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16.5F : Agrobacterium et maladie de la galle du collet - Biologie

16.5F : Agrobacterium et maladie de la galle du collet - Biologie


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Argobacterium provoque la maladie de la galle du collet en transférant un plasmide d'ADN à la plante hôte, ce qui amène l'hôte à lui fabriquer des nutriments.

Objectifs d'apprentissage

  • Résumer la relation symbiotique entre les plantes et l'agrobactérie

Points clés

  • La maladie de la galle du collet est causée par Agrobactérie tuméfaciens, une bactérie qui infecte les plantes. La bactérie provoque des tumeurs sur la tige de son hôte.
  • Agrobacterium tumefaciens manipule ses hôtes en transférant un ADN plasmidique aux cellules de son hôte. Les plasmides sont normalement utilisés pour transférer l'ADN de bactéries à bactéries.
  • Une fois dans la cellule hôte, le plasmide s'intègre dans le génome de la cellule végétale hôte et force l'hôte à produire des acides aminés uniques et d'autres substances qui nourrissent les bactéries. Ces composés sont inutilisables par la plupart des bactéries, de sorte que les Argobactéries peuvent rivaliser avec les autres espèces.

Mots clés

  • plasmide: Un cercle d'ADN double brin séparé des chromosomes, que l'on trouve dans les bactéries et les protozoaires.
  • pilus: Un appendice ressemblant à un cheveu que l'on trouve à la surface cellulaire de nombreuses bactéries.

La maladie de la galle de la couronne est causée par une bactérie appelée Agrobacterium tumefaciens. La maladie se manifeste par une croissance semblable à une tumeur, généralement à la jonction de la racine et de la pousse. A. tumefaciens peut transférer une partie de son ADN à la plante hôte, par l'intermédiaire d'un plasmide – une molécule d'ADN bactérienne indépendante d'un chromosome. Le nouveau segment d'ADN amène la plante à produire des acides aminés inhabituels et des hormones végétales qui fournissent aux bactéries du carbone et de l'azote.

Les bactéries utilisent normalement des plasmides pour le transfert horizontal de gènes, afin qu'elles puissent partager des gènes avec des bactéries apparentées pour les aider à faire face à des environnements stressants. Par exemple, les plasmides peuvent conférer aux bactéries la capacité de fixer l'azote ou de résister aux composés antibiotiques. En règle générale, les bactéries transfèrent les plasmides par conjugaison : une bactérie donneuse crée un tube appelé pilus qui pénètre dans la paroi cellulaire de la bactérie receveuse et l'ADN plasmidique passe à travers le tube. L'autre bactérie soit intègre le plasmide dans ses chromosomes, soit il reste en liberté dans le cytoplasme. Dans les deux cas, la bactérie receveuse reçoit du nouveau matériel génétique.

Dans le cas de la maladie de la galle du collet, A. tumefaciens transfère un plasmide contenant de l'ADN-T dans les cellules de sa plante hôte par conjugaison, comme il le ferait avec une autre bactérie. Cependant, une fois à l'intérieur de la cellule végétale, l'ADN s'intègre de manière semi-aléatoire dans le génome de la plante et modifie le comportement de la cellule.

Les nouveaux gènes plasmidiques sont exprimés par les cellules végétales et les amènent à sécréter des enzymes qui produisent les acides aminés octopine ou nopaline. Il porte également des gènes pour la biosynthèse des hormones végétales, l'auxine et les cytokinines, et pour la biosynthèse des opines, fournissant une source de carbone et d'azote pour les bactéries.

Ces opines peuvent être utilisées par très peu d'autres bactéries et donner A. tumefaciens un avantage concurrentiel.


Éditorial : 𠇊grobactérie la biologie et son application à la production de plantes transgéniques”


  • 1 Département des sciences de la vie, Université nationale Chung Hsing, Taichung, Taïwan
  • 2 Département des sciences biologiques, Purdue University, West Lafayette, IN, États-Unis
  • 3 Institut de biologie végétale et microbienne, Academia Sinica, Taipei, Taïwan

L'extraordinaire Agrobactérie L'histoire de la recherche a commencé à partir de la recherche de l'agent causal de la maladie de la galle du collet il y a plus de 100 ans. Agrobacterium tumefaciens a été isolé pour la première fois dans des galles de vigne en 1897, puis isolé dans une marguerite de Paris en 1907 (Cavara, 1897a,b Smith et Townsend, 1907). Les Agrobactérie Le mécanisme d'infection implique le traitement et le transfert d'un fragment d'ADN spécifique (l'ADN transféré, l'ADN-T) à partir d'un plasmide bactérien induisant une tumeur (Ti). Le transfert vers la plante se fait via un système de sécrétion de type IV (T4SS), après quoi l'ADN-T est intégré dans le génome de la plante hôte (Gelvin, 2010 Lacroix et Citovsky, 2013). Ce transfert d'ADN entre royaumes conduit à une surproduction des hormones végétales auxine et cytokinine, entraînant des tumeurs. La capacité de transfert d'ADN entre royaumes de Agrobactérie et la possibilité de remplacer les oncogènes de l'ADN-T par des gènes d'intérêt a fait Agrobactérie-transformation médiée la technique la plus populaire pour générer des plantes transgéniques.

Ce sujet de recherche fournit une collection de critiques et d'articles de recherche originaux sur Agrobactérie gènes impliqués dans la physiologie/virulence bactérienne et gènes végétaux impliqués dans la transformation et la défense contre Agrobactérie. Une revue de Kado (2014) fournit un aperçu historique de la façon dont A. tumefaciens a d'abord été établi comme la cause de la maladie de la galle du collet. Dans cette revue, Kado met en évidence les principales études de pathologie végétale précoce et de biologie moléculaire marquantes menant à la conclusion que l'expression d'oncogènes dans l'ADN-T natif est la cause de la croissance tumorale chez les plantes. Forts des bases solides de ces découvertes pionnières, A. tumefaciens est passé d'un phytopathogène à un puissant outil de transformation génétique pour la recherche en biologie végétale et en biotechnologie.

La première séquence complète du génome d'un Agrobactérie espèce (A. tumefaciens C58) a été achevée en 2001 (Goodner et al., 2001 Wood et al., 2001). Le génome de 5,67 mégabases de cette souche porte un chromosome circulaire, un chromosome linéaire et deux mégaplasmides : le plasmide Ti pTiC58 et un second plasmide, pAtC58. Dans la revue de Platt et al. (2014), les propriétés, l'écologie, l'évolution et les interactions complexes de ces deux A. tumefaciens les mégaplasmides sont discutés. Les coûts et les avantages pour A. tumefaciens les souches portant le plasmide Ti et/ou le plasmide pAtC58 sont discutées et présentées d'un point de vue écologique et évolutif. Des prévisions de modélisation sont présentées pour le coût et les avantages relatifs à A. tumefaciens souches abritant les plasmides Ti et/ou pAtC58 déterminées par les ressources environnementales. La conjugaison et l'amplification du plasmide Ti sont régulées par le système TraI/TraR quorum-sensing (QS) et les opines conjugales. Lang et Faure (2014) passent en revue les connaissances actuelles sur les réseaux génétiques et les bases moléculaires de la A. tumefaciens système de détection de quorum. Ces auteurs discutent également de l'impact biologique et écologique du système QS sur la conjugaison du plasmide Ti, le nombre de copies et les interactions entre Agrobactérie et les plantes hôtes.

