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Comment les agents chaotropiques aident à la purification de la molécule d'ADN ?

Comment les agents chaotropiques aident à la purification de la molécule d'ADN ?


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Ces plantes qui sont riches en métabolites secondaires et en polysaccharides, l'isolement de l'ADN peut-il être fait à l'aide de certains agents chaotropes ? quelqu'un peut-il expliquer comment cela fonctionne?


Les agents chaotropes sont des cosolutés qui peuvent perturber le réseau de liaisons hydrogène entre les molécules d'eau et réduire la stabilité de l'état natif des protéines en affaiblissant l'effet hydrophobe. un agent chaotrope réduit la quantité d'ordre dans la structure d'une protéine formée par les molécules d'eau, à la fois dans la masse et les enveloppes d'hydratation autour des acides aminés hydrophobes, et peut provoquer sa dénaturation (biochimie). Un agent chaotrope est souvent utilisé dans l'isolement de l'ADN. Son but est

une. Dégrader les lipides membranaires

b. Pour détruire le réticulum endoplasmique

c. Dégrader les mitochondries

ré. Limiter la quantité de sels de magnésium dans le lysat

e. Détruire la structure tridimensionnelle des protéines

Pour faire simple, un agent chaotrope détruit la structure 3D d'une protéine, entraînant ainsi une dégradation ultérieure de la protéine. Il sert d'enzyme protéinase, nettoyant les protéines cellulaires dans votre processus d'isolement et de purification de l'ADN.

http://www.hindawi.com/journals/bmri/2009/574398/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16152629


Les étapes de la méthode sont la lyse, la liaison, le lavage et l'élution. [1] [2] Plus précisément, cela implique la lyse des cellules cibles pour libérer des acides nucléiques, la liaison sélective de l'acide nucléique à une membrane de silice, l'élimination des particules et des inhibiteurs qui ne sont pas liés à la membrane de silice, et l'élution de la membrane nucléique. acide, le résultat final étant un acide nucléique purifié dans une solution aqueuse.

Pour la lyse, les cellules (sang, tissus, etc.) de l'échantillon doivent subir un traitement pour rompre la membrane cellulaire et libérer l'acide nucléique. Selon le matériau cible, cela peut inclure l'utilisation de détergent ou d'autres tampons, de protéinases ou d'autres enzymes, le chauffage à différentes durées/températures, ou une perturbation mécanique telle que la coupe avec un couteau ou un homogénéisateur, à l'aide d'un mortier et d'un pilon, ou de billes. battre avec un moulin à billes.

Pour la liaison, une solution tampon est ensuite ajoutée à l'échantillon lysé avec de l'éthanol ou de l'isopropanol. L'échantillon dans la solution de liaison est ensuite transféré dans une colonne de centrifugation et la colonne est placée soit dans une centrifugeuse, soit sous vide. La centrifugeuse/vide force la solution à traverser une membrane de silice qui se trouve à l'intérieur de la colonne de centrifugation, où, dans les bonnes conditions ioniques, les acides nucléiques se lieront à la membrane de silice, tandis que le reste de la solution passe à travers. Une fois le matériau cible lié, le flux continu peut être supprimé.

Pour le lavage, un nouveau tampon est ajouté sur la colonne, puis centrifugé/vide à travers la membrane. Ce tampon est destiné à maintenir les conditions de liaison, tout en éliminant les sels de liaison et autres contaminants restants. En général, il faut plusieurs lavages, souvent avec des pourcentages croissants d'éthanol/isopropanol, jusqu'à ce que l'acide nucléique sur la membrane de silice soit exempt de contaminants. Le dernier « lavage » est souvent une étape sèche pour permettre à l'alcool de s'évaporer, ne laissant que des acides nucléiques purifiés liés à la colonne.

Enfin, l'élution est le processus consistant à ajouter une solution aqueuse à la colonne, permettant à l'acide nucléique hydrophile de quitter la colonne et de revenir en solution. Cette étape peut être améliorée avec du sel, du pH, du temps ou de la chaleur. Enfin, pour capturer l'éluat/éluant, la colonne est transférée dans un microtube propre avant une dernière étape de centrifugation.

Même avant les méthodes d'acide nucléique employées aujourd'hui, on savait qu'en présence d'agents chaotropes, tels que l'iodure de sodium ou le perchlorate de sodium, l'ADN se lie à la silice, aux particules de verre ou aux algues unicellulaires appelées diatomées qui protègent leurs parois cellulaires avec de la silice. Cette propriété a été utilisée pour purifier l'acide nucléique en utilisant de la poudre de verre ou des billes de silice dans des conditions alcalines. [3] Cela a été amélioré plus tard en utilisant le thiocyanate de guanidinium ou le chlorhydrate de guanidinium comme agent chaotrope. [4] Pour faciliter la manipulation, l'utilisation de billes de verre a ensuite été remplacée par des colonnes de silice. Et pour permettre l'utilisation d'instruments d'extraction automatisés, il y a eu le développement de billes paramagnétiques recouvertes de silice, plus communément appelées extraction à "billes magnétiques".


