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Aide à la préparation du TSA Congo Rouge

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Je veux donc faire Congo Red TSA. Mon instructeur a donné quelques pistes mais j'ai encore quelques questions :

  1. Je commence par faire deux solutions mères : 20 mg/ml de rouge congo et de coomassie dans deux tubes Falcon différents. Pour préparer 30 ml de chacun, dois-je dissoudre 600 mg dans de l'eau stérile ?
  2. La concentration finale dans une solution de 500 ml de TSA doit être de 40 l/mL de CR et 20 g/mL de coomassie. Comment calculer la quantité de solution nécessaire pour le TSA ?

1) Oui, c'est exact.

2) Il s'agit simplement d'appliquer l'équation $C_1V_1=C_2V_2$. Pour le rouge congo :

  • $C_1=20frac{mg}{mL}$
  • $C_2=0.04frac{mg}{mL}$
  • $V_2=500 mL$

Je suis sûr que vous et une calculatrice pouvez comprendre le reste.


Techniques de laboratoire aseptiques : méthodes de placage

Les micro-organismes sont présents sur toutes les surfaces inanimées créant des sources omniprésentes de contamination possible dans le laboratoire. Le succès expérimental repose sur la capacité d'un scientifique à stériliser les surfaces de travail et l'équipement ainsi qu'à empêcher le contact d'instruments et de solutions stériles avec des surfaces non stériles. Nous présentons ici les étapes de plusieurs méthodes de placage couramment utilisées en laboratoire pour isoler, propager ou dénombrer des micro-organismes tels que des bactéries et des phages. Les cinq méthodes intègrent une technique aseptique ou des procédures qui maintiennent la stérilité des matériaux expérimentaux. Les procédures décrites comprennent (1) l'étalement de cultures bactériennes pour isoler des colonies uniques, (2) l'étalement et (3) l'étalement pour dénombrer les colonies bactériennes viables, (4) les superpositions de gélose molle pour isoler les phages et dénombrer les plaques, et ( 5) réplication-placage pour transférer des cellules d'une plaque à l'autre dans un modèle spatial identique. Ces procédures peuvent être effectuées sur la paillasse du laboratoire, à condition qu'elles impliquent des souches de micro-organismes non pathogènes (niveau de biosécurité 1, BSL-1). Si vous travaillez avec des organismes BSL-2, ces manipulations doivent avoir lieu dans une enceinte de biosécurité. Consultez l'édition la plus récente du Biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL) ainsi que Fiches signalétiques (FS) pour les substances infectieuses afin de déterminer la classification des risques biologiques ainsi que les précautions de sécurité et les installations de confinement requises pour le micro-organisme en question. Les souches bactériennes et les stocks de phages peuvent être obtenus auprès de chercheurs, d'entreprises et de collections conservées par des organisations particulières telles que le Collection de culture de type américain (ATCC). Il est recommandé d'utiliser des souches non pathogènes lors de l'apprentissage des différentes méthodes de placage. En suivant les procédures décrites dans ce protocole, les étudiants doivent être capables de : ● Effectuer des procédures de placage sans contaminer le support. ● Isoler les colonies bactériennes individuelles par la méthode de l'étalement par stries. ● Utiliser des méthodes d'étalement et d'étalement pour déterminer la concentration de bactéries. ● Effectuez des superpositions de gélose molle lorsque vous travaillez avec des phages. ● Transférer des cellules bactériennes d'une plaque à une autre en utilisant la procédure de placage de réplique. ● Étant donné une tâche expérimentale, sélectionnez la méthode de placage appropriée.


Résumé

Biotypes pathogènes de Yersinia enterocolitica (sérotypes O:3, O:8, O:9 et O:13), mais pas les biotypes environnementaux (sérotypes O:5, O:6, O:7,8 et O:7,8,13,19 ). Une observation similaire a également été faite lorsque des souches représentatives des sérotypes O:8 et O:5 ont été testées après un bref contact avec des monocytes humains. L'augmentation de la perméabilité était indépendante du plasmide de virulence. Le rôle du lipopolysaccharide (LPS) dans ce phénomène a été examiné en utilisant Y. enterocolitica sérotype O:8. Les agrégats de LPS de bactéries cultivées dans un bouillon acide ou additionné d'EGTA ont pris plus de N-phénylnaphtylamine que les agrégats LPS de bactéries cultivées dans un bouillon standard et a également montré une augmentation marquée de la fluidité de la chaîne acyle qui était corrélée à la perméabilité, telle que déterminée par les mesures obtenues en présence de colorants hydrophobes. Aucun changement significatif dans la polymérisation de l'antigène O n'a été observé, mais l'acylation du lipide A a changé en fonction des conditions de croissance. Dans le milieu standard à 37ଌ, il y avait des formes hexa-, penta- et tétraacyle lipide A, et la forme pentaacyle était dominante. La quantité de tétraacyl lipide A a augmenté dans les milieux acides et supplémentés en EGTA, et l'hexaacyl lipide A a presque disparu dans ces dernières conditions. Nos résultats suggèrent que le pathogène Y. enterocolitica les souches modulent l'acylation du lipide A de manière coordonnée avec l'expression des protéines de virulence, réduisant ainsi le tassement du LPS et augmentant la perméabilité de la membrane externe. Les modifications de la perméabilité, de la fluidité de la chaîne acyle du LPS et de l'acylation du lipide A chez les agents pathogènes Y. enterocolitica souches se rapprochent des caractéristiques dans Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia pestis et suggèrent qu'il existe un motif commun de membrane externe associé à la pathogénicité.

Les yersiniae sont des bactéries à Gram négatif qui appartiennent à la famille Entérobactéries. Le genre Yersinia comprend des espèces non pathogènes trouvées principalement dans l'environnement, deux espèces pathogènes (Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia pestis), et Yersinia enterocolitica, qui comprend des souches typiquement environnementales ainsi que des souches qui, bien qu'elles soient capables de se multiplier dans l'environnement, provoquent une lymphadénite mésentérique, une diarrhée et une entérite chez l'homme. Les deux sortes de Y. enterocolitica Les souches peuvent être distinguées bactériologiquement et sérologiquement. Cinq biogroupes (et deux sous-groupes du biogroupe 1) et plusieurs sérotypes sont reconnus, les souches environnementales se regroupent dans le biogroupe 1A, et les souches pathogènes sont membres des biogroupes 1B, 2, 3, 4 et 5 et appartiennent à un nombre relativement restreint de sérotypes (sérotypes O:3, O:4, O:5,27, O:8, O:9, O:13 et O:21) (8). Cependant, la différence la plus notable est que les souches pathogènes portent un plasmide (pYV) codant pour des protéines de virulence, telles que le Yersinia protéines externes (Yops) et les Yersinia l'adhésine A (YadA), qui bloque la phagocytose, l'opsonisation et l'activation du complément (13, 16, 23). Les souches pathogènes expriment également des facteurs de virulence codés dans les chromosomes, y compris le Yersinia entérotoxine (Yst), mucoïde Yersinia le facteur (Myf), l'invasine (Inv) et les protéines d'invasion de l'attachement (Ail) liées à l'invasion et à la résistance sérique (22, 44). Étant donné que ces bactéries se déplacent de l'environnement vers l'intestin puis se déplacent à travers les cellules M dans les tissus adjacents, il n'est pas surprenant que l'expression des gènes de virulence soit séquentiellement activée et désactivée par un ou plusieurs signaux servant de repères pour les milieux qu'elles rencontrent. (44). En conséquence, les protéines codées pYV sont exprimées à 37 ° C (la température corporelle de l'hôte), et l'expression de Yops nécessite également un contact bactérie-cellule eucaryote ou, in vitro, une disponibilité restreinte de Ca 2 ° (9, 11, 44) . L'expression de Yst et Inv in vitro est plus élevée à 23 °C et en phase stationnaire, mais les deux protéines sont également exprimées à 37 °C dans des conditions d'osmolarité et de pH adéquates. Ail et Myf sont exprimés à 37ଌ et sont également régulés par la tension d'oxygène et le pH, respectivement (23).

