus (indiqués par GFP + tdT + ). (e) Vues à plus fort grossissement d'une cellule DCX + marquée au tdT. Les astérisques et les pointes de flèches indiquent respectivement les corps cellulaires et les processus. (F,g) Les neurones TUBB3 + induits par SOX2 sont dérivés d'astrocytes infectés par le virus (indiqué par GFP + tdT + ). Les neurones tracés ont été quantifiés dans les régions injectées par le virus (moyenne + s.d. m= 5 souris par groupe n.d., non détectées). Barre d'échelle, 20 m (b,F).

En revanche, les astrocytes sont l'origine cellulaire la plus probable pour les neurones induits car ils sont le type cellulaire prédominant ciblé par les lentivirus sous le hGFAP promoteur (Figs supplémentaires 1,3). Cette hypothèse a été examinée par le traçage de la lignée génétique en utilisant le transgénique Ligne mGfap-Cre 77,6, qui a été signalé à tracer exclusivement des astrocytes dans le cerveau antérieur 23 . Nous avons franchi cette ligne pour Rosa-tdTomate (tdT) journaliste 37 et a examiné l'identité des cellules marquées dans la moelle épinière adulte (Fig. 3c, Fig. 5 supplémentaire). Sur la base de l'expression de la GFAP, 71,32 ± 6,75 % des astrocytes ont été marqués par le rapporteur tdT. Parmi les cellules tdT+, la grande majorité exprimait les marqueurs astrocytes GFAP (97,36 ± 3,24 %, moyenne ± s.d., m= 3) et la glutamine synthétase (GS, 95,14 ± 3,86 %, moyenne ± s.d., m=3), tandis que moins de 5 % étaient positifs pour NG2 ou OLIG2 (Fig. 5a–d,f supplémentaire). Les marqueurs de la microglie (IBA1 + ) ou des neurones (NeuN + , MAP2 + et TUBB3 + ) n'étaient pas exprimés dans les cellules tracées (Fig. 5e,f supplémentaire). Adulte mGfap-CreRosa-tdT les souris ont ensuite reçu une injection de lentivirus exprimant soit la GFP (comme contrôle) soit la GFP-T2A-SOX2 et examinées à 5 wpi. L'immunohistochimie a montré que SOX2 ectopique induit l'expression de DCX dans les cellules tdT + (Fig. 3d). Fait important, une fraction des cellules tracées a également été marquée par le marqueur neuronal TUBB3 (

5%) dans les régions centrales de la colonne vertébrale injectées avec le virus SOX2 (Fig. 3f,g). À l'opposé, ces marqueurs neuronaux n'étaient pas détectables dans les cellules tracées par tdT dans la moelle épinière injectée avec le virus de contrôle (Fig. 3g), bien que l'expression de la GFP ait montré une infection claire de ces cellules (Fig. 6 supplémentaire). Ces résultats indiquent que les nouveaux neurones induits par SOX2 proviennent d'astrocytes résidents.

Des tests de transplantation cellulaire ont été effectués pour confirmer davantage ces résultats. Les astrocytes rachidiens ont été isolés de nouveau-nés mGfap-CreRosa-tdT souris, cultivées pendant 7 à 10 jours dans un milieu contenant du sérum, puis repiquées une fois. Les astrocytes tdT + ont ensuite été purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence et infectés avec soit hGFAP-GFP ou hGFAP-GFP-T2A-SOX2 lentivirus (Fig. 4a). L'identité astrocytaire et l'expression de GFP ectopique et SOX2 ont été confirmées par immunocytochimie (Fig. 4b,c). Trois jours après l'infection virale (dpi), ces cellules ont été transplantées dans la moelle épinière de souris NOD scid gamma (NSG) immunodéficientes adultes. Lorsqu'elles ont été examinées à 4 wpi, aucune des cellules tdT+ témoins infectées par le virus GFP ne s'est révélée positive pour le marqueur neuronal TUBB3 (figure 4d). En revanche, l'expression de TUBB3 était clairement détectable dans les cellules tdT + qui ont été infectées par le hGFAP-GFP-T2A-SOX2 virus avant transplantation (Fig. 4d). L'expression de la GFP dans ce dernier groupe était également régulée à la baisse, reflétant des activités très réduites du hGFAP promoteur dans les cellules converties. À 5 wpi, certaines des cellules tdT+ du groupe SOX2 ont commencé à exprimer MAP2, un marqueur des neurones matures. Ces résultats démontrent que l'expression ectopique de SOX2 peut convertir les astrocytes rachidiens transplantés en neurones dans la moelle épinière adulte.