Lors de l'interaction initiale entre Agrobactérie et les cellules végétales, les bactéries détectent divers signaux dérivés des plantes dans la rhizosphère à l'aide du gène de virulence codé par le plasmide Ti (vir gène) et le gène de virulence chromosomique (chv gène). Les connaissances actuelles sur la manière A. tumefaciens sens et réagit à différents signaux d'origine végétale sont résumés dans l'article de synthèse de Subramoni et al. (2014), qui discute également des mécanismes de la façon dont les hormones végétales auxine, acide salicylique et éthylène affectent la virulence bactérienne. Enfin, cette revue traite de la complexité et de la complexité des Agrobactérie voies de signalisation et les mécanismes de régulation sous-jacents lors de la reconnaissance initiale de la cellule hôte pour maximiser le succès de l'infection ultérieure. Dans l'article de recherche original de Lin et al. (2014), la régulation mécanistique de la protéine du capteur membranaire VirA est davantage disséquée. L'histidine kinase VirA et la protéine VirG régulatrice de la réponse cytoplasmique jouent ensemble un rôle central dans la régulation vir l'expression des gènes en réponse aux composés phénoliques. Sur la base d'un modèle d'homologie de la région de liaison VirA, diverses protéines VirA mutantes et chimériques ont été générées et examinées pour leur capacité à induire VirB activité de promoteur. La capacité de VirA à détecter et à répondre à trois signaux d'entrée distincts, les composés phénoliques, les sucres et le pH environnemental, joue un rôle important dans la réussite de l'infection.

Agrobactérie l'attachement aux cellules végétales est une étape précoce importante dans la progression de la maladie de la galle du collet. Les bactéries mobiles nagent vers les cellules hôtes, puis interagissent physiquement avec les cellules hôtes pour former des agrégats et établir une communauté bactérienne multicellulaire connue sous le nom de biofilm. Divers facteurs génétiques et environnementaux qui affectent Agrobactérie l'attachement et la formation de biofilm sont passés en revue dans l'article de Heindl et al. (2014). Les fonctions des différents types d'exopolysaccharides qui constituent le biofilm et les mécanismes sous-jacents impliquant la façon dont le second messager cyclique-di-GMP, le système ChvG/ChvI, les niveaux de phosphore et la tension d'oxygène influencent l'attachement et la virulence bactériennes sont également résumés. Dans l'article de synthèse de Matthysse (2014), les premières études et les connaissances actuelles sur les mécanismes d'attachement bactérien polaire et latéral sont résumées. Ces deux mécanismes contribuent tous deux à l'attachement bactérien. Lorsque les niveaux de calcium et de phosphate environnementaux et les valeurs de pH sont faibles, l'attachement polaire prédomine. De plus, les phospholipides (PL), la phosphatidylcholine (PC) et les lipides ornithine lipidiques sans phosphate (OL) contribuent à Agrobactérie virulence. Dans la revue d'Aktas et al. (2014), les voies de biosynthèse et les rôles physiologiques de ces lipides membranaires sont résumés. Le lipide membranaire eucaryote typique PC n'est pas fréquemment retrouvé chez les bactéries, mais il constitue près de 22% de la Agrobactérie lipide membranaire. Il est intéressant de noter que les PC et les OL peuvent jouer des rôles opposés dans Agrobactérie virulence. La réduction de la formation de tumeurs dans un PC déficient Agrobactérie mutant peut résulter d'une altération vir expressions géniques contrôlées par VirA/VirG. L'absence d'OL dans A. tumefaciens peut diminuer les réponses de défense de l'hôte et donc provoquer une formation tumorale plus précoce et plus importante.

Les cellules végétales ont une variété de récepteurs qui reconnaissent ce que l'on appelle les modèles moléculaires associés aux microbes ou aux agents pathogènes (MAMP ou PAMP), et activent par la suite les réponses de défense des plantes, un processus connu sous le nom d'immunité déclenchée par le récepteur de reconnaissance de modèle (PTI) (Boller et Félix, 2009 Boller et He, 2009). Agrobactérie peuvent utiliser des effecteurs pour détourner les systèmes végétaux et échapper aux réponses de défense des plantes. Pitzschke (2013) passe en revue les stratégies utilisées par Agrobactérie pour transformer les réponses de défense des plantes à son propre avantage. Les cellules végétales infectées initient une cascade de signalisation de protéine kinase activée par un mitogène qui provoque VIP1 (Agrobactérie Protéine interagissant avec VirE2 1) phosphorylation et translocation dans le noyau de la plante pour induire l'expression des gènes de défense. D'autre part, Agrobactérie peut détourner VIP1 pour aider l'ADN-T à pénétrer dans le noyau de la plante. Sur la base des connaissances actuelles sur les réponses de défense des plantes contre Agrobactérie infection, Pitzschke (2013) discute de plusieurs approches biotechnologiques pour augmenter l'efficacité de la transformation. Dans une autre étude de Gohlke et Deeken (2014), les premières réactions des plantes à Agrobactérie, y compris diverses réponses de défense, réponses hypersensibles et altérations des niveaux de phytohormones sont discutées. Les altérations de la morphologie des plantes, de la translocation des nutriments et du métabolisme causées par la formation de tumeurs de la galle du collet sont également passées en revue. Les auteurs résument d'importantes études génomiques, épigénomiques, transcriptomiques et métabolomiques qui révèlent des changements épigénétiques associés à l'intégration de l'ADN-T et au développement de la galle. Par la suite, Hwang et al. (2015) passent en revue les éliciteurs pathogènes importants, les molécules réceptrices de la cellule hôte et leurs voies de transduction du signal en aval dans les plantes hôtes au cours de la réponse immunitaire déclenchée par PAMP. Ils mettent en évidence des découvertes récentes liant l'immunité des plantes au trafic endomembranaire et aux changements dynamiques de l'actine. Les effets de la physiologie de l'hôte, y compris les niveaux d'hormones, l'horloge circadienne, les stades de développement et les facteurs environnementaux, y compris les durées d'exposition à la lumière et la température, sur les réponses de défense des plantes et la virulence bactérienne sont passés en revue et discutés.

Dans la nature, des preuves d'anciens transferts horizontaux de gènes (HGT) de Agrobactérie aux plantes a été observée dans les genres Nicotiana et Linaria. Séquences homologues au type mikimopine Agrobacterium rhizogenes L'ADN-T pRiA4 a été découvert pour la première fois dans le génome du tabac d'arbre non transformé, Nicotiana glauca, et nommé �llular T-DNA” (cT-DNA White et al., 1983). Matveeva et Lutova (2014) examinent l'organisation, la distribution, la régulation de l'expression et une corrélation possible avec la formation de tumeurs génétiques dans l'ADNc Nicotiana espèce. Ils passent également en revue les découvertes récentes de l'ADNc dans les génomes de Linaria espèces et dans d'autres familles de dicotylédones. Les auteurs suggèrent que les plantes conservant l'ADNc dans leur génome pourraient potentiellement bénéficier aux micro-organismes de la rhizosphère en sécrétant des opines dans la zone racinaire. Ils proposent également que les empreintes d'anciennes insertions d'ADN-T pRi dans le génome de la plante peuvent fournir un avantage sélectif à ces plantes.