En plus de ces facteurs de virulence classiques, Y. enterocolitica les souches pathogènes diffèrent des souches environnementales par certaines propriétés de la membrane externe (MO). Lorsque ces bactéries se développent à 37ଌ, les MO des souches pathogènes sont plus résistantes aux peptides bactéricides que les MO des souches environnementales (4). De plus, les MO des souches pathogènes deviennent perméables aux sondes hydrophobes dans le milieu oxalate de Mg 2+ (utilisé pour générer les conditions de faible teneur en Ca 2+ qui induisent l'expression de pYV in vitro), alors que les MO des souches environnementales ne le font pas ( 4). Un fait complémentaire est que dans le même milieu d'oxalate de Mg 2+, une augmentation de la perméabilité est également observée dans les souches pathogènes guéries par pYV (4), suggérant que les facteurs déclenchant l'expression de pYV modulent la structure et la physiologie de l'OM au niveau chromosomique. Ces observations deviennent plus intrigantes lorsque le fait que Y. pseudotuberculosis et Y. pestis Les MO sont perméables aux composés hydrophobes dans les milieux standard est considérée (3), et par conséquent, il se peut que la perméabilité aux composés hydrophobes soit un trait partagé par tous les agents pathogènes. Yersinia spp. qui est régulé en pathogène Y. enterocolitica. Dans la présente étude, nous avons examiné cette hypothèse en testant les effets du pH acide, de la restriction du Ca 2&# x0002b et du contact avec les monocytes humains sur la perméabilité des Y. enterocolitica aux sondes hydrophobes. De plus, comme il est connu que la barrière de perméabilité est liée au moins en partie aux propriétés du lipopolysaccharide OM (LPS) (46, 47), nous avons également examiné cette molécule pour des changements chimiques et physico-chimiques liés aux changements de perméabilité. Nous rapportons ici que pathogène Y. enterocolitica souches modifient la perméabilité de la MO et la composition en lipides A en réponse à des facteurs connus pour réguler l'expression de Yersinia des protéines de virulence qui sont soit pYV, soit codées chromosomiquement.


Taches

Non seulement la plupart des bactéries sont très petites, mais elles sont également très claires et difficiles à voir au microscope sans coloration préalable. Vous devez attacher fermement vos bactéries à une lame de verre avant de pouvoir les colorer. Il y a deux choses importantes à considérer lors de la préparation d'une lame pour la coloration :

  1. Les bactéries doivent être dispersées uniformément et légèrement. S'il y a trop de bactéries sur la lame, elles formeront un gros globe et vous ne pourrez pas voir la morphologie des cellules individuelles. Les grosses gouttes de cellules ne se colorent pas correctement non plus et pourraient donner des résultats erronés en raison d'une coloration incorrecte.
  2. Les bactéries doivent être fermement attachées à la lame afin qu'elles ne soient pas lavées pendant les procédures de coloration. Toutes les procédures qui attachent les bactéries à la lame entraînent des changements morphologiques. Les cellules rétrécissent généralement en taille et présenteront des changements de forme et des matrices extracellulaires.

Vous préparerez des lames pour la coloration à partir des surfaces de bouillon et de gélose. Alors que les objectifs sont les mêmes pour les deux, les cellules uniformément et légèrement dispersées adhèrent fermement à la surface de la lame, les techniques sont légèrement différentes. La coloration est autant un art qu'une science. Il vous faudra sans aucun doute plusieurs essais avant de réussir.

Matériaux

  • Nettoyer les lames de verre
  • Inoculation d'anses ou d'aiguilles
  • Eau stérile
  • Stylo de marquage
  • Bouillons et assiettes de cultures assortis

Considérations de sécurité

Faites attention aux aérosols lorsque vous transférez des bactéries de votre anse à la lame. La boucle est très flexible et il est facile d'éliminer une boucle pleine d'organismes. Ne présumez pas que votre organisme est mort. Il n'est pas garanti que la fixation de la chaleur ou du méthanol tue l'organisme. Jetez vos lames terminées dans le seau désinfectant de votre paillasse.

Considérations générales

Vous recherchez une suspension légère de cellules qui laissera un léger dépôt trouble sur votre lame. Vous avez beaucoup de place sur votre toboggan, utilisez-le ! Il est utile de commencer par dessiner un cercle au bas de la diapositive afin que vous sachiez où chercher votre frottis. Il est très facile de se demander de quel côté de la lame se trouve votre frottis. Assurez-vous d'étiqueter le bord éloigné de la diapositive. Faites-le systématiquement sur la même extrémité de la diapositive pour vous aider à orienter votre diapositive.

Soyez patient et prenez le temps de laisser sécher votre lame à l'air libre avant de procéder à son adhésion à la lame. Si votre lame est mouillée et que vous la fixez à chaud, les bactéries vont bouillir et la morphologie cellulaire sera perdue. Si votre lame est mouillée et que vous la fixez dans du méthanol, elle sera très probablement lavée de la lame. Les frottis trop épais seront très probablement lavés de la lame, quelle que soit la méthode de fixation.

Frottis de bouillon

Les cultures en bouillon sont généralement plus faciles à travailler car les cellules sont déjà diluées dans le bouillon. Assurez-vous de mélanger soigneusement le tube de culture pour suspendre les bactéries dans le bouillon.

  1. Étiquetez votre diapositive. Transférez aseptiquement une boucle pleine d'organisme sur le centre de votre lame.
  2. Utilisez la partie plate de la boucle pour étaler la goutte de bouillon autour de la lame. Utilisez un mouvement circulaire en spirale pour étaler la goutte. Parce que le bouillon est plein de protéines, le frottis restera généralement étalé et ne perlera pas à la surface de la lame.
  3. Réglez la lame de côté pour sécher à l'air. Cela prendra au moins quelques minutes. Ne précipitez pas cette étape.

Frottis de la plaque

Vous pouvez retirer beaucoup d'organismes avec votre boucle. Vous pouvez utiliser une aiguille d'inoculation pour transférer votre organisme sur la lame. Assurez-vous d'utiliser de l'eau stérile pour diluer vos échantillons. L'eau du robinet ordinaire ou l'eau désionisée dans vos bouteilles de rinçage sont souvent contaminées par des bactéries.

  1. Étiquetez votre diapositive. Transférer aseptiquement une boucle pleine d'eau stérile au centre de la lame.
    • Cela sert à la fois à diluer vos bactéries et à vous donner quelque chose à répandre.
  2. Choisissez une colonie bien isolée.
  3. Piquez-le avec votre aiguille stérile, ou évidez légèrement le bord de la colonie avec votre anse stérile.
  4. Placez votre aiguille/boucle au centre de la goutte et avec un mouvement circulaire en spirale, étalez les bactéries sur la lame.
  5. Réglez la lame de côté pour sécher à l'air. Cela prendra au moins quelques minutes. Ne précipitez pas cette étape.