Watson et Crick

Appelés à l'origine James D. Watson et Francis Crick, ils ont utilisé les informations de diffraction des rayons X fournies par Rosalind Franklin pour détecter la construction en double spirale de la molécule d'ADN en 1953. Comme décrit précédemment, l'ADN a été principalement identifié dans les années 1860 par Friedrich Miescher et non par James Watson et Francis Crick comme beaucoup de gens le croient.

Après la découverte de Miescher, une longue concaténation de tentatives de recherche Watson et Crickof a été menée par plusieurs autres scientifiques, comme Phoebus Levene et Erwin Chargaff pour découvrir plus d'informations privilégiées sur la molécule d'ADN, ses principaux constituants chimiques et le mécanisme par lequel ils se sont joints Sûrement, sans cette fondation de base construite par d'anciens scientifiques, Watson et Crick n'auraient jamais pris leur décision mémorable en 1953 - La construction en 3 dimensions de la double spirale. Après la découverte de Miescher, d'autres scientifiques continué à analyser la ‘nucléine ‘ ou la molécule d'acide désoxyribonucléique. Le biochimiste russe Phoebus Levene, ancien médecin avant d'être chimiste, était en particulier un chercheur fécond qui a publié plus de 700 documents sur les molécules biologiques et la science chimique tout au long de sa vocation.

Bien avant la découverte de l'ancre sucre et phosphate, au début de l'appel de Levene, personne ne connaissait l'accord des acides nucléiques à l'infini. La pensée de Levene était une construction tétranucléotidique avec un ordre de séquence invariable, par exemple G C T A G C T A G C T Aaˆ¦.etc..

La grande variabilité de l'ordre des acides nucléiques prouva cependant que sa pensée était trop simpliste. Sa pensée, néanmoins, est précise d'une manière que les bases de l'ADN sont ordonnées en série dans les codons et composées de trois constituants, un groupe phosphate, une base individuelle contenant de l'azote et un ribose (dans l'ARN) ou un désoxyribose (dans l'ADN) molécule de sucre le long du tronçon d'ADN ou d'ARN. En outre, deux classes de bases azotées basiques, les purines (A (A) et G (G)) avec deux cycles d'amalgame et les pyrimidines (T (T), C (C) et uracile (U)) avec un cycle individuel. De plus, l'ARN contient simplement A, C, G et U alternativement de T, tandis que l'acide désoxyribonucléique contient A, C, G et T alternativement de U comme illustré dans la figure ci-dessous. Nature.

com [ Purines et Pyrimidines ] La catégorisation des bases contenant de l'azote de l'ADN et leur constructionErwin Chargaff ‘s constatent que A=T et C=G et les informations importantes sur les rayons X révélées par Rosalind Franklin et Maurice Wilkins soutiennent la proposition de Watson et Crick ‘s de la double spirale tridimensionnelle de l'ADN. Outre la technique avancée développée par Linus Pauling, un biochimiste, qui permet d'anticiper la construction tridimensionnelle de molécules à condition que les distances moléculaires et les angles de liaison ont aidé Watson et Crick à trouver. Pauling a proposé un autre compte rendu théorique de la construction d'ADN en 3 dimensions quelques mois seulement avant que Watson et Crick ne proposent le leur. Ce qui les a un peu inquiétés jusqu'à ce que son récit théorique se soit révélé faux. Comme pour mettre en place un mystificateur, Watson et Crick ont ​​placé des découpes de panneaux de composition représentant les différents constituants chimiques des bases et des unités monétaires fractionnaires de nucléotides sur leurs bureaux, cherchant à prédire la construction correcte. cela conviendrait parfaitement.

Cela a été rendu possible après qu'ils aient parfaitement compris comment la thymine et les différents éléments de G ‘s étaient configurés, sur la pensée d'un scientifique américain, Jerry Donohue. Leur construction proposée, néanmoins, reflétait en plus la réglementation de Chargaff. Au cours des âges anciens, les scientifiques ont apporté quelques modifications au compte théorique de Watson et Crick, ou l'ont modifié, mais les quatre principales caractéristiques sont restées les mêmes aujourd'hui : l'acide désoxyribonucléique est une double spirale maintenue par des liaisons H. A=T et C=G.Tous les ADN, à l'exception de l'ADN-Z, sont des doubles spirales pour droitiers.La double spirale de l'ADN est antiparallèle.La spirale à l'extérieur des bases N liées les unes aux autres en interne est exposée et capable de liaison H plus éloignée .


Lyse

Même si des molécules d'ADN peuvent littéralement être trouvées dans les rues, l'ADN d'intérêt est généralement enfermé dans une cellule. Pour obtenir l'ADN, un processus appelé lyse (grec &lambdaύ&sigma&iota&sigmaf, lýsis de lýein "séparer") est nécessaire : la paroi cellulaire (si présente) et la membrane sont rompues, permettant à tout ce qui était auparavant enfermé dans la cellule d'être libéré en solution : ADN, ARN , protéines, lipides et métabolites.