Avec ce sujet de recherche, nous fournissons une plate-forme aux scientifiques pour partager leur compréhension de Agrobactérie biologie et comment Agrobactérie transforme les plantes. Ces contributions démontrent comment une communauté de recherche très active en sciences végétales et microbiennes peut élucider d'importantes questions de pathogenèse. Des recherches futures sur Agrobactérie continuera à faire progresser notre compréhension des interactions plante-agent pathogène et fournira de nouvelles connaissances utiles pour le génie génétique des plantes.


Avancée

Nom scientifique
Rhizobium vitis (anciennement nommé Agrobacterium vitis )

Identification
Galles de la saison en cours

  • Apparaît pour la première fois au début de l'été sous forme de gonflements sur le tronc
  • Tissu mou, alambiqué, ressemblant à un cal, de couleur crème, faisant éruption à travers la couche d'écorce près des sites blessés de la vigne
  • Dans les jeunes vignes, la formation de galles est souvent observée juste au-dessus du point de greffe
  • À la fin de l'été, les galles s'assombrissent et deviennent de texture liégeuse avec une surface rugueuse et persistent pendant plusieurs années
  • Les galles mortes peuvent s'écailler de la vigne
  • De jeunes galles peuvent souvent se former à la périphérie des vieilles galles
  • Généralement vu de la ligne de sol au premier fil
  • Les vignes infectées stressées sont souvent tuées lors des épisodes de basse température en hiver

Souvent confondu avec :
Callosité excessive du matériel de pépinière dans des conditions humides : les callosités ne deviennent pas liégeuses et ne s'écaillent pas.

La biologie
La bactérie de la galle du collet survit dans les galles et les vignes systématiquement infestées. La bactérie reste à l'intérieur de la vigne, sans provoquer de symptômes, jusqu'à ce qu'il y ait une blessure au tronc et alors seulement envahit la partie externe du tronc où elle provoque une multiplication cellulaire rapide et une distorsion des galles produisant des tissus. La bactérie de la galle du collet peut également survivre dans les sols viticoles dans les débris de vigne. On pense que la majorité des infections sont le résultat de matériel de plantation contaminé sans symptômes. Généralement, l'incidence de la galle du collet est corrélée à la sensibilité au froid des variétés moins tolérantes au froid ayant une incidence plus élevée d'infection par la galle du collet.

Période d'activité
Au début de l'été, en particulier après des dommages hivernaux chez les variétés sensibles au froid.

Notes de scoutisme
Les galles se trouvent principalement sur le bas du tronc, de la ligne du sol au premier fil, cependant, les galles aériennes peuvent se développer à plus d'un mètre en haut du treillis. Surveillez ces zones du tronc pour les galles à partir du début de l'été. Les vignes gravement malades présentent généralement des réductions significatives de rendement et de vigueur, les prédisposant à la mort hivernale.

Seuil
Il n'y a pas de seuil. Les troncs présentant des symptômes de galle du collet s'affaibliront et mourront. Cependant, d'autres troncs asymptomatiques sur la même vigne, bien qu'infestés, peuvent continuer à produire des récoltes pendant de nombreuses années. Si la galle est au point de greffe et qu'aucun drageon ne se développe, la vigne mourra.

Notes de gestion
Les pratiques de gestion qui réduisent les blessures sont importantes dans la gestion de cette maladie, car l'expression de la galle du collet est étroitement corrélée à la survenue de blessures.

Avant la plantation

Les pertes de plants de vigne dues à la galle du collet peuvent être minimisées avec certaines considérations avant la sélection du site de vignoble ou la plantation.

  • Sélectionnez des sites avec un bon drainage du sol et de l'air, évitez les zones sujettes au gel
  • Sélectionnez des porte-greffes résistants à la galle du collet tels que Courderc 3309, 101-14 Mgt et Riparia Gloire,
  • Sélectionnez des variétés rustiques et tolérantes au froid dans la mesure du possible
  • Ne pas replanter de vieux vignobles où la galle du collet était présente moins de 2 ans après l'enlèvement des vignes. Les bactéries de la galle du collet peuvent survivre dans les restes des vieux plants de vigne jusqu'à ce que les débris se décomposent. Lorsque vous enlevez des vignes malades, enlevez autant de système racinaire que possible.
  • Achetez des vignes d'une source réputée. Le matériel de pépinière infesté de manière latente est la principale source de maladie de la galle du collet dans les vignobles.
  • Le traitement à l'eau chaude des vignes est efficace pour réduire les niveaux d'infection par la galle du collet dans le matériel de plantation.

Après la plantation

Il y a peu de choses à faire pour contrôler cette maladie une fois qu'elle est établie dans le vignoble, si ce n'est d'éviter les blessures aux vignes (hivernales, mécaniques et humaines) qui activeront la maladie.


Avancée

Nom scientifique
Agrobacterium tumefaciens

Identification

  • Galles sur les racines, les couronnes et parfois les troncs et les échafaudages
  • Les galles sont sphériques, grumeleuses et rugueuses, variant de 1 à plus de 10 cm de diamètre
  • Les galles sont initialement molles et lisses mais deviennent sombres, dures, rugueuses, ligneuses et fissurées à mesure qu'elles grossissent et vieillissent
  • Les galles ne se produisent généralement que d'un côté de la racine
  • Les jeunes arbres peuvent être ceinturés et tués assez rapidement par les galles du collet Les galles ne sont généralement pas graves sur les arbres plus âgés, à moins qu'elles ne soient envahies par des champignons de la pourriture du bois

Souvent confondu avec
Gale du nématode à galles sur les racines - le gonflement se produit sur tout le diamètre de la racine plutôt que sur un seul côté

La biologie
L'agent pathogène affecte un large éventail de plantes ligneuses à feuilles larges, y compris les fruits à noyau. Les bactéries sont libérées dans le sol lorsque les galles sont humides ou lorsque le tissu biliaire plus ancien se désintègre. La bactérie peut survivre dans le sol pendant au moins 1 an en l'absence de tissu hôte. Les arbres établis ne sont infectés que par des blessures, telles que celles causées par des fissures de croissance, un élagage, des dommages causés par le matériel de culture ou des blessures dues au gel. Les semis peuvent être infectés pendant la germination s'ils sont plantés dans un sol infesté. Les galles interfèrent avec l'écoulement normal de l'eau et des nutriments. Les jeunes arbres peuvent être tués tandis que les arbres plus âgés souffrent d'une croissance et d'une vigueur réduites.

Les bactéries pénètrent dans les racines et la couronne par les blessures produites lors de l'entretien et de la manipulation du matériel de pépinière. Ils peuvent également pénétrer par les blessures causées par les insectes qui se nourrissent des racines. Après l'infection, les bactéries de la galle du collet envahissent les tissus de l'hôte et se multiplient entre les cellules hôtes. Une partie du matériel génétique de la bactérie s'incorpore à celui des cellules hôtes, les faisant proliférer et produire des acides aminés inhabituels qui servent de source de nourriture pour les bactéries. La prolifération de ces cellules entraîne la formation de galles.

Les symptômes peuvent se développer en quelques semaines à des températures modérées ou la bactérie peut rester latente pendant 2 à 5 ans avant que les symptômes ne se manifestent. Si la galle du collet apparaît dans la pépinière, les symptômes sont généralement bien développés sur les arbres finis au moment de l'excavation.

En plus des galles primaires, des galles secondaires se développent parfois à une certaine distance de l'infection initiale. Ces galles peuvent se développer sur des tissus non blessés et les bactéries ne peuvent pas être associées à elles.

