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La PCR est-elle une technique de clonage d'ADN ?

La PCR est-elle une technique de clonage d'ADN ?


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Selon les génomes

La PCR est

Une technique qui entraîne une amplification exponentielle d'une région sélectionnée d'une molécule d'ADN [dans un tube à essai].

Le clonage d'ADN est

Insertion d'un fragment d'ADN dans un vecteur de clonage et propagation ultérieure de la molécule d'ADN recombinant dans un organisme hôte.

Tandis que Molecular Biology of the Cell, sixième édition dit dans un résumé :

Clonage d'ADN (par l'utilisation de vecteurs de clonage ou de réaction en chaîne par polymérase) dans laquelle partie d'un génome (souvent un gène individuel) est purifiée du reste du génome par copie répétée pour générer plusieurs milliards de molécules identiques.

Ici, le clonage d'ADN a été utilisé pour signifier la réplication de l'ADN en général.

Question: Quel point de vue de l'auteur est correct, ou au moins fournit les définitions les plus acceptées ?


Réponse courte

L'Oxford English Dictionary est assez clair à ce sujet. Pour le verbe cloner il y a deux sens :

La biologie Propager (un organisme ou une cellule) comme un clone.

Biologie moléculaire Pour faire des copies de (une séquence d'ADN ou un gène).

Cette dernière définition englobe clairement la PCR.

Leçon d'histoire

La plupart des informations ci-dessous sont tirées de l'Oxford English Dictionary.

Le terme cloner a une longue histoire, d'abord en tant que nom et plus récemment en tant que verbe. L'évolution du sens et de l'utilisation du mot suggère que nous ne devrions pas être trop précieux à ce sujet.

Quand j'utilise un mot », a déclaré Humpty Dumpty, d'un ton plutôt méprisant, « cela signifie exactement ce que je veux dire, ni plus ni moins. » « La question est de savoir si vous pouvez faire en sorte que les mots signifient autant de choses différentes. » « La question est, dit Humpty Dumpty, qui est d'être maître, c'est tout.

Le mot est basé sur un mot grec pour brindille et était à l'origine utilisé comme nom sous la forme cloner.

1903 H. J. Webber dans Science 16 octobre 502/2 Les clones… sont des groupes de plantes qui se multiplient par l'utilisation de toute forme de parties végétatives.

Il a rapidement remporté la finale e.

1905 C. L. Pollard dans Science 21 juillet 88/1 Je suggère donc clone (clones au pluriel) comme forme correcte du mot.

En 1930, il était devenu un verbe…

1930 Jr. Écol. 18 357 Il s'agit probablement d'un record pour le nombre d''individus' obtenus à la fois en clonant une plante herbacée

… et, vraisemblablement parce que les bactéries étaient considérées à l'époque comme des plantes, il était également utilisé en microbiologie.

1929 Bibliographie génétique 5 234 Chez Bacillus coli communis… un biotype a également été trouvé ayant une motilité plus faible que le reste du clone dont il est issu.

Au début des années 1960, il a été étendu aux animaux, probablement en conséquence directe des expériences de Gurdon avec Xénope

1963 J. B. S. Haldane dans G. Wolstenholme Man & his Future 352 La première étape sera peut-être la production d'un clone à partir d'un seul œuf fécondé, comme dans Brave New World.

Et finalement, le sens a été étendu pour englober les molécules d'ADN, ainsi clonage moléculaire.

1974 Proc. Acadie nationale. Sci. États-Unis 71 3459/1 ColE1 s'est avéré servir de véhicule moléculaire efficace pour le clonage et l'amplification de régions spécifiques d'ADN non apparenté.

(Points supplémentaires si vous avez lu jusqu'ici ET que vous savez ce qu'est ColE1.)

Cette dernière citation me semble montrer que la confusion sur ce que les biologistes moléculaires entendent par clonage est née très tôt. Si clonage signifie « faire des copies de », alors pourquoi le mot amplifier là? D'emblée, je pense que le clonage moléculaire avait le sens de purifier (en coupant et en ligaturant). Ou c'est ce que je pensais quand je l'ai fait pour la première fois en 1980.

Mettre à jour

Malgré ma confiance dans les définitions du dictionnaire ci-dessus, et incité par la découverte par Tyto alba d'une définition contradictoire dans une autre publication OUP (voir commentaire), voici ce que je vraiment pense:

Quiconque a déjà obtenu une colonie bactérienne contenant un plasmide avec le fragment inséré qu'il voulait a annoncé "J'ai cloné le gène!" et signifiait qu'ils avaient fabriqué un plasmide recombinant ET l'avaient introduit dans des cellules. D'un autre côté, s'ils ont commencé par une amplification PCR puis ont passé un gel pour vérifier avant de ligaturer et ont vu un fragment de la taille attendue, ils n'ont pas dit "J'ai cloné le gène!" Et enfin, le cloneur réussi, lors de la séparation de sa colonie de transformants, aura rarement qualifié cette étape de clonage.


Réponse courte
Toutes vos sources sont correctes car elles ne s'excluent pas mutuellement. La PCR est utilisée pour isoler et amplifier l'ADN afin de produire de petites quantités de produit cible pur. Le clonage de gènes peut ensuite être appliqué pour augmenter la production du fragment. La PCR peut donc faire partie du processus de clonage d'ADN.

Fond
Le clonage en général signifie simplement duplication. Le clonage en biologie fait référence à

[Faire] une copie exacte d'un animal ou d'une plante créée en laboratoire à partir de l'ADN de l'animal ou de la plante

source : Dictionnaire McMillan

Clonage de gènes, pour autant que je sache, se réfère spécifiquement à l'isolement d'un seul gène et l'insérer dans les cellules pour l'amplifier :

La production d'une lignée de cellules qui contiennent tous un type de fragment d'ADN d'intérêt dérivé d'une population de nombreux types de fragments d'ADN.

source : Université Northwestern

PCR est une technique pour amplifier un brin spécifique d'ADN qui peut être utilisé pour cloner ensuite l'ADN dans des cellules hôtes (source : New England Biolabs). Le clonage est fait pour augmenter la quantité d'ADN. La PCR utilise des amorces et peut être utilisée pour isoler et amplifier l'ADN jusqu'à l'échelle où il est facilement clonable.


Vous pouvez le dire. L'amplification de l'ADN est un terme plus général pour ce que vous indiquez. Clonage de gènes à l'aide de bactéries ; populairement connu comme seulement Clonage de gènes ou Clonage moléculaire; est principalement utilisé pour le gène ou l'ADN amplification in vivo; et aussi la méthode PCR (le type le plus basique) est également pour l'ADN amplification, mais in vitro, conditions sans cellule.

Mais en pratique, cela peut créer une certaine confusion ; puisque le terme « clonage de gènes »/ « clonage moléculaire » fait généralement référence à celui effectué dans des bactéries vivantes. (bien que le but ou l'application soit très le même).

Référence : Wikipédia


Techniques de clonage moléculaire

Clonage moléculaire ou la création d'ADN recombinant est un processus essentiel utilisé dans la recherche et la découverte scientifiques. Avec le clonage moléculaire, les scientifiques peuvent amplifier et manipuler les gènes d'intérêt, puis les insérer dans des plasmides pour la réplication et l'expression des protéines. Alors, comment les scientifiques recombinent-ils l'ADN ?

Il existe de nombreuses méthodes qui ont été utilisées au fil des ans pour déplacer des morceaux d'ADN. Souvent, plusieurs approches fonctionneront pour un projet de clonage spécifique, cependant, il est probable que pour un projet donné, il existe une approche idéale. Cela peut être dû à la vitesse, au coût, à la disponibilité des matériaux de départ ou simplement à des préférences personnelles. Consultez notre blog sur le choix de la bonne méthode de clonage pour votre projet de recherche.

Le guide suivant mettra en évidence plusieurs des méthodes de clonage les plus populaires utilisées pour créer de l'ADN recombinant.


Qu'est-ce que le clonage de gènes ?

Le clonage de gènes est une technique utilisée pour localiser et multiplier un gène spécifique à partir de l'ADN génomique extrait d'un organisme par la construction d'ADN recombinant. L'ADN génomique contient des milliers de gènes différents codés pour les protéines. Lorsque l'ADN est extrait, il comprend tous les gènes possibles qu'il peut porter. La technique de clonage de gènes a permis la détection d'un gène spécifique à partir de l'ADN total. Par conséquent, le clonage de gènes constitue un outil important en biologie moléculaire.

La création d'une bibliothèque génomique d'un organisme est essentielle dans le clonage de gènes s'il n'y a aucun indice sur l'emplacement du gène pertinent dans l'ADN. Une banque génomique est réalisée en suivant les étapes suivantes.

Étape 1: Extraction de l'ADN total d'un organisme qui contient le gène souhaité.

Étape 2: Digestion par restriction de l'ADN extrait pour produire de petits fragments gérables. Cette étape est facilitée par les endonucléases de restriction.

