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4.2 : Phage M13 - Biologie

4.2 : Phage M13 - Biologie


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Le bactériophage connu sous le nom de "M13" constitue la base de systèmes de clonage conçus pour introduire facilement des mutations dans des gènes insérés dans le génome du phage. Il a également été utilisé dans diverses méthodologies de "présentation sur phage" et dans des bibliothèques "combinatoires" d'ADN et de peptides.

Infection et réplication M13

M13 est un filamenteux bactériophage qui infecte E. coli hôte. Le génome M13 a les caractéristiques suivantes :

  • Circulaire simple brin ADN
  • 6400 paires de bases de long
  • Le génome code pour un total de 10 gènes (nommés en chiffres romains I à X)

Figure 4.2.1 : génome M13

  • Gène VIII codes pour la principale protéine structurale des particules de bactériophage
  • Gène III codes pour la protéine d'enveloppe mineure

Figure 4.2.2 : Gène III et gène VIII

  • La protéine du gène VIII forme un réseau tubulaire d'env. 2 700 sous-unités identiques entourant le génome viral
  • Environ cinq à huit copies de la protéine du gène III sont situées aux extrémités du phage filamenteux (c'est-à-dire l'assemblage du génome et du gène VIII)
  • Permet de se lier au pilus "sexuel" bactérien
    • Pilus est une structure de surface bactérienne de E. coli qui abritent l'élément extrachromosomique "facteur F"

Infection

  • Le génome simple brin (dénommé brin « + ») attaché au pilus pénètre dans la cellule hôte
    • Protéine d'enveloppe majeure (gène VIII) supprimée
    • La protéine d'enveloppe mineure (gène III) reste attachée
  • Les composants de l'hôte convertissent le génome simple brin (+) en ADN circulaire double brin (appelé forme réplicative ou « RF »)
  • La transcription commence
    • Série de promoteurs
      • Fournit un gradient de transcription tel que le gène le plus proche des deux terminateurs de transcription soit le plus transcrit
    • Deux terminaisons
      • Un à la fin du gène VIII
      • Un à la fin du gène IV
    • La transcription des 10 gènes se déroule dans le même sens

Amplification du génome viral

  • La protéine du gène II introduit une "entaille" dans le brin (+)
  • Pol I prolonge le brin (+) en utilisant déplacement de brin (et le brin '-' comme modèle)
  • Après un voyage autour du génome, la protéine du gène II se casse à nouveau pour libérer un génome « + » complet (linéaire)
    • Le génome linéaire (+) est circularisé
  • Au cours des 15 à 20 premières minutes de réplication de l'ADN, les brins (+) de la descendance sont convertis en forme double brin (RF)
    • Ceux-ci servent de modèles supplémentaires pour une transcription ultérieure
  • La protéine du gène V s'accumule
    • C'est un protéine de liaison à l'ADN simple brin
    • Empêche la conversion du brin simple (+) en forme RF
  • Obtenez maintenant une accumulation d'ADN circulaire simple brin (+) (génome M13)

Figure 4.2.3 : Amplification du génome

Emballage de phages

  • Protéine d'enveloppe majeure (gène VIII) présente dans E. coli membrane
  • Génome M13 (+), recouvert de protéine de liaison ss - Protéine du gène V, se déplace vers la membrane cellulaire
  • Protéine du gène V enlevée et la principale protéine d'enveloppe (gène VIII) recouvre l'ADN du phage lorsqu'il est extrudé
    • Le processus d'emballage est donc pas lié à une contrainte de taille du génome M13
    • La longueur du phage filamenteux est déterminée par la taille de l'ADN dans le génome
    • Des inserts allant jusqu'à 42 Ko ont été introduits dans le génome M13 et emballés (taille du génome 7x)
  • ~8 copies de la protéine Gene III sont attachées à la fin du génome extrudé

Développement de M13 en vecteur de clonage

M13 a été développé en un vecteur de clonage utile en insérant les éléments suivants dans le génome :

  • un gène pour le lac répresseur (lac je) protéine pour permettre la régulation de la lac promoteur
  • la région proximale de l'opérateur du lac Z gène (pour permettre la complémentation a chez un hôte avec délétion proximale de l'opérateur du lac Z gène).
  • une lac promoteur en amont de la lac Z gène
  • une région polylinker (site de clonage multiple) a inséré plusieurs codons dans le lac Z gène