Période d'activité
Les symptômes peuvent se développer en quelques semaines à des températures modérées ou la bactérie peut rester latente pendant 2 à 5 ans avant que les symptômes ne se manifestent.

Seuils
Il n'y a aucune tolérance pour les arbres de pépinière infestés de galles du collet.

Notes de scoutisme
Inspectez les arbres de pépinière pour des signes de galles avant la plantation. Surveillez les jeunes arbres pour des signes d'effondrement et les arbres plus âgés pour une perte de vigueur. Vérifiez les racines, les couronnes, les troncs et les échafaudages pour la galle du collet.

Notes de gestion
Plantez dans des champs bien drainés et alternez les sites de champs contaminés avec des plantes non hôtes telles que des graminées ou des céréales.

En pépinière, un milieu de plantation stérile doit être utilisé.

Utilisez uniquement du matériel de pépinière exempt de galle du collet provenant d'une pépinière réputée. Inspectez soigneusement le matériel de pépinière avant la plantation et retournez le lot entier si des arbres symptomatiques sont trouvés. Plantez des semis avec peu ou pas de gîte.

Manipulez les jeunes arbres pour éviter autant que possible les blessures, aussi bien à la plantation que pendant la vie de l'arbre dans le verger.

Enlevez les arbres trouvés avec de grosses galles entourant les couronnes lorsque les arbres deviennent improductifs.

Lors de la replantation d'un site précédemment touché, enlevez autant de vieilles racines d'arbres que possible, faites pousser une rotation de graminées pour aider à dégrader les restes de matériel hôte et à réduire les niveaux d'agents pathogènes, et décalez les nouveaux arbres de l'espacement précédent des arbres pour minimiser le contact de nouveaux arbres sains. racines avec toutes les racines infestées qui peuvent rester.


16.5F : Agrobacterium et maladie de la galle du collet - Biologie

Agrobacterium tumefaciens
Par Alyssa Collins
Un projet de classe pour
PP728 Agents phytopathogènes du sol
Université d'État de Caroline du Nord
Département de phytopathologie

Agrobacterium tumefaciens, la cause de la maladie économiquement importante, la galle du collet, a également été étudiée pendant des années en raison de sa biologie remarquable. Le mécanisme utilisé par cette bactérie pour parasiter les tissus végétaux implique l'intégration d'une partie de son propre ADN dans le génome hôte, ce qui entraîne des tumeurs disgracieuses et des changements dans le métabolisme des plantes. A. tumefaciens a incité le premier développement réussi d'un agent de contrôle biologique et est maintenant utilisé comme un outil pour l'ingénierie des gènes souhaités dans les plantes.

Plage d'hôtes et distribution

Agrobacterium tumefaciens a une distribution cosmopolite, affectant les plantes dicotylédones dans plus de 60 familles de plantes différentes. La galle du collet se trouve le plus souvent sur les arbres fruitiers à noyau et à pépins ainsi que sur les ronces et plusieurs espèces de plantes ornementales.

Agrobacterium tumefaciens est un membre de la famille Rhizobiacées. Ces bactéries sont Gram-négatives et se développent en aérobie, sans former d'endospores. Les cellules sont en forme de bâtonnet et mobiles, ayant un à six flagelles péritriches. Les cellules mesurent 0,6-1,0 m m sur 1,5-3,0 m m et peuvent exister seules ou par paires. En culture sur des milieux contenant des glucides, les cellules produisent de grandes quantités de polysaccharides extracellulaires, donnant aux colonies un aspect volumineux et visqueux.

Récemment, un reclassement des espèces de Agrobactérie a été entreprise en utilisant le séquençage de l'ARN ribosomique comme outil taxonomique. La nomenclature qui en résulte place l'ancienne espèce, A. tumefaciens biovar 1, A. radiobacter biovar 1, et A. rhizogenes biovar 1, au sein du nouveau taxon : Agrobacterium tumefaciens.
Isolation
A. tumefaciens peuvent être efficacement isolés pour identification à partir de tissus biliaires, du sol ou de l'eau. Le tissu biliaire optimal pour l'isolement est blanc ou crème à partir d'une jeune galle en croissance active. La galle doit être lavée ou stérilisée en surface avec de l'eau de Javel à 20 % et rincée plusieurs fois à l'eau stérile. Coupez quelques échantillons de différentes parties du tissu blanc de la galle et divisez encore les échantillons en petits morceaux. Placer ces morceaux dans un tube de culture contenant de l'eau distillée stérile ou un tampon, vortexer et laisser reposer pendant au moins 30 minutes. À l'aide d'une anse d'ensemencement, étalez cette suspension sur le milieu 1A (Schaad et al., 2001) et incubez à 25-27 °C. Différentes souches se développeront à des vitesses différentes. On peut aussi utiliser ce milieu sélectif pour détecter A. tumefaciens dans les dilutions du sol ou l'eau d'irrigation.

Il faut cependant noter que la présence de A. tumefaciens cellules dans un échantillon ne dicte pas nécessairement l'existence de la souche incitant la galle du collet dans l'échantillon. Seules les cellules contenant un plasmide spécifique (le Tjeplasmide) peut provoquer une maladie. A. tumefaciens les souches dépourvues du plasmide vivent comme des bactéries habitant la rhizosphère sans provoquer de maladie.

Symptômes

La galle du collet se manifeste initialement par de petits renflements sur la racine ou la tige près de la ligne du sol et occasionnellement sur les parties aériennes de la plante. Les jeunes tumeurs, qui ressemblent souvent au tissu calleux résultant d'une blessure, sont molles, quelque peu sphériques et de couleur blanche à crème. À mesure que les tumeurs vieillissent, leur forme devient assez irrégulière et elles deviennent brunes ou noires. Les tumeurs peuvent être reliées à la surface de l'hôte par seulement un petit morceau de tissu, ou peuvent apparaître comme un gonflement de la tige, non distinctement séparé. Le tissu peut être spongieux et s'effriter dans toute la galle ou peut être ligneux et en forme de nœud. Plusieurs tumeurs peuvent apparaître sur la même plante et peuvent pourrir complètement ou partiellement de la surface de la plante, se développant éventuellement à plusieurs reprises dans la même zone saison après saison. Les symptômes supplémentaires incluent le rabougrissement, les feuilles chlorotiques et les plantes peuvent être plus sensibles aux conditions environnementales défavorables et aux infections secondaires.

Des souches pathogènes de A. tumefaciens peut vivre de manière saprophyte dans le sol jusqu'à deux ans. Lorsqu'une plante hôte voisine est blessée près de la ligne du sol par l'alimentation d'insectes, une blessure de transplantation ou tout autre moyen, la bactérie se déplace par chimiotactisme dans le site de la blessure et entre les cellules hôtes. Ces bactéries stimulent ensuite la division rapide et irrégulière des cellules hôtes environnantes. La bactérie y parvient en insérant un morceau de son propre ADN dans les chromosomes des cellules hôtes, provoquant une surproduction de cytokinines et d'auxines qui sont des régulateurs de croissance des plantes, et d'opines qui servent de nutriments pour l'agent pathogène. Le tissu résultant est indifférencié avec une couleur blanche ou crème, et les cellules peuvent avoir un ou plusieurs noyaux. Ce tissu continue de s'agrandir et une tumeur se forme sur la racine ou la tige de la plante, selon le site de la plaie d'origine. Les bactéries occupent les espaces intercellulaires autour de la périphérie de la galle et ne se trouvent pas au centre de la tumeur en expansion. La tumeur n'est pas protégée par un épiderme, laissant le tissu sensible aux agents pathogènes secondaires, aux insectes et aux saprophytes. La dégradation de la tumeur par des envahisseurs secondaires provoque une décoloration brune ou noire et des libérations A. tumefaciens les cellules retournent dans le sol pour être emportées par de la terre ou de l'eau, ou restent dans le sol jusqu'à la prochaine saison de croissance. Chez les plantes vivaces, une partie des tissus infectés peut rester vivante et habitée par A. tumefaciens, qui, même si la tumeur s'est desséchée, peut persister et provoquer une nouvelle tumeur la saison suivante au même endroit.