Étape 3: Sélection d'un vecteur approprié et ouverture de l'ADN vecteur en utilisant les mêmes endonucléases de restriction. Les plasmides bactériens sont couramment utilisés comme vecteurs pour transporter de l'ADN étranger. Les plasmides sont de petits cercles d'ADN situés à l'intérieur des bactéries.

Étape 4: Combinaison de l'ADN vecteur et de l'ADN fragmenté pour produire une molécule d'ADN recombinant. Cette étape est régie par l'ADN ligase.

Étape 5 : Transfert de molécules d'ADN recombinant dans des bactéries hôtes. Cette étape est connue sous le nom de transformation et se fait à l'aide d'un choc thermique.

Étape 5 : Criblage de cellules bactériennes transformées sur milieu de culture. Une population mixte de cellules hôtes transformées et non transformées est obtenue à la fin du processus de transformation. En tant que gène d'intérêt, il n'est compris que dans les cellules hôtes transformées. Par conséquent, il est nécessaire de sélectionner des cellules transformées. La sélection se fait à l'aide de milieux sélectifs contenant des antibiotiques. Seules les cellules transformées croissent sur ce milieu de criblage permettant la sélection.

Étape 6 : Culture de bactéries pour produire une banque de gènes. Dans cette étape, les cellules hôtes transformées sont introduites dans des milieux de culture frais qui fournissent des exigences de croissance optimales. Les colonies totales sur les plaques de culture représentent la bibliothèque génomique de cet organisme.

Étape 7 : La molécule d'ADN recombinant contenant le gène d'intérêt doit être criblée à partir de milliers de fragments clonés d'ADN recombinant. Cela peut être accompli par l'utilisation de sondes qui marquent le gène spécifique ou la protéine spécifique résulte de ce gène.

Une fois que le gène intéressé contenant la colonie bactérienne est identifié à partir des colonies totales, il est possible de faire des millions de copies du plasmide recombinant qui contient le gène.

Le clonage de gènes est utilisé pour établir des bibliothèques de gènes, produire des protéines spéciales, des vitamines, des antibiotiques, des hormones, séquencer et cartographier les génomes des organismes, faire de multiples copies de l'ADN des individus en médecine légale, etc.

Figure_1 : Clonage de gènes


ADN polymérases

Les ADN polymérases sont des composants essentiels de la PCR, car elles synthétisent les nouveaux brins complémentaires à partir des matrices d'ADN simple brin. Toutes les ADN polymérases possèdent une activité polymérase 5'→ 3', qui est l'incorporation de nucléotides pour étendre les amorces à leurs extrémités 3' dans la direction 5' à 3' (Figure 2).

Au début de la PCR, le fragment Klenow de l'ADN polymérase I de E. coli a été utilisé pour générer les nouveaux brins filles [3]. Cependant, ce E. coli L'enzyme est sensible à la chaleur et facilement détruite aux températures de dénaturation élevées qui précèdent les étapes d'annelage et d'extension. Ainsi, l'enzyme devait être reconstituée à l'étape de recuit de chaque cycle tout au long du processus.

La découverte d'ADN polymérases thermostables s'est avérée être une avancée importante, ouvrant d'énormes opportunités pour l'amélioration des méthodes de PCR en permettant une stabilité à long terme des réactions. L'une des ADN polymérases thermostables les plus connues est Taq ADN polymérase, isolée de l'espèce bactérienne thermophile Thermus aquatique en 1976 [5,6]. Dans le premier rapport en 1988 [7], les chercheurs ont démontré Taq La rétention d'activité de l'ADN polymérase au-dessus de 75°C, permettant un cycle continu sans ajout manuel d'enzyme fraîche, et permettant ainsi l'automatisation du flux de travail. De plus, par rapport à E. coli ADN polymérase, Taq L'ADN polymérase a produit des amplicons PCR plus longs avec une sensibilité, une spécificité et un rendement plus élevés. Pour toutes les raisons susmentionnées, Taq L'ADN polymérase a été nommée « Molécule de l'année » par la revue Science en 1989 [8].

Figure 2. ADN polymérase prolongeant l'extrémité 3' d'une amorce PCR dans la direction 5' à 3'.

Même si Taq L'ADN polymérase a considérablement amélioré les protocoles de PCR, l'enzyme présentait encore quelques inconvénients. Taq L'ADN polymérase est relativement instable au-dessus de 90°C pendant la dénaturation des brins d'ADN. Ceci est particulièrement problématique pour les matrices d'ADN avec une teneur élevée en GC et/ou des structures secondaires fortes qui nécessitent des températures plus élevées pour la séparation. L'enzyme manque également d'activité de relecture par conséquent, Taq L'ADN polymérase peut incorporer à tort des nucléotides pendant l'amplification. Lorsque la précision de la séquence est critique, les amplicons PCR avec des erreurs ne sont pas souhaitables pour le clonage et le séquençage. De plus, la nature sujette aux erreurs de Taq L'ADN polymérase contribue à son incapacité à amplifier des fragments de plus de 5 kb en général. Pour surmonter ces lacunes, des ADN polymérases plus performantes sont continuellement développées pour exploiter la puissance de la PCR dans diverses applications biologiques (en savoir plus sur les caractéristiques de l'ADN polymérase).

Vidéo : Enzyme PCR rapide

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Stratégies de clonage par PCR

Le clonage par PCR est une méthode dans laquelle des fragments d'ADN double brin amplifiés par PCR sont ligaturés directement dans un vecteur. Le clonage par PCR offre certains avantages par rapport au clonage traditionnel qui repose sur la digestion d'inserts d'ADN double brin avec des enzymes de restriction pour créer des extrémités compatibles, la purification et l'isolement de quantités suffisantes, et la ligature dans un vecteur de choix traité de manière similaire (voir préparation de l'insert).

Avec l'amplification PCR, cette technique de clonage nécessite beaucoup moins de matériaux de matrice de départ qui incluent l'ADNc, l'ADN génomique ou un autre plasmide porteur d'insert (voir les bases du sous-clonage). En outre, le clonage par PCR fournit un flux de travail plus simple en contournant l'exigence de sites de restriction situés de manière appropriée et leur compatibilité entre le vecteur et l'insert. Néanmoins, il existe un certain nombre de considérations liées aux : amorces PCR et conditions d'amplification, la méthode de clonage de choix et les vecteurs de clonage utilisés, et, enfin, la confirmation du clonage et de la transformation réussis.

En ce qui concerne l'amplification par PCR d'une séquence d'intérêt, des amorces doivent être conçues et les conditions de PCR (composants et cycles) optimisées pour une amplification efficace et spécifique de la matrice. Des outils de conception d'amorces sont disponibles pour évaluer et sélectionner de manière bioinformatique des séquences d'amorces spécifiques à la cible appropriées pour l'amplification. La ligature nécessite que l'insert ou le vecteur ait des extrémités 5'-phosphorylées. Par conséquent, si le vecteur de clonage manque d'extrémités 5'-phosphorylées, des groupes 5'-phosphate doivent être ajoutés aux amorces PCR pendant la synthèse ou par la polynucléotide kinase T4 pour une ligature réussie. Pour l'optimisation de la PCR, les concentrations des composants de la réaction, les températures de recuit et les quantités de matrice sont importantes.

Le clonage TA et le clonage à extrémités franches représentent deux des méthodes de clonage par PCR les plus simples. Leur choix dépend de la nature du vecteur et du type d'enzymes PCR utilisées dans le clonage. clonage de l'AT utilise un thermostable Taq ADN polymérase capable d'amplifier de courtes séquences d'ADN. Cette enzyme manque d'activité de relecture 3'→ 5' et présente une activité de transférase terminale qui ajoute une désoxyadénine supplémentaire à l'extrémité 3' des amplicons (3' dA). Les produits de PCR résultants avec des surplombs de 3' dA sont facilement clonés dans un vecteur de clonage TA linéarisé contenant des surplombs complémentaires de 3' désoxythymine (3' dT) (Figure 1). Bien que relativement simple, les limitations de cette méthode incluent la longueur de l'insert (jusqu'à 5 ko), l'incapacité de cloner les inserts de manière directionnelle et le taux d'erreur élevé associé à Taq ADN polymérase.

Clonage direct implique la ligature d'un insert dans un vecteur linéarisé où les deux fragments d'ADN manquent de surplombs. Les inserts à extrémités franches peuvent être produits en utilisant des ADN polymérases haute fidélité avec une exonucléase 3'→5' ou une activité de relecture. Leur activité de relecture améliore la précision de la séquence des produits amplifiés. Cependant, les limitations incluent des efficacités de ligature inférieures lors de l'insertion dans des vecteurs de clonage à extrémité franche et l'incapacité de cloner de manière directionnelle. L'efficacité de la ligature peut être améliorée en incubant les amplicons avec un Taq ADN polymérase et dATP dans une procédure appelée « queue 3′ dA » (incuber 20 à 30 minutes à 72 °C), puis purifier les produits à queue 3′ dA (Figure 1).