Graphique 4.2.4 : Insertions dans le génome

  • Les vecteurs ont été nommés en fonction de la région polyliner spécifique qu'ils contenaient
  • Les vecteurs étaient généralement construits par paires, avec les régions de polylinker dans des orientations opposées

Graphique 4.2.5 : Polylinker Régions

Clonage dans des vecteurs M13mp

  • La forme RF (double brin) du phage M13 peut être isolée et traitée comme n'importe quel autre plasmide
  • La région polylinker peut être "ouverte" en utilisant des endonucléases de restriction appropriées pour accepter le fragment d'intérêt
  • Le fragment est ligaturé dans la région plink
  • La disponibilité de plink orientés inversement (par exemple mp18, mp19) signifie que les fragments insérés avec des extrémités non complémentaires peuvent être insérés dans l'une ou l'autre orientation

Formes simple brin du phage

La capacité d'isoler une forme simple brin du phage présente des avantages à la fois dans le séquençage et la mutagenèse.

  • La matrice d'ADN simple brin peut être lue plus loin que la matrice double brin

Une méthode efficace de mutagenèse (la méthode "Kunkel") a été développée en utilisant la forme simple brin du phage.

  • Le vecteur M13mp avec insert est d'abord cultivé dans un mutant E. coli hôte (par ex. CJ236) qui incorporerait occasionnellement de l'uracile dans l'ADN au lieu de la thymidine.
    • E. coli synthétise normalement une enzyme (uracile-N-glycosidase) qui élimine les résidus d'uracile dans l'ADN. Cependant, dans ung- souches, l'uracile n'est pas éliminé
    • Le niveau de mauvaise incorporation de l'uracile dans l'ADN est augmenté dans les souches qui ont un déficit en dUTPase. Cette enzyme convertit le dUTP en dUDP, et donc, en devoir- souches, les niveaux de dUTP sont élevés et augmentent la mauvaise incorporation de dUTP dans l'ADN de l'hôte
    • Les E. coli souche CJ236 a un génotype qui inclut des caractéristiques dut-/ung-
  • Une amorce mutagène serait hybridée à cette matrice simple brin (par exemple pour produire une mutation ponctuelle)
  • L'amorce est étendue à l'aide des quatre dNTP et est ligaturée pour produire un ADN duplex
  • L'ADN duplex est inséré dans un hôte différent E. coli (par exemple. JM101) qui reconnaît et excise (dégrade) l'ADN contenant de l'uracile (c'est-à-dire une souche qui est ung+)
  • Le brin parent (type sauvage) est préférentiellement dégradé et le brin mutagène est répliqué.
  • La descendance du phage a typiquement une incidence élevée (80-90%) de la mutation souhaitée.

Graphique 4.2.6 : Méthode Kunkel


1 Structure et fonction des acides nucléiques.

1.1 Structure des acides nucléiques.

1.1.3 Interactions hydrophobes.

1.1.4 Différentes formes de la double hélice.

1.1.6 Dénaturation et hybridation.

1.1.7 Orientation des brins d'acide nucléique.

1.2.1 Déroulage et rembobinage.

1.2.2 Fidélité de la relecture de réplication.

1.3 Réplication chromosomique et division cellulaire.

1.4.3 Réparation par recombinaison (post-réplication).

1.5.3 Événements post-traductionnels.