Introduction de pathogène A. tumefaciens Les souches peuvent être évitées par une inspection approfondie du matériel de pépinière pour détecter les symptômes de galle du collet. Les variétés sensibles ne doivent pas être plantées dans des sols connus pour être infestés par l'agent pathogène. Ces sols doivent être plantés dans une culture monocotylédone comme le maïs ou le blé pendant plusieurs années. Le matériel de pépinière doit être certifié exempt de galle du collet et doit être écussonné plutôt que greffé. Si la menace de galle du collet existe, toutes les pratiques qui blessent les tissus doivent être évitées et les insectes broyeurs doivent être contrôlés.

Traitement préventif des semences ou des transplants avec l'organisme de lutte biologique non pathogène Agrobacterium radiobacter est un moyen relativement peu coûteux et efficace de gérer le développement de la galle du collet dans les exploitations commerciales. L'application de cet antagoniste par trempage des graines ou trempage des transplants peut prévenir l'infection par la plupart des souches de A. tumefaciens due à la production de l'antibiotique agrocine 84 par la souche K84 de A. radiobacter. Certaines propriétés curatives sont présentées par un mélange disponible dans le commerce de 2,4-xylénol et de métacrésol dans une émulsion huile-eau lorsqu'il est peint directement sur des tumeurs établies. Mais cela est rarement utilisé en raison de contraintes de main-d'œuvre et de temps.

Agrios, G.N. 1988. Pathologie végétale, 3 e éd. Academic Press Inc., Londres. p. 558-565.

Horst, R.K. 1983. Compendium des maladies des roses. APS Press, St. Paul, MN. pages 23-25.

Schaad, N.W., J.B. Jones et W. Chun. 2001. Guide de laboratoire pour l'identification des bactéries phytopathogènes, 3 e éd. APS Press, St. Paul, MN. p. 17-35.

Liens vers d'autres sites contenant des informations sur Agrobacterium tumefaciens


Maladie de la galle du collet des cultures de pépinière

Notez toutes les galles le long de la tige vers la droite. Beaucoup ont commencé à tailler les plaies.

L.W. Moore (décédé), bactériologiste et phytopathologiste, OSU

Mis à jour par M. L. Putnam, diagnosticien et phytopathologiste, OSU

La galle du collet continue d'être un problème majeur pour l'industrie des pépinières, à la fois pour les plantes ligneuses et herbacées. L'agent pathogène traditionnellement connu pour causer la galle du collet dans la plupart des plantes est Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter). Le nom de l'agent pathogène est contesté depuis des décennies et A. tumefaciens est connu pour être un complexe d'espèces composé d'au moins 11 espèces génomiques différentes. Ici, nous désignerons les bactéries qui causent la galle du collet comme des agrobactéries tumorigènes. D'autres espèces d'Agrobacterium peuvent également provoquer des galles : A. rubi est beaucoup moins commun du nom de l'hôte dans lequel il a été trouvé pour la première fois (Rubus spp.), il a depuis été trouvé dans les galles sur rose, et sera probablement trouvé dans d'autres plantes avec le temps. Agrobacterium vitis (= Allorhizobium vitis ) provoque des galles sur la vigne. A. larrymoorei provoque des galles chez Ficus benjamina et a récemment été trouvé dans les galles du rosier. Une nouvelle espèce formant des galles, également isolée du rosier, a été récemment décrite et nommée A. rosae . Il est probable que d'autres espèces seront nommées dans les années à venir, car les bactéries associées aux galles sont examinées de plus près à l'aide de techniques moléculaires modernes. Toutes ces espèces ont une biologie similaire. Cette discussion porte sur la biologie, la gamme d'hôtes, les symptômes et la gestion de la maladie.

La galle du collet est une maladie tumorale des plantes causée par des agrobactéries tumorigènes, dont on pense que beaucoup sont présentes dans la plupart des sols agricoles. Les agents pathogènes, dans le sol ou sur les plantes infestées, sont disséminés par les éclaboussures de pluie, l'eau d'irrigation, le talonnage des plantes galles avec des plantes saines, les machines agricoles, les outils d'élagage, le vent et les parties de plantes utilisées pour la propagation. Des blessures sont nécessaires pour que l'agent pathogène infecte une plante. Les blessures sont causées par la taille et la culture, l'émergence des racines latérales, les dommages causés par le gel et l'alimentation des insectes et des nématodes. L'agent pathogène colonise la plaie, s'attache fermement aux cellules végétales blessées et transfère une partie de son ADN dans l'ADN de la plante. Les galles apparaissent en quelques semaines à des températures supérieures à 70 ° F sur les plantes herbacées, les plantes ligneuses telles que les roses peuvent ne présenter de galles que des mois ou des années après l'exposition. Les infections latentes se développent généralement en galles plus tard dans la saison de croissance. Les bactéries pathogènes peuvent être excrétées de la galle dans le sol ou l'eau environnant où elles colonisent ou infectent de nouveaux tissus végétaux.

Bien qu'il soit communément rapporté qu'il a une gamme d'hôtes de centaines, cette information est basée sur des inoculations artificielles souvent d'un seul isolat. En pratique, beaucoup moins de plantes sont naturellement sensibles. (Des exemples de plantes hôtes infectées par Agrobacterium sont répertoriés dans le tableau 3.) Cependant, les systèmes racinaires de plantes non hôtes telles que les mauvaises herbes, les graminées et les céréales peuvent abriter l'agent pathogène et servir de réservoir d'inoculum en milieu naturel.

La maladie est appelée galle du collet, mais la galle peut être trouvée à la base des boutures, sur les racines, les couronnes ou sur les tiges, les tiges, les vignes ou les feuilles. Les galles des feuilles se trouvent généralement sur les plantes herbacées qui ont une infection systémique. (Les plantes ornementales herbacées sensibles à la galle du collet sont présentées dans le tableau 1.) Les galles apparaissent souvent au niveau des plaies d'élagage. Les galles sont généralement arrondies et peuvent être lisses ou texturées comme une tête de chou-fleur. Sur les plantes ligneuses vivaces, les galles deviennent plus ligneuses et fissurées avec l'âge, atteignant parfois un diamètre de 6 pouces et ceignant la tige. Les galles sur les vignes, les myrtilles et les ronces sont généralement des crêtes de tissu allongées et éruptives qui éclatent à travers les tissus externes de la tige.