Les tampons de lyse pour l'ADN génomique comprennent généralement un détergent, du chlorure de sodium, de l'EDTA et des enzymes pour dégrader les protéines et l'ARN.

Les détergents ioniques tels que le SDS déstabilisent fortement la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. Solubilisant les lipides membranaires, ils forcent enfin la rupture de la structure cellulaire et favorisent la précipitation des lipides et des protéines. L'EDTA aide à déstabiliser la paroi cellulaire, mais sa tâche principale est d'inhiber l'activité de la DNase en chélatant des cations divalents tels que Mg 2+ . En ce qui concerne la dégradation des protéines, la protéase K est la protéase la plus couramment utilisée directement dans la solution de lyse. Les conditions qui favorisent l'inactivation des enzymes comme les détergents, les sels chaotropiques, les températures élevées et les changements de pH sont bien tolérées par la protéinase K. Outre sa grande stabilité, la protéinase K est caractérisée par un grand nombre de sites de clivage et donc parfaitement adaptée pour éliminer les protéines cellulaires et nucléaires qui sont attachés à l'ADN. L'ARN est également dégradé par voie enzymatique. La ribonucléase RNase A, qui hydrolyse les molécules d'ARN en nucléotides simples, est également thermostable et, comme la protéinase K, elle n'a pas besoin de cofacteurs qui pourraient être complexés par l'EDTA.

En revanche, d'autres enzymes telles que le lysozyme ne résistent pas aux conditions de lyse. Le lysozyme digère efficacement la paroi cellulaire bactérienne (composée de peptidoglycane), mais l'enzyme est inhibée par des agents tensioactifs comme le SDS. C'est pourquoi pour l'isolement de l'ADN à partir de bactéries (gram-positives), le traitement au lysozyme est effectué avant la lyse.

David contre Goliath : les plasmides récupèrent en premier !
Concernant les procaryotes et les levures, les isolements de plasmides sont au moins aussi importants que l'isolement d'ADN génomique. Bien qu'ils soient constitués des mêmes éléments constitutifs et qu'ils soient tous deux double brin, ces deux types d'ADN peuvent être clairement séparés pendant la procédure d'isolement. Les plasmides de bas poids moléculaire sont facilement purifiés à partir d'ADN génomique de haut poids moléculaire en fonction de leur solubilité et de leur taux de ré-annelage.

La méthode préférée pour l'isolement de l'ADN plasmidique est la lyse alcaline, une technique inventée en 1979 (Birnboim & Doly, 1979). Il fonctionne parfaitement pour les plasmides conventionnels d'une taille inférieure à 15 kpb. Le culot de cellules bactériennes est remis en suspension dans du tampon Tris avec EDTA et RNase A. Le tampon de lyse, contenant NaOH et SDS, est ajouté aux cellules homogénéisées et les solutions sont mélangées par inversion douce. Pour l'isolement de l'ADN plasmidique, la présence de sels chaotropes pendant la lyse est contre-productive et empêchera la séparation du plasmide du chromosome. Ainsi, contrairement au tampon de lyse pour l'ADN génomique, aucun sel chaotropique ne doit être ajouté à la solution de lyse alcaline. De plus, les temps d'incubation prolongés dans la solution de lyse doivent être évités, car ils comportent le risque de dénaturation irréversible de l'ADN plasmidique.

L'incubation des cellules dans des conditions alcalines conduit à la dénaturation à la fois des espèces d'ADN, des plasmides et de l'ADN génomique.

Au cours de la lyse, du fait de la solubilisation des macromolécules, la solution devient plus claire et très visqueuse.

En ajoutant une solution d'acétate de potassium/acide acétique, le mélange est neutralisé et toutes les macromolécules à l'exception de l'ADN plasmidique sont précipitées. Ceci est réalisé car le petit ADN plasmidique circulaire se renature rapidement. En revanche, les brins d'ADN génomique plus longs et enchevêtrés restent séparés, collés ensemble avec des protéines dénaturées et recouverts de molécules SDS. Les ions potassium dans le tampon de neutralisation remplacent les ions sodium SDS et conduisent à la formation d'un précipité blanc et trouble (Ish-Horowicz & Burke 1981) qui est, avec les débris cellulaires résiduels, sédimenté par centrifugation. L'ADN plasmidique renaturé, non affecté par le grand nombre d'interactions intermoléculaires, reste dans le surnageant et est ensuite purifié.

Le point crucial du processus de séparation est d'éviter un mélange vigoureux ou un vortex pendant la lyse et la neutralisation, car l'ADN génomique se brise facilement en petits fragments qui finiront par contaminer le plasmide contenant le surnageant. L'ADN est très résistant aux influences chimiques, mais plus la chaîne est longue, plus la molécule d'ADN est sensible aux forces physiques. Il est inévitable que les gros chromosomes d'ADN se brisent pendant le processus de purification, mais tant qu'ils ne sont pas fragmentés en petits morceaux, cette rupture n'est pas désavantageuse. Même le contraire est le cas : les réactions PCR ultérieures sont plus efficaces en raison de la meilleure fusion de l'ADN rompu.