Fixation

La procédure de fixation est la même quelle que soit la source de frottis, la plaque ou le bouillon. Il existe deux méthodes pour faire adhérer vos bactéries à la lame, la fixation à la chaleur ou la fixation au méthanol. La fixation thermique n'est utilisée qu'avec les organismes BSL1. Les organismes avec lesquels nous allons travailler sont BSL2, vous devrez donc utiliser la technique de fixation du méthanol. La fixation thermique de la lame peut créer des aérosols et avec les organismes BSL2, nous devons éviter cela autant que possible. La fixation du méthanol provoque moins de changements dans la morphologie cellulaire et ne crée pas d'aérosols.

Soyez prudent lorsque vous travaillez avec le méthanol, si vous oubliez que vous l'avez fixé avec du méthanol et que votre lame n'est pas totalement sèche, le méthanol restant prendra feu.

Fixation au méthanol (BSL2)

  1. Assurez-vous que votre diapositive est totalement sèche. Placez-le sur le support de coloration au-dessus de l'évier.
  2. Inonder soigneusement la lame avec 95 % de méthanol. Laissez reposer pendant deux minutes.
  3. Inclinez la lame et versez le méthanol.
    • Touchez le bord de la lame avec une serviette en papier pour éliminer l'excès de méthanol.
  4. Mettez la lame de côté pour qu'elle sèche à l'air avant de la colorer.

Teinture simple

Les taches simples ne sont que cela - ajoutez une tache à une lame de frottis fixe, laissez-la reposer, rincez-la, laissez-la sécher et regardez. Il s'agit d'une procédure rapide pour déterminer la présence et la morphologie des bactéries dans les échantillons cliniques tels que les selles et les écoulements.

Le bleu de méthylène est utilisé pour déterminer la morphologie des fusiformes et des spirochètes dans les infections buccales. C'est aussi le colorant de choix pour identifier les granules métachromatiques dans Corynebacterium diphtheriae. Les granules coloreront un bleu nettement plus profond que les bactéries bleues environnantes. D'autres espèces de Corynébactérie n'ont pas les granules métachromatiques. Tous les colorants basiques, tels que le bleu de méthylène, le violet cristal, le vert malachite ou la safranine fonctionnent bien.

Les colorants basiques (cationiques ou chargés positivement) se lient aux composants chargés négativement de la membrane cellulaire et du cytoplasme.

Matériaux

  • Bleu de méthylène
  • Safranine
  • Violet cristallisé
  • Vert Malachite
  • Supports de coloration
  • Micro boîtes à outils
  • Lames de frottis préparées

Considérations générales

La coloration est à la fois un art et une science. Il n'y a pas de règles strictes pour les temps de coloration et de rinçage. Les heures indiquées sont des suggestions qui fonctionnent généralement bien. Vous devrez expérimenter ce qui fonctionne pour les bactéries que vous avez et les techniques que vous utilisez.

Il est essentiel que vous notiez exactement ce que vous faites et les résultats que vous observez dans votre livre de laboratoire. Vous répéterez ces taches plus tard dans le semestre et vous ne voulez pas perdre votre temps à réinventer votre procédure de coloration réussie. Il serait utile que chaque membre de la paillasse choisisse une tache différente afin que vous puissiez voir à quoi elles ressemblent toutes.

Procédure de coloration simple

  1. Placez vos lames de frottis fixes soigneusement préparées sur le support à taches au-dessus de l'évier.
    • Faites une diapositive à la fois.
    • Couvrez le frottis avec l'un des colorants de base à votre disposition.
    • Vous n'avez besoin que d'assez de colorant pour couvrir le frottis. La tache ne doit pas couler de la lame.
  2. Laissez la tache reposer pendant 1 à 5 minutes.
  3. À l'aide de la pince à linge, saisissez l'extrémité longue de la glissière, inclinez la glissière au-dessus de l'évier et rincez la tache avec un jet d'eau de la bouteille de lavage.
    • Assurez-vous de vaporiser au-dessus du frottis et de le laisser couler.
    • Si vous vaporisez directement sur le frottis, vous risquez de retirer le frottis de la lame.
    • Rincez jusqu'à ce que l'eau soit claire ou légèrement colorée.
  4. Touchez le bord de la lame avec une serviette en papier pour éliminer l'excès d'eau. Vous pouvez maintenant le laisser sécher à l'air libre. Alternativement, vous pouvez le sécher avec du papier buvard en le plaçant dans le livre de papier buvard et en appuyant légèrement. Bien que cette méthode soit plus rapide, vous pouvez également effacer un frottis mal adhéré.
  5. Visualisez votre diapositive sous immersion dans l'huile et notez vos observations dans votre cahier de laboratoire.
  6. Jetez vos lames tachées usagées dans le seau de désinfectant de l'évier.

Tache négative

Les taches négatives sont encore plus simples que les taches simples car vous n'avez pas à faire de frottis. Une goutte de cellules est étalée sur une lame et visualisée sans fixation. La tache est une suspension de carbone, trouvée dans l'encre de Chine ou la nigrosine. Les particules de carbone sont chargées négativement, tout comme la membrane cellulaire. L'arrière-plan est noir ou de couleur sépia et les cellules restent claires, car elles repoussent le colorant.

Certains corps d'inclusion chargés positivement, comme le soufre, peuvent tacher. Cette coloration donne des informations précises sur la morphologie cellulaire et la présence de capsules car les cellules ne sont pas fixées. La taille des cellules semble légèrement plus grande car les revêtements ou sécrétions extracellulaires à l'extérieur de la membrane cellulaire ne se colorent pas non plus. Les colorations négatives sont utiles pour déterminer rapidement la présence de Cryptococcus neformans, l'agent causal de la cryptococcose, dans le liquide céphalo-rachidien. Cette technique est également utilisée lorsque vous colorez des endospores et des capsules.

Matériaux

Considérations générales

Tout comme pour préparer un frottis, vous n'avez besoin que d'une petite quantité d'organisme. Si vous avez trop d'organismes, vous ne pourrez pas voir la morphologie des cellules individuelles. Il est également important de ne pas utiliser trop de nigrosine. S'il est trop épais, le fond aura un aspect fissuré semblable à des flaques de boue séchant au soleil. Vous voulez obtenir un film léger. Votre instructeur vous montrera cette technique.

Procédure de coloration négative

  1. Étiquetez votre diapositive. Si vous travaillez à partir d'une culture en bouillon, placez une boucle pleine d'organismes aux trois quarts environ du côté gauche de la lame. Si vous travaillez à partir d'une culture sur plaque, ajoutez une goutte d'eau stérile à la lame et diluez votre organisme dans la goutte sans étaler la goutte.
  2. Mettez une ou deux gouttes de nigrosine sur une autre lame. Utilisez votre boucle stérilisée pour ramasser une boucle pleine de nigrosine. Mélangez-le délicatement avec la goutte de cellules, sans trop étaler la goutte.

  1. Tenez l'extrémité droite de la diapositive dans votre main droite avec votre main gauche, prenez une autre diapositive à un angle de 45 ° ou moins par rapport à la première diapositive, juste après votre goutte de nigrosine/cellule.
  2. Ramenez la glissière coudée le long de la surface de la première glissière jusqu'à ce qu'elle seulement touche la goutte de nigrosine et les cellules. Attendez que l'action capillaire aspire le liquide le long du bord d'attaque de la glissière coudée.
  3. Poussez la glissière coudée sur la surface de la glissière plate. La plus grande partie de la nigrosine doit encore être laissée à l'endroit d'origine. Jeter la lame dans le seau de désinfectant.
  4. Réglez la lame tachée de côté pour sécher à l'air avant de l'observer sous immersion dans l'huile. Assurez-vous de commencer à examiner votre diapositive dans la zone avec le fond gris le plus faible.
  5. Notez vos observations dans votre cahier de laboratoire.
  6. Jetez votre lame tachée usagée dans le seau de désinfectant.

