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Une question liée à l'analyse qPCR

Une question liée à l'analyse qPCR


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Voici la chose. J'utilise une méthode, appelée TU-Tagging, pour isoler l'ARN spécifique à un type de cellule. Vous pouvez en savoir plus sur la méthode ici : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2783170/

Pour l'expliquer très brièvement, il existe une enzyme appelée UPRT (Uracil Phosphoribosyltransferase) qui est exprimée en Toxoplasma gondii. Dans des circonstances normales, l'UPRT crée l'UMP à partir de l'uracile des cellules hôtes et cette UMP est incorporée dans l'ARN. Cependant, ils ont constaté que cette enzyme ne peut pas distinguer l'uracile et l'analogue de l'uracile 4-Thiouracile (a fondamentalement le thio sur la 4ème position de l'uracile). Ainsi, lorsque le 4-TU est fourni en externe, l'UPRT incorpore le 4-TU dans l'ARN et vous obtenez le thio-ARN. Ensuite, avec la biotinylation basique et l'isolement de streptaividine, vous pouvez obtenir du thio-ARN à partir de votre isolat d'ARN total. (Bien sûr, UPRT doit être appliqué à des types de cellules spécifiques de votre intérêt)

Quoi qu'il en soit, après l'explication (c'était peut-être inutile cependant) voici ma question.

Après avoir isolé mon ARN dit spécifique, je vérifie la pureté par qPCR en utilisant des marqueurs spécifiques au type de cellule. Je n'ai pas de gène de référence. La seule chose qui m'intéresse est la présence ou l'absence de marqueurs (et aussi le changement de pli bien sûr). Maintenant, j'ai quelques données mais je ne sais pas comment les présenter (il n'y a personne dans mon laboratoire expérimenté avec qPCR et mon expérience est tellement limitée).

Avez-vous une idée de comment je peux surmonter ce problème? J'ai examiné certains calculs, mais la plupart d'entre eux sont nécessaires pour les gènes de référence ou d'autres choses. La seule chose que j'ai, ce sont les nombres de cycles et l'efficacité de mes amorces. Pensez-vous que je peux faire quelque chose avec ces entrées? (Je sais que les numéros de cycle ne signifient rien dans un tracé, donc je ne veux pas fondamentalement mettre des numéros de cycle.)

Merci de l'avoir lu. Toute aide/idée serait très appréciée. Je suis tellement désespéré. Merci.


OK, commençons par le début. Nous savons que ce qui différencie un type de cellule d'un autre, c'est son expression, c'est-à-dire quels gènes sont réellement transcrits en ARN. Par conséquent, il devrait y avoir un certain ARN dans un type de cellule qui ne devrait pas sortir dans un autre type de cellule. Si vous isolez l'ARN d'un certain type de cellule, disons un neurone et que vous voulez montrer que votre échantillon d'ARN ne contient que de l'ARN neuronal, alors vous devez prouver 2 choses :

  1. Que votre échantillon contient certaines séquences d'ARN connues pour être dans les neurones
  2. Que votre échantillon ne contient PAS certaines séquences d'ARN qui ne sont PAS connues pour être dans les neurones

Il existe plusieurs procédures de laboratoire pour identifier la présence/absence de certaines séquences d'ARN dans un échantillon, votre technique choisie est la qPCR. Voici une brève explication du fonctionnement de la qPCR.

Vous placez votre échantillon d'ARN avec une amorce spécifique à la séquence dans la machine qPCR. L'amorce se liera à une séquence spécifique, puis ce brin sera répliqué. Cela continuera à se répéter, cycle après cycle. Donc, si vous commencez avec 1 séquence de disons séquenceA, après le cycle 1, vous vous retrouverez avec 2, puis 4, puis 8 et ainsi de suite.

Quoi qu'il en soit, si votre objectif est d'utiliser la qPCR pour prouver que votre échantillon d'ARN provient d'un neurone, vous devez alors trouver des séquences connues pour être spécifiques aux neurones. Trouvez ensuite des amorces pour ces séquences. Utilisez ensuite ces amorces pour amplifier une partie de l'ARN de votre échantillon. Si vous obtenez une amplification, alors vous devez avoir cette séquence dans votre échantillon d'ARN. Pour vous soutenir davantage, vous pouvez également rechercher quelques séquences connues pour ne PAS être exprimées dans les neurones et, en utilisant le même principe, prouver que ces séquences ne sont PAS dans votre échantillon.

Ce qui précède vous donnera des données qualitatives, il vous dira simplement si une certaine séquence existe ou n'existe pas dans votre échantillon d'ARN. Puisque vous n'êtes intéressé que par la présence ou l'absence de marqueurs, cela devrait être suffisant. Cependant, si vous souhaitez quantifier vos données, c'est-à-dire découvrir combien une certaine séquence est exprimée, puis lisez la suite.

Vous pouvez également obtenir des données quantitatives à partir de la qPCR (après tout, qPCR signifie PCR quantitative). Le nombre de copies d'une séquence d'ARN après un certain nombre de cycles est proportionnel au nombre initial de copies de cette séquence dans votre échantillon. En d'autres termes, si votre échantillon d'ARN initial contient beaucoup de séquence A et un peu de séquence B, alors à n'importe quel cycle, vous devriez voir plus de séquence A.

Nous pouvons profiter de cette relation. Il existe deux méthodes générales que vous pouvez utiliser pour quantifier vos résultats. L'une est appelée quantification absolue et l'autre quantification relative.