Le nettoyage final de la solution plasmidique peut être effectué en utilisant les mêmes méthodes que pour l'ADN génomique, par ex. par extraction au phénol-chloroforme, précipitation à l'éthanol ou à l'aide d'une colonne de silice. Cette dernière méthode est la plus populaire aujourd'hui, car elle est très rapide et fournit un ADN plasmidique de haute qualité, adapté à la transformation, à la digestion enzymatique, à la mutagenèse, etc.


Conclusion

La méthode décrite dans cette étude est très efficace et économique pour isoler l'ADN bactérien de la communauté à partir d'une quantité minimale d'échantillons humains et environnementaux. La qualité et la quantité d'ADN extrait conviennent à diverses applications en aval, notamment la digestion par enzyme de restriction, l'amplification PCR à l'aide d'un adaptateur de séquençage et des amorces marquées par code-barres utilisées pour les réactions NGS. Par rapport aux deux méthodes attestées, le kit et le système automatisé d'extraction d'acide nucléique, la récupération de l'ADN communautaire dans la méthode THSTI est considérablement plus élevée. Une limitation de la présente méthode est la durée d'extraction de l'ADN de l'échantillon. Cela est possible, compte tenu de la qualité, de la quantité et de l'adéquation de l'ADN isolé pour des applications ultérieures en aval.


Matériaux et méthodes

Échantillons cliniques

Un total de 265 paires d'échantillons (un GEB et un échantillon de caillot) ont été obtenus à partir de spécimens archivés dans notre biodépôt. Les échantillons ont été obtenus à partir de deux ensembles d'échantillons : des échantillons archivés de femmes se présentant pour un accouchement à l'hôpital municipal Camiri de Camiri, en Bolivie (n = 100) [15] et des échantillons collectés à l'hôpital municipal de San Juan de Dios, à Santa Cruz, en Bolivie ( n = 165) [16,17].

Déclaration d'éthique

Le protocole d'étude à l'hôpital municipal Camiri a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'école de santé publique Johns Hopkins Bloomberg, de l'Asociacion Benefica PRISMA (Lima, Pérou) et de l'Universidad Catolica Boliviana (Santa Cruz, Bolivie).

Le protocole d'étude à l'hôpital municipal de San Juan de Dios a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de la Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health (Baltimore, MD, États-Unis), de l'Universidad Catolica Boliviana (Santa Cruz, Bolivie) et de l'Université de Californie à San Francisco. École de médecine (San Francisco, Californie, États-Unis).

Collecte d'échantillons

Le sang périphérique d'individus suspectés de maladie de Chagas a été collecté dans des tubes avec EDTA et des tubes sans additifs. Le sang obtenu sans additifs a été laissé au repos pendant au moins 30 min pour laisser le caillot se former (pas plus de 60 min) puis centrifugé à 1100 x g pendant 20 min [18]. Après avoir transféré le sérum, le caillot a été congelé à -80°C et expédié avec de la neige carbonique au laboratoire de recherche infectieuse de l'Universidad Peruana Cayetano Heredia à Lima, au Pérou. A leur arrivée, les échantillons ont été immédiatement stockés à -80°C jusqu'à leur utilisation. Le sang obtenu avec l'EDTA a été immédiatement mélangé avec un volume de chlorhydrate de guanidine 6M/EDTA 0,2M, pH = 8,0 (GE), expédié et stocké à 4°C jusqu'à utilisation [19].

Extraction d'ADN

Des échantillons de sang mélangés à de la guanidine/EDTA (GEB) ont été traités à l'aide du kit de préparation de modèles de PCR High Pure (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne) comme décrit précédemment [12,20]. L'extraction a été réalisée à l'aide de 300 l de GEB et 5 l (40 g/μl) d'un contrôle d'amplification interne (IAC), ont été ajoutés à chaque échantillon au début du processus de purification pour assurer la qualité du processus de purification de l'ADN et l'absence des inhibiteurs de PCR.

Les échantillons de caillots ont été initialement homogénéisés à l'aide de la machine FastPrep, puis extraits à l'aide du kit de préparation de modèles de PCR High Pure. Brièvement, 300 l de caillot, 300 l de Guanidine/EDTA (GE), 40 l de Protéinase K (20 mg/ml) et 5 l d'IAC (40 g/μl) ont été placés dans un tube Lysing Matrix E (MP Biomedicals , Santa Ana, Californie). Le mélange a été traité par FastPrep à 5,5 m/s pendant 30 secondes puis centrifugé à 14 000 x g pendant 2 minutes à température ambiante. Un total de 450 l de surnageant a été transféré dans un nouveau tube et 150 l de tampon de liaison du kit de préparation de matrice de PCR High Pure (Roche Diagnostics) ont été ajoutés. Le mélange a été incubé à 70°C pendant 10 min et le processus d'extraction a été réalisé à l'aide du kit de préparation de matrice PCR High Pure (Roche Diagnostics).