Note spéciale

La nigrosine se détache très facilement de la lame et sur votre objectif à immersion d'huile. Assurez-vous de bien nettoyer votre lentille à huile lorsque vous avez terminé. Puis nettoyez-le à nouveau. Une fois qu'il sèche sur l'objectif, il est très difficile à retirer et affectera votre capacité (et celle des autres micro-étudiants utilisant cette lunette) à voir clairement hors de l'objectif.

Coloration de Gram

La coloration de Gram est la coloration différentielle la plus couramment utilisée en microbiologie. Les teintures différentielles utilisent plus d'un colorant. Les composants cellulaires uniques des bactéries détermineront comment elles réagiront aux différents colorants. La procédure de coloration de Gram est restée pratiquement inchangée depuis son développement en 1884. Presque toutes les bactéries peuvent être divisées en deux groupes, Gram négatif ou Gram positif. Quelques bactéries sont à gram variable. Trichomonas, Strongyloïdes, certains champignons et certains kystes de protozoaires ont également une réaction de Gram. De très petites bactéries ou des bactéries sans paroi cellulaire, telles que Tréponème, Mycoplasme, Chlamydia, ou Rickettsia n'ont pas de réaction gramme. La caractérisation de toute nouvelle bactérie doit inclure leur réaction gram.

Typiquement, une tache différentielle a quatre composants : la tache principale, un mordant qui fixe la tache, un agent décolorant pour éliminer la tache principale et une contre-tache. Dans la coloration de Gram, la coloration primaire est le cristal violet. Cela donne à la cellule une couleur pourpre intense. Le mordant, l'iode, forme un complexe avec le cristal violet à l'intérieur de la paroi cellulaire. La cellule est ensuite lavée avec un décolorant de Gram ou de l'éthanol à 95 %. Les cellules Gram positives retiendront le complexe colorant et resteront violettes. Le colorant se rince dans les cellules à Gram négatif. Le contre-colorant, la safranine, est utilisé pour colorer les cellules qui ont perdu le colorant primaire, sinon elles resteraient incolores et vous ne seriez pas en mesure de les voir.

Le grand complexe cristal violet d'iode est retenu dans les parois cellulaires des cellules à Gram positif en raison de la structure moléculaire des nombreuses couches de peptidoglycane dans la paroi cellulaire. Il y a beaucoup d'acides teichoïques réticulés et le complexe iode-colorant ne peut pas sortir physiquement. Il y a aussi moins de lipides dans la membrane et l'agent décolorant ne peut pas non plus y pénétrer. Les cellules à Gram négatif ont une membrane externe et une seule couche de peptidoglycane, avec plus de lipides. Le colorant cristal violet est facilement lavé.

Considérations générales

La précision de la coloration de Gram dépend de l'intégrité de la paroi cellulaire bactérienne. Il y a une variété de choses qui peuvent influencer l'intégrité de la paroi cellulaire de vieilles cellules (c. la chaleur les a fixés. Dans ces conditions, les cellules gram-positives sortiront comme gram-négatives. Si vous décolorez trop longtemps, les cellules Gram-positives ressembleront à des cellules Gram-négatives. A l'inverse, si vous ne décolorez pas assez, les Gram-négatifs ressembleront à des Gram-positifs. La seule façon de faire confiance à vos résultats est de toujours exécuter un Gram-positif connu et un Gram-négatif connu sur la même lame. S'ils se colorent comme prévu, vous pouvez être à peu près sûr que le résultat de votre échantillon inconnu est fiable.

La coloration de Gram demande de la pratique pour réussir. Ne vous attendez pas à obtenir une bonne coloration de Gram du premier coup. C'est une bonne idée de tenir votre toboggan avec une pince à linge, vos gants deviendront assez psychédéliques, tout comme tout ce que vous toucherez !

Procédure de coloration de Gram

  1. Étiquetez votre diapositive. Préparez vos frottis sur une lame avec un Gram négatif à gauche, votre inconnu au milieu et un Gram positif à droite.
    • N'oubliez pas de réparer votre toboggan au méthanol !
  2. Déposez votre lame sur le support de coloration, recouvrez les frottis de cristal violet pendant 1 minute.
    • Utilisez juste assez de teinture pour couvrir complètement le frottis, mais pas au point qu'il coule ou s'égoutte de la lame.
  3. Inclinez la lame et versez le cristal violet et rincez brièvement à l'eau de votre pissette.
    • N'oubliez pas de ne pas vaporiser directement sur les frottis ou vous les laverez.
  4. Inonder la lame de mordant à l'iode pendant 1 minute.
  5. Inclinez la lame, versez l'excès d'iode et décolorez doucement avec le décolorant de Gram jusqu'à ce qu'il commence à devenir clair.
    • C'est la partie délicate !
  6. Inclinez votre lame sur des serviettes en papier pour éliminer l'excès de décolorant.
  7. Inondez votre lame de safranine pendant 1 minute.
  8. Inclinez la lame pour éliminer l'excès de safranine et rincez doucement à l'eau jusqu'à ce qu'elle soit claire.
  9. Laissez la lame sécher à l'air libre
  10. Observer sous immersion d'huile.
    • Le contrôle Gram positif doit être violet et le contrôle Gram négatif doit être rose.
  11. Jetez votre lame usagée dans le seau de désinfectant.

Teinture Capsule Rouge Congo

La coloration Congo Red Capsule est une modification de la coloration négative à la nigrosine que vous avez peut-être effectuée précédemment. Les bactéries absorbent le colorant rouge Congo et le fond est ensuite coloré avec un colorant acide fuchsine. La capsule ou les couches visqueuses, polymères hautement hydratés, excluent les deux colorants. L'arrière-plan apparaîtra en bleu, les cellules bactériennes apparaîtront en rose et les halos clairs seront les capsules.

Cliniquement, les capsules de certaines bactéries hautement pathogènes (ex : pneumocoques, Haemophilis influenzae, et méningocoques), peuvent être distingués grâce à l'utilisation d'antisérums spécifiques à ce type de capsule. Les bactéries sont mises en suspension dans les antisérums puis mélangées avec du bleu de méthyle. Dans la procédure de coloration des antisérums, les bactéries apparaîtront en bleu entourées d'un halo clair, puis entourées d'une fine ligne bleue à l'endroit où les antisérums se sont attachés à la capsule.

Matériaux

  • Tache rouge Congo
  • Tache acide à la fuchsine
  • Alcool acide
  • Klebsiella pneumoniae culture
  • Enterobacter aerogenes culture

Procédure de coloration de la capsule rouge Congo

  1. Placer une boucle pleine de Rouge Congo sur une lame
  2. Mélangez une petite quantité de votre organisme dans la goutte de Congo Red.
    • Bien étaler la suspension organisme/colorant sur la lame
  3. Laissez la lame sécher complètement à l'air.
    • Ne pas réparer au méthanol !
  4. Fixer la lame séchée avec de l'alcool acide pendant 15 secondes.
  5. Rincer à l'eau distillée et couvrir la lame de fuchsine acide pendant 1 à 5 minutes.
  6. Rincer à l'eau et laisser sécher à l'air.
  7. Examiner la lame sous immersion dans l'huile.
    • Les cellules se colorent en rouge/rose et les capsules apparaissent sous forme de halos incolores sur un fond bleu foncé.