Figure 1. Stratégies de clonage PCR courantes.

Pour simplifier et rationaliser davantage le flux de travail de clonage, des vecteurs spécialisés ont été développés pour placer un insert dans le vecteur, par exemple, sans utiliser de ligase. Une telle classe de vecteurs comprend les vecteurs de clonage Invitrogen TOPO qui contiennent une ADN topoisomérase I liée de manière covalente qui fonctionne à la fois comme une enzyme de restriction et une ligase (en savoir plus sur la technologie de clonage TOPO). Par rapport aux vecteurs de clonage PCR conventionnels, ces vecteurs entraînent des temps de réaction de ligature plus courts (par exemple, 5 minutes) et une plus grande efficacité de clonage (par exemple, >95 % de clones positifs) et avec un protocole beaucoup plus simple. De plus, le clonage directionnel des produits PCR peut être réalisé avec un vecteur TOPO spécialement conçu en utilisant une conception d'amorce spécifique.

Quel que soit le choix de la méthode de clonage, les efficacités de clonage sont considérablement améliorées par la purification des amplicons PCR avant la réaction de ligature. Le nettoyage PCR aide à éliminer les sels, les nucléotides, les amplicons non spécifiques et les dimères d'amorces. Après la ligature et la transformation dans les cellules compétentes appropriées, les colonies résultantes doivent être soigneusement sélectionnées pour l'insert correct, ainsi que son cadre et son orientation appropriés pour les études ultérieures afin d'analyser les fusions de gènes et/ou l'expression de protéines.


Réaction en chaîne par polymérase : techniques et variantes

Lisez cet article pour en savoir plus sur les techniques et les variations de la réaction en chaîne par polymérase avec diagramme.

Réaction en chaîne par polymérase :

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique de laboratoire (in vitro) pour générer de grandes quantités d'un ADN spécifié.

De toute évidence, la PCR est une technique d'amplification sans cellule pour synthétiser plusieurs copies identiques (milliards) de tout DMA d'intérêt. Développée en 1984 par Karry Mullis, la PCR est aujourd'hui considérée comme un outil de base pour le biologiste moléculaire. De même qu'une photocopieuse est une exigence de base dans un bureau, la machine PCR dans un laboratoire de biologie moléculaire l'est aussi !

Principe de la PCR:

L'ADN double brin d'intérêt est dénaturé pour se séparer en deux brins individuels. Chaque brin est ensuite autorisé à s'hybrider avec une amorce (renaturation). Le duplex amorce-matrice est utilisé pour la synthèse d'ADN (l'enzyme-ADN polymérase). Ces trois étapes - dénaturation, renaturation et synthèse sont répétées encore et encore pour générer de multiples formes d'ADN cible.

Technique de PCR:

Les exigences essentielles pour la PCR sont énumérées ci-dessous :

1. Un ADN cible (100 à 35 000 pb de longueur).

2. Deux amorces (oligonucléotides synthétiques d'une longueur de 17 à 30 nucléotides) complémentaires des régions flanquant l'ADN cible.

3. Quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dCTP, dTTP).

4. Une ADN polymérase pouvant résister à une température allant jusqu'à 95 °C (c'est-à-dire thermostable).

Le mélange réactionnel contient l'ADN cible, deux amorces (en excès), une ADN polymérase thermostable (isolée de la bactérie Thermus aquaticus (c'est-à-dire l'ADN polymérase Taq) et quatre désoxyribonucléotides. La technique actuelle de PCR implique des cycles répétés pour ADN cible.

Chaque cycle comporte trois étapes :

En augmentant la température à environ 95°C pendant environ une minute, l'ADN se dénature et les deux brins se séparent.

2. Renaturation ou recuit:

Lorsque la température du mélange est lentement refroidie à environ 55°C, les bases des amorces s'apparient avec les régions complémentaires flanquant les brins d'ADN cibles. Ce processus est appelé renaturation ou recuit. Une concentration élevée d'amorce assure l'hybridation entre chaque brin d'ADN et l'amorce plutôt que les deux brins d'ADN.

L'initiation de la synthèse de l'ADN se produit à l'extrémité 3 - hydroxyle de chaque amorce. Les amorces sont étendues en joignant les bases complémentaires aux brins d'ADN. Le processus de synthèse en PCR est tout à fait comparable à la réplication de l'ADN du brin principal.

Cependant, la température doit être maintenue optimale comme l'exige l'enzyme ADN polymérase. Pour l'ADN polymérase Taq, la température optimale est d'environ 75°C (pour l'ADN polymérase d'E. coli, elle est d'environ 37°C). La réaction peut être arrêtée en élevant la température (jusqu'à environ 95°C).

Les 3 étapes de la PCR en fonction de la température et du temps sont représentées sur la figure 8.1. Chaque cycle de PCR prend environ 3 à 5 minutes. Dans la pratique courante, la PCR est réalisée dans une machine automatisée.

Comme le montre la figure 8.2 (cycle I), le nouveau brin d'ADN joint à chaque amorce est au-delà de la séquence complémentaire de la seconde amorce. Ces nouveaux brins sont appelés modèles longs et ils seront utilisés dans le deuxième cycle.

Pour le deuxième cycle de PCR, les brins d'ADN (matrice longue d'origine + nouvellement synthétisée) sont dénaturés, hybridés avec des amorces et soumis à une synthèse d'ADN. À la fin du deuxième tour, des matrices longues et des matrices courtes (brins d'ADN avec une séquence d'amorce à une extrémité et une séquence complémentaire à l'amorce à l'autre extrémité) sont formées.

Dans le troisième cycle de PCR, les brins d'ADN d'origine ainsi que les modèles longs et courts sont les matériaux de départ. Les techniques de dénaturation, renaturation et synthèse sont répétées. Cette procédure est répétée encore et encore pour chaque cycle. On estime qu'à la fin du 32e cycle de PCR, environ un million de fois l'ADN cible est synthétisé (tableau 8.1). Les modèles courts possédant précisément l'ADN cible sous forme de molécules double brin s'accumulent.

Sources d'ADN polymérase :

Dans la technique originale de PCR, un fragment de Klenow de l'ADN polymérase d'E. coli a été utilisé. Cette enzyme se dénature à une température plus élevée, par conséquent, une enzyme fraîche a dû être ajoutée pour chaque cycle. Une percée s'est produite avec l'introduction de l'ADN polymérase Taq de la bactérie thermophile Thermus aquaticus. La Taq ADN polymérase est résistante à la chaleur, il n'est donc pas nécessaire d'ajouter fraîchement cette enzyme pour chaque cycle de PCR.

Facteurs clés pour une PCR optimale:

Les amorces jouent un rôle important dans la détermination de la PCR. Les amorces (17-30 nucléotides) sans structure secondaire et sans complémentarité entre elles sont idéales. Les amorces complémentaires peuvent s'hybrider pour former un dimère d'amorce et être amplifiées par PCR. Cela empêche la multiplication de l'ADN cible.

Comme déjà décrit, la Taq ADN polymérase est préférée car elle peut résister à des températures élevées. Dans le protocole de démarrage à chaud, l'ADN polymérase est ajoutée après l'étape de dénaturation thermique du premier cycle. Cela évite l'extension des amorces mésappariées qui se produisent généralement à basse température.

La Taq polymérase manque d'activité de relecture de l'exonucléase (3′-5′), ce qui pourrait contribuer à des erreurs dans les produits de la PCR. Certaines autres ADN polymérases thermostables avec une activité de relecture ont été identifiées, par exemple, l'ADN polymérase Tma de Thermotoga maritama Pfu ADN polymérase de Pyrococcus furiosus.

En général, plus la séquence d'ADN cible est courte, meilleure est l'efficacité de la PCR. Cependant, ces dernières années, une amplification de fragments d'ADN jusqu'à 10 kb a été rapportée. La séquence de l'ADN cible est également importante en PCR. Ainsi, les régions riches en CC du brin d'ADN entravent la PCR.

Promoteurs et inhibiteurs :

L'ajout de protéines telles que l'albumine de sérum bovin (BSA) améliore la PCR en protégeant l'enzyme ADN polymérase. Les acides humiques, fréquemment trouvés dans les échantillons archéologiques d'ADN cible, inhibent la PCR.

Variantes de la PCR:

La technique de base de la PCR a été décrite. Étant une technique polyvalente, la PCR est modifiée selon les exigences spécifiques de la situation. Ainsi, il existe de nombreuses variantes de la PCR d'origine, dont certaines sont décrites ci-dessous.