Initialement, les matrices de lyse C, F, H et J ont été testées en utilisant un caillot sanguin enrichi, seules les matrices de lyse E et les matrices de lyse H ont donné des résultats comparables tels que mesurés par les valeurs de Cq. Cependant, la matrice de lyse E a été choisie car les résultats étaient plus reproductibles.

Échantillons de sang dopés

Les courbes standard pour la quantification de la charge parasitaire ont été construites à l'aide d'un isolat (BIO-6398) de Santa Cruz, Bolivie identifié comme TcDTU V suivant la méthodologie de typage décrite précédemment [21]. Pour construire la courbe, 9 ml de sang total extrait à l'EDTA de sujets séronégatifs ont été additionnés de 1 ml de 10 6 parasites cultivés au stade épimastigote/ml en suspension dans du PBS [22]. Après avoir correctement mélangé l'échantillon, l'ADN a été extrait comme décrit pour les échantillons cliniques GEB.

De même, pour construire une courbe standard pour les échantillons de caillots, 9 ml de sang extrait sans additifs ont été additionnés de 1 ml de 10 6 parasites/ml en suspension dans du PBS immédiatement après le prélèvement du sang et soigneusement mélangés en retournant le tube pendant au moins 20 fois. . L'échantillon enrichi a ensuite été laissé au repos pendant au moins 30 min pour permettre au caillot de se former (pas plus de 60 min). Le caillot a ensuite été récupéré après centrifugation à 1100 x g pendant 20 min. L'ADN du caillot a été extrait comme décrit pour les échantillons de caillots cliniques.

Contrôle d'amplification interne

Pour assurer une purification adéquate de l'ADN, un plasmide recombinant (pZErO-2) contenant le gène de l'aquaporine de Arabidopsis thaliana comme contrôle d'amplification interne extrinsèque hétérologue (IAC) a été utilisé [12,20,23]. Le plasmide recombinant a été fourni par le laboratoire du Dr Alejandro Schijman (INGEBI-CONICET, Argentine).

Autres tests de diagnostic

Le diagnostic de la maladie de Chagas dans les échantillons humains était basé sur des tests sérologiques. ELISA a été réalisé en utilisant Chagatek Wiener Recombinante v3.0 ELISA (laboratoires Wiener, Rosario-Argentine). Le test d'hémagglutination indirecte (IHA) a été réalisé à l'aide du kit Chagas Polychaco (Laboratoires Lemos, Buenos Aires-Argentine). L'analyse Western blot a été réalisée en utilisant l'antigène TESA récolté à partir de T. cruzi Croissance de la souche Y dans les cellules LLC-MK2 comme décrit précédemment [24].

Pcr en temps réel

Une qPCR duplex a été réalisée ciblant la séquence satellite du génome nucléaire de T. cruzi et la séquence d'un contrôle d'amplification interne [25]. La réaction qPCR a été réalisée comme décrit précédemment en utilisant 5 l d'ADN remis en suspension dans un volume final de 20 l [12]. Le Mastermix était composé de 1X FastStart Essential DNA Probes Master (Roche Diagnostics GmbH Corp., Mannheim, Allemagne), 0,75 M de chaque amorce Cruzi1 et Cruzi2, 0,1 M de chaque amorce IACFor et IACRev, et 0,5 M de chaque sonde Cruzi3 et sonde IACtq . Les conditions de cyclage étaient une première étape de 10 min à 95 °C suivie de 40 cycles à 95 °C pendant 15 secondes et 58 °C pendant 1 minute.

L'analyse des données

La qPCR d'un échantillon était considérée comme valide lorsque le Cq correspondant à l'amplification de son IAC était inférieur au 75 e centile plus 1,5 l'intervalle interquartile de la médiane de chaque lot d'extraction (CqIAC<75 e centile + 1,5*IQR).

Les valeurs de Cq pour l'échantillon clinique positif ont été normalisées par rapport à l'efficacité de la procédure d'extraction d'ADN mesurée par l'amplification de l'IAC. La formule suivante a été utilisée : Cqni = Cq IACposition / CqIACnégatif, où Cqni est la valeur Cq normalisée pour un échantillon positif donné, Cq IACposition est la valeur moyenne du Cq IAC pour les contrôles positifs, et le CqIACnégatif est la valeur moyenne de Cq IAC pour les contrôles négatifs inclus dans la plaque.

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de Stata14 (Stata Corp, College Station, TX). Des tabulations à double entrée des fréquences et des moyennes ont été effectuées. Les résultats des tests initiaux des différentes matrices de lyse ont été comparés à l'aide du test de Kruskal Wallis. Les intervalles de confiance et le test de McNemar ont été utilisés pour comparer la fréquence des résultats de la PCR. Les valeurs moyennes de Cq ont été comparées à l'aide du test de McNemar. La concordance entre les résultats de la qPCR des échantillons de caillot et de GEB a été évaluée à l'aide de la statistique kappa.