Coloration endospore de Wirtz

La formation d'endospores est caractéristique de Clostridium et Bacille spp. La capacité de concentrer et d'enrober leur protoplasme leur permet de survivre aux conditions environnementales défavorables qu'ils connaissent dans leur habitat du sol. Cela permet également aux spores de résister à la coloration. Les organismes « vivants » sont facilement visualisés avec des colorations simples et des colorations de Gram.

Les endospores sont généralement très réfractiles, la lumière qui les frappe est déviée. De nombreux Bacille les espèces ont des corps d'inclusion hautement réfractiles. Ces corps d'inclusion peuvent ressembler à des endospores avec une coloration régulière. La présence d'endospores doit être confirmée par des colorations spécifiques aux endospores. La présence, la forme et la position caractéristiques des endospores nécessitent des procédures spéciales pour imprégner la couche d'endospores. La plupart des taches d'endospores impliquent de chauffer les lames tout en les gardant continuellement humides avec le colorant. Bien que plus rapide, il produit des produits chimiques volatils et n'est qu'un gros gâchis. Les mêmes résultats peuvent être obtenus en laissant reposer le colorant sur la lame pendant 30 minutes. C'est une bonne idée de commencer cette diapositive d'abord et de travailler sur une autre tache pendant que vous attendez que le colorant imprègne l'endospore.

Considérations générales

Vous utiliserez un Bacille espèces pour la coloration des endospores. La forme et la position de B. cereus les spores sont très semblables à celles de B. anthracis. Bacille ne commence pas à former des spores tant qu'il n'a plus de nourriture. Si les cultures sont trop jeunes, vous ne verrez surtout que les bâtonnets roses des bactéries. Si les cultures sont trop anciennes, vous ne verrez surtout que les petits ovales verts des endospores. Idéalement, vous devriez voir les corps ovales verts de l'endospore entourés de la cellule bactérienne végétative rose. Sélectionnez un échantillon au milieu d'une colonie avec l'aiguille d'inoculation droite pour les meilleurs résultats. Le bord de la colonie est toujours en croissance active et aura peu d'endospores.


Construction de bibliothèques d'ADN complémentaires directionnelles complexes dans SfiI

Tampons enzymatiques

Toutes les digestions par endonucléases de restriction ont été effectuées dans 0,5 à 2 × tampon KGB [2 × = 200 mM glutamate de potassium, 20 mM Tris–acétate, pH 7,6, 20 mM acétate de magnésium, 100 μg/ml d'albumine de sérum bovin (BSA) 1 mM 2-mercaptoéthanol (2-ME)]. 7 Les phosphorylations ont été réalisées dans 1 × tampon polynucléotide kinase [PNKB 1 × = 70 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 50 mètresM dithiothréitol (DTT)]. Les ligatures ont été réalisées soit dans 0,5 × KGB ou 1 × PNKB avec l'ajout d'ATP à une concentration finale de 1 mM.

Médias

SB : Bactotryptone, 32 g d'extrait de Bacto-levure, 20 g de chlorure de sodium, 5 g. Ajouter 1 litre de H bidistillé 2O et stériliser en autoclave

LB : Bacto-tryptone, 10 g d'extrait de Bacto-levure, 5 g de chlorure de sodium, 5 g. Les plaques sont préparées par addition de Bacto-agar, 15 g. Ajouter 1 litre de H bidistillé2O et stériliser en autoclave SOC : Bacto-tryptone, 20 g Extrait de Bacto-levure, 5 g 10 mM NaCl (2 ml de 5 M solution) 2,5 mM KCl (1,25 ml de 2 M solution) 10 mM MgCl2 (1 ml de 1 M solution) 10 mM MgSO4 (1 ml de 1 M solution) 20 mM glucose (2 ml de 1 M Solution). Ajouter 1 litre de H bidistillé2O, aliquoter et stériliser en autoclave


Résultats

Dégradation de la kératine à partir de cultures monospécifiques

La dégradation de la kératine a été testée dans des cultures en flacons agités avec un milieu liquide à la kératine (KLM) contenant 10 mg/mL de kératine. Après 4 jours de culture, la dégradation de la kératine a été évaluée par mesure du poids sec résiduel. La croissance de la population a été évaluée en comptant les unités formant colonies (UFC). X. rétroflexus a dégradé une quantité significativement plus importante de kératine (2,1 ± 0,2 mg/mL, écart type [SD]) (padj < 0,05, Lin.1) (Fig 1A) et atteint des nombres d'UFC significativement plus élevés, par rapport aux autres espèces individuelles (S8A Fig). Une dégradation de la kératine a été observée à partir de S. rhizophile, mais M. oxydans et P. amylolytique montré une capacité limitée pour éliminer la kératine du milieu. Nombre d'UFC dans les cultures de S. rhizophile et M. oxydans étaient supérieurs à ceux de P. amylolytique, qui affichait le nombre d'UFC significativement le plus bas (padj < 0.05, Lin.1) (S8A Fig). Les co-cultures ont augmenté le nombre de P. amylolytique (S8B Fig). La dégradation de la kératine a été normalisée par rapport au nombre d'UFC pour étudier le potentiel de dégradation de chaque espèce. Avec la normalisation CFU, X. rétroflexus et S. rhizophile étaient tout aussi efficaces dans la dégradation de la kératine et avaient une dégradation significativement plus élevée que M. oxydans (S9 Fig) (padj < 0.05, Lin.1). Calcul de la dégradation de la kératine par UFC pour P. amylolytique a été omis, car P. amylolytique n'a pas grandi en monoculture. Surnageants acellulaires de X. rétroflexus cultivée sur kératine n'a pas pu faciliter la croissance des autres souches, ce qui indique que l'environnement est très pauvre en nutriments et que la kératine dégradée est rapidement métabolisée. La dégradation de la kératine a également été soutenue par une alcalinisation observée des médias au fil du temps pour X. rétroflexus mono et co-cultures. Une alcalinisation a été observée pour ces cultures du pH initial de 7 vers pH 8,5.

S. rhizophile, X. rétroflexus, M. oxydans et P. amylolytique sont représentés par les lettres S, X, M et P, respectivement. Les co-cultures sont représentées par des lettres signifiant ses constituants de l'espèce unique, par ex. XS représente la co-culture de X. rétroflexus et S. rhizophile. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois répétitions biologiques. A) Dégradation de la kératine (mg/mL) pour les cultures mono-espèces après 4 jours d'incubation. Différentes lettres définissent le regroupement statistique (ordre croissant, padj < 0,05, Lin.1) B) Augmentation d'un facteur de la dégradation de la kératine dans les co-cultures de X. rétroflexus, par rapport au X. rétroflexus monoculture (indiquée par une ligne pointillée rouge). La différence statistique est déduite par Lin.3. C) Dégradation mesurée et théorique de la kératine (mg/mL) dans le X. rétroflexus monocultures et co-cultures. ‘Measured’ refers to the measured keratin degradation, whereas ´expected´ refers to the expected theoretical amount of keratin degraded by the given co-culture. The expected amount was calculated as follows: Expected XS co-culture degradation = Degradation potential of X. retroflexus in mono-culture per CFU * CFU count of X. retroflexus in XS co-culture + degradation potential of S. rhizophila in mono-culture per CFU * CFU count of S. rhizophila in the XS co-cultures. For convenience a complete calculation of the XS co-culture has been added as S12 Fig. Significant difference was inferred by a two-tailed independent two-sample t-test.