2 Mutation et Variation.

2.1 Variation et évolution.

2.1.3 Mutation dirigée chez les bactéries ?

2.2.3 Variation due à des altérations de l'ADN à plus grande échelle.

2.2.4 Agents extrachromosomiques et transfert horizontal de gènes.

2.3.1 Un modèle du processus de recombinaison général (homologue).

2.3.2 Enzymes impliquées dans la recombinaison.

2.4.1 Restauration du phénotype.

2.5 Mécanismes de mutation.

2.5.3 Irradiation ultraviolette.

2.6 Isolement et identification des mutants.

2.6.1 Mutation et sélection.

2.6.3 Isolement d'autres mutants.

3 Régulation de l'expression génique.

3.2 Contrôle transcriptionnel.

3.2.2 Terminateurs, atténuateurs et anti-terminateurs.

3.2.3 Induction et répression : protéines régulatrices.

3.2.4 Systèmes réglementaires à deux volets.

3.2.5 Systèmes réglementaires mondiaux.

4 Génétique des bactériophages.

4.1 Structure du bactériophage.

4.2 Bactériophages à ADN simple brin.

4.3 Phages contenant de l'ARN : MS2.

4.4 Phages à ADN double brin.

4.4.3 Régulation lytique et lysogène du bactériophage λ.

4.5 Restrictions et modifications.

4.6 Résistance bactérienne à l'attaque des phages.

4.7 Complémentation et recombinaison.

4.8 Pourquoi les bactériophages sont-ils importants ?

4.8.4 Phages dans le milieu naturel.

4.8.5 Virulence bactérienne et conversion phagique.

5.1 Certaines caractéristiques bactériennes sont déterminées par les plasmides.

5.1.1 Résistance aux antibiotiques.

5.1.2 Colicines et bactériocines.

5.1.3 Déterminants de virulence.

5.1.4 Les plasmides dans les bactéries associées aux plantes.

5.2 Propriétés moléculaires des plasmides.

5.2.1 Réplication et contrôle du plasmide.

5.2.4 Incompatibilité plasmidique.

5.3.3 Taux de croissance différentiel.

5.4 Associer un plasmide à un phénotype.

6.2.1 Mécanisme de conjugaison.

6.2.3 Conjugaison dans d'autres bactéries.

6.3.1 Transduction spécialisée.

6.4.1 Conséquences de la recombinaison.

6.4.2 Recombinaison spécifique au site et non homologue (illégitime).

6.5 Gènes mosaïques et plasticité chromosomique.

7 Plasticité génomique : gènes mobiles et variation de phase.

7.1.1 Structure des séquences d'insertion.

7.1.2 Occurrence des séquences d'insertion.

7.2.1 Structure des transposons.

7.3 Mécanismes de transposition.

7.3.1 Transposition réplicative.

7.3.2 Transposition non réplicative (conservatrice).

7.3.3 Règlement de transposition.

7.3.4 Activation de gènes par des éléments transposables.

7.3.5 Mu : Un bactériophage transposable.

7.3.6 Transposons conjugatifs.

7.4.1 Variation médiée par une simple inversion de l'ADN.

7.4.2 Variation médiée par l'inversion de l'ADN emboîté.

7.4.3 Variation antigénique chez le gonocoque.

7.4.4 Variation de phase par mésappariement des brins glissés.

7.4.5 Variation de phase médiée par la méthylation différentielle de l'ADN.

7.5 De ​​courtes répétitions palindromiques groupées régulièrement entrecoupées.

8 Modification génétique : exploiter le potentiel des bactéries.

8.1.1 Génération de variation.

8.1.2 Sélection des variantes souhaitées.

8.2 Surproduction de métabolites primaires.

8.3 Surproduction de métabolites secondaires.

8.4.1 Couper et joindre l'ADN.

8.4.3 Bactériophage λ vecteurs.

8.4.4 Clonage de fragments plus gros.

8.4.5 Vecteurs de bactériophages M13.

8.5.1 Construction de bibliothèques génomiques.

8.5.2 Criblage d'une bibliothèque de gènes.

8.5.4 Construction d'une banque d'ADNc.

8.6 Produits issus de gènes clonés.

8.6.3 Autres hôtes bactériens.

8.7 Autres utilisations du génie génétique.

9 Méthodes génétiques pour enquêter sur les bactéries.

9.2.2 Immunoprécipitation de la chromatine.

9.2.4 Motilité et chimiotaxie.

9.3.1 Mécanismes à large spectre de pathogenèse bactérienne.

9.3.2 Détection des gènes de virulence.

9.5 Taxonomie, évolution et épidémiologie.

9.5.4 Électrophorèse sur gel à gradient dénaturant et électrophorèse sur gel à gradient de température.


4.2 : Phage M13 - Biologie

a Institute of Cancer and Genomic Science, Université de Birmingham, Birmingham, Royaume-Uni
E-mail: [email protected]

b School of Engineering and Materials Science, Queen Mary University of London, Londres, Royaume-Uni

c School of Biosciences, Université de Birmingham, Birmingham, Royaume-Uni

d École de génie chimique, Université de Birmingham, Birmingham, Royaume-Uni
E-mail: [email protected]