PCR imbriquée:

Des similitudes de séquences entre l'ADN cible et l'ADN apparenté sont très fréquemment observées. En conséquence, les amorces peuvent se lier aux deux ADN et, par conséquent, même l'ADN indésirable est également amplifié en PCR. L'utilisation d'amorces nichées augmente la spécificité de la PCR et amplifie sélectivement l'ADN cible. La PCR nichée est illustrée à la figure 8.3. Dans le premier cycle de PCR, les produits proviennent à la fois de l'ADN cible et de l'ADN indésirable. Un deuxième jeu d'amorces internes est maintenant utilisé. Ils se lieront sélectivement à l'ADN cible et l'amplification se poursuivra.

PCR inverse:

Dans la PCR inverse, l'amplification de l'ADN des séquences inconnues est réalisée à partir de la séquence connue (Fig. 8.4). L'ADN cible est clivé avec une endonucléase de restriction qui ne coupe pas la séquence connue mais coupe la séquence inconnue de chaque côté. Les fragments d'ADN ainsi formés sont inversés et se circularisent (l'ADN ligase est utilisé comme agent de scellement).

Le cercle contenant les séquences connues est maintenant coupé avec une autre enzyme de restriction. Cela ne coupe que la séquence connue. L'ADN cible ainsi formé contient la séquence connue aux deux extrémités avec l'ADN cible au milieu. L'amplification PCR peut maintenant être réalisée. On peut noter que les amorces sont générées dans le sens inverse de la normale, puisque la séquence d'origine est inversée lors de la circularisation.

PCR ancrée:

Dans la PCR ancrée, une petite séquence de nucléotides peut être attachée (marquée) à l'ADN cible, c'est-à-dire que l'ADN est ancré. Ceci est particulièrement utile lorsque la séquence entourant l'ADN cible n'est pas connue. L'ancre est fréquemment une queue poly G sur laquelle une amorce poly C est utilisée. L'ancrage peut également se faire à l'aide d'adaptateurs. Comme les adaptateurs possèdent une séquence connue, l'amorce peut être choisie.

PCR par transcription inverse:

La technique PCR peut également être utilisée pour l'amplification de molécules d'ARN, auquel cas elle est appelée transcription inverse - PCR (RT-PCR). À cette fin, la molécule d'ARN (ARNm) doit d'abord être convertie en ADN complémentaire (ADNc) par l'enzyme transcriptase inverse. L'ADNc sert alors de matrice pour la PCR. Différentes amorces peuvent être utilisées pour la synthèse du premier brin d'ADNc. Ceux-ci incluent l'utilisation d'amorces aléatoires, d'amorces oligo dT et d'une amorce spécifique de séquence (Fig. 8.5).

PCR asymétrique:

La technique PCR peut également être utilisée pour la synthèse de molécules d'ADN simple brin, particulièrement utile pour le séquençage de l'ADN. Dans la PCR asymétrique, deux amorces dans un rapport de 100:1 sont utilisées. Après 20-25 cycles de PCR, une amorce est épuisée. Le résultat est que dans les 5 à 10 prochains cycles de PCR, seuls des ADN simple brin sont générés.

PCR quantitative en temps réel:

La quantification des produits de PCR dans différents cycles n'est pas aussi simple que prévu par des considérations théoriques (tableau 8.1). Dans la pratique, de grandes variations se produisent. La technique la plus couramment utilisée pour mesurer la quantité de PCR consiste à utiliser un composé de fluorescence comme le bromure d'eithidium.

Le principe est que les molécules d'ADN double brin se lient au bromure d'éthidium qui émet une fluorescence détectable, et l'ADN quantifié. La synthèse de gènes par PCR et le rôle de la PCR dans la mutagenèse dirigée sont décrits ailleurs.

ADN polymorphe amplifié aléatoirement (RAPD):

Normalement, l'objectif de la PCR est de générer des fragments définis d'ADN à partir d'amorces hautement spécifiques. Dans le cas de RAPD (prononcé comme rapide), de courtes amorces oligonucléotidiques sont choisies arbitrairement pour amplifier un ensemble de fragments d'ADN répartis de manière aléatoire dans tout le génome. Cette technique, l'ADN polymorphe amplifié au hasard, est également connue sous le nom de PCR arbitrairement amorcée (AP-PCR).

La procédure de RAPD est comparable à la technique générale de PCR. Cette méthode implique essentiellement l'utilisation d'une seule amorce à faible stringence. Un seul oligonucléotide court (généralement une amorce de 9 à 10 bases) se lie à de nombreux sites du génome et les fragments d'ADN en sont amplifiés. La stringence de la liaison à l'amorce peut être augmentée après quelques cycles de PCR. Cela permet l'amplification des meilleurs mésappariements.

RAPD peut être conçu avec soin de manière à produire finalement des modèles de bandes spécifiques au génome qui sont utiles pour l'analyse comparative. Ceci est possible car l'ADN génomique de deux individus différents produit souvent des motifs amplifiés différents par RAPD. Ainsi, un fragment d'ADN particulier peut être généré pour un individu et pas pour l'autre, et cela représente un polymorphisme d'ADN qui peut être utilisé comme marqueur génétique.

Le RAPD est largement utilisé par les biologistes moléculaires végétaux pour l'identification génétique des espèces végétales. A cet effet, différentes combinaisons de nucléotides, dont la plupart sont des amorces oligonucléotidiques aléatoires, ont été conçues et sont disponibles dans le commerce. Comme chaque amorce aléatoire s'hybride à une région différente de l'ADN, de nombreuses régions différentes de loci sur l'ADN peuvent être identifiées. RAPD est donc utile pour la construction de cartes génétiques et comme méthode d'empreinte génomique.

Limites du RAPD:

Le principal problème de RAPD est lié à la reproductibilité. Il est souvent difficile d'obtenir des niveaux similaires de liaison à l'amorce dans différentes expériences. Il est donc difficile de corréler les résultats obtenus par les différents groupes de recherche sur le RAPD.

Polymorphisme de longueur de fragment amplifié (AFLP):

AFLP est une méthode très sensible pour détecter le polymorphisme dans le génome. Il est basé sur le principe du polymorphisme de longueur des fragments de restriction et du RAPD. L'AFLP peut être considérée de manière appropriée comme une technique d'empreintes diagnostiques qui détecte les fragments de restriction génomique.

Dans l'AFLP, l'amplification PCR plutôt que le Southern blot (principalement utilisé dans RFLP) est utilisée pour la détection des fragments de restriction. On peut noter que l'AFLP est employée pour détecter la présence ou l'absence de fragments de restriction, et non les longueurs de ces fragments. C'est la principale différence entre AFLP et RFLP. L'AFLP est très largement utilisée en génétique végétale.

Elle ne s'est pas avérée utile dans la cartographie des génomes animaux, car cette technique est principalement basée sur la présence de taux élevés de variations substitutionnelles qui ne se retrouvent pas chez les animaux. D'autre part, les variations substitutionnelles résultant en RFLP sont plus fréquentes dans les plantes. Le principe de base de l'AFLP implique l'amplification de sous-ensembles de RFLP par PCR (Fig. 8.6).

Un ADN génomique est isolé et digéré simultanément avec deux endonucléases de restriction différentes - EcoRI avec un site de reconnaissance de 6 paires de bases et Msel avec un site de reconnaissance de 4 paires de bases. Ces deux enzymes peuvent cliver l'ADN et produire de petits fragments (< 1 kb) qui peuvent être amplifiés par PCR. A cet effet, les fragments d'ADN sont ligaturés avec des adaptateurs EcoRI et Msel.

Ces séquences adaptatrices communes (séquences génomiques flanquantes) servent de sites de liaison d'amorce sur les fragments de restriction. Les fragments d'ADN peuvent être amplifiés avec des amorces AFLP ayant chacune un seul nucléotide sélectif. Ces produits de PCR sont dilués et utilisés comme matrices pour l'amplification sélective en utilisant deux nouvelles amorces AFLP qui ont 2 ou 3 nucléotides sélectifs.

Après l'amplification sélective par PCR, les produits d'ADN sont séparés sur gel. L'empreinte ADN résultante est identifiée par autoradiographie. Les fragments AFLP représentent des positions uniques dans les génomes et peuvent donc être utilisés comme points de repère pour combler les écarts entre les cartes génétiques et physiques des génomes. Chez les plantes, l'AFLP est utile pour générer des cartes à haute densité et pour détecter des clones génomiques.

Amplification rapide des extrémités d'ADNc (RACE):

Comme déjà décrit (Voir p. 115), la transcription inverse, suivie d'une PCR (RT-PCR) conduit à l'amplification de séquences d'ARN sous forme d'ADNc. Mais la limitation majeure de la RT-PCR est liée aux séquences d'ADN incomplètes dans l'ADNc. Ce problème est résolu en utilisant la technique d'amplification rapide des extrémités d'ADNc. RACE est illustré à la Fig. 8.7 et brièvement décrit ci-dessous.

L'ARN cible est converti en un ADNc partiel par extension d'une amorce d'ADN. Cette amorce d'ADN a d'abord été hybridée à une position d'intervalle de l'ARN, pas trop loin de l'extrémité 5 & 8242 de la molécule. Maintenant, l'ajout de dATP (As) et de désoxynucléotidyl transférase terminale étend l'extrémité 3 & 8242 de l'ADNc.