(une) Schéma expérimental. Astrocytes rachidiens cultivés à partir de mGfap-CreRosa-tdT les souris ont été purifiées sur la base de l'expression de tdT. Trois dpi, des cellules ont été infectées avec un lentivirus et transplantées dans la moelle épinière de souris NSG. (b) Immunocytochimie montrant l'expression des marqueurs GFAP et Aldolase c (Aldc) pour les astrocytes, dans des cellules tdT + purifiées. (c) Immunocytochimie confirmant l'expression de SOX2 dans les astrocytes spinaux infectés par le hGFAP-GFP-T2A-SOX2 virus. () Images confocales montrant des neurones dérivés d'astrocytes dans la moelle épinière transplantés avec le SOX2 mais pas des astrocytes infectés par le virus de contrôle. Les vues orthogonales des cellules dans les régions encadrées sont affichées dans les panneaux de droite. Les neurones dérivés des astrocytes (tdT + TUBB3 + ou tdT + MAP2 + ) sont indiqués par des flèches. Barres d'échelle, 60 m (b,c) et 30 m ().

Prolifération cellulaire au cours de la neurogenèse induite

Les neurones induits par SOX2 pourraient être convertis à partir d'astrocytes par un changement de lignée directe sans l'ajout de nouvelles cellules. Nous avons testé cette hypothèse en examinant la prolifération cellulaire au cours du processus de neurogenèse induite par SOX2. Les cellules proliférantes dans la moelle épinière adulte lésée ont été continuellement marquées par injection intrapéritonéale de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) (100 mg kg -1 , deux fois par jour) de 3 à 18 jours après l'injection virale. Lorsqu'elles ont été examinées à 4 wpi, environ 90 % des cellules DCX+ induites étaient clairement marquées par BrdU, indiquant qu'elles avaient traversé un stade de prolifération (Fig. 5a,c). Fait intéressant, près de 17% des cellules DCX + ont également exprimé le marqueur de prolifération cellulaire Ki67, indiquant que ces cellules étaient toujours dans un état de cycle (Fig. 5b,c). En utilisant TUBB3 comme marqueur supplémentaire pour les neurones, nous avons constaté que

3% des neurones entourant les sites d'injection virale de base pourraient être marqués par BrdU (Fig. 5d,f). L'administration de BrdU pendant 4 à 8 wpi a également conduit à un nombre similaire de cellules TUBB3 + marquées (Fig. 5e,f). Ces données démontrent collectivement que la neurogenèse adulte induite par l'expression ectopique de SOX2 est un processus continu, qui passe par une phase de prolifération.

(une) Incorporation de BrdU dans des cellules DCX + induites par SOX2. Une vue orthogonale des cellules BrdU + DCX + dans la région encadrée est affichée dans le panneau de droite (semaine, semaines IHC, immunohistochimie). (b) Coloration Ki67 montrant que les cellules DCX + induites par SOX2 prolifèrent à 5 wpi. Une vue orthogonale des cellules Ki67 + DCX + dans la région encadrée est affichée dans le panneau de droite. (c) Quantification des cellules DCX + marquées au BrdU ou au Ki67 (moyenne + s.d. m= 3 souris par groupe). (,e) Neurones nouvellement générés indiqués par les cellules TUBB3 + tracées par BrdU dans la moelle épinière adulte. Des vues orthogonales de la cellule BrdU + TUBB3 + sont également présentées. (F) Quantification des nouveaux neurones induits par SOX2 (indiqués par BrdU + TUBB3 + ) entourant les régions d'injection de virus dans la moelle épinière adulte (moyenne + s.d. m= 3 souris par groupe n.d., non détectées). Barre d'échelle, 20 m (une,b,,e).