Résumé

Pour vraiment comprendre les mécanismes derrière l'auto-assemblage supramoléculaire des nanocomposants, la caractérisation de leurs propriétés de surface est cruciale. Le M13 est devenu un nanocomposant pratique pour les bio-nanoassemblages de matériaux et de dispositifs fonctionnels, et sa popularité augmente au fil du temps. L'enquête réalisée dans cette étude fournit des informations importantes sur la charge de surface et la surface de M13 déterminées par la comparaison des données structurelles et la mesure de ??-potentiel à un pH compris entre 2 et 11. Les méthodologies développées ainsi que les résultats expérimentaux peuvent ensuite être exploités comme un nouvel outil de prédiction pratique de la charge totale des versions modifiées de M13. Ceci, à son tour, facilitera la conception des stratégies d'auto-assemblage qui combineraient le bloc de construction du virus avec d'autres composants micro et nano passant par interactions intermoléculaires.


Purification du bactériophage M13 par chromatographie échangeuse d'anions

M13 est un bactériophage filamenteux non lytique (phage). Il a été largement utilisé dans la technologie d'affichage sur phage pour afficher des peptides étrangers, et également pour étudier les structures et les interactions des macromolécules. Traditionnellement, ce phage a été purifié par ultracentrifugation en gradient de densité de chlorure de césium (CsCl) qui est très laborieuse et longue. Dans la présente étude, une méthode simple, rapide et efficace pour la purification de M13 basée sur la chromatographie d'échange d'anions a été établie. Une colonne SepFast™ Super Q pré-remplie connectée à un système de chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) a été utilisée pour capturer les phages libérés dans Escherichia coli bouillon fermenté. Un rendement moyen de 74 % a été obtenu à partir d'une élution en mode lit tassé utilisant un tampon citrate (pH 4), contenant 1,5 M de NaCl à un débit de 1 ml/min. Le processus de purification a été considérablement raccourci à moins de 2 h au lieu de 18 h dans la méthode d'ultracentrifugation conventionnelle. SDS-PAGE a révélé que la pureté des particules était comparable à celle de la méthode d'ultracentrifugation à gradient de densité de CsCl. Le test de formation de plaques a montré que les phages purifiés étaient encore infectieux.


Les agrégats de protéines mal repliés, caractérisés par un repli amyloïde canonique, jouent un rôle central dans la pathobiologie des maladies neurodégénératives. Des agents qui lient et séquestrent les intermédiaires neurotoxiques de l'assemblage amyloïde, inhibent l'assemblage ou favorisent la déstabilisation de tels agrégats protéiques sont en cours d'essais cliniques. Ici, nous montrons que la protéine du gène 3 (g3p) du bactériophage filamenteux médie une puissante liaison générique au pli amyloïde. Nous avons caractérisé les activités de liaison amyloïde et de remodelage conformationnel à l'aide d'un éventail de techniques, notamment la diffraction des fibres aux rayons X et la RMN. Le mécanisme de liaison de g3p avec l'amyloïde semble refléter son rôle physiologique au cours de l'infection de Escherichia coli, qui dépend du dépliement interdomaine sensible à la température et cistrans isomérisation du prolyle de g3p. De plus, un récepteur naturel pour g3p, TolA-C, interfère de manière compétitive avec la liaison de Aβ à g3p. Des études RMN montrent que la liaison de g3p aux fibres Aβ se fait principalement par les résidus médians et C-terminaux de la sous-unité Aβ, indiquant des interactions brin –g3p. Une molécule g3p bivalente recombinante, une fusion d'immunoglobuline Fc (Ig) des deux domaines g3p N-terminaux, (1) lie puissamment les fibres Aβ (fAβ) (K = 9,4 nM) (2) blocs fAβ assemblage (IC50

50 nM) et (3) dissocie fAβ (EC50 = 40 à 100 nM). La liaison de g3p aux assemblages de protéines mal repliées est générique, et les activités ciblant l'amyloïde peuvent être démontrées à l'aide d'autres systèmes de protéines mal repliées. Ensemble, nos études montrent que g3p(N1N2) agit comme un motif général d'interaction amyloïde.