This happens due to the addition of a series of as to the cDNA. These as series now act as the primer to anneal to the anchor primer. A second strand of DNA can be formed by extending the anchor primer. The double-stranded DNA is now ready for amplification by PCR. The above procedure described is called 5′- RACE, since it is carried out by amplification of the 5′-end of the starting RNA. Similar protocol can be used to carry out 3′-RACE when the 3′-end RNA sequence is desired.

Limitations of RACE:

Since a specific primer is used, the specificity of amplification of RACE may not be very high. Another disadvantage is that the reverse transcriptase may not fully reach the 5′-ends of RNA, and this limits the utility of RACE. In recent years, some modifications have been done to improve RACE.


DISCUSSION

En utilisant les procédures expérimentales décrites ci-dessus, les quatre étudiants du cours de laboratoire d'un semestre ont indépendamment produit des plasmides contenant le GFP-His6-serpine chimère. Cette série expérimentale a exposé les étudiants à un certain nombre de techniques modernes en biologie moléculaire et a permis aux étudiants d'utiliser ces techniques dans la poursuite d'un objectif expérimental basé sur un projet concret. Étudiants et professeurs se sont réunis en groupe au début et à la fin des périodes de cours. Au début du semestre, ces réunions ont permis de vérifier les calculs des étudiants pour la préparation du tampon, de discuter de la gestion du temps pendant le reste de la période, de commenter les protocoles de la journée et d'introduire la théorie sous-jacente aux protocoles. Later in the semester, basic protocols (par exemple. ceux fournis par les fournisseurs), des outils de calcul et des sites Web ont été fournis aux étudiants et ils devaient concevoir leurs expériences en se basant uniquement sur les encarts des fournisseurs, ce qui a obligé les étudiants à se familiariser avec les protocoles et la gestion du temps expérimental. De plus, les étudiants devaient apporter leur interprétation de leurs résultats à ces réunions pour discussion. Les étudiants sont devenus plus indépendants dans leur travail au fur et à mesure que le semestre avançait.

Ce projet s'est poursuivi l'été suivant par deux étudiants et au semestre d'automne en tant qu'étude indépendante. Durant ces périodes, les étudiants ont pu exprimer et purifier la protéine à l'aide d'une colonne d'affinité au nickel à plus de 95 % d'homogénéité du système d'expression bactérien. Il a été démontré que le produit chimérique GFP-serpine a conservé son activité d'inhibition de la sérine protéase. Comme bénéfice pédagogique supplémentaire, les progrès résultant des travaux réalisés dans cette séquence de laboratoire et session d'été ont généré l'opportunité de présentation d'étudiants lors de conférences scientifiques [ 16 ].

En outre, en utilisant les procédures expérimentales décrites ci-dessus, les quatre étudiants participant au projet indépendant du Dr Deibel ont pu produire un ensemble de plasmides contenant le His6-N-lobe transferrine chimère. Les étudiants de ce projet ont mené 6 h de recherche par semaine à des jours déterminés par leurs horaires individuels. En conséquence, les étudiants devaient coordonner leurs recherches les uns avec les autres, car la procédure spécifique qu'ils devaient exécuter un jour donné dépendait de ce que les autres étudiants avaient terminé la veille. Au cours de ce projet, les étudiants ont non seulement été exposés à des recherches « pratiques » sur les techniques modernes de biologie moléculaire/biochimique, mais ont également pu participer à un projet de recherche en groupe.

Organisations nationales (par exemple. PKAL), et les agences de financement privées et gouvernementales (par exemple. Howard Hughes Medical Institute, National Science Foundation) ont mis au défi la communauté scientifique de premier cycle de commencer à éduquer les étudiants de manière à mieux modéliser le processus réel de la science. Cette série de laboratoires a été conçue pour répondre à ces recommandations. Certains des avantages potentiels d'un projet de recherche d'une durée d'un semestre sont : 1) une ressemblance plus étroite avec un environnement de recherche professionnel tel qu'il pourrait être rencontré dans les études supérieures 2) une expérience avec la conception expérimentale 3) une compréhension de la façon dont différentes techniques peuvent être intégré pour atteindre un objectif plus large 4) et un sentiment d'implication personnelle dans un projet du « monde réel » qui peut conduire à l'avancement des connaissances et pourrait être présenté à la communauté scientifique plus large. Bien que cette série de laboratoire ne soit pas strictement basée sur l'enquête car un résultat particulier était attendu, la série modélise les expériences typiques impliquées dans un projet de recherche, y compris les opportunités de résoudre les étapes qui ne fonctionnent pas. De telles expériences établissent des bases techniques et théoriques sur lesquelles les étudiants peuvent ensuite commencer à faire un travail indépendant basé sur l'enquête.

PKAL affirme qu'un aspect important du succès d'un étudiant de premier cycle dans un environnement de recherche est de ressentir la présence d'une communauté de soutien. Pour atteindre cet objectif et parce que nos étudiants avaient des formations différentes en techniques de laboratoire, nous les avons encouragés à s'appuyer fortement les uns sur les autres, en plus du corps professoral. En étant attentifs aux réussites et aux luttes des étudiants, nous avons pu favoriser une autonomie progressive dans le laboratoire. Par exemple, au début du semestre, des protocoles (par exemple. pour la transformation) ont été réécrits et étendus par les professeurs à partir de ceux fournis par le fabricant afin de fournir aux étudiants une instruction et une explication maximales de la théorie. Dans certains cas, des présentations peuvent être faites à l'aide d'exemples tirés de manuels pédagogiques de biologie pour expliquer les principes scientifiques impliqués dans le protocole [ 17 – 21 ]. Au fur et à mesure que les étudiants comprenaient la théorie et les étapes critiques, les professeurs ont fourni des protocoles abrégés, puis ont surveillé et interrogé les étudiants de près pendant le laboratoire pour s'assurer qu'ils comprenaient bien le protocole et comment le mettre en œuvre. À la fin du semestre, les étudiants recevaient les protocoles des fournisseurs et devaient les développer en un plus détaillé dans leurs propres cahiers. La consultation avec le corps professoral et les autres étudiants a été utilisée pour s'assurer que les étudiants interprétaient les documents de manière appropriée. Ce retrait judicieux du soutien a forcé les étudiants à prêter attention aux objectifs généraux d'un protocole, ainsi qu'à des détails importants tels que les températures, les temps d'incubation, les compositions de tampon et les rendements attendus. À la fin du cours de laboratoire, les étudiants ont été invités à faire de courtes présentations détaillées sur les étapes du protocole, telles que la ligature ou la PCR, afin de renforcer leur compréhension des principes impliqués dans les procédures de laboratoire effectuées.

En plus d'être représentative de l'expérience de recherche professionnelle, la série de laboratoires a modélisé l'importance d'une bonne tenue des dossiers de laboratoire, des expériences de contrôle et d'une bonne conception expérimentale. Bien que le calendrier fourni dans le tableau I soit représentatif d'une série expérimentale idéale, l'instructeur doit permettre des reculs expérimentaux et être flexible dans son orientation des étudiants au cours du semestre. Des exemples de revers expérimentaux rencontrés par certains de nos étudiants comprenaient l'échec à obtenir de l'ADN purifié et l'échec à obtenir des colonies avec la transformation après la ligature du plasmide. Cependant, ces revers occasionnels ont fourni des opportunités éducatives précieuses. La nature séquentielle de la série expérimentale a permis aux étudiants de réfléchir à ce qui aurait pu mal tourner, d'ajuster leur conception expérimentale, puis de réessayer l'expérience en utilisant le matériel de l'étape précédente. Ainsi, l'instructeur et les étudiants doivent être conscients de la quantité de matériel (par exemple. plasmide, produit PCR) produit à chaque étape lors de la conception des expériences, et économiser le matériel inutilisé au cas où des problèmes surviendraient dans les expériences ultérieures. Dans certains cas, des matériaux tels que des préparations de plasmides peuvent être partagés entre les étudiants si un ou plusieurs ne réussissent pas à récolter le plasmide. Dans d'autres cas, en particulier plus tard dans le semestre, lorsque les étudiants sont plus familiarisés avec les techniques expérimentales, les étudiants peuvent être encouragés à poursuivre indépendamment les expériences nécessaires pour mener à bien le projet.

Ce format d'apprentissage par projet a été bien accueilli par les étudiants. En général, à la fin du semestre, nos étudiants sont devenus très enthousiastes à l'idée de terminer leur projet et dans plusieurs cas ont voulu travailler sur le projet en dehors des heures normales de laboratoire. Les évaluations des étudiants ont révélé qu'ils considéraient « l'expérience pratique des techniques biochimiques » et que « les étudiants étaient autorisés à faire une grande partie de la planification (et) de la procédure expérimentale » comme des aspects positifs du cours de laboratoire. De plus, tous les étudiants ont indiqué que cette expérience a accru leur intérêt pour le sujet. Enfin, les constructions plasmidiques générées dans le cours ont fourni des points de départ pour des projets de recherche supplémentaires pour plusieurs étudiants et seront probablement présentées dans d'autres présentations et publications. Ainsi, cette expérience semble avoir fourni une préparation unique et précieuse à une carrière en science expérimentale.