L'idée derrière la quantification absolue est que vous exécutez deux qPCR. Dans l'un, vous faites votre échantillon d'ARN. Dans le second, vous exécutez un échantillon standard, pour lequel une courbe standard est disponible. Vous pouvez ensuite comparer les résultats de votre échantillon d'ARN avec les résultats du standard pour avoir une idée du nombre de copies dans votre échantillon.

L'idée derrière la quantification relative est que vous comparez les résultats de la qPCR pour votre séquence d'intérêt avec les résultats de la qPCR d'un gène de référence. Cela vous donnera seulement une idée du nombre de fois plus ou moins votre séquence d'intérêt si elle est exprimée que le gène de référence. Puisque vous n'avez pas de gène de référence, vous ne pouvez pas utiliser cette méthode, mais vous pouvez utiliser la méthode de quantification absolue expliquée dans le paragraphe ci-dessus !

Voici des liens très utiles sur la quantification à l'aide de la qPCR : http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction#Quantification_of_gene_expression

http://relative.gene-quantification.info/

Faites-moi savoir si vous avez besoin de précisions supplémentaires.


Nous avons développé un package R pour mettre en œuvre des méthodes d'évaluation de la qualité, d'analyse et de test des données qPCR pour la signification statistique. Double Delta CT et des modèles de courbe standard ont été mis en œuvre pour quantifier l'expression relative des gènes cibles de CT dans des expériences de groupe de contrôle qPCR standard. De plus, le calcul de l'efficacité d'amplification et des courbes à partir d'expériences de qPCR de dilution en série sont utilisés pour évaluer la qualité des données. Enfin, des tests à deux groupes et des modèles linéaires ont été utilisés pour tester la signification de la différence dans les groupes témoins d'expression et les conditions d'intérêt.

À l'aide de deux ensembles de données provenant d'expériences qPCR, nous avons appliqué différentes évaluations de qualité, analyses et tests statistiques dans le package pcr et comparé les résultats aux articles publiés d'origine. Les valeurs d'expression relatives finales des différents modèles, ainsi que les sorties intermédiaires, ont été comparées aux résultats attendus dans les articles originaux et se sont avérées exactes et fiables.


Résumé

Une méthode courante pour calculer les résultats des expériences qPCR est la comparaison Ct méthode, également appelée méthode 2 -ΔΔCt. Cependant, plusieurs hypothèses sont incluses dans la méthode 2 -ΔΔCt et les analyses statistiques standards ne sont pas directement applicables. Ici, nous décrivons une méthode différente, le X0 méthode, pour les calculs de résultats et l'analyse statistique des expériences qPCR. Le X0 diffère de la méthode 2 -ΔΔCt en introduisant une conversion des valeurs de Ct liées de façon exponentielle en X linéairement liés0 valeurs, qui représentent la quantité de matériau de départ dans une expérience qPCR. Résultats calculés par le X0 méthode sont illustrés pour les expériences qPCR avec des répétitions techniques et biologiques, y compris les procédures pour calculer les écarts types. Intégration des efficacités des amorces dans les calculs par le X0 méthode est également décrite. Au total, le X0 constitue une alternative très simple et précise à la méthode 2 -ΔΔCt pour les calculs de résultats à partir des données qPCR.


Un rôle durable vu pour la qPCR

Même si la dPCR se développe, les fournisseurs sont convaincus que la qPCR restera une technologie de pointe dans la recherche en biologie moléculaire.

Pourquoi? Premièrement, la qPCR est bien établie en tant que technologie crédible et performante et sur laquelle les chercheurs se fient pour sa vitesse, sa sensibilité, sa spécificité et sa facilité d'utilisation. Il est particulièrement utile pour les expériences d'expression génique relative et comme outil de validation prenant en charge d'autres méthodes génomiques, notamment les puces à ADN et les applications de séquençage de nouvelle génération (NGS). De plus, comme la qPCR existe depuis 1993, la plupart des chercheurs ont un accès facile à la technologie et à un vaste corpus de littérature disponible pour référence.

Les chercheurs peuvent s'appuyer sur leurs propres données historiques lors de la conception et de l'interprétation de leurs expériences d'analyse de l'expression génique, de génotypage, de détection d'agents pathogènes, de quantification virale, d'analyse de méthylation de l'ADN et d'analyse de fusion à haute résolution, entre autres.

Comme son nom l'indique, la PCR en temps réel mesure l'amplification PCR au fur et à mesure qu'elle se produit. La nature relative de la qPCR, qui calcule la concentration ou l'abondance relative d'une cible en la comparant à une concentration connue ou à un contrôle, rend la méthode particulièrement bien adaptée à l'analyse de l'expression génique. Lors de l'utilisation de la qPCR, comme c'est souvent le cas avec de nombreux autres outils biologiques, les changements dans les résultats de l'expression cible sont plus significatifs par rapport à différentes conditions expérimentales, telles que les tissus malades par rapport aux tissus sains.

Des tests qPCR bien conçus peuvent détecter plusieurs à plusieurs millions de copies d'une séquence cible par réaction, ce qui lui confère une plage dynamique considérable. Il convient aux expériences de criblage ou de validation en aval grâce à sa capacité à détecter des cibles avec un nombre de copies très faible et très élevé dans le même cycle.