4.2 : Phage M13 - Biologie

Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis Vol. 75, n° 4, pp. 1754-1758, avril 1978 Biochimie

Synthèse de la protéine d'enveloppe du phage M13 et son assemblage dans les membranes in vitro (hypothèse du signal/précurseur de la protéine membranaire/repliement des protéines/liposomes)

WILLIAM WICKNER, GAIL MANDEL, CRAIG ZWIZINSKI, MARJORIE BATES ET TERESA KILLICK Département de chimie biologique et Institut de biologie moléculaire, Université de Californie, Los Angeles, Californie 90024

Communiqué par Eugene P. Kennedy, 6 février 1978

RÉSUMÉ La protéine d'enveloppe (produit du gène 8) du coliphage M13 est une protéine intégrale de la membrane de la cellule hôte à tous les stades de l'infection virale. Cette protéine, lorsqu'elle est fabriquée dans une réaction sans cellule, s'est avérée par d'autres avoir une région peptidique NH2-terminale supplémentaire et est appelée "procoat". Il n'est initialement pas lié à la membrane mais, lors de l'exposition à des vésicules membranaires d'Escherichia coli ou à des liposomes préparés à partir de lipides d'E. coli, il s'assemble dans la bicouche de manière intégrale. Il est montré qu'une grande partie de cette protéine est exposée sur la surface interne du liposome. Nous suggérons que le repliement du procoat lorsqu'il rencontre la bicouche est suffisant pour transporter de grands segments de la chaîne peptidique à travers le noyau d'hydrocarbure apolaire. Les protéines membranaires partagent certaines caractéristiques structurelles qui soulèvent des questions fondamentales sur leur synthèse et leur assemblage en bicouches lipidiques. Bien que de nombreuses protéines membranaires intégrales possèdent des domaines polaires étendus sur chaque surface membranaire, elles sont ancrées à la bicouche par les interactions de leurs régions hydrophobes avec le noyau hydrocarboné de la membrane. Comment les portions hydrophiles des protéines traversent-elles la bicouche en route depuis leur site de synthèse dans le cytoplasme jusqu'à leur place finale à la surface cellulaire ? De nombreuses cellules se développent rapidement et peuvent ainsi assembler de nouvelles protéines dans leurs membranes en quelques minutes. Chaque espèce de protéine a une distribution asymétrique caractéristique à travers le plan de la bicouche vraisemblablement stabilisée par le taux infiniment lent de rotation des protéines à travers le noyau d'hydrocarbure, appelé "flip-flop". Où sont les informations qui spécifient l'orientation asymétrique d'une protéine membranaire ? Il a été récemment suggéré (1) que les séquences "signal" NH2-terminales spécifient l'orientation lorsqu'elles interagissent avec des systèmes de transport de protéines membranaires spécifiques. Une fois les protéines membranaires extraites de la bicouche et purifiées en présence de détergents, elles nécessitent la présence continue de détergent pour leur dispersion. Comment les régions hydrophobes de ces protéines membranaires sont-elles synthétisées dans le milieu aqueux du cytoplasme sans dénaturation ni agrégation ? Des travaux antérieurs (2-5) ont abordé ces questions à travers des études du petit coliphage M13. Sept des huit protéines codées par le virus M13 sont liées à la membrane (6-8). L'une d'entre elles, la protéine d'enveloppe (produit du gène 8), est notamment apportée en abondance par la cellule infectée (6). À tous les stades de l'infection, il traverse la membrane cytoplasmique en tant que protéine intégrale (3, 6). Des études sur la synthèse de cette protéine et son assemblage dans les membranes peuvent aider à répondre aux questions sur la membrane