La séquence expérimentale peut être utilisée pour faire avancer la recherche des étudiants ou des professeurs dans une grande variété de situations. Une telle approche peut être particulièrement bénéfique pour le corps professoral des établissements de premier cycle où l'accent est mis sur l'enseignement et où le temps de recherche traditionnel est limité. Les progrès de la technologie de l'ADN et des protéines auront un impact sociétal de plus en plus important. En conséquence, un accent accru est actuellement mis sur le rôle des collèges d'arts libéraux dans la présentation de leurs étudiants à des projets de recherche pertinents. Par chance, la disponibilité de nouveaux kits et réactifs de biologie moléculaire économiques rend l'utilisation de ces techniques de plus en plus réalisable dans le laboratoire de premier cycle. La taille de la section de laboratoire est certainement une considération pour une telle approche ouverte. Our group, being unusually small, allowed for a great deal of individual attention and guidance. Cependant, nous sommes convaincus qu'une telle approche pourrait être utilisée avec un plus grand groupe d'étudiants. Les interactions entre pairs étaient une ressource importante, même parmi le groupe de quatre. Les aides-enseignants, que nous n'avions pas, pouvaient également fournir beaucoup d'orientation et de consultation et faciliter l'utilisation de cette séquence de laboratoire avec des groupes d'étudiants plus importants.

Parce que cette série a été un succès, nous pensons qu'il existe plusieurs options pour les futurs laboratoires de physiologie cellulaire avancée utilisant cette séquence expérimentale. L'une consiste à répéter la série avec un produit d'amplification d'ADN différent comme indiqué dans le paragraphe précédent. Comme cette procédure peut être utilisée avec n'importe quelle séquence, un ensemble spécifique de gènes marqués tels que ceux d'une voie de transduction de signal particulière pourrait être produit dans différentes sections de laboratoire. En variante, une série de gènes marqués homologues provenant d'un certain nombre d'espèces pourrait être produite. L'achèvement récent d'un certain nombre de projets sur le génome a considérablement augmenté le nombre de cibles génétiques potentielles. La génération de bibliothèques de gènes marqués apparentés a une myriade d'utilisations potentielles dans d'autres études protéomiques de la fonction des produits géniques. Ainsi, la séquence de laboratoire présentée pourrait être utilisée pour augmenter considérablement la recherche du corps professoral de premier cycle.

Schéma de clonage global pour produire un GFP-His6-serpine construction. UNE, une carte du plasmide pGFPuv, qui a été achetée auprès de Clontech. Toutes les cartes plasmidiques ont été créées par le programme shareware MacPlasMap (v1.83). Les gènes de résistance à la GFPuv et à l'ampicilline sont représentés par flèches noires. Les flèches pointent dans le sens de la traduction des protéines. Le promoteur lac inductible Plac contrôle l'expression de GFPuv. L'origine de réplication pUC maintient un nombre élevé de copies du plasmide dans la cellule, facilitant la purification du plasmide. Les sites de multi-clonage (MCS) sont présentés dans gris. Les emplacements des sites de début et d'arrêt de la traduction du gène GFPuv, ainsi que les sites de restriction uniques SacI et EcoRI, sont indiqués. Le plasmide pGFPuv est digéré avec SacI et EcoRI et traité avec la phosphatase CIAP, donnant un fragment d'ADN linéarisé qui ne peut pas reléguer pour former un plasmide circulaire. Les extrémités cohésives créées par la digestion de restriction de pGFPuv sont utilisées pour ligaturer les extrémités cohésives complémentaires de l'insert PCR contenant l'ADNc de serpine. B, le produit d'amplification PCR généré à partir du plasmide serpin1B(A343K) contenant le His6-ADNc de serpine. Les amorces PCR sont conçues pour introduire les sites de restriction complémentaires aux extrémités du His6-ADN de serpine. Ces sites de restriction doivent être uniques dans le produit d'amplification PCR. La digestion du produit d'amplification PCR avec SacI et EcoRI génère des extrémités cohésives adaptées à la ligature dans le vecteur pGFPuv linéarisé de manière similaire. C, le GFP-His6-vecteur d'expression serpine pMAJILK créé par ligature du pGFPuv linéarisé et du produit d'amplification PCR digéré. Les extrémités cohésives complémentaires créées par les deux enzymes de restriction assurent une ligature directionnelle appropriée de l'insert dans le vecteur. La traduction de la GFP-His de 1,9 kb résultante6-le gène de la serpine est sous le contrôle du promoteur lac inductible. , le produit protéique créé par traduction de la GFP-His6-gène de la serpine. Cette protéine de 75 kDa se compose d'un domaine GFPuv N-terminal de 27 kDa suivi d'un domaine de liaison flexible qui comprend le His6 séquence. Le domaine serpine C-terminal est de 45 kDa et contient le site de clivage de la protéase C-terminal. Le site de clivage de la protéase C-terminal a exigé que le domaine GFP soit ajouté en N-terminal du domaine de la serpine. Les structures des domaines GFP et serpine isolés sont également données. As shown, the figure is only approximately to scale. Le lieur flexible entre les domaines GFP et serpine constitué de résidus glycine de chaque côté du His6 domaine peut favoriser l'accessibilité de l'étiquette d'épitope au solvant. Bien que l'emplacement exact des domaines dans la protéine recombinante ne soit pas connu, le lieur flexible semble permettre à ces domaines d'adopter des positions qui n'interfèrent pas fonctionnellement. GFP (#1EMA) et M. sexta serpine (#1SEK) ont été téléchargés à partir de la Protein Data Bank et manipulés à l'aide de Deep View-Swiss Pdb Viewer (us.expasy.org/spdbv). La protéine est représentée sous forme de diagramme à ruban standard. La région de liaison entre les deux protéines est représentée sous la forme d'un brin B linéaire pour démontrer la relation tridimensionnelle potentielle des domaines individuels.

Conception d'amorces et PCR du His6-ADNc de serpine. UNE, aperçu de la conception des amorces pour l'amplification par PCR du His6-gène de la serpine. Montré est le double brin 1,2-kb His6 ADNc de serpine dans le plasmide serpin1B(A343K). Les grande flèche désigne le sens de la transcription. Après séparation thermique des deux brins, deux amorces oligonucléotidiques synthétiques sont ajoutées pour servir de matrices pour l'amplification PCR. Ces amorces sont constituées d'une région complémentaire 3' et non complémentaire 5'. Les régions complémentaires 3' des amorces servent de points d'initiation pour l'allongement des amorces, tandis que les régions non complémentaires 5' permettent l'introduction de sites de restriction dans le produit PCR. L'amorce avant se lie au brin non codant près du début de la His6-serpine, et l'amorce arrière se lie au brin codant à l'extrémité du His6-gène de la serpine. B, conception de l'amorce d'ADN avant. Montré est l'amorce avant liée au brin non codant de la His6-gène de la serpine dans le plasmide serpin1B(A343K). Les abréviations d'acides aminés à une lettre pour chaque codon sont indiquées au-dessus du brin codant. L'extrémité non complémentaire 5' de l'amorce est constituée du site de restriction SacI et d'un surplomb de 6 bases de séquence aléatoire pour permettre un clivage efficace du site SacI. Comme le site SacI dans le plasmide pGFPuv se trouve juste avant la fin du gène GFPuv, la séquence d'ADN codant pour les deux derniers acides aminés dans GFPuv a été ajoutée après le site de restriction pour maintenir le gène GFPuv complet lors du sous-clonage du produit PCR dans pGFPuv. Les bases de la région non complémentaire du plasmide sont notées N. Un résidu glycine a également été introduit pour permettre la flexibilité conformationnelle du domaine pGFPuv par rapport au reste du produit du gène. Le site de clivage du brin d'ADN codant lors de la digestion avec SacI est montré. La région complémentaire de l'amorce se compose du début de la His6-serpine et comprenait un résidu de liaison alanine avant le début du domaine serpine. Périodes représentent de longues séquences d'ADN s'étendant à partir de la séquence montrée. Les La Flèche indique la direction de l'extension de l'amorce dans une PCR. C, conception de l'amorce d'ADN arrière. Montré est l'amorce de PCR arrière liée au brin codant de l'extrémité de la His6-gène de la serpine dans le plasmide serpin1B(A343K). Les abréviations d'acides aminés à une lettre pour chaque codon sont indiquées au-dessus du brin codant. L'extrémité non complémentaire 5' de l'amorce est constituée du site de restriction EcoRI et d'un surplomb de 6 bases de séquence aléatoire pour permettre un clivage efficace du site EcoRI. Les bases de la région non complémentaire du plasmide sont notées N. Un résidu glycine a également été introduit pour permettre la flexibilité conformationnelle du domaine pGFPuv par rapport au reste du produit du gène. Le site de clivage du brin d'ADN codant lors de la digestion avec EcoRI est également montré. Un codon d'arrêt supplémentaire a été introduit après le codon d'arrêt endogène pour assurer la terminaison du produit génique. Périodes représentent de longues séquences d'ADN s'étendant à partir de la séquence montrée. Les La Flèche indique la direction de l'extension de l'amorce dans une PCR.