Keratin degradation in co-cultures

Degradation from co-cultivation was evaluated for all combinations of dual-species and the 4-species cultures. However, only co-cultures containing X. retroflexus had enhanced keratin degradation as compared to the best single species degrader of the individual co-cultures. X. retroflexus constituted the majority of these communities according to CFU counts (S8A Fig). The enhanced degradative effect of co-cultures had an average fold-change of 1.29, indicating that keratin degradation in co-cultures was on average enhanced by

30% as compared to X. retroflexus mono-cultures (Fig 1B). Co-cultures XM (mean fold change [MFC] = 1.297, p = 0.02, Lin.3), XP (MFC = 1.38, p < 0.01, Lin.3) and XSMP (MFC = 1.27, p = 0.03, Lin.3) displayed significantly enhanced keratin degradation (Fig 1B). Measurements of keratin degradation for all X. retroflexus mono and co-cultures are presented in S10A Fig. Although average total cell counts of co-cultures were not significantly different from that of X. retroflexus mono-cultures, keratin degradation was normalized to cell counts to account for potential variations. Measurements of keratin degradation normalised to CFU counts for all X. retroflexus mono and co-cultures are shown in S10B Fig. With CFU normalisation, the co-culture of XP and the four-species co-culture still had significantly enhanced keratin degradation compared to that in X. retroflexus mono-cultures (S10C Fig).

Community-intrinsic properties

To test for the presence of community-intrinsic properties, the measured degradation of the individual co-cultures was compared to the predicted maximum degradation from the sum of their constituent single species cultures (S11A Fig). Data included three biological replicates, yielding three measures of community degradation with associated measures of single species degradation. Notably, co-culture XP had a significantly higher mean degradation than the predicted maximum. The XM co-culture non-statistically supported the trend of co-cultures having higher degradation than the predicted level. However, comparing co-culture degradation to the sum of multiple single species cultures can make identification of community-intrinsic properties difficult. Instead co-culture degradation was compared to a normalised theoretical degradation of the co-culture, e.g. for the XS culture (Fig 1C) Expected theoretical degradation of the XS co-culture = Degradation potential of X. retroflexus in mono-culture per CFU * CFU count of X. retroflexus in XS co-culture + degradation potential of S. rhizophila in mono-culture per CFU * CFU count of S. rhizophila in the XS co-culture. For convenience a complete calculation of the XS co-culture has been added as S12 Fig. All co-cultures had a higher mean of measured keratin degradation, as compared to the theoretical degradation, indicating that community-intrinsic properties resulted in enhanced degradation. For co-cultures of XP and XSMP (p < 0.0073 and 0.0042 respectively, independent two-tailed t-test) the measured mean was significantly higher than the theoretical estimate. Normalizing with CFU revealed that co-cultures XP and the four-species community were still significantly more productive than the expected theoretical degradation (S11B Fig).

Quantitative PCR analysis for keratin adhered cells

Previous studies on microbial degradation of recalcitrant material have linked the degree of degradation to the amount of microbes physically associated to the material. Quantitative analysis using universal eubacterial primers targeting the 16S rRNA gene (qPCR) was used to address the number of cells adhered to the keratin particles, with the assumption that total bacterial cell counts on the particles could indicate a level of biofilm formation on the particles. QPCR analysis was performed on mono- and co-cultures after 2 and 4 days of incubation. Among the mono-cultures cultures of X. retroflexus contained significantly higher counts of copy numbers, as compared to any other type of mono-culture (S13A Fig, p < 0.001, Lin.1) at both time points. S. rhizophila displayed the second highest level of copy numbers, although it was not significantly different from M. oxydans et P. amylolyticus, (S13A Fig).

After two days of incubation only the co-culture XM contained higher amounts of attached cells, as compared to the X. retroflexus mono-culture (Fig 2). However, after 4 days of incubation all co-cultures contained more attached cells than the X. retroflexus mono-culture, suggesting that a synergistic biofilm production or attachment was at play during co-cultivation. Co-cultures of XM (MFC = 1.61, p = 0.018, Lin.3) and XP (MFC = 1.52, p = 0.014, Lin.3) displayed significantly higher numbers of attached cells, as compared to X. retroflexus mono-cultures. Co-cultures of XS and the four-species culture also presented higher fold change, although not significantly (Fig 2). Biofilm counts from co-cultures are included in S13B Fig.

Q-PCR analysis was based on universal eubacterial 16s rDNA gene primers. Keratin particles were isolated from mono- and co-cultures after 2 and 4 days of incubation. Counts of 16S gene copy numbers were believed to correspond to cells associated to the particles in a biofilm state. Co-culture counts were compared to counts of X. retroflexus mono-cultures. Dotted red line corresponds to the X. retroflexus mono-culture. Co-cultures are represented by letters of their constituent species e.g. X.retroflexus–S.rhizophila (XS), X.retroflexus–M.oxydans (XM) and X.retroflexus–P.amylolyticus (XP). At day 2, the level of adhered cells was not significantly different between co-cultures and the X. retroflexus mono-culture. At day 4, the co-cultures trended an increased fold change of adhered cells, as compared to the X. retroflexus mono-culture. Co-cultures of X.retroflexus–M.oxydans et X.retroflexus–P.amylolyticus had a significantly increased fold change (Lin. 3).

To further investigate the relevance of cell attachment in relation to keratin degradation, we performed a correlation analysis between measured keratin degradation, total cell counts in the supernatant and biofilm counts. The correlation analysis was performed on day 4 data of X. retroflexus mono- and co-cultures. Using Pearson’s correlation, a significant (padj = 0.04, FDR corrected p-value) strong positive (r = 0.98) correlation coefficient was observed between keratin degradation and biofilm counts. Oppositely, total CFU counts from the supernatant (as presented in S8 Fig) showed only a non-significant weak negative correlation with keratin degradation. Hence, biofilm formation on the keratin particles is a better predictor for keratin degradation than total CFU counts (S15 Fig and S2 Table). To further support this observation a Spearman’s ranked correlation approach was also adopted. Similar to the Pearson’s approach a strong positive correlation (rs = 1) was observed for keratin degradation and biofilm counts, although the correlation in this case was only nominal significant (p = 0.01667, padj = 0.14 with FDR correction). Again, total culture CFU and keratin degradation only showed a weak negative non-significant correlation (S15 Fig and S3 Table).

Enzymatic assays and protein measurements

Protease and keratinase activity were measured on a spectrophotometer using azocasein and azokeratin dyed substrates, respectively. Among mono-cultures, protease activity, keratinase activity and soluble protein concentration in the medium were found to increase with time for X. retroflexus et S. rhizophila (S16A–S16C Fig). Pour M. oxydans et P. amylolyticus, no clear proteinase and keratinase activity was observed, and protein content did not change over time. At day 4, the protease and keratinase activity of X. retroflexus was significantly higher than that of all other mono-cultures (protease: 39.42 ±2.34 U/mL, keratinase: 34.58 ±12.1 U/mL, standard deviation, Lin.1). S. rhizophila had the second highest proteinase and keratinase activity at day 4 (S16A and S16B Fig), which was significantly higher than M. oxydans et P. amylolyticus in regards to protease activity, but only nominal significant in regards to keratinase activity (protease: 12.26 ±1.96 U/mL, keratinase: 15.57 ±4.59 U/mL, standard deviation, Lin.1). X. retroflexus et S. rhizophila (0.29 ±0.01 mg/ml and 0.24 ±0.005 mg/ml respectively, SD) produced significantly higher amounts of soluble protein (Lin.1) compared to M. oxydans et P. amylolyticus, but there was no significant difference between the production from X. retroflexus et S. rhizophila (S16C Fig). At day 4, observed protease and keratinase activities for co-cultures of X. retroflexus were similar to that of X. retroflexus mono-cultures Only the protease activity of the XS co-culture deviated significantly, and was significantly lower (padj = 0.0118, Lin.1) (Fig 3A and 3B).