Lors de l'utilisation de la qPCR, les chercheurs peuvent choisir leur chimie de détection. Ils peuvent choisir parmi des colorants intercalants bon marché (tels que le vert SYBR) à une variété de sondes spécifiques à une cible (TaqMan, balises moléculaires, etc.). La tarification par échantillon est très flexible car les utilisateurs peuvent facilement modifier le volume de réaction, le débit et la méthode de détection pour répondre aux besoins expérimentaux.


Réplique et propagation d'erreur

Un endroit où un certain nombre d'erreurs semblent se glisser est le traitement des réplicats dans les expériences de PCR.

L'erreur la plus fréquente que j'ai vue est l'utilisation du mauvais type de moyenne lors du calcul du rapport moyen. Le fait essentiel à retenir est de toujours utiliser la moyenne arithmétique sur n'importe quoi sur une échelle linéaire et de toujours utiliser la moyenne géométrique sur n'importe quoi sur une échelle exponentielle.

Plus concis, s'il s'agit de valeurs CT (ou de leurs différences), utilisez une moyenne arithmétique. Si ce sont des valeurs de concentration (tout ce qui est $$Efficacité^$$) puis utilisez la moyenne géométrique.

Je rencontre aussi fréquemment un traitement incorrect des barres d'erreur. Souvent, les gens prennent l'écart type (ou l'erreur type) des données de concentration, ou des rapports, et les représentent directement dans leurs graphiques à barres. Cependant, ces métriques supposent des données normalement distribuées, ce qui n'est le cas que pour les valeurs CT elles-mêmes, et non pour les ratios ou les concentrations. En bref, si votre axe y sur votre graphique est une échelle linéaire et que vos barres d'erreur sont les mêmes des deux côtés, alors c'est faux.

Enfin, nous devons traiter de la propagation des erreurs. L'erreur dans votre expérience est composée des erreurs de $$(Non traité,Réf) + (Non traité,Cible) + (Traité,Réf) + (Traité,Cible)$$. Cette erreur sera généralement supérieure à l'erreur impliquée en prenant l'erreur standard des valeurs ΔΔCT pour chaque réplicat. Cependant, pour les variables non corrélées, nous pouvons propager les erreurs additives en utilisant la formule :

Cela fonctionne bien pour le delta delta CT car l'erreur n'est que le produit de plusieurs erreurs additives. Cependant, pour les approches de courbe standard, nous avons également une erreur des valeurs d'efficacité que nous avons calculées pour notre courbe et cela ne peut pas être exprimé en tant que facteur additif.

Au lieu de cela, nous devons utiliser une série de Taylor pour propager l'erreur. Cela permet d'inclure les six sources de variance (4x TC + 2x efficacités) dans le calcul d'erreur final.


Normalisation

La normalisation des données vise à combler certaines des lacunes énumérées ci-dessus, et il existe de nombreuses approches différentes, de nouvelles étant proposées en permanence. La normalisation à la masse ou au volume total de l'échantillon est une approche héritée des techniques de Northern blot lorsque le chargement du gel et le transfert de l'échantillon sur du papier filtre ont été validés en sondant l'ARNr ou les gènes dits domestiques tels que GAPDH, dont l'expression était supposée être stable entre les individus , conditions expérimentales ou états physiologiques. Bien qu'il soit encore utilisé pour les mesures RT-qPCR, il existe plusieurs inconvénients à mesurer les niveaux d'ARNm ou de miARN par rapport à la masse ou au volume de l'échantillon. Par exemple, dans une comparaison d'échantillons d'origine différente, par ex. biopsies tumorales et tissus normaux, il est incorrect de supposer que la même masse tissulaire contient des nombres de cellules similaires, ou que la distribution relative des cellules en prolifération est égale. La normalisation par rapport à l'ARN total sous-estimera l'expression des gènes cibles dans les biopsies tumorales. Cette approche peut être plus appropriée lorsque les échantillons sont extraits à l'aide d'une microdissection par capture laser et qu'un nombre précis et des cellules similaires sont ciblés, même dans ce cas, cette approche n'est pas idéale. Une technique apparentée, rappelant à nouveau le Northern blot, consiste à normaliser la concentration d'ADN ou d'ARN. Bien que la mesure du nombre de copies de gènes par rapport à la concentration d'ADN d'entrée soit une approche parfaitement valide, la situation est plus compliquée pour la quantification des transcrits. Lorsque la concentration d'ARN est déterminée, la grande majorité du composant d'ARN est de l'ARN ribosomique (ARNr). La transcription de l'ARNr est indépendante de la transcription de l'ARN messager (ARNm) puisqu'il est transcrit par différentes enzymes. De plus, comme l'ARNr constitue