Un E-gel d'agarose à 1,2% (Invitrogen) d'échantillons d'ADN générés tout au long du cours en laboratoire. Tous les échantillons ont été dilués à 20 l et chargés directement sur le E-gel. Après électrophorèse à 60 V pendant 45 min, le gel a été placé sur un transilluminateur ultraviolet et l'image capturée à l'aide d'une caméra CCD. Voie 1 contient le marqueur d'ADN à large spectre Directload (Sigma, St. Louis, MO). Les longueurs des fragments d'ADN du marqueur sont données à côté du gel. Voie 2 contient une préparation d'ADN de pGFPuv non coupé montrant plusieurs bandes en raison du superenroulement du plasmide. Voie 3 contient la préparation pGFPuv coupée individuellement mais EcoRI donnant un fragment d'ADN de 3,3 kb. Voie 4 contient la préparation de plasmide pGFPuv digérée par SacI. Voie 5 contient la double digestion de pGFPuv par EcoRI et SacI, donnant un seul fragment visible d'environ 3,3 kb. voie 6 contient l'amplification PCR 1,2 kb du His6-serpine produit généré à partir du plasmide serpin1B(A343K) et en utilisant des amorces PCR qui ont introduit le site de restrictions EcoRI et SacI aux extrémités des produits PCR. Lane 7 contient la double digestion du produit PCR donnant un fragment d'ADN d'environ 1,2 kb avec des extrémités cohésives. Voie 8 contient la réaction de ligature diluée avant l'addition de la ligase contenant le produit de digestion pGFPuv et PCR. Le produit PCR n'est pas visible dans l'échantillon dilué en raison de sa petite taille. Voie 9 contient la solution de réaction de ligature diluée après ligature. Un certain nombre de faibles bandes de masse moléculaire d'ordre supérieur peuvent être observées qui ne sont pas présentes dans voie 8, indiquant que la ligature a réussi. Une transformation de cette réaction a donné un petit nombre de colonies bactériennes. Voie 10 est une double digestion d'une préparation de plasmide à partir d'une colonie bactérienne obtenue suite à la réaction de ligature. Cette digestion a donné un seul fragment de 3,3 kb comme dans voie 5, ainsi qu'un fragment de 1,2 kb comme dans voie 6, indiquant que le plasmide était constitué du vecteur d'expression pGFPuv et comprenait le His recombinant6-insert PCR serpine. Voie 11 est une double digestion d'une préparation de plasmide à partir d'une colonie bactérienne obtenue suite à la réaction de ligature. Cette digestion a donné un seul fragment de 3,3 kb comme dans voie 5, indiquant que le plasmide de cette colonie est pGFPuv et manque de l'insert de serpine recombinant. Voie 12 contient un marqueur d'ADN à large plage Directload (Sigma).

Chromatogramme à partir d'un séquençage automatisé d'ADN fluorescent. Montré est pour le His6-N-lobe transferrine plasmide chromatagramme produit par séquençage fluorescent automatisé (Genegateway). Le chromatogramme est visualisé à l'aide chrominance, téléchargeable gratuitement sur www.technelysium.com.au/chromas14x.html. La lecture automatique du chromatagramme s'affiche.

La semaine Activité principale du laboratoire Manipulations pré-laboratoires
1 Transformation de l'ADNc de la serpine en DH5α
2 Isolement de l'ADN plasmidique et digestion par restriction diagnostique conçue par les étudiants Mettre en place une culture de nuit la veille du laboratoire
3 E-gel de vecteur de coupe et de conception d'apprêt
4 Conception d'amorces et commande d'amorces Reconstituer les amorces PCR
5 PCR du gène d'intérêt
6 Utilisation des E-gels pour vérifier les digestions de restriction des produits PCR Conserver le produit PCR à –20 °C après PCR
7 Digestion par restriction du plasmide et du vecteur. Traitement CIAP du vecteur.
8 Ligature et transformation du produit de ligature
9 Préparation de plasmide ADN de transformants digestion diagnostique de l'ADN de plasmide transformant Mettre en place des cultures nocturnes de transformants
10 Gel d'agarose de digestion d'ADN diagnostique pour identifier la conception de produits recombinants et commander des amorces de séquençage
11 séquençage ADN Reconstituer les amorces de séquençage
12 Interprétation des résultats du séquençage Ouvrir les fichiers de données de séquence

In vitro Mutagenesis

PCR Mutagenesis of Circular DNA

PCR mutagenesis can also be used to amplify the entire plasmid containing the gene of interest. One straightforward method, termed ‘inverted’ or ‘counter’ PCR, uses back-to-back primers ( Figure 2B ) one PCR primer serves as the mutagenic oligonucleotide and the other oligonucleotide primes from the opposite strand, adjacent to the mutagenic primer. The PCR product is a full-length, linear plasmid which is then phosphorylated and ligated before transformation. This method can readily be used to make deletion mutants by creating a gap between the primers. Variants of this method include ‘recombinant circle’ PCR ( Figure 2C ) and ‘recombination’ PCR, both of which rely on recombination of linear plasmids. In these techniques, two inverse PCRs are performed with gapped primers at different sites. These two mutant plasmids are then recombined in vitro by mixing and annealing (recombinant circle PCR) or in vivo (recombination PCR). The gaps are then repaired by the bacterial DNA repair machinery.


Standard PCR experiment overview

The PCR is used to amplify a specific DNA fragment from a complex mixture of starting material called template DNA. The sample preparation and purification protocols depend on the starting material, including the sample matrix and accessibility of target DNA. Often, minimal DNA purification is needed. However, PCR does require knowledge of the DNA sequence information that flanks the DNA fragment to be amplified (called target DNA).

From a practical point of view, a PCR experiment is relatively straightforward and can be completed in a few hours. In general, a PCR reaction needs five key reagents:


DNA to be amplified : also called PCR template or template DNA. This DNA can be of any source, such as genomic DNA (gDNA), cDNA, and plasmid DNA.

ADN polymérase : all PCR reactions require a DNA polymerase that can work at high temperatures. Taq polymerase is a commonly used one, which can incorporate nucleotides at a rate of 60 bases/second at 70 °C and can amplify templates of up to 5 kb, making it suitable for standard PCR without special requirements. New generations of polymerases are being engineered to improve reaction performance. For example, some are engineered to be only activated at high temperatures to reduce non-specific amplification at the beginning of the reaction. Others incorporate a “proofreading” function, important, for example, when it is critical that the amplified sequence matches the template sequence exactly, such as during cloning.

Amorces : DNA polymerases require a short sequence of nucleotides to indicate where they need to initiate amplification. In a PCR, these sequences are called primers and are short pieces of single-stranded DNA (approximately 15-30 bases). When designing a PCR experiment, the researcher determines the region of DNA to be amplified and designs a pair of primers, one on the forward strand and one on the reverse, that specifically flanks the target region. Primer design is a key component of a PCR experiment and should be done carefully. Primer sequences must be chosen to target the unique DNA of interest, avoiding the possibility of binding to a similar sequence. They should have similar melting temperatures because the annealing step occurs simultaneously for both strands. The melting temperature of a primer can be impacted by the percentage of bases that are guanine (G) or cytosine (C) compared to adenine (A) or thymine (T), with higher GC contents increasing melting temperatures. Adjusting primer lengths can help to compensate for this in matching a primer pair. It is also important to avoid sequences that will tend to form secondary structures or primer dimers, as this will reduce PCR efficiency. Many free online tools are available to aid in primer design.

Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs): these serve as the building blocks to synthesize the new strands of DNA and include the four basic DNA nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP). dNTPs are usually added to the PCR reaction in equimolar amounts for optimal base incorporation.

PCR buffer: the PCR buffer ensures that optimal conditions are maintained throughout the PCR reaction. The major components of PCR buffers include magnesium chloride (MgCl2), tris-HCl and potassium chloride (KCl). MgCl2 serves as a cofactor for the DNA polymerase, while tris-HCl and KCl maintain a stable pH during the reaction.

The PCR reaction is carried out in a single tube by mixing the reagents mentioned above and placing the tube in a thermal cycler.

The PCR amplification consists of three defined sets of times and temperatures termed steps : dénaturation, recuit, et extension (Figure 1).

Each of these steps, termed cycles, is repeated 30-40 times, , doubling the amount of DNA at each cycle and obtaining amplification (Figure 2).