L'électrophorèse sur gel d'amide a montré la synthèse sans cellule de presque toutes les protéines M13 spécifiques. La protéine d'enveloppe synthétisée par de tels extraits a 23 résidus supplémentaires sur son extrémité NH2 (10-12) et est appelée "procoat". Dans cette communication, nous rapportons les conditions de la synthèse presque exclusive de la protéine procoat M13, examinons l'état physique de cette protéine nouvellement synthétisée et rapportons son insertion dans les membranes naturelles et les liposomes synthétiques. MATÉRIAUX ET MÉTHODES Produits chimiques. L'acide folinique (leucovorine) a été acheté chez Lederle. La [35S]méthionine (200 Ci/mmol) provenait de New England Nuclear. La DEAE-cellulose (DE52) a été achetée chez Whatman. La chymotrypsine, la RNase pancréatique et la DNase I provenaient de Worthington. Synthèse de protéines sans cellules. Ceci a été réalisé dans des extraits de souche d'Escherichia coli Q-13 (2) préparés par la méthode de Gold et Schweiger (13) avec les modifications mineures décrites ci-dessous. Les protéines solubles ont été débarrassées des acides nucléiques par adsorption à 40 °C sur DEAE-cellulose équilibrée avec du tampon A [22 mM NH4CH3COO/0,01 M Tris-HCl, pH 7,5/0,01 M Mg(CH3COO) 2/1 mM dithiothréitoll et élution avec le tampon A plus 0,35 M NH4CH3COO. Les ribosomes ont été davantage purifiés après centrifugation différentielle par sédimentation pendant 2 heures à 40 et 24 000 tr/min à travers un gradient de saccharose de 5 à 20 % dans le tampon A dans un rotor Beckman SW 27. Des réactions synthétiques (30,l) ont été réalisées comme décrit par Model et Zinder (9) avec 160 mM de NH4CH3COO, 10 mM de Mg(CHsCO0)2, M13 duplex d'ADN (5 Mig), des protéines solubles (30 ,ug), des ribosomes (0,5 A2j0) et d'autres composants comme indiqué (9). Après 8 min à 37°C, de la [3S]méthionine (1,Ci) a été ajoutée à une activité spécifique de 10 Ci/mmol. RÉSULTATS Synthèse des protéines de la couche. La synthèse des protéines dirigées par l'ADN M13 dans des extraits acellulaires a été contrôlée par électrophorèse sur gel de NaDodSO4/polyacrylamide. Un pic important de radioactivité à RF = 0,86 a été identifié en tant que protéine procoat (10-12) par les critères suivants : (i) elle a migré avec la protéine d'enveloppe dansylée (15) (Fig. 1A) (ii) elle n'a pas été trouvée dans les extraits programmé par l'ADN M13 avec une mutation ambre dans le gène de la protéine d'enveloppe 8 (Fig. 1A) (iii) il n'a pas été marqué par la [3H]arginine, un acide aminé qui ne se trouve pas dans la protéine d'enveloppe (11, 16, 17) ( données non présentées) et (v) il portait un peptide chymotryptique supplémentaire non trouvé dans la protéine d'enveloppe mature avec les résidus d'acides aminés attendus pour la séquence de tête de pro-couche (11). Après que cette synthèse ait été optimisée, pratiquement tout le produit in vitro s'est avéré être une protéine de procoat (Fig. 1B). Ceci a été confirmé par l'identité des cartes peptidiques du total in vitro

biogenèse. L'ADN duplex M13 a été utilisé par d'autres (9, 10) pour programmer des extraits qui prennent en charge la transcription et la traduction couplées. Analyse par dodécyl sulfate de sodium (NaDodSO4)/polyacrylLes frais de publication de cet article ont été en partie pris en charge par le paiement des frais de page. Cet article doit donc être marqué par la présente « publicité » conformément à 18 U.S.C. §1734 uniquement pour indiquer ce fait.


Protocoles

Partie 1 : Modèle de dépôt de phage

Il y a deux parties dangereuses dans le labo d'aujourd'hui. Vous travaillerez avec un couteau Exact-O pour découper soigneusement un motif sur votre lame. Ces couteaux sont extrêmement pointu et tout le monde doit faire preuve du plus grand soin dans leur manipulation, sinon vous vous retrouverez au MIT Medical. Le deuxième danger est le traitement acide concentré nécessaire pour modeler les diapositives. Vous devez, devez, devez porter une blouse de laboratoire, des chaussures fermées, des gants (peut-être des gants doubles) et des lunettes de protection lorsque vous avez affaire à la solution HCl, HNO3. Dans le laboratoire d'aujourd'hui, ce sera le corps professoral qui s'adaptera pour le faire.

    Récupérez une diapositive ITO auprès de la faculté d'enseignement, en touchant la diapositive avec une main gantée et uniquement sur les bords.


Les références

Belcher, Angela. "Utiliser la nature pour faire pousser des batteries." Caltech, Pasedena, Californie. 14 janvier 2011. Conférences TED.

Belcher A., ​​Mao C., Sols D. "Nanofils inorganiques." Brevet américain 20120273987. 1er novembre 2012.

Gloso Co. Lithium Ion Battery.Web Graphic.

Mao, C., Solis, D.J., Reiss, B.D., Kottmann, S.T., Sweeney, R.Y., Hayhurst, A., Georgiou, G., Iverson B., & Belcher, A.M. . "Boîte à outils basée sur les virus pour la synthèse dirigée de nanofils magnétiques et semi-conducteurs." Sciences 303.5655 (2004) : 213-217.