Nettoyage de l'ADN : 5 méthodes

1. Extraction de phénol-chloroforme

L'extraction au phénol et au chloroforme, normalement suivie d'une précipitation à l'éthanol, est la méthode traditionnelle pour éliminer les protéines d'un échantillon d'ADN. Dans cette procédure, la solution d'ADN est mélangée avec du phénol et du chloroforme. L'ADN soluble dans l'eau se répartit dans la phase aqueuse, tandis que les protéines se dénaturent en présence de solvants organiques, restant ainsi dans la phase organique. La phase aqueuse contenant l'ADN sans protéine est alors prête à être collectée.

Avantages : Un moyen peu coûteux et efficace d'éliminer les protéines des solutions d'ADN.
Inconvénients : Lent par rapport à la plupart des méthodes modernes. Il existe un risque de transfert de phénol/chloroforme dans l'échantillon final (qui pourrait inhiber les réactions enzymatiques en aval). Le chloroforme et le phénol sont tous deux des produits chimiques dangereux.

2. Précipitation d'éthanol

La précipitation à l'éthanol est une méthode populaire pour dessaler et concentrer l'ADN. Des cations monovalents (0,1 à 0,5 M, normalement sous forme de sel d'acétate de sodium) sont ajoutés à l'ADN, ainsi que de l'éthanol, à une concentration finale de 70 %. L'éthanol modifie la structure de l'ADN de sorte que les molécules d'ADN s'agrègent et précipitent hors de la solution (voir Eickbush et Moudrianakis, 1978). La plupart des sels et des petites molécules organiques sont solubles dans l'éthanol à 70 %, laissant l'ADN précipité prêt pour la séparation par centrifugation.

Avantages : Un moyen peu coûteux et efficace de dessaler et de concentrer l'ADN.
Inconvénients : Prend du temps. Vous risquez de transporter de l'éthanol dans l'échantillon final.

3. Kits à base de colonne de silice

Les kits basés sur des colonnes offrent une approche pratique pour le nettoyage de l'ADN. Le principe est que des sels chaotropiques sont ajoutés à l'échantillon pour dénaturer l'ADN en perturbant ses liaisons hydrogène. Dans ces conditions, l'ADN se lie sélectivement à la résine de silice dans la colonne, facilitant sa séparation du reste de l'échantillon.

Après lavage, l'ADN est élué de la colonne avec une solution à faible teneur en sel qui permet la renaturation, provoquant la perte d'affinité de l'ADN pour la silice. La plupart des fournisseurs commerciaux proposent des kits basés sur cette technologie, avec une gamme de kits disponibles pour le nettoyage de l'ADN après extraction sur gel d'agarose, réactions enzymatiques et PCR, pour n'en nommer que quelques-uns.

Avantages : Pratique, relativement rapide, et l'utilisateur peut traiter un grand nombre d'échantillons grâce à l'option collecteur sous vide.
Inconvénients : Peut être coûteux. Certains kits donnent de faibles rendements (jusqu'à 25%). Le transfert de sel chaotrope peut être un problème.

Noter: Certains fournisseurs proposent désormais des kits de colonnes de silice améliorés, où l'élution des échantillons a lieu dans un très petit volume pour produire des concentrations élevées d'ADN.

4. Échange d'anions

Les méthodes de purification d'ADN par échange d'anions utilisent généralement des résines fonctionnalisées DEAE chargées positivement pour lier le squelette phosphate d'ADN chargé négativement. En utilisant des conditions de sel et de pH spécifiques, l'ADN de l'échantillon se lie à la résine et des étapes de lavage rigoureuses éliminent les contaminants (par exemple, protéines, débris cellulaires). L'ADN restant peut ensuite être sélectivement élué de la résine.

Avantages : ADN de haute pureté pour les applications en aval, par ex. transfection et séquençage d'ADN.
Inconvénients : Les résines peuvent être chères.

5. Perles magnétiques

Cette approche utilise des billes magnétiques qui lient l'ADN de manière conditionnelle en fonction du pH, ce qui vous permet de séparer l'ADN du reste de l'échantillon en contrôlant simplement le pH. Il existe quelques kits de billes magnétiques sur le marché. Les billes magnétiques sont chargées positivement et se lient à l'ADN à faible pH, mais à pH élevé, elles se chargent négativement, libérant ainsi l'ADN.

Avantages : Rapide, aucun sel chaotrophe ou solution de lavage organique n'est nécessaire. Idéal pour l'automatisation du traitement à haut débit, car il n'y a pas besoin de centrifugation et d'autres étapes de traitement fastidieuses. Notez qu'il existe également des kits de billes magnétiques qui se lient sélectivement à l'ADN en fonction de la concentration en sel.
Inconvénients : Le coût initial d'achat des aimants est raisonnablement élevé. Cette procédure peut être délicate lors de la manipulation de plusieurs échantillons, mais ce n'est pas un problème si vous avez accès à un flux de travail automatisé.

Publié à l'origine le 25 octobre 2007. Mis à jour et republié en juin 2019. Révisé et republié en mars 2021.


Qu'arrive-t-il à l'ADN en présence d'un sel chaotrope ?