80 % de la fraction d'ARN, la normalisation à l'ARNr masquerait des changements subtils dans le composant d'ARNm qui comprend généralement 2 à 5 %. De plus, cette approche ne prend pas en compte les variations de la qualité de l'ARN matrice, ni les changements des niveaux d'ARNr dépendant de l'état de différenciation/prolifération cellulaire. Néanmoins, bien qu'elles ne soient pas idéales, il peut y avoir des situations où il n'y a pas d'autres alternatives que de mesurer par rapport à l'ARN total et certains packages d'analyse tels que le logiciel GenEx de MultiD6 permettent d'évaluer la concentration d'ARN total en tant que technique de normalisation aux côtés d'autres approches. Une solution théorique serait de purifier l'ARNm et de se normaliser par rapport à l'ARNm total. Malheureusement, le processus de purification introduit des inexactitudes et une étape de traitement supplémentaire qui est indésirable et dans de nombreux cas, la biopsie est trop petite pour permettre une purification efficace de l'ARNm re. Une approche très courante pour corriger les différences d'échantillon consiste à exprimer la concentration cible par rapport à celle d'un seul gène de référence interne. Pour que cette approche soit valide, l'expression du gène de référence unique doit rester constante entre tous les échantillons expérimentaux. Pour trouver une cible aussi pratique, une validation supplémentaire est nécessaire, mais même aujourd'hui, l'approche trop courante et erronée consiste à sélectionner ce gène au hasard sans validation. GAPDH, b actine et 18S sont particulièrement préférés dans la littérature publiée, généralement utilisés sans validation ni justification . Lorsque le gène de référence n'est pas exprimé de manière stable entre tous les échantillons, un rapport du gène cible d'intérêt au gène de référence reflétera les changements d'expression des deux cibles. Ceci est inutile lorsque le comportement d'expression d'aucune des cibles n'a été défini et peut conduire à des inexactitudes et à de faux résultats7. Un amendement à cette approche consiste à valider le gène de référence choisi8 ou à sélectionner un gène de référence significatif avec une biologie définie où la réponse transcriptionnelle est bien caractérisée (une approche appelée normalisation à une référence interne spécifique, ou SIR). De cette manière, la biologie du gène cible est exprimée par rapport au changement de biologie du gène de référence. Le problème avec l'utilisation de ces approches de gène de référence unique est que leur résolution (mesure minimale de confiance) est limitée à l'erreur minimale de la technique.

Une approche alternative, qui est l'étalon-or actuel, consiste à exprimer les données relatives au comportement de plusieurs gènes de référence et à utiliser une moyenne géométrique pour mesurer et contrôler les tendances induites par les erreurs dans l'expression relative des gènes de référence. Il existe différentes approches telles que celles proposées par geNorm ou Normfinder10,11 qui permettent de comparer la quantité de gènes de référence potentiels dans des groupes sélectionnés d'échantillons expérimentaux et témoins. Ceux-ci utilisent la variation combinée de plusieurs gènes pour produire un facteur de référence stable pour la normalisation. Cependant, l'exigence de mesures de transcriptions de référence multiples, bien que très précises et offrant potentiellement une résolution de 0,5 fois12, est exigeante en temps, en échantillons et en ressources. De plus, l'utilisation d'un seul gène de référence, SIR ou de plusieurs gènes de référence nécessite une validation appropriée. Un développement récent pointe vers une solution possible à cette énigme. Cette méthode normalise l'expression du gène cible d'intérêt à plusieurs centaines de transcrits différents en ciblant leurs répétitions ALU exprimées intégrées (EAR) dans les systèmes de primates ou les répétitions exprimées par l'élément B (dans les modèles murins). Cela évite les problèmes associés à tout biais causé par l'utilisation d'une poignée de gènes, permet une normalisation qui ne dépend plus du tissu ou du traitement et promet d'augmenter la transparence et la reproductibilité des données. Une approche similaire peut être utilisée pour la normalisation de l'expression des microARN, où la valeur d'expression moyenne de tous les miARN exprimés dans un échantillon donné est utilisée comme facteur de normalisation pour les données PCR quantitatives en temps réel des microARN et surpasse les stratégies de normalisation actuelles dans termes d'une meilleure réduction de la variation technique et d'une appréciation plus précise des changements biologiques13.


LinRegPCR et Factor-qPCR

LinRegPCR a été développé par le Dr Jan Ruijter, chercheur principal au département d'anatomie, d'embryologie et de physiologie (Academic Medical Center, Amsterdam, Pays-Bas). L'analyse statistique de ses propres données de recherche a conduit au développement de ce programme largement utilisé appelé LinRegPCR

LinRegPCR est un programme pour l'analyse des données PCR quantitatives (qPCR) basées sur les valeurs d'efficacité PCR dérivées des courbes d'amplification. Le programme importe des données corrigées non de référence, effectue une correction de référence sur chaque échantillon séparément, détermine une fenêtre de linéarité, puis utilise une analyse de régression linéaire pour déterminer l'efficacité de la PCR par échantillon à partir de la pente de la ligne de régression. L'efficacité PCR moyenne par amplicon est calculée. Le seuil de fluorescence est ensuite réglé pour déterminer la valeur Cq. L'efficacité moyenne de la PCR par amplicon et la valeur Cq par échantillon sont ensuite utilisées pour calculer une concentration de départ par échantillon, exprimée en unités de fluorescence arbitraires.

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    La cinétique d'augmentation de la fluorescence des différents reporters fluorescents utilisés pour la qPCR dépend de la chimie de surveillance, de la séquence ciblée, du type d'entrée d'ADN et de l'efficacité de la PCR. Microchimica Acta 2014 (DOI 10.1007/s00604-013-1155-8) Évaluation des méthodes d'analyse de courbe qPCR pour la découverte fiable de biomarqueurs : biais, résolution, précision et implications. Méthodes 59 : 32-46, 2013 . Le biais de la valeur Cq observé avec la PCR quantitative basée sur une sonde d'hydrolyse peut être corrigé avec la valeur d'efficacité de la PCR estimée. Methods 50 : 313-322, 2010 Efficacité d'amplification : lier la ligne de base et le biais dans l'analyse des données PCR quantitatives. Nucleic Acids Research 37 : e45, 2009 Importance statistique de la PCR quantitative. BMC Bioinformatics 8 : 131, 2007 Quantification relative de l'ARNm : comparaison des méthodes actuellement utilisées pour l'analyse des données PCR en temps réel. BMC Mol Biol 8 : 113, 2007 Analyse sans hypothèse de données PCR quantitatives en temps réel. Neurosci Letters 339 : 62-66, 2003