Let's take a closer look at each step.

1. Dénaturation

The first step of PCR, called denaturation, heats the template DNA up to 95 ° C for a few seconds, separating the two DNA strands as the hydrogen bonds between them are rapidly broken.

2. recuit

The reaction mixture is then cooled for 30 seconds to 1 minute. Annealing temperatures are usually 50 - 65 ° C however, the exact optimal temperature depends on the primers' length and sequence. It must be carefully optimized with every new set of primers.

The two DNA strands pourrait rejoin at this temperature, but most do not because the mixture contains a large excess of primers that bind, or anneal, to the template DNA at specific, complementary positions. Once the annealing step is completed, hydrogen bonds will form between the template DNA and the primers. At this point, the polymerase is ready to extend the DNA sequence.

3. Extension

The temperature is then raised to the ideal working temperature for the DNA polymerase present in the mixture, typically around 72 ° C, 74 ° C in the case of Taq.

The DNA polymerase attaches to one end of each primer and synthesizes new strands of DNA, complementary to the template DNA. Now we have four strands of DNA instead of the two that were present to start with.

The temperature is raised back to 94 ° C and the double-stranded DNA molecules – both the "original" molecules and the newly synthesized ones – denature again into single strands. This begins the second cycle of denaturation-annealing-extension. At the end of this second cycle, there are eight molecules of single-stranded DNA. By repeating the cycle 30 times, the double-stranded DNA molecules present at the beginning are converted into over 130 million new double-stranded molecules, each one a copy of the region of the starting molecule delineated by the annealing sites of the two primers.

To determine if amplification has been successful, PCR products may be visualized using gel electrophoresis, indicating amplicon presence/absence, size and approximate abundance. Depending on the application and the research question, this may be the endpoint of an experiment, for example, if determining whether a gene is present or not. Otherwise, the PCR product may just be the starting point for more complex downstream investigations such as sequencing and cloning.


Site-Directed Mutagenesis

Site-directed mutagenesis is a widely used procedure for the study of the structure and function of proteins by modifying the encoding DNA. By using this method, mutations can be created at any specific site in a gene whose wild-type sequence is already known. Many techniques are available for performing site-directed mutagenesis. A classic method for introducing mutations, either single base pairs or larger insertions, deletions, or substitutions into a DNA sequence, is the Kunkel method.

The first step in any site-directed mutagenesis method is to clone the gene of interest. For the Kunkel method, the cloned plasmid is then transformed into a dut ung mutant of Escherichia coli. Cette E. coli strain lacks dUTPase and uracil deglycosidase, which will ensure that the plasmid containing the gene of interest will be converted to DNA that lacks Ts and contains Us instead.

The next step is to design a primer that contains the region of the gene which you wish to mutate, along with the mutation you want to introduce. PCR can then be used with the mutated primers to create hybrid plasmids each plasmid will now contain one strand without the mutation and uracil bases, and another strand with the mutation and lacking uracil.

The final step is to isolate this hybrid plasmid and transform it into a different strain that does contain the uracil-DNA glycosylase (ung) gene. The uracil deglycosidase will destroy the strands that contain uracil, leaving only the strands with your mutation. When the bacteria replicate, the resulting plasmids will contain the mutation on both strands.


Procédure expérimentale

Run PCR and purify the PCR product:

Run PCR to amplify your insert DNA. It is important to use a high fidelity taq polymerase to minimize mutations. The fidelity of the polymerase becomes more important the longer the expected PCR product is. You should select an annealing temperature based on the melting temperature (Tm) of the portion of the primer that hybridizes to the sequence to be amplified (the ORF in this case), not the Tm of the entire primer. If you are amplifying from a plasmid or simple template, there is very little chance for mis-priming, so you can use a pretty wide range of annealing temperatures, but you may need to increase your primer length and increase the Tm if you are trying to clone from genomic DNA, a cDNA library, or by RT-PCR.

Isolate your PCR product from the rest of the PCR reaction using a kit, such as the QIAquick PCR Purification Kit. The PCR product is now ready for restriction digestion.

Digérez votre ADN :

Set up restriction digests for your PCR product and recipient plasmid. Because you lose some DNA during the gel purification step, it is important to digest plenty of starting material. We recommend using your entire PCR reaction and 1μg of recipient plasmid. It is also critical that as much of the recipient plasmid as possible be cut with both enzymes, and therefore it is important that the digest goes at least 4 hours and as long as overnight.

If you are going to use only one restriction enzyme, or enzymes that have compatible overhangs or no overhangs after digestion, you will need to use a phosphatase to prevent re-circularization of the vector. You should treat your digested recipient vector with a phosphatase prior to the ligation step or prior to the gel purification step, depending on the phosphatase you choose. CIP (calf alkaline phosphatase) or SAP (shrimp alkaline phosphatase) are commonly used. Follow the manufacturer’s instructions.

Isolez votre insert et vecteur par purification sur gel :

Run your digest DNA on an agarose gel and conduct a gel purification to isolate the DNA. When running a gel for purification purposes it is important to have nice crisp bands and to have space to cut out the bands. Because of this we recommend that you use a wide gel comb, run the gel on the slower side, and skip lanes between samples. In addition to a DNA ladder standard, it is also a good idea to run an uncut sample of each vector to help with troubleshooting if your digests don’t look as you expected.

When cloning by PCR, it is especially important to run the product on a gel. This allows you to visualize that your PCR product is the anticipated size and that your band is strong (indicating that the PCR reaction worked and that you have a sufficient amount of DNA).

Once you have cut out and purified your insert and vector bands away from the gel, it is important to determine the concentration of recovered DNA.

Ligaturez votre insert dans votre vecteur :

Conduct a DNA Ligation to fuse your insert to your recipient plasmid.

We recommend around 100ng of total DNA in a standard ligation reaction. You ideally want a recipient plasmid to insert ratio of approximately 1:3. Since the number of base pairs for each varies, it is difficult to calculate this based on DNA concentration alone. One method is to conduct 2 ligations for each plasmid you are trying to create, with varying ratios of recipient plasmid to insert.

It is also important to set up negative controls in parallel. For instance, a ligation of the recipient plasmid DNA without any insert will tell you how much background you have of uncut or self-ligating recipient plasmid backbone.

Transformation:

Proceed with the transformation according to the manufacturer’s instructions for your competent cells.

For most standard cloning, you can transform 1-2μl of your ligation reaction into competent cells such as DH5alpha or TOP10. If using much less total DNA (<1ng) or if you are having trouble getting colonies, you might want to use higher competency cells. Additionally, if your final product is going to be very large (>10kb) you might want to use electro-competent cells instead of the more common chemically-competent cells.

The number of bacterial colonies resulting from your transformation will give you the first indication as to whether your transformation worked. Your recipient plasmid + insert plate should have significantly more colonies than the recipient plasmid alone plate. The recipient plasmid alone control will tell you your “background” level or more specifically it will tell you how many colonies you can expect on your recipient plasmid + insert plate that are not correct.

If you have a high number of colonies on your recipient plasmid alone plate, you can try ligating the recipient plasmid alone in the presence and absence of ligase. If the colonies are a result of uncut empty plasmid, you will still have colonies when you do not add ligase. If the colonies are a result of recipient plasmid self-ligation, you will see significantly more colonies when you add ligase.

If you do not see any colonies, you should conduct a positive control to ensure that your transformation worked. You could also try varying the amount of recipient plasmid to insert.

Isoler le plasmide fini :

Finally, you will need to pick individual bacterial colonies and check them for successful ligations. Pick 3-10 colonies depending on the number of background colonies on your control plate (the more background, the more colonies you will need to pick) and grow overnight cultures for DNA purification.

After purifying the DNA, conduct a diagnostic restriction digest of 100-300ng of your purified DNA with the enzymes you used for the cloning. Run your digest on an agarose gel. You should see two bands, one the size of your vector and one the size of your new insert.

Vérifiez votre plasmide par séquençage :

PCR based cloning carries a much higher risk for mutation than restriction enzyme based cloning. DNA replication by PCR has error rates that range from roughly 1 per 500bp to roughly 1 per 10 million bp depending on the polymerase used. Because of this, no matter which taq polymerase you use, it is important that you sequence the final product.


Voir la vidéo: Le principe de La PCR et leur différents étapes (Septembre 2022).


Commentaires:

  1. Cyneleah

    Je m'excuse, mais, à mon avis, vous n'avez pas raison. je suis assuré. Je suggère d'en discuter. Écrivez-moi en MP.

  2. Palamedes

    Pas de mots, c'est cool

  3. Doutilar

    vous pouvez voisin!)))

  4. Mezuru

    Vous avez tort. Je suis sûr. Je suis capable de le prouver. Écrivez-moi dans PM, discutez-en.

  5. Faurn

    Je ne l'ai pas regretté!

  6. Jesse

    Je ne peux pas décider.



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