Les plantes ligneuses infectées la première année de plantation sont plus sévèrement endommagées. (Les plantes ligneuses sensibles à la galle du collet sont présentées dans le tableau 2.) Les jeunes plantes gravement atteintes de galles sont affaiblies, rabougries et improductives et meurent parfois à cause d'un système racinaire inférieur. Les rapports de la littérature sur les dommages à la galle du collet sont contradictoires, ils vont de bénins à débilitants et mortels.

Les symptômes deviennent évidents 2 à 4 semaines après l'infection si les températures sont égales ou supérieures à 68 °F, coïncidant généralement avec des températures du sol plus chaudes en mai ou juin. Initialement, les galles ressemblent à des excroissances de callosités, mais augmentent ensuite rapidement en taille et en nombre. Le développement des symptômes ralentit considérablement en dessous de 58 °F et s'arrête en dessous de 50 °F. L'infection est inhibée au-dessus de 92°F à 95°F. Les infections latentes sont asymptomatiques et surviennent généralement lorsque les sols sont frais. Les symptômes des galles se développent généralement au niveau de la plaie infectée la saison suivante, à de rares occasions, les galles n'apparaissent pas avant la troisième saison de croissance.

Certains problèmes peuvent ressembler à la galle du collet mais ne sont pas pathogènes. Aerial burr knot on apple tree trunks and branches is a cushion-like assemblage of adventitious roots its cause is thought to be genetic rather than an infectious agent.

Small galls require careful diagnosis because they may be confused with excessive wound callus. Detection using molecular methods specific to plasmid gene regions involved with virulence, or isolation of bacteria later identified as pathogenic is necessary to confirm a crown gall diagnosis. Nonpathogenic Agrobacterium cells are often prevalent in these same tissues and can reach high populations. That makes diagnosis difficult, especially in galls on apple, blueberry, and grapevines where non-pathogens can constitute over 99% of the Agrobacterium population.

Disease Management – Woody Nursery Stock

Pathogen-free plants grown in uninfested soil will not develop crown gall. This emphasizes the importance of planting clean propagating material in clean soil. Good sanitation and cultural practices are important deterrents to crown gall. Discard all nursery stock showing symptoms to avoid contaminating healthy plants and storage facilities. At harvest, leave noticeably galled plants in the field for later pickup and destruction. If possible, choose a rootstock that is less susceptible, avoid planting sites heavily infested by root-attacking insects and nematodes, disinfect pruning equipment between trees, and adopt management practices that minimize wounding. Avoid planting into heavy, wet soil. Don’t plant trees deeper than they grew in the nursery. If possible, incubate dormant seedling roots at 73°F to 76°F for 10 to 14 days to heal wounds and reduce susceptibility to tumorigenic agrobacteria before planting them in wet soil. Use irrigation water from wells, if possible. Avoid planting where galled plants grew in the last 4 to 5 years choose fields that were planted recently to vegetables or grain. In summary, think prevention —avoid exposing plants to tumorigenic agrobacteria at any stage of plant production.

Crown gall is generally much more prevalent in heavy soils or in soil where water stands for a day or so. In New York, crown gall incidence was highest on a heavy clay knoll (15 ft elevation) from which water drained toward flat, loamy portions of the field. In Oregon, gall incidence on an Old Home x Farmingdale pear rootstock selection was severe (495 of 500 trees infected) in a heavy, wet soil, but in the same field only 1 of 500 trees was galled outside the wet area.

Cropping history can influence crown gall incidence. Budded apple trees became badly galled in fields where a previous nursery crop such as grape, peach, raspberry, and rose had been heavily infected. This situation isn’t repeated at every site, but we still recommend avoiding fields with a recent history of crown gall.

Reports of resistance in plants normally susceptible to crown gall are limited and depend on the strains of bacteria present in a given location. There are no reliable lists of cultivars with resistance that hold up in all geographic locations. It is better to select plants that are not susceptible in the first place if crown gall is a chronic problem in a particular field.

Using A. radiobacter K84, a biological control agent, has been very effective against crown gall on a number of hosts, but exceptions exist. Strain K84 produces a toxin against some tumorigenic strains of agrobacteria. This biological control is solely preventive, not curative application timing is critical to properly protect plant wounds caused at harvest or by pruning. Htay and Kerr recommend seed and root treatment with K84 for best results. Not all strains of tumorigenic agrobacteria are sensitive to K84. For example, most agrobacteria isolated from grape tumors are A. vitis , which are insensitive to K84. If K84 has been used properly and galling persists, its use should be discontinued since it is likely the bacteria present are not sensitive to the product.

An improved, genetically engineered strain of K84 called K1026 is available. Its use is preferable, since the K1026 bacteria are not capable of transferring to other bacteria the genes that produce the toxin.

Biological control is compatible with a few pesticides such as metalaxy (Ridomil), thiram and thiophanate-methyl (Topsin) but not with captan, etridiazole alone (Truban), etridiazole plus thiophanate-methyl (Banrot or Zyban), mancozeb, PCNB or streptomycin. It is also not compatible with chlorinated water.

No registered chemicals that effectively control crown gall are currently available in the United States. In general, chemical preplant dips or soil drenches have been ineffective.

Fumigation to rid soil of Agrobacterium generally has been ineffective, and in some cases, growers reported more disease after fumigation.

Heat therapy has been tried in cherry and plum seedlings, and in dormant grape cuttings. Although these measures can reduce the incidence of disease, there will still be a small percentage of plants that remain infected. Time and temperatures needed for effective heat therapy has not been determined for many plants, and injury to the plant material can occur when temperatures are too high. Although promising, heat therapy is not commonly used due to these difficulties.

In solarization, a thin plastic film is stretched over moist soil to capture energy from the sun and heat the soil to temperatures that kill pathogenic microbes. Populations of tumorigenic agrobacteria could not be detected in a solarized sandy loam soil, but solarization did not work in the heavier silty-loam. Mazzard cherry seedlings planted later in solarized and in nonsolarized control plots developed crown gall only in the nonsolarized plots.

Following is a summary of the best practices for managing crown gall. They include experimental results and grower observations. Understandably, physical and economic constraints occasionally may impede applying all these practices. But for best results, follow or adapt the procedures as closely as possible to fit your management plan.

Best Practices for Managing Crown Gall

  • Discard diseased plants as soon as noticed to avoid cross-contaminating other plants, equipment, or storage facilities.
  • Don’t heel-in galled plants with healthy plants.
  • Use good sanitation in handling planting stock.
  • Minimize wounding disinfect pruning tools between plants.
  • Plant only disease-free stock.
  • Plant in clean soil.
  • Avoid fields with a recent history of high crown gall infestation.
  • Avoid fields with heavy infestations of root-attacking insects and nematodes.
  • Select well-drained soils tile heavy soils.
  • Field-fallowing is helpful but may be impractical west of the Cascade Range.
  • Rotate susceptible crops with small grains.
  • Plant when soil is below 50°F.
  • Solarize lighter soils.
  • Avoid mechanical injury from tillage, hoeing.
  • Irrigate with deep-well water or sanitized pond water.
  • Keep grafts and buds above soil line.
  • Avoid high nitrogen and irrigation late in the growing season.

The following are specific procedures for commonly grown plants that can be used in addition to the above general procedures.

Stone Fruit, Nut Crops, Roses: Dip or spray with the biocontrol agent K84 or K1026. Apply to seed, bare roots, and aboveground grafts.