Facteur-qPCR

Le Dr Jan Ruijter a récemment développé un autre programme appelé Factor-qPCR. Ce programme supprime la « variation multiplicative entre les analyses » qui se produit lorsqu'une expérience de PCR quantitative comprend plusieurs plaques pour accueillir tous les échantillons, cibles et réplications. Ces répétitions montrent des différences proportionnelles similaires entre les conditions expérimentales, mais des valeurs absolues différentes, même si les mesures sont vraisemblablement effectuées dans des circonstances identiques. Dans la plupart des cas, la variation entre les sessions est multiplicative et peut donc être supprimée en divisant les données de chaque session avec un facteur de correction spécifique à la session.

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    Suppression de la variation entre les séries dans une expérience qPCR multi-plaques. Biomolecular Detection and Quantification In Press, 2015. La correction factorielle en tant qu'outil pour éliminer la variation entre les sessions dans les expériences répétées : application à la biologie moléculaire et à la rétrovirologie. Retrovirology 3:2, 2006. RDML : langage structuré et directives de rapport pour les données PCR quantitatives en temps réel. RDML-Ninja et RDMLdb pour l'échange standardisé de données qPCR.

Produit associé

Présentation de “ Micro ” votre cycleur qPCR personnel

Il est RAPIDE, PRÉCIS, COMPACT et ÉVOLUTIF.

C'est le PREMIER instrument qPCR à suivre les principes LinRegPCR pour l'analyse de ses données qPCR.

Et son Conçu et Fabriqué par Bio Molecular System, une société australienne fondée par les principaux innovateurs de l'ancienne société Corbett Research Life Sciences.


Résumé

La réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR) est une technique standard dans la plupart des laboratoires utilisée pour diverses applications en recherche fondamentale. L'analyse des données qPCR est une partie cruciale de l'ensemble de l'expérience, qui a conduit au développement d'une pléthore de méthodes. Les outils publiés couvrent des parties spécifiques du flux de travail ou fournissent des solutions d'analyse complètes.

Ici, nous avons interrogé 27 progiciels et outils en libre accès pour l'analyse des données qPCR. L'enquête comprend 8 outils Microsoft Windows, 5 basés sur le Web, 9 basés sur R et 5 d'autres plateformes. Les packages et outils examinés prennent en charge l'analyse de différentes applications qPCR, telles que la quantification de l'ARN, la méthylation de l'ADN, le génotypage, l'identification des variations du nombre de copies et la PCR numérique. Nous présentons un aperçu des fonctionnalités, des caractéristiques et des exigences spécifiques des outils logiciels individuels, tels que les formats d'échange de données, la disponibilité d'une interface utilisateur graphique, les procédures incluses pour la présentation graphique des données et les méthodes statistiques proposées. En outre, nous fournissons un aperçu des stratégies de quantification et rapportons diverses applications de la qPCR.

Notre enquête complète a montré que la plupart des outils utilisent leur propre format de fichier et que seule une fraction des outils actuellement existants prend en charge le format d'échange de données standardisé RDML. Pour permettre une analyse plus rationalisée et comparable des données qPCR, davantage de fournisseurs et d'outils doivent adapter le format standardisé pour encourager l'échange de données entre le logiciel de l'instrument, les outils d'analyse et les chercheurs.


Une question liée à l'analyse qPCR - Biologie

  • Pathway Focused - Profil de l'expression d'un panel de gènes sélectionnés pertinents pour une voie ou un état pathologique.
  • Simple et précis - La méthode PCR en temps réel simple offre les avantages de qRT-PCR = haute sensibilité et plage de quantification dynamique plus large.
  • Quantitatif -S'ils sont appliqués correctement, ils sont entièrement quantitatifs et présentent une bonne reproductibilité.
  • Conçu pour les applications à haut débit et l'utilisation de routine - Apporte le profilage d'expression à presque tous les laboratoires avec un instrument PCR en temps réel basé sur des blocs.
  • Sensibilité - Avec une sensibilité jusqu'à 1 ng par configuration de réaction ou 5 g d'ARN total par plaque de matrice entière, fournit des taux d'appels actuels supérieurs à 80 pour cent (indiqués par le producteur).
  • Reproductibilité - La haute reproductibilité du système, avec des coefficients de corrélation de réplication r > 0,99, signifie que les échantillons expérimentaux peuvent être comparés de manière fiable entre les plaques de matrice et dans plusieurs analyses.
  • Spécificité - La spécificité du système, conférée par la combinaison d'amorces SYBR Green ou de mélanges de sondes et de mélanges principaux de PCR, garantit un produit unique de la taille prévue pour chaque réaction sans produits secondaires tels que des dimères d'amorces.
  • Plusieurs gènes de référence pour une normalisation ultérieure via des gènes de référence validés (voir Genorm ou Normfinder)
  • Contrôles de la contamination par l'ADN génomique = contrôle du transfert d'ADN
  • Contrôles de transcription inverse = contrôle RT
  • contrôles PCR positifs

Documents d'application de la matrice qPCR

La prochaine frontière PCR PCR
Le cheval de bataille de la biologie moléculaire moderne avance en utilisant à la fois des méthodes conventionnelles et numériques pour explorer des cellules individuelles et même des molécules uniques.
Rapports de Nathan Blow.
MÉTHODES DE LA NATURE VOL 4 (10) 2007 : 869

Reproductibilité de la puce RT-PCR quantitative dans le profilage d'expression des miARN et comparaison avec l'analyse des puces à ADN.
Chen Y, Gelfond JA, McManus LM, Shireman PK.
Département de chirurgie, Centre des sciences de la santé de l'Université du Texas, San Antonio, TX 78229, États-Unis
BMC Génomique. 2009 2810 : 407.