Lines represent a linear regression of three biological replicates across sampling time. A) Protease production by different co-cultures using azo-casein as substrate. One unit protease activity was defined (U) as the amount of protein that increased the absorbance by 0.01. B) Keratinase production by different co-cultures using azo-keratin as substrate. One unit keratinase activity was defined as the amount of protein that increases the absorbance by 0.01 under given conditions. C) Protein production from degraded keratin by different co-cultures. Bradford assay was used for protein quantification with BSA as standard.

When comparing changes in activity over time, steeper activity increases were observed for some co-cultures, as judged from linear slope’s coefficients. Slope coefficients and p-values have been appended as S4 Table. The slope coefficient for the four-species community was higher for both protease and keratinase activity (slope = 7.87 and p = 0.007 and padj = 0.0276 for protease activity slope = 8.03 and p = 0.0184 and padj = 0.0718 for keratinase activity, Lin.2) as compared to the X. retroflexus mono-culture, indicating an increased turn-over within the tested time-span. Co-cultures of XM and XP also trended a higher slope coefficient, although not significantly different (p = 0.0571 and padj = 0.2095 for XM p = 0.064 and padj = 0.2323 for XP, Lin.2).

Although slope coefficients of most co-cultures with X. retroflexus were higher, the soluble protein concentration did not vary significantly between these co-cultures and that of X. retroflexus mono-cultures (Fig 3C).

Observation of protease activity, keratinase activity and protein concentration was included in the correlation analysis with keratin degradation, total CFU counts and biofilm counts, with day 4 observations. For both the Pearson’s and Spearman’s ranked correlation analysis keratinase activity displayed a higher correlation coefficient with keratin degradation than protease activity. However, none of the correlations were significant (S14 and S15 Figs and S2 and S3 Tables). Of the three, protein concentration had the second highest correlation coefficients to keratin degradation, although not significant for neither Pearson’s nor Spearman’s ranked correlations.

Secretome analysis by mass spectroscopy

To further resolve the increased keratin degradation in co-culture, the secretome of X. retroflexus was assessed through LC-MS/MS-based proteomics profiling. Secretome profiling was restricted to X. retroflexus as it was i) the species with the highest potential for degradation and ii) constituted the majority of cells in the co-cultures making it unlikely to obtain good proteome coverage from the other species present in the co-cultures. Secretome profiling was conducted after two days of cultivation, as preliminary tests showed that secretome profiling quality was inversely proportional to incubation time due to build-up of keratin degradation products that hampered identification of secreted bacterial proteins over time. Identified proteins from X. retroflexus were mapped with i) function and subsystem features from the RAST database [60,61], ii) prediction of signal peptides for secretion to the extracellular environment using SignalP [64] and iii) MEROPS protease functions [32,63]. Data quality is summarised in S2–S7 Figs, and the materials and methods section. Identified proteins were filtered according to the presence of signal peptides based on SignalP [64], narrowing the search towards secreted and/or membrane exported proteins. Total counts of identified proteins after SignalP filtration are summarised in Fig 4. Noticeably, several proteins were uniquely observed in the co-culture sample and not in the mono-culture X. retroflexus échantillons.

Identified proteins from the secretome samples were filtered by i) removing the two outlying biological replicates and ii) removing proteins which did not contain a signal peptide. A) Identified proteins and their overlap between different sample groups, only requiring that the protein is observed in one sample of all biological replicates. B) Quantifiable proteins are defined as proteins which were detectable in 4 out of the 6 biological replicates of a given culture. From each co-culture type, only proteins shared with the X. retroflexus mono-culture were included in the differential abundance analysis.

Secretome differences of X. retroflexus in mono- and co-cultures were addressed by both a supervised and un-supervised statistical approach. A supervised approach was used to make pairwise comparisons of the secretome profiles of the X. retroflexus mono-cultures to X. retroflexus in the different co-cultures using paired t-test with FDR correction. An unsupervised approach (principal component analysis) was used to identify the proteins causing separation between the different culture types.

For the paired t-test the tested proteins were required to be present in four out of the six biological replicates in both of the compared groups. Fig 4 summarises counts and culture overlap of proteins included in the pairwise comparison. Pairwise comparison identified several proteins of X. retroflexus with a significantly changed abundance between the mono-culture and either the four-species or the XS co-culture (Table 1). Notably, many of the proteins with significant changes in abundance were hypothetical proteins without known functions in the RAST or MEROPS database. When comparing the mono-culture to any of the two co-cultures, the same serine protease (S08A) was found to be significantly more abundant in the mono-cultures. An additional predicted protease was significantly more abundant in the mono-cultures when compared to the four-species co-culture (S08A / U69). Oppositely, a glutathionine peroxidase family protein was significantly more abundant for both co-cultures as compared to the mono-culture. From the four-species co-cultures, a nikel transport family protein (NikM) and a PQQ-dependent oxidoreductase, gdhB family protein were also found to be significantly increased.

Significant proteins (after FDR correction, padj < 0.05) were only observed between mono- and co-cultures of X.retroflexus-S.rhizophila and the four-species culture. Proteins are listed according to their genome reference name (Protein ID) with the log2 fold change between mono- and co-culture and the FDR corrected p-value of the paired two-sided t-test. Proteins are mapped with RAST subsystem function (Function) and MEROPS functions (MEROPS). a The first part of the Protein ID’s (fig|305959.5) were removed from the presented IDs.

Proteins with a nominal significantly increased abundance were observed from comparison of the XM and XP co-cultures to the X. retroflexus mono-cultures, but no proteins presented a significantly changed abundance after FDR correction. Among these nominal significant proteins, the predicted S08A / U69 protease and a M28B protease were more abundant for the X. retroflexus mono-cultures when compared to the XP co-cultures, supporting that X. retroflexus alone had increased abundance of secreted proteases. For the XP co-culture, the glutathionine peroxidase family protein was also found to be nominal significantly more abundant than in the mono-cultures.

Principal component analysis did not yield a complete group separation on the two main axes (PCA1: 47.69% and PCA2: 35.97%). However, a trend was observed with co-cultures of XM, XP and the four-species separating away from the XS co-culture and X. retroflexus mono-cultures (S17 Fig). Focusing on the top ten features causing group separation in either direction of PCA1 and PCA2, revealed a similar protein profile as presented by the supervised approach (S18 Fig). For instance, the three proteins causing the largest separation on PCA2 were proteases, including two serine proteases and a metallo-protease, supporting that a large difference between the X. retroflexus mono-culture and the majority of the co-cultures was related to the abundance of secreted proteases. The protein with the strongest impact on group separation on both PCA1 and PCA2 was a chitinase. However, the effect from the chitinase was mostly due to its fluctuating presence and absence between culture groups, and not its abundance-variation between groups, which was revealed by performing a binary principal component analysis. Oppositely, the effect of the proteases on PCA2 could not be attributed to mere presence and absence between groups.