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Fond

Crown gall disease was identified long ago as a bacterial plant disease [1], and its pathogenic bacterium is Agrobacterium tumefaciens, which mainly infects dicots. This disease often results in severe economic losses to the production of cherry and other fruit trees [2,3,4]. Crown gall disease starts with the attachment of A. tumefaciens to plant cell. And then the transfer DNA, a portion of the Ti plasmid, will be integrated into the plant genome. Finally, the symptomatic tumors form and grow [5].

Crown gall disease affects many fruit trees and causes extensive economic losses in nurseries. In a previous study, 11 tree species were surveyed. The highest disease incidence was found in peach (Prunus persica [L.] Batsch), almond (P. dulcis D Webb), cherry (P. avium L.), apple (Malus sylvestris Mill) and olive (Olea europaea L.) [6]. It was also found the rootstock of peach, cherry, apple and pear (Pyrus communis L.) trees was a influence factor contributing to the significant differences in the frequency of galled plants.

Plants are often exposed to many various bacterial, viral, and fungal pathogens but have evolved potent defense systems to protect themselves [7]. In defense responses of plants, the identification of microbial pathogens plays a key role, as it “turns on” the signal transduction pathway which activates the expression of numerous pathogen-responsive genes [8, 9]. These disease resistance genes are crucial for identifying the effector proteins during the process of pathogen infection [7].

Many biotechnological strategies have been developed and applied in the attempt to control crown gall disease. In transformation experiments, the truncated genes involved in T-DNA transfer have been used to induce plant resistance to crown gall disease [10, 11], and inactivating the oncogenes could prevent tumor formation [12]. Therefore, to obtain plants that are resistant to crown gall disease, much research has been devoted to producing sense and antisense strands of the oncogene sequence by placing these sequences between opposing strong constitutive promoters [13], or to silencing the involved bacterial oncogenes by using premature stop codons [14]. The study of Niemeyer et al. (2014) demonstrated a successful reprogramming of the viral N gene response against crown gall disease [9]. In recent years, Rosalia Deeken’s group has been working on the molecular mechanism between crown gall disease and A. tumefaciens dans Arabidopsis thaliana [8, 15,16,17,18]. Pathogen infection always induces response of plant hormones. Lee et al. (2009) explored the physiological changes and adaptations on the aspect of SA, JA, ethylene (ET), and auxin (indole-3-acetic acid, IAA) with changes in the Arabidopsis thaliana transcriptome during tumor development [5].

At present, planting resistant cultivars and developing biological antagonists both are effective measures to control crown gall disease in orchards [3]. The existing biological antagonists are mainly used for prevention but they act poorly as a treatment. So the crown gall-resistant cultivars in agriculture were in need [19]. Previous studies have reported crown gall-resistant cultivars for apple, peach, plum, grapevine, aspen, and roses [20,21,22,23,24,25,26,27]. Crown gall resistance has been assessed in accessions of 20 Prunus species [21]. And it was found that when the strains K12 and C58 of A. tumefaciens were used to infect the main stems or lateral branches of seedlings, the incidence of resistance was up to 30% in some accessions of P. mahaleb. The cherry breeding resource plant P. mahaleb is a cosmopolitan cherry rootstock. In northwest China, it has become one of the main sweet cherry rootstocks because of its excellent biological traits, such as strong resistance to crown gall disease, dwarfing ability and salinity among other desirable traits [28]. By systematic classification of cherry species, P. mahaleb belongs to the III. Cerasus subgenus, Section 5 Mahaleb Focke [29]. It is a deciduous tree or large shrub, growing to 2–10 m (rarely up to 12 m) tall with a trunk up to 40 cm diameter. In most cherry growing countries, mahaleb cherry is used to be rootstock of sweet and sour cherries [28]. This rootstock showed strong resistance to crown gall disease in cherry production, but little is known about its mechanism of crown gall resistance. Furthermore, the actual genes (without modification) underpinning resistance to crown gall have not yet been reported.

In this study, we focused on cherry rootstock ‘CDR-1’ (P. mahaleb), the natural hybrid cultivar of P. mahaleb. The objective of our study was to investigate the resistance mechanism of ‘CDR-1’ to crown gall disease. Here, we carried out morphological observations, physiological and biochemical analyses, gene expression analysis and transcriptomic analysis in ‘CDR-1’, and conducted transient expression and transgenic verification in tobacco. Our results provide evidence that the crown gall resistance of ‘CDR-1’ is likely related to the lignin biosynthetic pathway.


Procédures expérimentales

Matières végétales

Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 was used for the seedling transformation assay, transcriptome assay and Agrobactérie inoculation assay. GS mutants in the Col-0 background, including myb28/myb29 (SALK_136312 x GABI_868E02), cyp81F2-1 (SALK_073776), cyp81F2-2 (SALK_123882), myb51-1 (SM_3_16332), myb51-2 (SALK_059765), cyp79B2/cyp79B3 (Zhao et al., 2002 ), pen2-1 (Lipka et al., 2005 ) and pen2-2 (GABI-KAT 134C04), the camalexin mutants, including cyp71A12 (GABI-KAT 127-H03), cyp71A13-1 (SALK_105136), cyp71A13-3 (SALK_128994) and pad3-1 (CS3805), and the cyp79b2/B3/myb28/29 quadruple (qko) mutant, completely free of GSs and camalexin, were used in the transient seedling transformation assay as described.

Agrobactérie transformation of Arabidopsis seedlings and GUS assays

The virulent A. tumefaciens wild-type strain C58 was used for the infection of Col-0 seedlings. Seeds were germinated in 2 mL of half-strength Murashige and Skoog (MS) (Basal Salt Mixture, PhytoTechnology Laboratories, Kansas City, Kansas, USA) liquid medium [half-strength MS salt supplemented with 0.5% sucrose (w/v), pH 5.7] in each well of a six-well plate. Germination and growth took place in a growth room at 22 °C under a 16-h/8-h light–dark cycle (100 µmol/m 2 /s). Virulence of A. tumefaciens was pre-induced by 200 µ m acetosyringone in AB-MES (AB Minimal Medium plus MES salt, pH 5.5) (Wu et al., 2014 ) at 25 °C for 16 h prior to infection. Les Arabidopsis seedlings were infected with pre-induced A. tumefaciens C58 cells at an optical density at 600 nm (OD600) = 0.02 in half-strength MS medium. If the removal of agrobacterial cells was necessary, co-cultivation medium was removed after the chosen infection time and replaced with 2 mL of freshly prepared half-strength MS medium containing 100 µ m timentin, and incubated for recovery before analysis.

For the monitoring of the transient transformation efficiency, the T-DNA vector pBISN1 carrying the gusA-intron genes (Narasimhulu et al., 1996 ) was transformed into A. tumefaciens strain C58 for infection of Arabidopsis seedlings. GUS staining and activity assays were carried out as described at the chosen infection time (Salinas and Sánchez-Serrano, 2006 Wu et al., 2014 ). In brief, seedlings were stained by incubation in GUS staining solution containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc), and incubated at 37 °C in the dark overnight, followed by destaining in 90% ethanol (EtOH). For the GUS activity assay, liquid nitrogen-frozen seedlings from each well were ground into a fine powder to extract total protein. The GUS activity in 20 µg of protein per 200-μL reaction was quantified with the fluorescence substrate 4-methylumbelliferyl-β- d -glucuronide (MUG). The fluorescence intensity (excitation, 365 nm emission, 455 nm filter at 430 nm) was measured using a Microplate Reader (BioTek, Taipei, Taiwan) at 37 °C for 1 h. GUS activity was normalized to the protein amount and 4-methylumbelliferone standard curve. For statistical analysis, one-way analysis of variance (ANOVA) with Dunnett's test was performed. To determine the effects of GS-derived metabolites and camalexin on GUS enzyme activity in vitro, the selected compounds and DMSO control were each incubated with 5 ng of recombinant GUS protein (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in GUS extraction buffer containing 1 m m MUG. The reaction mixture was measured for GUS activity at 37 °C for 1 h.