Phénotypage moléculaire personnalisé par expression génique quantitative et analyse de reconnaissance de formes
Shreeram Akilesh, Daniel J. Shaffer et Derry Roopenian
Génome Res. 2003 13(7) : 1719-1727
The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine 04609, États-Unis

Une matrice PCR en temps réel pour l'identification hiérarchique des isolats de Francisella
Kerstin Svensson1,2, Malin Granberg1, Linda Karlsson1, Vera Neubauerova3, Mats Forsman1, Anders Johansson1,2
1 Division de la défense et de la sécurité CBRN, Agence suédoise de recherche sur la défense, Ume , Suède, 2 Département de microbiologie clinique, maladies infectieuses et bactériologie, Université d'Ume , Ume , Suède, 3 Institut central de santé militaire, Prague, République tchèque
PLoS ONE 4(12) : e8360

Le facteur de jonction d'extrémité non homologue Artemis supprime la formation de tumeurs multi-tissus et prévient la perte d'hétérozygotie
Y Woo, SM Wright, SA Maas1,7, TL Alley1, LB Caddle1, S Kamdar1, J Affourtit, O Foreman1, EC Akeson, D Shaffer, RT Bronson, HC Morse, D Roopenian et KD Mills
Oncogène. 2007 26(41): 6010-6020

  • ". un aperçu complet de la technologie RT-PCR, qui est aussi à jour qu'un livre peut l'être. " Mareike Viebahn dans Current Issues in Molecular Biology (2009)
  • ". un livre utile pour les étudiants. " de J. Méthodes microbiologiques
  • "fournit un double objectif en visant, dans les premiers chapitres, à fournir à la fois la théorie et les aspects pratiques de cette technologie diversifiée et superficiellement simple, en contrebalançant cela dans les chapitres suivants avec des applications du monde réel, couvrant les maladies infectieuses, la biodéfense, l'haplotypage moléculaire et les normes alimentaires." de Microbiologie aujourd'hui
  • "un ouvrage de référence qu'il faut trouver aussi bien dans les bibliothèques universitaires que sur les rayons des spécialistes d'applications expérimentés." de Microbiologie aujourd'hui
  • "un guide complet de la technologie PCR en temps réel et de ses applications" de Food Science and Technology Abstracts (2009) Volume 41 Numéro 6
  • Ce volume devrait être du plus haut intérêt pour tous les chercheurs intéressés et impliqués dans l'utilisation de la RT-PCR. les protocoles de RT-PCR abordés dans ce livre intéresseront la plupart, sinon la totalité, des chercheurs engagés dans des recherches utilisant cette importante technique . un livre bien équilibré couvrant les nombreuses utilisations potentielles de la PCR en temps réel. précieux pour tous ceux qui s'intéressent à la RT-PCR." d'après les critiques de Doodys (2009)
  • "fournir au novice et à l'utilisateur expérimenté des conseils sur la technologie, son instrumentation et ses applications" de SciTech Book News juin 2009 p. 64
  • ". écrit par des auteurs internationaux experts en principes et applications techniques spécifiques. un recueil utile d'applications de base et avancées pour les scientifiques de laboratoire. C'est un manuel d'introduction idéal et servira de manuel pratique dans les laboratoires où la technologie est utilisée." de Christopher J. McIver, Département de microbiologie, Hôpital Prince of Wales, Nouvelle-Galles du Sud, Australie écrivant dans Australian J. Med. Sci. 2009. 30(2) : 59-60

Entreprises fournissant des matrices qPCR :

Livre blanc : StellARray Gene Expression System - Révéler des profils avec une signification impartiale
Daniel Shaffer, Aaron Brown, William Olver
Bar Harbor BioTechnology, Inc. et Marjorie Smithhisler, Lonza Walkersville, Inc.

Dans cet article, nous présentons trois exemples d'application démontrant l'utilité du système d'expression génique StellARray pour révéler les changements de niveau d'expression génique dans divers contextes biologiques tels que la toxicologie, le cancer et la différenciation des cellules souches. En combinant des cellules humaines primaires clonétiques et poïétiques avec le système d'expression génique StellARray, tous de Lonza, le chercheur dispose d'un système synergique pour révéler des changements bruts et subtils dans l'expression génique lors de l'analyse de modèles in vitro de tissus humains. Ceci est réalisé facilement dans des matrices StellARrayqPCR formatées à 96 et 384 puits à l'aide d'un instrument qPCR standard et d'un mélange maître générique de réactifs à base de vert SYBR®. L'outil d'analyse de données Global Pattern Recognition (GPR) est parfaitement adapté pour générer une liste classée de gènes considérablement modifiés dans un ensemble de données qPCR. La GPR surmonte les incohérences associées aux procédures conventionnelles de normalisation d'un seul gène en éliminant la sélection de normalisateur a priori. Dans l'ensemble, les résultats montrent comment le système d'expression génétique StellARray élimine les faux positifs et fournit des résultats VRAIS étayés par une analyse statistique rigoureuse.