Affiliations

Department of Microbial Ecology, Netherlands Institute of Ecology, P.O. Box 50, Wageningen, 6700 AB, The Netherlands

Irene de Bruijn, Victor de Jager, Ruth Gómez Expósito & Jos M. Raaijmakers

Wageningen University and Research Centre, Laboratory of Phytopathology, P.O. Box 8025, Wageningen, 6700 EE, The Netherlands

Irene de Bruijn, Xu Cheng & Ruth Gómez Expósito

Departments of Pharmacology, Chemistry and Biochemistry Center for Marine Biotechnology and Biomedicine, Scripps Institution of Oceanography Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California at San Diego, La Jolla, San Diego, USA

Jeramie Watrous & Pieter C. Dorrestein

Department of Plant Biology & Pathology, Cook College, Rutgers, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ, 08901-8520, USA

Nrupali Patel & Donald Kobayashi

Wageningen University and Research Centre, Plant Research International, PO Box 16, Wageningen, 6700 AA, The Netherlands


W-JL, MX, WH, and S-XG designed the research and project outline. B-BL and M-ML performed the DNA extraction and physicochemical analysis. MN, Z-HL, and Z-YD performed the culture-dependent and culture-independent analyses. MN drafted the manuscript. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Funding. This work was financially supported by the Key Realm Rɭ Program of Guangdong Province (Grant No. 2018B020206001) and the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32061143043, 91951205, and 31800001). The Scientific Investigation Voyage supported by Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhuhai). The authors are grateful to the Deanship of Scientific Research, King Saud University for funding through Vice Deanship of Scientific Research Chairs.


1. Introduction

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Auparavant Actinobacillus actinomycetemcomitans) is a member of the Pasteurellaceae, a family of Gram-negative bacteria that includes many important human and animal pathogens. A. actinomycetemcomitans colonizes the human oral cavity and causes periodontitis and nonoral infections including endocarditis [1]. Clinical isolates of A. actinomycetemcomitans are known for their ability to form extremely tenacious biofilms on abiotic surfaces in vitro [2, 3]. Mutants that fail to form biofilms in vitro are unable to colonize the oral cavity of the rat or cause bone loss in a rat model of periodontitis [4, 5]. These findings suggest that biofilm formation is an important virulence factor in A. actinomycetemcomitans.

Tenacious biofilm formation by A. actinomycetemcomitans requires the production of adhesive, bundled, type IV pili (known as Flp-pili) that form on the surface of the cell [3, 6, 7]. Mutants that lack Flp-pili are deficient in surface attachment, autoaggregation, biofilm formation and colonization of the rat oral cavity [3, 5𠄷]. However, Flp-pili mutants still form weak biofilms on abiotic surfaces in vitro [6]. These findings indicate that additional adhesins mediate cohesion in A. actinomycetemcomitans biofilm colonies. Interestingly, biofilms produced by a Flp-pili mutant strain were sensitive to detachment by DNase I [6], which suggests that extracellular DNA (eDNA) may function as a biofilm matrix adhesin in A. actinomycetemcomitans.

Another major component of the A. actinomycetemcomitans biofilm matrix is a hexosamine-rich polysaccharide that is functionally and genetically related to extracellular polysaccharide adhesins produced by Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia coli et Actinobacillus pleuropneumoniae [8]. These polysaccharides, usually referred to as PNAG, PIA (polysaccharide intercellular adhesin), or PGA, consist of linear chains of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) residues in β(1,6) linkage (hereafter referred to as PGA). Various forms of PGA appear to differ in their molecular weight, in the degree of N-deacetylation of the GlcNAc residues, and in the presence of O-succinate substituents [9�]. PGA has been shown to play a role in abiotic surface attachment and intercellular adhesion [11�], protection from killing by antibiotics, antimicrobial peptides and phagocytes [12, 16], and virulence [17]. Dans A. actinomycetemcomitans, PGA has been shown to mediate intercellular adhesion and resistance to killing by the anionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) [8, 18].

The purpose of the present study was to gain better insight into the structure, synthesis and function of A. actinomycetemcomitans PGA. We purified PGA polysaccharide from a biofilm-producing clinical strain of A. actinomycetemcomitans and analyzed its chemical structure by using NMR spectroscopy. We also investigated the genetics of PGA production and the role of PGA in biofilm cohesion and detergent resistance in A. actinomycetemcomitans. In this report we present evidence that A. actinomycetemcomitans PGA is a β(1,6)-linked GlcNAc polymer that mediates intercellular adhesion and detergent resistance in A. actinomycetemcomitans biofilm colonies.


Surface Spreading Motility Shown by a Group of Phylogenetically Related, Rapidly Growing Pigmented Mycobacteria Suggests that Motility Is a Common Property of Mycobacterial Species but Is Restricted to Smooth Colonies

FIGUE. 1 . Smooth and rough colonies of M. chubuense (UNE), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The images are representative of hundreds of colonies obtained through the study. FIGUE. 2 . SEM images of smooth colonies of M. chubuense (UNE), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The right column shows the same sample as the left column but at greater magnification. These images are representative of the studies performed with six colonies of each species. FIGUE. 3 . SEM images of rough colonies of M. chubuense (UNE), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The right column shows the same sample as the left column but at greater magnification. These images are representative of the studies performed with six colonies of each species. FIGUE. 4 . Spreading of smooth colonies on motility medium after 6 days of growth. (UNE) M. chubuense (B) M. gilvum (C) M. obuense (RÉ) M. parafortuitum (E) M. vaccae. Arrows indicate the external margins of the colonies. The right column shows pictures obtained with a binocular stereomicroscopy. These images are representative of the studies performed with 10 colonies of each species. FIGUE. 5 . Spreading of rough colonies on motility medium after 6 days of growth. (UNE) M. chubuense (B) M. gilvum (C) M. obuense (RÉ) M. parafortuitum (E) M. vaccae. Arrows indicate the external margins of the colonies. In the right column are pictures obtained with a binocular stereomicroscopy. These images are representative of the studies performed with 10 colonies of each species. FIGUE. 6 . TLC images of chloroform-methanol extracts from M. vaccae (lanes 1 and 2), M. gilvum (lanes 3 and 4), M. obuense (lanes 5 and 6), M. chubuense (lanes 7 and 8), and M. parafortuitum (lanes 9 and 10). In the odd-numbered lanes, extracts are from smooth colonies, and in the even-numbered lanes, extracts are from rough colonies. TLC was developed with methanol-chloroform (90:10, vol/vol) and revealed with anthrone. Red spots indicate SP and SP-L. FIGUE. 7 . Cellular adhesion of smooth and rough variants of M. chubuense (UNE), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E) strains to glass tubes at 1, 2, 3, 4, and 7 days of incubation. The cellular adhesion level is expressed as the number of CFU/cm 2 . The results are expressed as means ± standard deviations obtained from triplicates. The results are representative of one out of three independent experiments. Cellular adhesion levels of smooth variants were significantly higher than those of rough variants (*, P < 0.05 **, P < 0.01). Cellular adhesion levels of rough variants were significantly higher than those of smooth variants (&, P < 0.05). FIGUE. 8 . Cellular adhesion of smooth and rough variants of M. chubuense (UNE), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E) strains to polystyrene tubes at 1, 2, 3, 4, and 7 days of incubation. The cellular adhesion level is expressed as the number of CFU/cm 2 . The results are expressed as means ± standard deviations obtained from triplicates. The results are representative of one out of three independent experiments. Cellular adhesion levels of smooth variants were significantly higher than those of rough variants (**, P < 0.01). Cellular adhesion levels of rough variants were significantly higher than those of smooth variants (&&, P < 0.05).


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