SOX2 induit des neuroblastes dans la moelle épinière adulte

L'expression ectopique de SOX2 seul était capable de convertir des fibroblastes ou des astrocytes corticaux humains en CNS prolifératives et multipotentes 28,38, soulevant la possibilité que les astrocytes rachidiens puissent être reprogrammés de la même manière par SOX2. Les astrocytes rachidiens ont été isolés à partir de la période postnatale précoce. mGfap-CreRosa-tdT souris et infectées par un lentivirus exprimant soit GFP-T2A-SOX2 soit la GFP témoin seule (Fig. 6a,b). Trois jours plus tard, le milieu contenant du sérum bovin fœtal pour les astrocytes a été remplacé par un milieu synthétique complet pour les NSC. Neurospheres, which indicate the presence of self-renewable NSCs, were observed as early as 7 dpi in cultures with ectopic SOX2 but not the control GFP (Fig. 6c,d). These spheres were clearly labelled by tdT and GFP indicating an origin for SOX2 virus-infected astrocytes. Consistent with neural stem-like cells being present in postnatal spinal cords 39 , neurospheres were also detectable in the GFP group by 14 dpi. However, their number was significantly lower than that in the SOX2 group (Fig. 6d). Interestingly, ectopic SOX2 further dramatically enhanced the generation of secondary neurospheres from the primary ones (Fig. 6c,d). These spheres and the single cells dissociated from them were labelled by tdT, GFP and the NSC marker nestin (NES Fig. 6e). When cultured under differentiation conditions for 6 days, neurosphere-derived single cells could become TUBB3 + neurons, GFAP + astrocytes and NG2 + oligodendrocyte precursors (Fig. 6f). All of these cells were traced by the marker tdT indicating an origin from astrocytes. Together, these data show that SOX2 can promote the generation of multipotent NSCs from spinal astrocytes in culture consistent with results from cultured fibroblasts and cortical astrocytes 28,38 .

(une) Experimental scheme. (b) Immunocytochemistry confirming the astrocyte identity of cultured tdT + cells. (c) Representative micrographs of neurospheres from spinal astrocytes infected with the hGFAP-GFP-T2A-SOX2 lentivirus. () Frequency of neurosphere-forming cells from spinal astrocytes infected with the indicated lentivirus. Secondary spheres were quantified at 7 days after plating (mean+s.d. m=5 *P<0.01 by Student’s t-test). (e) Nestin (NES) expression in SOX2-induced neurospheres. (F) Multiple lineage differentiation of SOX2-induced secondary neurospheres. Immunocytochemistry was performed 6 days after plating dissociated single cells. Scale bars, 50 μm (b), 200 µm (c), 60 μm (e) and 40 μm (F).

We then examined the SOX2-induced neurogenesis in the adult spinal cord using immunohistochemistry. A time course analysis showed that DCX + cells were not readily detectable until 4 wpi suggesting that the induced neurogenesis was a slow process. SSEA1 (also known as LeX or CD15) and KLF4, markers for multipotent stem cells, were not expressed in virus-infected astrocytes or the induced DCX + cells in the adult spinal cord at 1, 2, 3 or 4 wpi (Fig. 7a). Interestingly, SOX1 and SOX3, members of the SOXB1 subfamily of SOX transcription factors and key players in neural progenitors, were expressed in a subset of SOX2 virus-infected astrocytes, although these two factors were also distributed in some of the non-infected cells (Fig. 7b). The expression of SOX1 and SOX3 persisted into the DCX + stage, consistent with their reported expression in neuroblasts in the subventricular zone of the adult mouse brain 40,41 .