Analyse simple et précise des données de PCR en temps réel à l'aide du logiciel Bar Harbor Biotechnology GPR
http://www.bhbio.com/products/gpr/

Bar Harbor Biotechnology a résolu l'un des problèmes les plus fondamentaux auxquels est confrontée l'expérimentation utilisant la PCR en temps réel. Comment analyser les données et déterminer les VRAIS changements dans l'expression des gènes ? La réponse à cette question se trouve dans l'algorithme Global Pattern Recognition (GPR) en instance de brevet de Bar Harbor Biotechnology, Inc., qui rend l'analyse de l'expression génique simple, rapide et fiable. Voici quelques raisons pour lesquelles nous avons développé cet algorithme.

SA Biosciences (une société QIAGEN)

  • Page Web de la matrice qPCR
  • Tutoriel d'analyse de données de matrice PCR
  • RT2 - profiler la technologie PCR - diaporama
  • Manuel de la matrice qPCR
  • Centre eLearning de SA Biosciences :
    • Séminaire - Comment fonctionnent les puces qPCR ?
    • Films sur l'application des puces qPCR
    • Analyse de microARN du génome entier à partir d'une seule réaction de synthèse d'ADNc
    • Validé avec les séquences de microARN les plus mises à jour annotées par Sanger miRBASE Release 14
    • Le protocole facile à utiliser apporte le profilage de l'expression des microARN à n'importe quel laboratoire avec un instrument de PCR en temps réel
    • Baies PCR de microARN de génome entier version 2.0 RT
    • disponible pour l'homme, la souris et le rat.
    • Matrices PCR de microARN de génome entier RT humain (96 puits et 384 puits v2.0)
    • Matrices PCR MouseRT Whole Genome MicroRNA (96 puits et 384 puits v2.0)
    • Puces RatRT Whole Genome MicroRNA PCR (96 puits et 384 puits v2.0)

    Maximisez l'efficacité - Sélectionnez des tests pour vos cibles de choix parmi des listes de gènes de familles de gènes fonctionnellement apparentées ou de voies biologiques. Commandez-les sous forme de tests uniques ou configurez votre propre panel personnalisé sur une plaque multipuits LightCycler® 480.

    Garantissez des résultats optimaux - Faites confiance à des tests qPCR testés et basés sur la technologie éprouvée Universal ProbeLibrary, avec des informations de base bioinformatiques détaillées et de nouvelles fonctionnalités de détection d'erreurs.

    • Panel de gènes de référence humains
    • Panneau de régulation du cycle cellulaire humain
    • Panel sur l'apoptose humaine
    • Panel GPCR humain
    • Panneau de récepteur nucléaire humain
    • Panneau de transport ABC humain
    • trouver plus de détails
    • Bonne forme d'amplification
    • Cp de la concentration d'ADNc la plus élevée = 34
    • PCR efficiency 2.0 +/- 0.2,
    • R value of standard curve between 0.99 and 1.00
    • Linear dynamic range of at least 3 logs
    • Similar signal heights of amplification curves
    • High specificity, no side products (tested on gels)
    • for more details

    Featuring validated and Tm-normalized LNAbased capture probes, the miRCURY LNAarrays offer global microRNA expression profiling with unmatched specificity and sensitivity.

    • Animation about the Exiqon LNA technology
    • Exiqon E-talk - view other animations, presentations and scientific movies
    • Sensitivity - microRNA profiling possible from as low as 30 ng total RNA
    • Specificity - efficient discrimination between closely related microRNA family members
    • Coverage get access to the 428 unique human microRNAs (miRPlus ) on our human, mouse and rat array or the 4168 mature microRNAs from 85 species on our Other species array
    • Reproducibility - high reproducibility with 99% correlation between arrays
    • Dynamic range - greater than 4 orders of magnitude
    • Diversity - the most comprehensive probe set available
    • Open platform - protocols available for Tecan and MAUI hybridization stations, and for manual hybridization.

    microRNA Ready-to-Use PCR Panels
    Ready-to-Use panels contain pre-aliquoted microRNA PCR primer sets in 384-well PCR plates. Just add cDNA and PCR master mix to the wells and run your real-time PCR profiling of up to 730 microRNAs => Read more details

    Universal cDNA Synthesis and SYBR Green master mix kits
    Highly optimized reagents for first strand synthesis and real-time PCR amplification => Read more details

    Our new interactive tutorial will walk you through every step of a microRNA experiment from RNA Isolation to Functional Analysis.

    Custom TaqMan Assay Manufacturing & Plating Service
    If your research application requires special manufacturing modifications - such as a different dye or assay volume, or you would like to have your assays plated in a specific way, our custom services can help.

    TaqMan Gene Expression Assays
    TaqMan Gene Expression Assays provide over 1.3 million predesigned primer/probe sets covering 23 species, the most comprehensive set of quantitative gene expression assays available. Alternatively, custom assays enable you to study the expression of any gene or splice variant in any organism.

    TaqMan MicroRNA Assays
    Innovative TaqMan Assays for microRNA and other small RNAs, as well as longer noncoding RNA transcripts such as pri-miRNAs and long noncoding RNA. We offer products for noncoding RNA discovery, profiling, quantitation, validation, and functional analysis.

    TaqMan Protein Assays
    Revolutionary TaqMan Protein Assays enable fast, easy identification, and relative quantification of protein markers from limited quantities of cultured cells. Choose from predesigned assays for human stem cell pluripotency markers and control proteins, or create your own assay from your biotinylated antibodies.