Nam, K. T., Kim, D. W., Yoo, P. J., Chiang, C. Y., Meethong, N., Hammond, P. T., Chaing, Y. & Belcher, A. M. "Synthèse et assemblage de nanofils activés par les virus pour les électrodes de batterie lithium-ion." sciences 312.5775 (2006) : 885-888.

Ross, Philippe. « Nanotechnologie virale ». Scientifique américain. 295,4 (2006) : n. page. La toile. 15 mars 2013.

Slonczewski, J. L., & Foster, J. W. (2011). La microbiologie, une science en évolution. (2 éd.). New York : W. W. Norton & Company.


Édité par (Justine Oesterle), une étudiante de Nora Sullivan dans BIOL187S (Microbial Life) dans The Keck Science Department of the Claremont Colleges Spring 2013.


Table des matières

Avant-propos
Remerciements
1. Les bases de la biologie moléculaire
2. Les outils du biologiste moléculaire
3. Préparations générales, procédures et considérations pour l'utilisation du manuel
Section 3-1 Utilisation de ce manuel
3-2 Considérations de sécurité
3-3 Équipement nécessaire pour les études de biologie moléculaire
4. Clonage de vecteurs et de cellules bactériennes
Article 4-1 pBR322
4-2 M13
4-3 pUC
4-4 gtlO
4-5 gtll
4-6 EMBL3 et EMBL4
4-7 Charon 28
4-8 souches bactériennes
5. Préparation d'ADN à partir de cellules eucaryotes
Section 5-1 Préparation rapide de l'ADN
5-2 Préparation d'ADN à partir de cellules eucaryotes : méthode générale
5-3 Préparation d'ADN à partir de cellules et de tissus cultivés
5-4 Endonucléases de restriction (RE) et leur utilisation
5-5 Électrophorèse sur gel d'agarose
5-6 Southern Blot
6. Sonder les acides nucléiques avec des sondes synthétiques étiquetées
Section 6-1 Fabrication de sondes ADN synthétiques : description générale
6-2 Étiquetage final des sondes synthétiques
6-3 Hybridation avec sonde synthétique 32P étiquetée en bout
7. Sonder les acides nucléiques avec des sondes dérivées de plasmides
Section 7-1 Traduction de pseudo
7-2 Hybridation d'ADN (hybridation Southern Blot)
8. Préparation de l'ADN plasmidique
Section 8-1 Transformation des bactéries
8-2 Préparation de l'ADN plasmidique : Méthode Triton-Lysozyme
8-3 Méthode de lyse alcaline à grande échelle : purification de plasmide
8-4 Méthode "Mini-Prep" de plasmide
9. Préparation de fragments de restriction d'ADN
Section 9-1 Minigels 1
9-2 Analyse de fragments d'ADN après clivage enzymatique : électrophorèse sur gel d'agarose
9-3 Électroélution
9-4 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide des fragments de restriction d'ADN
10. Purification de l'ADN
Section 10-1 Purification de l'ADN par les spermines
10-2 Élution de poudre de verre de l'ADN
10-3 Purification de l'ADN : autres méthodes
11. Préparation et analyse de l'ARN de cellules eucaryotes
Section 11-1 Préparation de l'isothiocyanate de guanidine de l'ARN total
11-2 Préparation d'ARN : Mini méthode
11-3 Sélection d'ARN Poly(A+) sur Oligo(dT) Cellulose
11-4 Gel de formaldéhyde pour la séparation électrophorétique de l'ARN et Northern Blot
11-5 "Dot Blot" Hybridation de la sonde marquée à des échantillons d'ADN ou d'ARN
11-6 Sonder les gels d'ARN : Notes générales
11-7 Préparation de sondes d'ARN à partir d'ADN cloné dans des plasmides
12. Préparation de l'ADN à partir de clones de bactériophages
Section 12-1 Croissance et préparation du bactériophage
12-2 Préparation et purification à grande échelle de l'ADN du bactériophage
13. Clonage de l'ADN du génome eucaryote
Section 13-1 Clonage d'ADN à partir du génome eucaryote : Introduction
13-2 Préparation de l'ADN génomique : méthode de digestion partielle de Mbol
13-3 Préparation du vecteur bactériophage pour le clonage génomique
13-4 Ligature de l'ADN génomique dans les bras de bactériophage et emballage pour former une bibliothèque
13-5 Titrage et placage de la bibliothèque emballée