Le terme « chaotrope » signifie la formation de chaos, un terme qui, en biochimie, fait généralement référence à la capacité d'un composé à perturber les structures de liaison hydrogène régulières dans l'eau. La liaison hydrogène affecte profondément la structure secondaire des polymères tels que l'ADN, l'ARN et les protéines, ainsi que la solubilité dans l'eau d'une molécule. Dans des conditions natives, les acides nucléiques sont recouverts d'une enveloppe hydratée constituée de molécules d'eau qui maintiennent la solubilité de l'ADN dans les solutions aqueuses. Avec l'ajout d'ions chaotropes à l'acide nucléique, cette structure relativement ordonnée des molécules d'eau de la coquille d'hydrate est détruite. Les sels chaotropiques créent un environnement hydrophobe. Dans ces conditions hydrophobes, la membrane de silice des colonnes NucleoSpin est le partenaire de liaison le plus approprié pour les acides nucléiques. Les protéines, métabolites et autres contaminants ne se lient pas à la membrane et sont donc éliminés par lessivage lors des étapes de lavage suivantes. Autre caractéristique des sels chaotropes, les cations respectifs saturent la membrane de silice avec des charges positives, ce qui améliore encore la liaison des acides nucléiques dans des conditions hydrophobes. Les sels chaotropes augmentent la solubilité des substances non polaires dans l'eau. Ils dénaturent les protéines car ils ont la capacité de perturber les interactions hydrophobes. Ils ne dénaturent pas l'ADN ou l'ARN. Leur fonction dans le kit d'extraction NucleoSpin est de dénaturer les protéines cellulaires (telles que la DNase et la RNase). La concentration élevée de sel facilite également la liaison des acides nucléiques ADN et ARN à la membrane de silice dans la colonne.


Résultats

Préparation et caractérisation des PAMAM-SpMNPs

Les SpMNPs de 10 nm ont été modifiés en utilisant 1 à 6 générations de dendrimères PAMAM. Les dendrimères PAMAM étaient liés de manière covalente aux SpMNP de la magnétite en utilisant l'AEEA et le GMBS. La modification du dendrimère a été confirmée en mesurant les nombres d'amines de surface des PAMAM-SpMNP. Les nombres d'amines expérimentaux et théoriques des PAMAM-SpMNPs dans chaque génération sont répertoriés dans le tableau 1. Les nombres d'amines expérimentaux des PAMAM-SpMNPs ont augmenté des générations 1 à 6. L'indice d'amines des PAMAM-MNPs G6 (5,2 × 10 2 groupes aminés/particule) était environ quatre fois supérieure à celle des G1 PAMAM–SpMNP (1,2 × 10 2 groupes aminés/particule). Les nombres d'amines théoriques ont été estimés pour un dendrimère PAMAM qui était étroitement immobilisé à la surface d'un SpMNP, tel qu'une sphère de 10 nm avec un compactage hexagonal étroit. Sur la base de la force de répulsion parmi les dendrons, les nombres d'amines expérimentaux étaient inférieurs aux nombres d'amines théoriques pour chaque génération. L'indice d'amine expérimental des G6 PAMAM-SpMNP divisé par la surface d'un SpMNP donne une valeur d'environ 1,6 groupes aminés nm -2 . La densité de groupes amino des PAMAM-SpMNP G6 à 10 nm était d'environ 80 % de celle des PAMAM-MNP G6 à 80 nm préparés à l'aide de la méthode de dendronisation d'auto-assemblage utilisant un noyau de thiol, des dendrons PAMAM fonctionnalisés.

Les PAMAM-SpMNPs préparés présentent une forte dispersivité en solution, et la dispersivité a augmenté avec les générations successives de dendrimères. La figure 2 montre les suspensions de PAMAM-SpMNPs dans un tampon PBS (pH 8,0) après sonication pendant 1 h. Les G1-G4 PAMAM-SpMNP se sont déposés par agrégation, tandis que les G5 et G6 PAMAM-SpMNP sont restés dispersés dans la solution. Les ?? Le potentiel des PAMAM-SpMNPs dans les générations successives a ensuite été mesuré (tableau 2). Les ?? potentiel corrélé avec l'indice d'amine des PAMAM-SpMNPs (R 2 = 0,94), suggérant que l'interaction électrostatique entre les SpMNPs avait un rôle majeur dans les agrégations observées dans la solution.

PAMAM-dendrons immobilisés sur SpMNPs dans un tampon PBS. Les SpMNPs ont été incubés pendant 1 h après dispersion par sonication.

Liaison de l'ADN à et libération de PAMAM-SpMNPs

La liaison à l'ADN et la libération des PAMAM-SpMNP ont été évaluées en utilisant l'ADN comme échantillon modèle. L'ADN était lié aux PAMAM-SpMNP via des interactions électrostatiques entre les groupes phosphate de l'ADN et les groupes amino des dendrimères PAMAM. Après la liaison, les PAMAM-SpMNPs se sont immédiatement agrégés, l'agrégation a augmenté la magnétisation nette des PAMAM-SpMNPs et a facilité leur collecte magnétique à partir de la solution. L'ADN a ensuite été libéré en ajoutant des ions phosphate, qui ont remplacé l'ADN lié aux PAMAM-SpMNP, et en chauffant à 80 °C pendant 20 min. Les quantités d'ADN lié et libéré en utilisant 10 g de PAMAM-SpMNPs ont augmenté avec les générations successives de dendrimères (Figure 3). La quantité d'ADN lié aux G6 PAMAM-SpMNP (566 g/10 g SpMNPs) était de 333% de la quantité liée aux G1 PAMAM-SpMNPs (170 μg/10 μg SpMNPs). La libération d'ADN des PAMAM-SpMNPs pour toutes les générations était très efficace, en particulier pour les PAMAM-SpMNPs G4-G6, qui ont libéré plus de 95 % de leur ADN.