(une) Markers for multipotent stem cells are not detectable in the spinal cord injected with the hGFAP-GFP-T2A-SOX2 virus. The expression in NSCs was served as a control. (b) The SOXB1 transcription factors are expressed during the reprogramming process. (b) Expression of SOX1 and SOX3 in SOX2 virus-infected cells and induced neuroblasts (indicated by arrows). Cultured NSCs served as controls. (c) Robust expression of SOX2 in the spinal cord injected with the hGFAP-GFP-T2A-SOX2 virus (indicated by arrows). Arrowheads indicate endogenous SOX2 expression. () Downregulation of SOX2 in converted neuroblasts (indicated by arrows). Arrowheads indicate endogenous SOX2 expression. Scale bar, 40 μm (une).

Although endogenous SOX2 is broadly expressed in astrocytes in the adult spinal cord 42 , immunostaining showed that cells infected with the hGFAP-GFP-T2A-SOX2 virus had a significantly higher level of total SOX2 expression when compared with the surrounding non-infected cells (Fig. 7c). In induced DCX + cells, SOX2 expression was downregulated to a level similar to their neighbouring non-DCX + cells at 4 wpi and became almost non-detectable at 6 wpi (Fig. 7d). We hypothesized that such dynamic expression of SOX2 that was delivered by the hGFAP promoter was critical for induced neurogenesis. This hypothesis was tested by controlling SOX2 expression through the constitutively active CMV early enhancer/chicken beta actin (CAG) promoter. Robust SOX2 expression was observed in virus-infected cells however, DCX + cells were not detected at 4 wpi (Supplementary Fig. 7). These results suggest that the initial higher level of SOX2 expression and its subsequent downregulation was indeed necessary for the reprogramming process.

In summary, these results reveal that the ectopic expression of SOX2 reprograms resident astrocytes to proliferative DCX + neuroblasts in the adult spinal cord contrary to in vitro cell culture conditions that enable SOX2 to convert astrocytes to multipotent stem cells (Fig. 6). This highlights the importance of the cellular milieu on the reprogramming process.

Induced neuroblasts mature into synapse-forming interneurons

As DCX is restricted to neuroblasts and immature neurons and TUBB3 is also broadly expressed in both immature and mature neurons, the expression of these two markers during SOX2-induced neurogenesis does not indicate that these new neurons can become mature. In comparison, MAP2 and NeuN are markers for mature neurons. These markers were undetected in both BrdU- and tdT-traced cells in mGfap-CreRosa-tdT mice that were injected with SOX2-expressing virus at 4 wpi (Fig. 8a,f,g). When examined at 8 wpi, however,

3% of tdT + cells were labelled by either MAP2 or NeuN around the virus-injected region (Fig. 8b,c,f). Correspondingly, an estimated 1% of either MAP2- or NeuN-positive cells within the injected region also incorporated BrdU (Fig. 8d,e,g), indicating that they were mature neurons reprogrammed through cell division. VPA is a histone deacetylase inhibitor that enhances cellular reprogramming 43 and promotes normal neurogenesis and maturation of induced adult neuroblasts in the adult brain 29,44 . Here, we examined the effect of VPA on SOX2-induced neurogenesis in the adult spinal cord. Interestingly, 4 weeks of intraperitoneal injection of VPA (100 mg kg −1 , twice daily) resulted in nearly a twofold increase of tdT + cells being labelled by either MAP2 or NeuN in mGfap-CreRosa-tdT mice (Fig. 8f). These neurons could survive up to 30 wpi, the longest time examined (Supplementary Fig. 8). Quantification of BrdU-labelled cells also showed a threefold increase of newly generated MAP2 + or NeuN + mature neurons (Fig. 8g). Together, these data indicate that SOX2-induced neurons become mature by 8 wpi and can be further enhanced by treatment with VPA.