13-6 Criblage d'une bibliothèque plaquée avec des sondes radiomarquées
13-7 Amplification de la bibliothèque
14. Clonage d'ADNc dans gtlO et λgt11
Section 14-1 Préparation des vecteurs de clonage d'ADNc λgt10 et gt11
14-2 Génération d'insert d'ADNc à partir d'ARNm eucaryote
14-3 Ligature et conditionnement de la bibliothèque d'ADNc dans les bras λgt10 ou λgt11
14-4 Placage et criblage des inserts emballés λgt10 et λgt11
14-5 Préparation d'ADN à partir des clones d'ADNc λgt10 et λgt11
15. Sous-clonage dans des plasmides
Section 15-1 Sous-clonage dans les plasmides : notes générales
15-2 Préparation des plasmides pBR322 pour le sous-clonage et la ligature de l'insert
15-3 Hybridation de colonies pBR322
15-4 Sous-clonage dans des plasmides pUC
16. Clonage et séquençage M13
Section 16-1 Clonage et séquençage M13 : Notes générales
16-2 Préparation de l'insert pour le clonage à partir de sites de restriction spécifiques
16-3 Préparation de l'insert pour le clonage Μ13 par suppression successive de l'exonucléase BAL 31
16-4 Μ13 Préparation du vecteur et ligature de l'insertion dans le vecteur
16-5 Transformation de M13 en hôte E. coli JM103
16-6 Dépistage de Μ13 clones avec une sonde radiomarquée pour sélectionner les inserts pour le séquençage
16-7 Préparation de l'ADN Μ13 simple brin pour le séquençage
16-8 Analyse d'écran à voie unique de Μ13 clones
16-9 Préparation du gel de séquençage de polyacrylamide
16-10 Séquençage Μ13 Clones
17. Caractérisation plus poussée de l'ADN cloné
Section 17-1 Essai de protection des nucléases Si
18. Transfection de cellules de mammifères en culture
Section 18-1 Transfection au phosphate de calcium de cellules non adhérentes et adhérentes avec des plasmides purifiés
18-2 Transfection à médiation par le dextran DEAE de cellules de mammifères non adhérentes et adhérentes
18-3 Électroporation
18-4 Sélection de cellules de mammifères transfectées : la méthode G418
Dosage de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT) 18-5
19. Méthodes de protéines
Section 19-1 Traduction in vitro et immunoprécipitation
19-2 Gels de polyacrylamide pour la séparation des protéines
19-3 Analyse Western Blot
19-4 Coloration à l'argent des gels pour les protéines ou l'ARN
20. Méthodes générales
Section 20-1 Extraction et précipitation d'ADN/ARN
20-2 Scellage des sacs en plastique
20-3 Mesures analytiques de la densité optique
20-4 Photographier des gels ou des autoradiogrammes
20-5 Autoradiographie
20-6 Fabrication de plaques pour la croissance bactérienne
20-7 Titrage et placage du phage
21. Méthodes spécialisées
Section 21-1 Préparation de souris transgéniques
21-2 Production d'anticorps monoclonaux : fusion d'hybridomes
21-3 Hybridation in situ de sondes marquées à des coupes de tissus
21-4 Clonage dans la levure
Annexe I Solutions d'actions
Annexe II Enzymes
Annexe III Fournisseurs de réactifs et d'équipements
Indice


LE FINANCEMENT

Ce travail (SR et DM) a été financé par l'Australian Research Council (DP110104525) et le Center for Marine Bio-Innovation. JGKH a été soutenu par un Australian Post-Graduate Award. Le soutien au laboratoire JR a été fourni par un donateur anonyme, la Royal Society of New Zealand Marsden Council subvention MAU210, Massey University Research Fund, Palmerston North Medical Research Fund, Lottery Health Board et subvention 280289 et New Zealand Foundation for Research and Technology contrat C03X0701 . Le financement a également été fourni par la NRF et le ministère de l'Éducation de Singapour dans le cadre de son programme de centre d'excellence en recherche.

Déclaration de conflit d'intérêts. Aucun déclaré.

Adresse actuelle : CSIRO Materials Science and Engineering, PO Box 218, Lindfield NSW 2070, Australie.


Voir la vidéo: M13 vector, a type of viral vector for cloning (Janvier 2023).