Quantités d'ADN adsorbées et libérées par les PAMAM-SpMNP en fonction de la génération de dendrimères. Les données sont compilées à partir d'expériences en triple et sont exprimées en ± s.d.

La capacité de liaison à l'ADN des PAMAM-SpMNPs a été comparée à celle des PAMAM-MNPs préparés à l'aide de noyaux de magnétite de 80 nm, comme indiqué précédemment. 20 Une expérience de liaison a été réalisée en utilisant la même quantité de particules dans les mêmes conditions de liaison. The resulting amount of DNA bound to the G6 PAMAM–SpMNPs was four times that bound to the G6 PAMAM–MNPs (Table 3). Moreover, the amine number of the G6 PAMAM–SpMNPs was six times larger than that of the G6 PAMAM–MNPs.

Enhancement of DNA release from PAMAM–SpMNPs by AMF

MNPs subjected to an external AMF generate a remarkable heating effect because of their magnetic loss. 21, 22 Because the heat is generated from the MNP core, the energy should be directly transferred to the water and other molecules that exist locally on the MNP surface, resulting in the rapid and efficient heating of the target molecule. In this study, we used an AMF to enhance DNA release from the PAMAM–SpMNP surface.

Before the investigation, heat generation from bare MNPs was confirmed by applying an external AMF to a glass vessel containing MNPs dispersed in a phosphate buffer. When 80-nm ferromagnetic MNPs were added at a concentration of 250 μg ml −1 , a rapid increase in the solution temperature was observed within 1 min (Supplementary Figure 1). In contrast, a slow and small temperature change was observed when 10-nm SpMNPs were used at the same concentration, although the SpMNPs should have experienced a local temperature increase at the surface region (Figure 4). These behaviors conformed to the ferromagnetic and superparamagnetic characteristics derived from the 80-nm and 10-nm sizes of the magnetite particles.

Fluorescent intensities of the Cy3-labeled oligonucleotide released from G6 PAMAM–SpMNPs by applying an AMF at 248 kHz. ● : Fluorescent intensity, ▴ : Temperature of suspension.

The temperature changes in the solution containing SpMNPs were determined when different AMF power levels were applied to the SpMNPs. The Cy3-labeled oligonucleotide was bound to the PAMAM–SpMNPs, and an AMF was applied. The release of the oligonucleotide was monitored by measuring the fluorescent intensity of the solution. The time course of the oligonucleotide release indicated that it occurred within 1 min (Figure 4), whereas no temperature increase was observed over 10 min. This result suggests that the heat generated from a SpMNP increases the local temperature at the surface and facilitates the release of the oligonucleotide from the surface.

The DNA release from the G6 PAMAM–SpMNPs was investigated by applying an external AMF to the vessel. When no AMF was applied to a solution containing DNA bound to G6 PAMAM–SpMNPs, approximately 40% (200 ng) of the DNA was released from the PAMAM–SpMNPs after 20 min of incubation in a phosphate buffer (Figure 5). When an AMF was applied for 1 min and 10 min, approximately 80% (400 ng) and 100% (500 ng) of the DNA was released from the PAMAM-SpMNPs, respectively. Complete DNA release was achieved after AMF treatment for 10 min. The heat generation of the SpMNPs was considered to support the rapid and highly efficient DNA release from the SpMNPs.

Amount of released lambda DNA from G6 PAMAM–SpMNPs by applying or not applying an AMF at 248 kHz. The particle suspensions were incubated for 20 min at room temperature.


Single-Molecule Analysis Using DNA Origami

During the last two decades, scientists have developed various methods that allow the detection and manipulation of single molecules, which have also been called “in singulo” approaches. Fundamental understanding of biochemical reactions, folding of biomolecules, and the screening of drugs were achieved by using these methods. Single-molecule analysis was also performed in the field of DNA nanotechnology, mainly by using atomic force microscopy. However, until recently, the approaches used commonly in nanotechnology adopted structures with a dimension of 10–20 nm, which is not suitable for many applications. The recent development of scaffolded DNA origami by Rothemund made it possible for the construction of larger defined assemblies. One of the most salient features of the origami method is the precise addressability of the structures formed: Each staple can serve as an attachment point for different kinds of nanoobjects. Thus, the method is suitable for the precise positioning of various functionalities and for the single-molecule analysis of many chemical and biochemical processes. Here we summarize recent progress in the area of single-molecule analysis using DNA origami and discuss the future directions of this research.