(une) Experimental scheme. mGfap-CreRosa-tdT mice were injected with hGFAP-SOX2 or a control virus immediately after injury and analysed by IHC at 4 (I) or 8 (II, III) wpi. (b,c) Expression of the mature neuronal markers MAP2 (b) or NeuN (c) in tdT + cells in SOX2 virus-injected spinal cords at 8 wpi. tdT-traced MAP2 + or NeuN + cells were not detectable in control virus-injected spinal cords. Orthogonal views of cells with expression of the indicated markers are also shown. Compared with endogenous spinal motoneurons (indicated by an asterisk in c), the SOX2-induced neurons are interneuron-like with a smaller soma (indicated by an arrow in c). (,e) SOX2-induced mature neurons pass through a proliferative stage. Mice were treated with BrdU at 3–18 dpi and analysed at 8 wpi. Orthogonal views of BrdU-traced mature neurons are also shown. (F,g) Quantification of SOX2-induced mature neurons in the injured adult spinal cord (mean+s.d. m=5 mice per group *P<0.01 by Student’s t-test). Scale bar, 20 μm (be).

We analysed the cellular identity of the reprogrammed neurons in mGfap-CreRosa-tdT mice that were injected with hGFAP-SOX2 virus and treated with VPA for 4 weeks beginning at 4 wpi (Fig. 9a). These mice were also treated with BrdU from 3–18 dpi to label newly generated cells (Fig. 9a). Immunohistochemistry showed that none of the tdT + cells expressed choline acetyltransferase (ChAT), a marker for cholinergic motor neurons (Supplementary Fig. 9a). In contrast, the astrocyte-derived mature neurons (indicated by the expression of tdT and MAP2) were positive for GABA or vGLUT1, markers for inhibitory or excitatory neurons, respectively (Fig. 9b and Supplementary Fig. 9b,c). Importantly, co-staining with GABA and BrdU confirmed that these cells were indeed newly reprogrammed (Fig. 9c). The GABAergic neuronal identity was further demonstrated by staining with an antibody against glutamate decarboxylase (GAD65) (Fig. 9d). Interestingly, some tdT-traced cells were co-labelled by synapsin-1 (SYN1), a marker for presynaptic terminals, in spinal cords injected with SOX2 virus but not with a control virus (Fig. 9e). Confocal analyses under higher magnifications showed that dense bouton-like terminals co-stained with SYN1 and tdT were juxtaposed to the soma and axon of ChAT + cells (Fig. 9f,g), indicating the formation of synapses between SOX2-induced new neurons and local motor neurons. Together, these results showed that ectopic SOX2 could convert local astrocytes into synapse-forming GABAergic interneurons in the adult spinal cord.

(une) Experimental scheme to examine SOX2-induced mature neurons. (b,c) Ectopic SOX2 converts astrocytes (indicated by tdT) to GABAergic interneurons (indicated by GABA and GAD65 expression). Coexpression of the indicated markers is also shown by an orthogonal view. These cells were not detectable in spinal cords injected with a control virus. () BrdU labelling indicates that SOX2-induced GABA + cells are newly generated. Coexpression of the indicated markers is shown by an orthogonal view. (e) Expression of synapsin-I (SYN1) in tdT + cells in spinal cords injected with SOX2 but not a control virus. An orthogonal view is to show co-localization of the indicated markers. (F,g) Confocal images showing synapse-formation between SOX2-induced neurons (labelled by tdT) and the soma (F) or axon (g) of endogenous cholinergic motoneurons (labelled by ChAT). Synapses are indicated by SYN1-expression. Scale bar, 20 μm (bF) and 10 μm (g).


Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes

The quality of genetically encoded calcium indicators (GECIs) has improved dramatically in recent years, but high-performing ratiometric indicators are still rare. Here we describe a series of fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based calcium biosensors with a reduced number of calcium binding sites per sensor. These 'Twitch' sensors are based on the C-terminal domain of Opsanus troponin C. Their FRET responses were optimized by a large-scale functional screen in bacterial colonies, refined by a secondary screen in rat hippocampal neuron cultures. We tested the in vivo performance of the most sensitive variants in the brain and lymph nodes of mice. The sensitivity of the Twitch sensors matched that of synthetic calcium dyes and allowed visualization of tonic action potential firing in neurons and high resolution functional tracking of T lymphocytes. Given their ratiometric readout, their brightness, large dynamic range and linear response properties, Twitch sensors represent versatile tools for neuroscience and immunology.


Voir la vidéo: Surface Engineering Lentiviral Vectors for Gene Transfer into Gene Therapy Target Cells (Janvier 2023).