    Next Generation Real-time PCR Comes of Age

    The WaferGen SmartChip System enables profiling and validation workflows on a single platform, by combining high-throughput, cost-effective target discovery with the sensitivity, precision, and dynamic range of real-time PCR for validation studies.

    Gene Expression Profiling - Discover More
    Gene expression profiling of specific diseases has become increasingly important in drug development. Comparison of gene expression patterns between normal and diseased patients or expression profiles in the presence or absence of drugs leads to discovery of genes or a set of genes that can be used in drug development. This requires monitoring of tens, hundreds or thousands of mRNAs in large numbers.
    The WaferGen SmartChip System offers the capability to achieve this level of throughput with a high degree of accuracy.

    MicroRNA Profiling - Comprehensive human microRNA profile on a single chip
    MicroRNAs (miRNA) are post-transcriptional regulators of cell proliferation, tissue differentiation, embryonic development, and apoptosis. Specific miRNA expression profiles may be characteristic of diseases or disease states and used as biomarkers. The identification of miRNA profiles has become important for streamlining drug development processes. The comparison of miRNA patterns from normal and disease samples or contrasting miRNA profiles of the same sample in the presence or absence of a drug leads to a greater understanding of pathways and mechanisms of action.
    The WaferGen SmartChip System in conjunction with the pre-validated SmartChip human miRNA panel, offers researchers the ability to carry out comprehensive, rapid miRNA profiling on their human samples simply, cost-effectively, and accurately.
    Fluidigm

    These new integrated fluidic circuits (IFCs) are capable of performing 9,216 simultaneous experiments without any pre-spotting and with complete flexibility for the researcher. In a word, they are revolutionary. Flyer

    The 96.96 Dynamic Arrays are at the heart of Fluidigm s BioMark Genetic Analysis System, which delivers new efficiencies in Gene Expression and Genotyping. Fluidigm products enable and accelerate your Single Cell Gene Expression, Copy Number Variation and Absolute Quantitation research in completely new ways.


    Speaker bios

    Stephen A. Bustin, Ph.D.

    Queen Mary, University of London
    London, UK

    Stephen Bustin obtained his Ph.D. in molecular genetics from Trinity College in Dublin and is currently Professor of Molecular Science at Barts and the London School of Medicine and Dentistry, a part of Queen Mary, University of London, and serves as Visiting Professor of Molecular Biology at the University of Middlesex. His research group’s general areas of interest are the small and large bowel, as well as colorectal cancer with particular emphasis on investigating the process of invasion and metastasis. An important aim is to translate molecular techniques into clinical practice by including molecular parameters into clinical tumor staging. He also has a special interest in real-time polymerase chain reactions (PCR) and has written and edited two books and published numerous peer-reviewed publications and book chapters on this subject. He advised the U.K. High Court and the U.S. Department of Justice on PCR technology in the measles, mumps, rubella (MMR) vaccine/Autism class action, and was an expert witness at the MMR trial in Washington, D.C. He coordinated the recent Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE) initiative.

    Gregory L. Shipley, Ph.D.

    University of Texas Health Science Center at Houston
    Houston, TX

    Dr. Gregory Shipley completed both his undergraduate and graduate training at the University of California, Santa Barbara, after which he moved to the University of Florida in Gainesville and then to MIT in Cambridge, Massachusetts, to carry out his postdoctoral training. Following academic appointments at Texas A&M University and the University of Houston, Texas, Dr. Shipley moved to the University of Texas Health Science Center in Houston, Medical School in 1990, where he is currently the director of the Quantitative Genomics Core Laboratory. There he and his team perform quantitative protein assays using the MesoScale technology and multiple assay types utilizing real-time quantitative PCR. Dr. Shipley oversees the running and analysis of all real-time qPCR assays as well as the development of new assays. He publishes his work regularly and is also one of the authors of the MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR), together with Dr. Stephen Bustin.

    Manju R. Sethi

    Thermo Fisher Scientific
    Wilmington, DE

    Manju Sethi joined Thermo Fisher Scientific in 2008, and as senior product manager is responsible for the development and management of its NanoDrop products line. Sethi specializes in the unique technology and workflow solution needs of life science customers and brings over 20 years of biotech and life science product management, as well as marketing and business development experience to the Thermo Fisher Scientific team. Previously, Sethi was a business consultant for various Fortune 100 companies and was also a senior member of the management team for the Qualicon biotech division at DuPont, where she served as the director of strategic planning and director of business development. Sethi holds a B.Tech. (ChemE) from the Indian Institute of Technology and an M.S. (ChemE) from Clarkson University.

    Sean Sanders, Ph.D.

    Science/AAAS
    Washington DC

    Dr. Sanders did his undergraduate training at the University of Cape Town, South Africa, and his Ph.D. at the University of Cambridge, UK, supported by the Wellcome Trust. Following postdoctoral training at the National Institutes of Health and Georgetown University, Dr. Sanders joined TranXenoGen, a startup biotechnology company in Massachusetts working on avian transgenics. Pursuing his parallel passion for writing and editing, Dr. Sanders joined BioTechniques as an editor, before joining Science/AAAS in 2006. Currently, Dr. Sanders is the Director and Senior Editor for Custom Publishing for the journal Science and Program Director for Outreach.


    Voir la vidéo: Lanalyse des pratiques professionnelles en 4 questions (Janvier 2023).