Transcriptome analysis

For gene expression profiling of Agrobactérie-infected seedlings, the shoots and roots of Col-0 seedlings (infected or mock control) were separated by cutting with a micro-scissor and immediately frozen in liquid nitrogen. Total RNA was extracted according to the phenol (pH 4.5)/chloroform protocol, followed by gene expression analysis with Affymetrix ATH1 chips (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). The chips of three biological repeats were normalized by the MAS5.0 algorithm using GeneSpring software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), and the genes with an intensity higher than the background value (value > 75), which passed the asymptotic unpaired t-test with Benjamini–Hochberg test correction (FDR, P < 0.05), were selected for further analysis. The fold changes were determined from the signals of infected plant tissues versus mock infection controls under the same conditions, and two-fold changes were used as cut-off to determine Agrobactérie-gènes sensibles. GOBU software (Lin et al., 2006 ) was used to analyse GO. The significant GO items were calculated with elim Fisher's exact test (P < 0.01) based on gene counts (Alexa et al., 2006 ).

Crown gall growth assay

For the crown gall growth assay, the A. thaliana wild-type Col-0 and mutants were cultivated in growth cabinets (Percival, CLF, Wertingen, Germany) under short-day conditions at 22 °C (8 h of 80–100 µmol/m 2 /s light Osram 400 W, Power Star HQI-E 400W/DV, 380–780 nm) (Wuerzburg, Germany) and 16 °C during the dark period (16 h) with a relative humidity of 50%–60%. Tumour development was induced by streaking virulent A. tumefaciens strain C58 into a wound of 1.5 cm in length, scratched into the base of young 5-cm-long inflorescence stalks. Tumour tissue was harvested 28 days after infection using a scalpel and a binocular. Wounded, but uninfected, tumour-free inflorescence stalk sections of the same age served as reference tissues.

GS and camalexin analysis in Arabidopsis semis

Extraction and analysis of seedling GSs and camalexin were performed and modified as described previously (Glauser et al., 2012 Zandalinas et al., 2012 ). In total, 100 mg FW of Arabidopsis seedlings were homogenized and dissolved in 1 mL of 70% high-performance liquid chromatography (HPLC)-grade methanol containing 12.5 ng/μL sinalbin (4-hydroxybenzyl GS) as an internal standard. The supernatants obtained were heated at 80 °C for 20 min and subjected to a UPLC-Synapt G1 high-definition mass spectrometry (HDMS) system (Waters, Taipei, Taiwan). GSs were separated on an Acquity CSH C18 column (length, 100 mm 2.1 mm i.d. 1.7 μm Waters) at a flow rate of 400 μL/min. The GSs were eluted by solvent A (2% acetonitrile and 0.05% formic acid) and solvent B (100% acetonitrile and 0.05% formic acid) for 8 min in 1%–45% solvent B and 1 min in 45%–100% solvent B. The fractions were injected for MS analysis, and negative ion data were recorded in MS1 mode. The peak area was calculated by MassLynx software (Waters), and then normalized to nanomoles for GSs or micrograms for camalexin per gram FW. The GSs were quantified with the given references, including I3M for iGSs, 4MTB for methylthioalkyl GSs and 4MSOB for methylsulfinylalkyl GSs, purchased from AppliChem (Darmstadt, Germany). Camalexin was quantified with pure camalexin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

GS and camalexin analysis in Arabidopsis inflorescence stalks

For GS analysis of infected Arabidopsis inflorescence stalks, 100 mg (FW) were lyophilized, thoroughly homogenized and extracted three times with 1 mL of 80% (v/v) methanol. For the first extraction step, benzyl GS (Phytoplan, Heidelberg, Germany) was added to each sample as internal standard. GSs were desulfonated as described previously (Agerbirk et al., 2001 ), and separated on a Grom-Sil 80 ODS 7 pH column (length, 60 mm 4 mm i.d. 4 μm Alltech) (Wuerzburg, Germany) by HPLC (Agilent 1200, Waldbronn, Germany flow rate, 0.25 mL/min). The desulfo GSs were eluted as follows: 0.3 min in 0%–5% solvent A (water), 7 min with 1.2 min hold in 5%–95% solvent B (methanol) and 3.5 min in 95%–5% solvent B. Desulfo-GSs were determined via UV diode array detection (229 nm), identified and quantified using particular response factors (aGSs, 1 iGSs, 0.26) (Gonzáles-Megías and Müller, 2010 ).

Camalexin was extracted from lyophilized tissue (50 mg FW) by the addition of 400 μL of 85% methanol. The samples were thoroughly homogenized with a metal ball in a Mixer Mill 301 (Retsch, Haan, Germany) for 1.5 min at a frequency of 30 Hz. The extract was incubated at 42 °C for 60 min with addition of 0.3 μg/μL camalexin as an external standard. For the identification and quantification of camalexin, HPLC was applied as described by Mikkelsen et al. ( 2009 ).

GS derived metabolites and camalexin treatment for transient transformation assays and Agrobactérie cell counts

The selected aGS-ITCs (LKT Laboratories, St Paul, MN, USA) and camalexin were dissolved in DMSO, and I3M was dissolved in methanol. These compounds were added to the seedling co-cultivation medium for Agrobactérie infection and GUS assays, as described above.

For the measurement of the viable Agrobactérie cell number, the bacterial cells (C58 strain carrying pBISNI) in co-cultivation medium and associated with seedlings at 1 and 3 dpi were collected. Six seedlings per well were washed by 2 mL of double-distilled H2O to remove unbound bacteria and ground by a mortar in 1 mL of 0.9% NaCl solution. The bacterial cells in medium or associated with seedlings were 10× serially diluted and then plated on 523 medium (Kado and Heskett, 1970 ) containing kanamycin, and incubated at 25 ºC for 2 days to obtain colony-forming units (CFUs). The seedling-associated Agrobactérie cell number was further normalized to the plant fresh weight.

Myrosinase activity

Myrosinase activity was determined from 50–200 mg of frozen plant material, which was purified from internal substrate. Activity was measured by the photometric quantification of the released glucose from standardized amounts of externally added substrate according to the protocol developed by Travers-Martin et al. ( 2008 ).

Callus induction assay

Callus induction assay was performed and modified as described previously (Hwang and Gelvin, 2004 ). Col-0 and the tested mutants were grown on half-strength MS agar plates for 3 weeks, and the roots were cut into ∼1-cm segments. About 60 root explants were transferred to agar plates containing callus induction medium (CIM), further incubated for 4 weeks, followed by counting of the number of developing calli and calculation of the rate of callus induction.


Agrobacterium tumefaciens and Crown Gall Disease - PowerPoint PPT Presentation

Antibiotic treatment against bacteria that allow the plant to survive are useful . In Situ Transfer of Antibiotic Resistant Genes from Transgenic (Transplastomic) . &ndash PowerPoint PPT presentation

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Commentaires:

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